CA2366217A1 - Inducible comtii promoter, chimera gene containing same and transformed plants - Google Patents

Inducible comtii promoter, chimera gene containing same and transformed plants Download PDF

Info

Publication number
CA2366217A1
CA2366217A1 CA002366217A CA2366217A CA2366217A1 CA 2366217 A1 CA2366217 A1 CA 2366217A1 CA 002366217 A CA002366217 A CA 002366217A CA 2366217 A CA2366217 A CA 2366217A CA 2366217 A1 CA2366217 A1 CA 2366217A1
Authority
CA
Canada
Prior art keywords
promoter
plants
sequence
plant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Abandoned
Application number
CA002366217A
Other languages
French (fr)
Inventor
Bernard Fritig
Valerie Toquin
Pierrette Geoffroy
Michel Legrand
Serge Kauffmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RhoBio
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9903700A external-priority patent/FR2791359A1/en
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CA2366217A1 publication Critical patent/CA2366217A1/en
Abandoned legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/1003Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C12N9/1011Catechol O-methyltransferase (2.1.1.6)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237Externally regulated expression systems
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237Externally regulated expression systems
    • C12N15/8239Externally regulated expression systems pathogen inducible
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/1003Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Abstract

The invention concerns a novel regulating COMTII promoter sequence inducible in response to a mechanical or chemical injury, or in response to aggression by a pathogenic agent, in particular bacterial, fungal or viral, or by an insect or a threadworm. The invention also concerns a chimera gene (or expression cassette) comprising the inventive regulating promoter sequence controlling the expression of a heterologous coding sequence and host organism comprising said chimera gene, the transformed plants containing it and the seeds of said transformed plants.

Description

Promoteur inductible COMTII, gène chimère le comprenant et plantes transformées La présente invention concerne une nouvelle séquence de régulation promotrice inductible en réponse à une blessure, mécanique ou chimique, ou en réponse à
une agression par un agent pathogène, notamment bactérien, fongique ou viral, ou par un insecte ou un nématode.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d' expression) comprenant la séquence de régulation promotrice selon l' invention qui contrôle l'expression d'une séquence codante hétérologue, hétérologue signifiant ici une séquence codante différente de la séquence codante native.
La présente invention concerne également un organisme hôte comprenant ledit gène chimère, les plantes transformées le comprenant et les semences (graines) desdites plantes transformées.
Il est connu de l'état de la technique que certains gènes, silencieux en l'absence d'agression, ne sont activés que par une agression tant mécanique que chimique et/ou en réponse à une agression par un agent pathogène, un insecte ou un nématode. De tels gènes et leurs facteurs d'activation sont notamment décrits dans le brevet US
5 670 349.
Ces différents modes de défense sont généralement liés à une régulation de l'expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes de défense des plantes par induction de leurs séquences de régulation promotrices. On connaît plusieurs séquences de régulation inductibles comme les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB, tous ces promoteurs étant rappelés avec les références des publications correspondantes par le Tableau 3 du brevet US 5 670 349. On connaît également le promoteur HMG2 décrit dans ce même brevet US 5 670 349, comme le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme décrits dans la demande de brevet WO
98/45445.
La présente invention concerne un nouveau fragment d'acide nucléique, en particulier isolé, comprenant un promoteur de plante (ou séquence de régulation promotrice) inductible, ledit promoteur inductible étant constituë par le promoteur d'un WO 00/56897
COMTII inducible promoter, chimeric gene comprising it and plants transformed The present invention relates to a new promoter regulatory sequence inducible in response to an injury, mechanical or chemical, or in response to a aggression by a pathogenic agent, in particular bacterial, fungal or viral, or by a insect or nematode.
The present invention also relates to a chimeric gene (or cassette expression) comprising the promoter regulatory sequence according to invention which controls the expression of a heterologous, heterologous coding sequence meaning here a coding sequence different from the native coding sequence.
The present invention also relates to a host organism comprising said chimeric gene, transformed plants comprising it and seeds said transformed plants.
It is known from the state of the art that certain genes, silent in the absence of aggression, are only activated by both mechanical and chemical aggression and / or in response to an attack by a pathogen, an insect or a nematode. Of such genes and their activation factors are described in particular in the US patent 5,670,349.
These different modes of defense are generally linked to a regulation of the expression of certain genes involved in the defense mechanisms of plants by induction of their promoter regulatory sequences. We know several sequences regulators such as phenylalanine ammonia lyase promoters (PAL), HMG-CoA reductase (HMG), chitinases, glucanases, inhibitors of proteinase (PI), genes of the PR1 family, nopaline synthase (nos) or of the gene vspB, all these promoters being recalled with the references of the publications corresponding by Table 3 of US Patent 5,670,349. We also know the HMG2 promoter described in this same US Pat. No. 5,670,349, as the promoter of the apple beta-galactosidase (ABG1) or the amino cyclopropane promoter apple carboxylate syntase (ACC synthase) described in the patent application WO
98/45445.
The present invention relates to a new nucleic acid fragment, in particular isolated, comprising a plant promoter (or sequence of regulation promoter) inducible, said inducible promoter being constituted by the promoter of a WO 00/56897

2 PCT/FR00/00714 gène d' O-méthyltransférase de classe II (ci-après COMT II) de plante.
Les gènes d'O-méthyltransférase de classe II; dont le gène d'acide caféique-O-méthyltransférase de classe II, de plantes sont silencieux (inactifs) en l'absence de toute agression puisque les plantes non agressées ne l'expriment pas, ou pour le moins à des niveaux indétectables par les méthodes d'analyse usuelles. Ainsi, le messager de la COMT II est indétectable par la technique de " Northern blot " dans différents tissus d'une plante saine non traitée, comme par exemple le tabac (Pellegrini & al., 1993).
Cette COMTII et son promoteur sont activés (ou induits) par les blessures, les infections virales, les agressions aux rayons UV, ou aux agressions chimiques par différents produits comme le benzothiazole (BTH), le méthyle jasmonate ou des éliciteurs d'origine végétale comme la pectine.
De manière avantageuse, le fragment d'acide nucléique isolé selon l'invention est constitué par un promoteur de COMTII de plante.
Par COMTII de plante, on entend selon l'invention toute OMT de plante qui n'est pas exprimée dans les plantes saines non traitées, mais qui l'est à la suite d'une agression mécanique, chimique, par un pathogène, un insecte ou un nématode.
Par plante d'origine de la COMTII, on entend selon l'invention tout organisme pluricellulaire différencié capable de photosynthèse, qu'elle soit monocotylédone ou dicotylédone, comme par exemple le riz, le blé, l'orge, le tournesol, le maïs, le tabac, le colza, le soja ou Arabidopsis thaliana.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la COMT II est une COMT de plante dicotylédone, de préférence de tabac.
Par promoteur, on entend selon l'invention la région non codante d'un gène impliqué dans la liaison avec l'ARN polymérase et d'autres facteurs qui sont responsables de l'initiation et de la modulation de la transcription conduisant à la production d'un transcrit d'ARN. Il s'agit plus particulièrement de toute séquence en 5' du site d'initiation de la traduction ou codon " start " (ATG) de la séquence codante de la COMTII permettant la transcription et l'expression de ladite séquence codante.
Le promoteur selon l'invention comprend avantageusement une séquence de plus de 600 nucléotides en amont de l'ATG de la COMT II, de préférence de plus de 70.0, de plus de 800 voire de plus de 900 nucléotides en amont de l'ATG, plus préférentiellement de plus de 1000 nucléotides en amont de l'ATG, encore plus WO 00/56897
2 PCT / FR00 / 00714 plant O-methyltransferase class II gene (hereinafter COMT II).
Class II O-methyltransferase genes; whose gene for caffeic acid-O-Class II methyltransferase, plants are silent (inactive) in the absence of any aggression since the non-aggressed plants do not express it, or for the less at levels undetectable by usual analysis methods. So the messenger of the COMT II is undetectable by the technique of "Northern blot" in different fabrics a healthy untreated plant, such as tobacco (Pellegrini & al., 1993).
This COMTII and its promoter are activated (or induced) by injuries, infections viral, assaults with UV rays, or chemical assaults by different products like benzothiazole (BTH), methyl jasmonate or elicitors of plant origin such as pectin.
Advantageously, the isolated nucleic acid fragment according to the invention East consisting of a COMTII plant promoter.
By COMTII of plant is understood according to the invention any OMT of plant which is not not expressed in healthy untreated plants, but is expressed as a result of a mechanical, chemical attack by a pathogen, an insect or a nematode.
By COMTII plant of origin, we mean according to the invention any organism differentiated multicellular capable of photosynthesis, whether monocot or dicot, such as rice, wheat, barley, sunflower, corn, tobacco, rapeseed, soybeans or Arabidopsis thaliana.
According to a particular embodiment of the invention, the COMT II is a COMT of dicotyledonous plant, preferably tobacco.
By promoter is meant according to the invention the non-coding region of a gene involved in binding with RNA polymerase and other factors that are responsible for initiating and modulating transcription leading to the production of an RNA transcript. It is more particularly about any 5 'sequence of the translation initiation site or codon "start" (ATG) of the sequence coding of COMTII allowing the transcription and expression of said sequence coding.
The promoter according to the invention advantageously comprises one more sequence 600 nucleotides upstream of the COMT II ATG, preferably more than 70.0, from more than 800 or even more than 900 nucleotides upstream of the ATG, more preferably more than 1000 nucleotides upstream of the ATG, even more WO 00/56897

3 PCT/FR00/00714 préférentiellement de plus de 1200 nucléotides en amont de l'ATG. Les promoteurs comprenant plus de 1500 nucléotides en amont de l'ATG de la COMTII font également partie de la présente invention.
Le promoteur comprend un site d'initiation de la transcription. Le site d'initiation S de la transcription est généralement situé à moins de 100 nucléotides en amont de l'ATG, avantageusement à environ 90 nucléotides en amont.
De manière avantageuse, l'extrémité 3' du promoteur COMTII selon l'invention est située entre le site d'initiation de la transcription et l'ATG. De préférence, l'extrémité 3' du promoteur COMTII est située entre 10 et 50 nucléotides en aval du site d'initiation de la transcription, plus préférentiellement entre 20 et 40 nucléotides en aval, encore plus préférentiellement entre 20 et 30 nucléotides en aval.
Le promoteur COMTII selon l'invention comprend également au moins une boite TATA et au moins une boite CAT. La boite TATA est généralement située à moins de 50 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription, à environ 40 nucléotides en amont. La boite CAT est généralement située à moins de 100 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription, de préférence à environ 100 nucléotides et/ou 80 nucléotides en amont. De manière avantageuse, le promoteur comprend deux boites CAT.
Le promoteur selon l'invention comprend également des éléments régulateurs impliqués dans l'expression de gènes du métabolisme des phénylpropanoïdes et des gènes associés à la défense, en particulier au moins une boite A et/ou au moins une boite L et/ou au moins une boite L inversée et/ou au moins une boite P et/ou au moins une boite W inversée. La boite A comprend la séquence suivante CCGTCC. Elle est généralement située à moins de 410 nucléotides du site d'initiation de la transcription.
La boite L comprend la séquence suivante CTTCAACAACCAACC. Elle est généralement située à moins de 180 nucléotides du site d'initiation de la transcription.
La première boite L inversée comprend la séquence suivante GTTAGGTGAAG. Elle est généralement située à moins de 1000 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. Avantageusement, le promoteur selon l'invention comprend deux boites L
inversées, l'une à environ 970 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription et l'autre à environ 440 nucléotides en amont. La deuxième boite L
inversée comprend la séquence suivante TGTTAGGTGTGTGTTT. La boite P

WO 00/56897
3 PCT / FR00 / 00714 preferably more than 1200 nucleotides upstream of the ATG. The promoters comprising more than 1,500 nucleotides upstream of the COMTII ATG
also part of the present invention.
The promoter includes a transcription initiation site. The site initiation S of transcription is generally located less than 100 nucleotides in upstream of ATG, advantageously about 90 nucleotides upstream.
Advantageously, the 3 ′ end of the COMTII promoter according to the invention is located between the transcription initiation site and the ATG. Of preference, the 3 'end of the COMTII promoter is located between 10 and 50 nucleotides in downstream of the site transcription initiation, more preferably between 20 and 40 nucleotides in downstream, even more preferably between 20 and 30 nucleotides downstream.
The COMTII promoter according to the invention also comprises at least one box TATA and at least one CAT box. The TATA box is generally located at least of 50 nucleotides upstream of the transcription initiation site, about 40 nucleotides upstream. The CAT box is generally located less than 100 nucleotides in upstream transcription initiation site, preferably about 100 nucleotides and / or 80 nucleotides upstream. Advantageously, the promoter comprises two boxes CAT.
The promoter according to the invention also comprises regulatory elements involved in the expression of genes for the metabolism of phenylpropanoids and of defense-associated genes, in particular at least one A and / or minus a box L and / or at least one reverse L box and / or at least one P box and / or at minus one reverse W box. Box A includes the following sequence CCGTCC. She is generally located less than 410 nucleotides from the initiation site of the transcription.
Box L includes the following sequence CTTCAACAACCAACC. She is generally located less than 180 nucleotides from the initiation site of the transcription.
The first reverse L box includes the following sequence GTTAGGTGAAG. She is generally located less than 1000 nucleotides upstream of the site initiation of the transcription. Advantageously, the promoter according to the invention comprises two boxes L
inverted, one about 970 nucleotides upstream of the initiation site of the transcription and the other about 440 nucleotides upstream. The second box L
reverse includes the following sequence TGTTAGGTGTGTGTTT. The P box WO 00/56897

4 PCT/FR00/00714 comprend la séquence suivante CACACCAACTCCCA. Elle est généralement située à
moins de 750 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. La boite W
inversée comprend la séquence suivante GGTCAA. Elle est généralement située à
moins de 1200 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription.
Avantageusement, le promoteur selon l'invention comprend deux boites W
inversées, l'une à environ 1110 nucléotides en amont et l'autre à erz~iron 210 nucléotides en amont.
Le promoteur selon l'invention comprend également au moins une boite E et/ou au moins une boite G et/ou au moins une boite GT. La boite E comprend la séquence suivante TTCCATCAAG. Elle est généralement située à moins de 110 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. La boite G comprend la séquence suivante CCACGT. Elle est généralement située à moins de 600 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. La boite GT comprend la séquence suivante GGTTAA.
Elle est généralement située à moins de 450 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. Avantageusement, le promoteur selon l'invention comprend deux boites GT, l'une à environ 400 nucléotides en amont et l'autre à environ 280 nucléotides en amont.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, le promoteur selon l'invention est constitué par le promoteur COMTII de tabac défini par la séquence nucléotidique en amont de l'ATG représentée par l'identificateur de séquence 1 (SEQ
ID NO 1 ). De préférence le promoteur COMTII de tabac comprend la séquence comprise entre les nucléotides 557 et 1795 de la SEQ ID NO l, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues.
Préférentiellement le promoteur COMTII de tabac comprend la séquence comprise entre les nucléotides 557 et 889 de la SEQ ID NO l, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues. Le promoteur inductible COMTII de tabac est activé par par les blessures, les infections virales, les agressions aux rayons UV, ou aux agressions chimiques par différents produits comme le benzothiazole (BTH), le méthyle jasmonate ou des éliciteurs d'origine végétale comme la pectine. L'étude fonctionnelle du promoteur a permis d'identifier les regions impliquées dans l'induction du promoteur dans différentes conditions. Le fragment comprenant la séquence comprise entre les nucléotides 698 à 1365 est nécessaire et WO 00/56897
4 PCT / FR00 / 00714 includes the following sequence CACACCAACTCCCA. It is usually located less than 750 nucleotides upstream from the transcription initiation site. The box W
reverse includes the following sequence GGTCAA. It is usually located less than 1200 nucleotides upstream of the transcription initiation site.
Advantageously, the promoter according to the invention comprises two boxes W
reversed, one at around 1110 nucleotides upstream and the other at erz ~ iron 210 nucleotides in upstream.
The promoter according to the invention also comprises at least one E box and / or at least one G box and / or at least one GT box. Box E includes the sequence following TTCCATCAAG. It is generally located less than 110 nucleotides in upstream of the transcription initiation site. Box G includes the next sequence CCACGT. It is generally located less than 600 nucleotides upstream of the site transcription initiation. The GT box includes the following sequence GGTTAA.
It is generally located less than 450 nucleotides upstream from the site initiation of the transcription. Advantageously, the promoter according to the invention comprises two boxes GT, one about 400 nucleotides upstream and the other about 280 nucleotides in upstream.
According to an advantageous embodiment of the invention, the promoter according to the invention consists of the COMTII tobacco promoter defined by the sequence nucleotide upstream of the ATG represented by the sequence identifier 1 (SEQ
ID NO 1). Preferably the COMTII tobacco promoter comprises the sequence between nucleotides 557 and 1795 of SEQ ID NO 1, the sequences capable to selectively hybridize to said sequences and their sequences counterparts.
Preferably the COMTII tobacco promoter comprises the sequence included Between nucleotides 557 and 889 of SEQ ID NO 1, the sequences capable of hybridize selectively to said sequences and their homologous sequences. The promoter COMTII tobacco inducible is activated by injuries, infections viral, the UV attack, or chemical attack by different products as benzothiazole (BTH), methyl jasmonate or original elicitors vegetable like pectin. The promoter's functional study identified the regions involved in the induction of the promoter under different conditions. The fragment comprising the sequence between nucleotides 698 to 1365 is necessary and WO 00/56897

5 PCT/FR00/00714 suffisant pour conférer la sensibilité et l'induction par blessure, par le VMT, la mégaspermine, la pectine et la chitine. Préférentiellement le promoteur ÇOMTII
de tabac comprend donc la séquence comprise entre les nucléotides 698 et 1365 de la SEQ
ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues. Ce fragment peut être associé à un autre promoteur pour induire l'expression d'un gène par blessure, par le VMT, la mégaspermine, la pectine ou la chitine. Ce fragment peut ainsi être associé au promoteur minimum du RNA 355 du CaMV. La présente invention a donc également pour objet un promoteur chimère comprenant la séquence comprise entre les nucléotides 698 et 1365 de la SEQ ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues. L'analyse de la réponse du promoteur vis à vis du méthyl jasmonate et les UV indique que le fragment comprenant la séquence comprise entre les nucléotides 815 et 1795 de la SEQ ID

est fonctionnel. Dans un mode de réalisation avantageux, le promoteur COMTII
de tabac comprend donc la séquence comprise entre les nucléotides 815 et 1795 de la SEQ
ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues.
Par « séquence capable de s'hybridiser de manière sélective », on entend selon l'invention les séquencesqui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau suppérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à
l'hybridiqtion d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybridiser de manière sélective et les séquences définies par les séquence ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple , par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCI
0,03 M
et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C-60°C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook &
al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).
Par séquence homologue, on entend selon l'invention toute séquence comprenant WO 00/56897
5 PCT / FR00 / 00714 sufficient to impart sensitivity and induction by injury, by the VMT, the megaspermine, pectin and chitin. Preferably the promoter ÇOMTII
of tobacco therefore comprises the sequence between nucleotides 698 and 1365 of the SEQ
ID NO 1, the sequences capable of hybridizing selectively to the said sequences and their homologous sequences. This fragment can be associated with a other promoter to induce expression of a gene by injury, by VMT, the megaspermine, pectin or chitin. This fragment can thus be associated with minimum promoter of CaMV RNA 355. The present invention therefore also has relates to a chimeric promoter comprising the sequence between nucleotides 698 and 1365 of SEQ ID NO 1, the sequences capable of hybridizing to way selective to said sequences and their homologous sequences. Analysis of the reply of the promoter with respect to methyl jasmonate and the UV indicates that the fragment comprising the sequence between nucleotides 815 and 1795 of SEQ ID

is functional. In an advantageous embodiment, the COMTII promoter of tobacco therefore comprises the sequence between nucleotides 815 and 1795 of the SEQ
ID NO 1, the sequences capable of hybridizing selectively to the said sequences and their homologous sequences.
By "sequence capable of hybridizing selectively" is meant according to the invention the sequences which hybridize with the above sequences to a level significantly higher than background noise. Background noise can be linked to the hybridization of other DNA sequences present, in particular other cDNAs present in a cDNA library. The signal level generated by the interaction enter here sequence capable of selectively hybridizing and the sequences defined by The above sequence ID according to the invention is generally 10 times, from preferably 100 times more intense than that of the interaction of other DNA sequences generating the noise of background. The level of interaction can be measured, for example, by marking the probe with radioactive elements, like 32P. Selective hybridization is usually obtained using very harsh environmental conditions (e.g. NaCI
0.03M
and 0.03 M sodium citrate at about 50 ° C-60 ° C). Hybridization can of course be carried out according to the usual methods of the state of the art (in particular Sambrook &
al., 1989, Molecular Cloning: A Labratory Manual).
By homologous sequence is meant according to the invention any sequence comprising WO 00/56897

6 PCT/FR00/00714 plus de 70 % d'homologie, préférentiellemént plus de 80 % d'homologie, encore plus préférentiellement plus de 90 % d'homologie, et qui conserve les éléments fonctionnels du COMTII lui conférant ses propriétés de promoteur inductible. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol. Evol. 36 :290-300 ;
Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).
L'isolement, le clonage et la caractérisation des promoteurs COMT II à partir des gènes de COMT II se fait selon les méthodes expérimentales usuelles de l'homme du métier pour isoler, cloner et caractériser un promoteur, abondamment décrites dans la littérature.
L'isolement et le clonage d'un gène COMT II se fait par analyse d'une banque génomique préparée à partir de l'ADN de la plante d'intérêt. L'ADN génomique est coupée par une ou plusieurs enzymes de restriction appropriées et introduit dans un vecteur adéquat pour constituer, par des méthodes connues de l'homme du métier, une banque contenant l'ensemble du DNA génomique de la plante (Ausubel et al., 1998;
Sambrook et al., 1989).
Le ou les clones renfermant un gène COMT II est (sont) isolés) grâce à une sonde nucléotidique. La séquence de la sonde est. soit déduite de la séquence protéique si l'enzyme a été purifiée (en suivant son activité, par exemple), soit préparée à partir d'un clone de cDNA issu d'une banque. Cette banque de cDNA est préparée à partir de mRNA extrait de tissus traités de façon à induire l'expression du gène COMT II
(par la blessure, l'infection ou un traitement chimique comme décrit dans les exemples ou les figures 1-5). La banque de cDNA est ensuite criblée par des anticorps dirigés contre une protéine COMT II (de tabac par exemple) ou par une sonde nucléotidique déduite de la protéine COMT II de la plante considérée ou déduite des séquences conservées chez les COMT de plantes. Le cDNA ainsi isolé est caractérisé par sa séquence nucléotidique ou par l'activité enzymatique de la protéine recombinante obtenue après expression du cDNA dans un organisme procaryote ou eucaryote.
Les séquences non codantes du cDNA (3' et/ou 5') sont utilisées pour sélectionner, par PCR, en conditions très sélectives, le ou les clones génomiques renfermant le gène COMT II exprimé lors du traitement utilisé pour construire la banque cDNA. Les WO 00/5689
6 PCT / FR00 / 00714 more than 70% homology, preferably more than 80% homology, again more preferably more than 90% homology, and which retains the elements functional COMTII giving it its properties as an inducible promoter. The methods of measurement and identification of homologies between acid sequences nucleic acids are well known to those skilled in the art. One can use for example the programs PILEUP or BLAST (in particular Altschul & al., 1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300;
Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10).
Isolation, cloning and characterization of COMT II promoters from of COMT II genes are made according to the usual experimental methods of man of profession to isolate, clone and characterize a promoter, abundantly described in the literature.
COMT II gene isolation and cloning is done by bank analysis genomics prepared from the DNA of the plant of interest. Genomic DNA
East cut by one or more suitable restriction enzymes and introduced in one suitable vector for constituting, by methods known to those skilled in the art profession, a library containing all of the plant's genomic DNA (Ausubel et al., 1998;
Sambrook et al., 1989).
The clone (s) containing a COMT II gene is (are) isolated) thanks to a probe nucleotide. The probe sequence is. be deduced from the sequence protein if the enzyme has been purified (by following its activity, for example), or prepared from a cDNA clone from a bank. This cDNA bank is prepared from mRNA extracted from tissues treated to induce expression of the COMT II gene (over there injury, infection or chemical treatment as described in the examples where the Figures 1-5). The cDNA library is then screened by directed antibodies against a COMT II protein (from tobacco for example) or by a deduced nucleotide probe of the COMT II protein of the plant considered or deduced from the conserved sequences at the COUNT of plants. The cDNA thus isolated is characterized by its sequence nucleotide or by the enzymatic activity of the recombinant protein obtained after expression of cDNA in a prokaryotic or eukaryotic organism.
The non-coding sequences of cDNA (3 'and / or 5') are used to to select, by PCR, under very selective conditions, the genomic clone (s) containing the gene COMT II expressed during the processing used to build the cDNA library. The WO 00/5689

7 ~ PCT/FR00/00714 séquences promotrices sont alors être isolées par PCR ou toute autre méthode appropriée bien connue de l'homme du métier.
Sur la base des informations contenues dans la présente demande de brevet pour le promoteur COMTII de tabac, l'homme du métier sera à même d'identifier d'autres promoteurs COMTII d'autres espèces végétales une fois le gène COMTII identifié
et cloné selon les méthodes usuelles, notamment celles décrites ci-dessus.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5', une séquence codante et une séquence de régulation en 3', la séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur COMT II selon l'invention défini auparavant.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
I S On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à
sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.
Comme séquence de régulation en 5', on peut utiliser le promoteur COMTII selon l'invention seul ou associé à au moins une partie d'un promoteur d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé.
Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311).
On peut encore utiliser le promoteur COMTII selon l'invention en association avec au moins une partie d'un promoteur spécifique de régions ou de tissus particuliers WO 00/56897 g PCT/FR00/00714 des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ([22] Datla, R.& al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269-296), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO
92/17580), de l'albumine (WO 98/45460) ou de l'oélosine (WO 98/45461).
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec le promoteur COMTII selon l'invention, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (VET) décrit par Carrington & Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La séquence codante du gène chimère selon l'invention comprend une séquence codante pour un gène rapporteur, comme la séquence codante GUS, ou une séquence codante pour une protéine d' intérêt. Au regard du mode d' induction du promoteur selon l'invention, blessure, infection virale ou réponse à des éliciteurs, la protéine d'intérêt est avantageusement une protéine conférant aux plantes des propriétés de résistance aux maladies ou aux insectes.
Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérrêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; Panabières & al., 1995). De manière préférentielle, le peptide éliciteur fongique est la mégaspermine. La mégaspermine et sa séquence codante est représentée par l'identificateur de séquence n° 13 (SEQ ID 13). De manière plus préférentielle, le gène chimère selon l'invention comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur COMT II
et une séquence codante pour la mégaspermine comprend la séquence d'ADN
représentée par l'identificateur de séquence n° 14 (SEQ ID 14).
Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5', une séquence codante pour un éliciteur et une séquence de régulation en 3', la séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur inductible.
De manière préférentielle, l'éliciteur est une élicitine, plus préférentiellement la mégaspermine telle que définie ci-dessus.
Le promoteur inductible est avantageusement choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US 5 670 349, Tableau 3), le promoteur HMG2 (US 5 670 349), le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme (WO
98/45445).
La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation des cellules végétales ou des plantes contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué
par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui WO 00/56897 1~ PCT/FR00/00714 peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, le gène chimère selon l'invention peut être employé en association avec un gène marqueur de sélection, soit dans un même vecteur, les deux gènes étant associés de manière convergente, divergente ou colinéaire, ou encore dans deux vecteurs employés simultanément pour la transformation de l'organisme hôte. De tels gènes marqueurs et leur utilisation pour la transformation des plantes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP
242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales par intégration au génome des dites cellules végétales d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l' invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales ou plantes transformés et contenant un gène chimère défini ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US
4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US
4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US
5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US
5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP
486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, le tournesol, la betterave, le trèfle, etc.
Les plantes transformées selon l'invention peuvent contenir d'autres gènes d'intérêt, conférant aux plantes de nouvelles propriétés agronomiques. Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une tolérance à
certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies . De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128. On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés ([1]; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO
95/31554 ;

WO 94/2082
7 ~ PCT / FR00 / 00714 promoter sequences are then to be isolated by PCR or any other method suitable well known to those skilled in the art.
Based on the information contained in this patent application for the COMTII tobacco promoter, those skilled in the art will be able to identify other COMTII promoters of other plant species once the COMTII gene has been identified and cloned according to the usual methods, in particular those described above.
The present invention also relates to a chimeric gene (or cassette expression) functional in plant cells and plants including in the sense of transcription a 5 'regulatory sequence, a sequence coding and a 3 'regulatory sequence, the 5' regulatory sequence comprising a promoter COMT II according to the invention defined above.
By "plant cell" is meant according to the invention any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, tissues differentiated such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
IS The term "plant" according to the invention means any multicellular organism differentiated capable of photosynthesis, in particular monocots or dicots, more particularly crop plants intended or not intended for food animal or human, such as corn, wheat, rapeseed, soy, rice, cane sugar, beet, tobacco, cotton, etc.
As a 5 ′ regulatory sequence, the COMTII promoter can be used according to the invention alone or associated with at least part of a promoter of a gene speaking naturally in plants especially a promoter expressing itself especially in plant leaves, such as so-called promoters original bacterial, viral or plant or so-called light promoters addicted like that of a gene for the small ribulose subunit-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) plant or any known suitable promoter that can be used.
Among promoters of plant origin include histone promoters such as described in EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US 5,641,876). Among the promoters of a plant virus gene, that of the mosaic of cauliflower (CAMV 19S or 35S), or the promoter of the circovirus (AU 689 311).
The COMTII promoter according to the invention can also be used in combination with at least part of a region or tissue specific promoter individuals WO 00/56897 g PCT / FR00 / 00714 plants, and more specifically seed promoters ([22] Datla, R. & al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269-296), in particular the promoters of the napine (EP 255 378), phaseoline, glutenin, heliantinine (WO
92/17580), albumin (WO 98/45460) or oelosin (WO 98/45461).
According to the invention, it is also possible to use, in combination with the promoter COMTII according to the invention, other regulatory sequences, which are located between the promoter and coding sequence, such as transcription activators ("enhancer"), such as the translational activator of the mosaic of tobacco (VMT) described in application WO 87/07644, or the etch tobacco virus (VET) described by Carrington & Freed.
As terminating or polyadenylation regulatory sequence, use any corresponding sequence of bacterial origin, such as example the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, or of plant origin, like example a histone terminator as described in application EP 0 633 317.
The coding sequence of the chimeric gene according to the invention comprises a sequence coding for a reporter gene, such as the coding sequence GUS, or a sequence coding for a protein of interest. Regarding the induction mode of promoter according to invention, injury, viral infection or response to elicitors, the protein of interest is advantageously a protein conferring on plants properties of resistance to diseases or insects.
Among the proteins or peptides of interest conferring new properties of resistance to diseases include chitinases, glucanases, oxalate oxidase, all of these proteins and their coding sequences being largely described in literature, or even antibacterial and / or antifungal peptides, in especially the peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, and more particularly the lytic peptides of all origins comprising one or more disulfide bridges between cysteines and regions comprising basic amino acids, in particular lytic peptides following androctonine (WO 97/30082 and PCT / FR98 / 01814, filed on August 18, 1998) or drosomicin (PCT / FR98 / 01462, filed July 8, 1998).
According to a preferred embodiment of the invention, the protein or peptide of interest is chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun & al., 1993; Panabières & al., 1995). Preferably, the peptide fungal elicitor is megaspermine. Megaspermine and its coding sequence East represented by sequence identifier No. 13 (SEQ ID 13). Of way more preferential, the chimeric gene according to the invention comprising, in the sense of the transcription of a 5 'regulatory sequence comprising a COMT II promoter and a coding sequence for megaspermine includes the DNA sequence represented by sequence identifier No. 14 (SEQ ID 14).
Among the proteins of interest conferring new resistance properties to the insects, more particularly the Bt proteins widely described in the literature and well known to those skilled in the art. We will also mention the proteins extracted bacteria such as Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
The present invention also relates to a chimeric gene (or cassette expression) functional in plant cells and plants including in the sense of transcription a 5 'regulatory sequence, a sequence coding for a elicitor and a 3 'regulatory sequence, the 5' regulatory sequence including an inducible promoter.
Preferably, the elicitor is an elicitin, more preferably the megaspermine as defined above.
The inducible promoter is advantageously chosen from the promoters of phenylalanine ammonia lyase (PAL), HMG-CoA reductase (HMG), chitinases, of glucanases, proteinase inhibitors (PI), genes of the PR1 family, nopaline synthase (nos) or the vspB gene (US 5,670,349, Table 3), the HMG2 promoter (US 5 670 349), the promoter of apple beta-galactosidase (ABG1) or the promoter of apple amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) (WO
98/45445).
The present invention also relates to a cloning vector and / or of expression for the transformation of plant cells or plants containing at minus one chimeric gene as defined above. This vector also includes uncomfortable above chimera, at least one origin of replication. This vector can be constituted by a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention. Such vectors of transformation are well known to those skilled in the art and widely described in the literature. For the transformation of plant cells or plants, this will include of a virus that WO 00/56897 1 ~ PCT / FR00 / 00714 can be used for the transformation of developed plants and containing in addition its own elements of replication and expression. So preferential, the vector transformation of plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
For the transformation of plant cells or plants, the chimeric gene according to the invention can be used in association with a marker gene for selection, either in the same vector, the two genes being convergently associated, divergent or collinear, or in two vectors used simultaneously for the transformation of the host organism. Such marker genes and their use for the transformation of plants are well known to those skilled in the art and widely described in the litterature.
Among the genes coding for selection markers, mention may be made of genes of antibiotic resistance, herbicide tolerance genes (bialaphos, glyphosate or isoxazoles), genes coding for reporter enzymes easily identifiable as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells. Of such selection marker genes are described in particular in the applications for EP patent 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
The invention also relates to a method for transforming cells.
plants by integration into the genome of said plant cells of at least one uncomfortable chimera as defined above, transformation which can be obtained by any means known appropriate, amply described in the specialized literature and in particular the references cited in the present application, more particularly by the vector according to the invention.
A series of methods involves bombarding cells, protoplasts or of tissues with particles to which the DNA sequences are attached. A
other series of methods is to use as a means of transfer into the plant a gene chimera inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes. Other methods can be used such that the microphone injection or electroporation, or even direct precipitation by means of PEG.
Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the nature of the host organism, in particular the plant cell or the plant.
The present invention also relates to plant cells or plants transformed and containing a chimeric gene defined above.
The present invention also relates to plants containing cells transformed, especially plants regenerated from cells transformed. The regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above. For the processes of transformation of plant cells and plant regeneration, we will quote including the following patents and patent applications: US 4,459,355, US
4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US
4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US
5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US
5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP
486,234, EP 539,563, EP 674,725, WO 91/02071 and WO 95/06128.
The present invention also relates to the transformed plants derived from the cultivation and / or crossing of the above regenerated plants, as well as seeds transformed plants.
The transformed plants obtainable according to the invention can be of monocotyledonous type such as for example cereals, sugar cane, rice and corn or dicot such as tobacco, soy, rapeseed, cotton, the sunflower, beet, clover, etc.
The plants transformed according to the invention may contain other genes of interest, giving plants new agronomic properties. Among the genes conferring new agronomic properties on transformed plants, we can quote genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring tolerance to certain insects, those which confer tolerance to certain diseases. Such genes are in particular described in patent applications WO 91/02071 and WO 95/06128. We may also cite the genes modifying the constitution of plants modified, in in particular the content and quality of certain essential fatty acids (EP 666 918) or still the protein content and quality, especially in leaves and / or seeds of said plants. Mention will in particular be made of the genes coding for protein enriched with sulfur amino acids ([1]; WO 98/20133; WO 97/41239; WO
95/31554;

WO 94/2082

8 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à
une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998.
Ces autres gènes d'intérêt peuvent être combinés au gène chimère selon l'invention soit par croisement conventionnel de deux plantes contenant chacune l'un des gènes (la première le gène chimère selon l'invention et la seconde le gène codant pour la protéine d'intérêt) soit en effectuant la transformation de cellules végétales d'une plante contenant le gène codant pour la protéine d'intérêt avec le gène chimère selon l'invention.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à
en limiter la portée.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocole in Molecular Biology"
Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al ou dans Sambrook et al 1989.
Description de la figure 1 : Cinétiques d'activités GUS (lA) correspondant à
la construction promoteur COMTII(-1215 à +24)/GUS et COMTII (1B) au cours d'une infection virale (VMT) ou lors d'une blessure.
Exemple 1 : Isolement du gène COMT de classe II
Le criblage d'une banque génomique de tabac a permis d'isoler 6 clones différents contenant des gènes de COMT de classe II (COMTII). Ces derniers ont d'abord été
caractérisés par leurs profils de restriction qui ont révélé une certaine hétérogénéité

parmi les différents clones.
Les COMTII forment une famille multigénique composée de six à sept gènes dont un seul est transcrit dans les réactions de défense puisqu'un seul type d'ADNc a été
caractérisé dans une banque élaborée à partir de feuilles inoculées par le virus de la S mosaïque du tabac (VMT) (Pellegrini & al. 1993). Afin d'identifier le ou les clones renfermant le gène exprimé lors des réactions de défense, des réactions PCR
ont été
réalisées en utilisant des amorces dérivées de la région 3' non codante de l'ADNc. Dans des conditions de sélectivité élevée un seul clone est alors amplifié. Les produits d'amplifications ont été séquencés. Les séquences obtenues ont présenté une homologie parfaite avec celles des régions 3' non codantes de l'ADNc.
Exemple 2 : Analyse des séquences du promoteur de gène de la COMT de classe II
Le clone génomique retenu a été sous-cloné dans un vecteur bactérien (puc 18) et représente un insert de 14 kb dont 9 kb sont situés en amont de l'ATG du gène COMTII.
Le site d'initiation de la transcription a été déterminé par la technique d'extension d'amorce et il se place a 90 nucléotides du site d'initiation de la traduction.
Le promoteur a été séquencé sur une longueur de 1771 kilobases. Des éléments non spécifiques et communs aux gènes eucaryotes impliqués dans l'initiation de la transcription tels la TATA box et la CAT box ont été retrouvés dans le promoteur COMTII (SEQ ID NO 1 ). Des sites de régulation ont été mis en évidence par comparaison des séquences promotrices du gène COMTII avec celles de gènes intervenant dans les mécanismes de défense. Le promoteur COMTII contient des éléments spécifiques des gènes du métabolisme des phénylpropanoïdes impliqués dans la réponse au stress comme les trois boîtes P, A, L (initialement identifiées dans le gène PAL de persil) (SEQ ID NO 1). Ces trois boîtes sont impliquées dans la réponse aux éliciteurs et les boîtes P et L sont également impliquées dans la réponse aux UV. La boîte E initialement identifiée dans le gène de la CCoAOMT de persil et extrêmement conservée dans les gènes du métabolisme des phénylpropanoïdes joue aussi un rôle dans la réponse aux éliciteurs.
Le promoteur COMTII possède également des éléments jouant un rôle important dans l'induction de gènes PR par les éliciteurs telle la boîte W (SEQ ID NO 1 ).

Des éléments régulateurs généraux sont retrouvés dans le promoteur de la COMTII telles les boîtes G, GT et l'élément activateur du virus simiens SV40 (SEQ ID
NO 1). La boîte G est un élément présent dans une grande variété de promoteurs végétaux. La boîte G, associée à des éléments cis spécifiques, est impliquée dans la régulation de nombreux gènes répondant à différents signaux physiologiques et environnementaux. La région promotrice, responsable de la,,régulation de gènes par le méthyle jasmonate, est constituée d'une boîte G associée à des séquences riches en nucléotides C. Une organisation similaire est retrouvée au niveau du promoteur de gènes spécifiquement induits lors de la blessure. Les boîtes L, présentes dans le promoteur de la COMTII, pourraient intervenir dans ce genre d'interactions car ce sont des motifs riches en nucléotides C.
Les boîtes GT, représentées plusieurs fois dans les promoteurs, semblent jouer un rôle dans la modulation de l'expression de certains gènes végétaux, soit en tant qu'activateur ou en tant que répresseur.
Exemple 3 : Analyse fonctionnelle des régions promotrices du gène COMTII
L'analyse fonctionnelle du promoteur COMTII a été réalisée par transgénèse en expression stable. Le transgène a été obtenu par fusion transcriptionnelle entre le promoteur et un gène rapporteur, le gène GUS ((3-glucuronidase). Quatre constructions correspondant à différentes délétions du promoteur ont été réalisées afin de préciser la nature des séquences promotrices importantes responsables de la régulation du gène.
Ces constructions correspondent aux séquences promotrices de -1215 à +24 paires de bases (bp), de -420 à +24 bp, de -313 à +24bp et de -121 à +24 bp (par rapport au site +1 de la transcription), 557 à 1795, 1352 à 1795, 1459 à 1795 et 1651 à 1795 respectivement sur la SEQ ID NO 1 introduites en amont du gène GUS dans le vecteur pBi101 (Clontech).
Les différentes constructions ont été introduites via Agrobacterium tumefaciens dans le génome des plantes. Une population d'une dizaine de plants de tabac transformés a été régénérée pour chaque construction. Le niveau d'expression du transgène a été
déterminé par dosage de l'activité enzymatique et par des tests histochimiques.
Parallèlement l'expression des gènes COMTII a été analysée par mesure de l'activité des enzymes correspondantes.

Résultats:
L'activité GUS a été testée dans ces plantes dans différentes conditions d'induction des réactions de défense, par un éliciteur fongique injecté dans les feuilles (mégaspermine), ou après exposition aux UV. Les résultats obtenus sont rapportés dans les Tableaux I et 2 ci-dessous. L'activité GUS est exprimée en pmole MU/min.
mg.
Pour le Tableau I, le témoin (T) est constitué par l'infiltration d'eau dans les feuilles des plantes transformées. Des plantes contrôles transformées avec un vecteur vide avaient une activité d'environ 10-30 pmoles/min.mg. Pour le Tableau 2, le témoin (T) correspond à l'activité GUS basale dans les plantes non traitées.
Tableau 1 - Expression de l'activité GUS correspondant aux différentes constructions COMT II/GUS : induction par la mégaspermine Activit GUS

Construction COMT II/GUST Mgaspermine COMT II -1215 +24 150 1150 COMT II -420 +24 2 6 COMT II -313 +24 0,4 0,8 COMT II -121 +24 0,2 0,8 Tableau 2 - lJxpression de l'activité GUS correspondant aux différentes constructions COMT II/GUS : induction aux UV
Activit GUS

Construction COMT II/GUST UV

COMT II -1215 +24 90 900 COMT II -420 +24 10 12 COMT II -313 +24 10 11 COMT II -121 +24 1 I I 0 I S Ces résultats montrent que la taille du promoteur doit être supérieure à
600pb, en l'occurrence 1239 bp pour permettre l'induction et une forte expression du gène GUS.
Les délétions du promoteurs correspondant aux constructions (-420 à +24), de (-313 à
+24) et de (-121 à +24) provoquent une perte complète de l'expression du gène GUS
dans toutes les conditions testées. L'activité du gène GUS sous le contrôle du promoteur de 1239 pb est 1000 fois supérieure à celle observée pour les autres constructions.

Activation du promoteur de la COMTII par la blessure et le méthyle jasmonate et par des éliciteurs d'origine et de nature variées.
Les plantes transgéniques possédant la construction COMTII(- 1215 à +24)/GUS
ont été traitées avec différents produits chimiques, régulateurs des réactions de défense, par l'acide salicylique (SA) et le méthyl-2-6-dichloroisonicotinique (INA), par des éliciteurs fongiques comme des glucanes ou des fragments de chitine et un éliciteur d'origine végétale comme la pectine. L'activité GUS a été mesurée dans les feuilles 16h après infiltration de ces composés et les résultats rapportés dans le Tableau 3 ci-dessous.
L'activité GUS est exprimée en pmole MU/min.mg. Le témoin (T) correspond à
l'activité GUS basale dans les plantes transformées non traitées.
Tableau 3 - Induction de l'activité GUS par des éliciteurs Activit GUS Induction SA (1mM) 1200 200 INA (1mM) 1700 200 Chitines (100~g/ml) 1200 200 Glucanes (ZOOpg/ml) 1400 200 Pectines (200~,g/ml)3700 600 L'augmentation la plus forte de l'activité GUS (de l'ordre de 3) est obtenue dans les plantes infiltrées par des fragments pectiques par rapport au contrôle.
L'induction du promoteur de 1239 pb a été étudiée lors de la blessure ou après traitement par le méthyle jasmonate (molécule jouant un rôle dans la signalisation des réponses de défense lors de la blessure) et par le benzothiadiazole (BTH) (inducteur chimique de la SAR). L'activité GUS est mesuré 16h après traitement. Les résultats sont rapportés sur le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 - Induction de l'activité GUS par différents composés et stress Induction de l'activit GUS

WO 00/56897 1~ PCT/FR00/00714 Blessure 600 Mthyle jasmonate 1450 Le tmoin fTl correspond 1 ~'aCtlVtiPi~rTJ~(IPC n~antPC nnn traitPPe T P nrnmntPr est activé par les différents traitements.
Les facteurs d'induction varient de 2,5 (BTH) à 14,5 (méthyle jasmonate).
Activation du promoteur de la COMTII lors de l'infection virale.
L'inoculation du VMT chez le tabac nécessite la production de micro blessures au niveau des feuilles permettant l'entrée du virus et sa multiplication.
L'activité GUS et l'activité COMTII ont été mesurées dans les feuilles blessées et dans les feuilles inoculées par le virus. Les résultats (figure 1 ) montrent que le gène GUS
sous le contrôle du promoteur COMTII a une cinétique d'induction identique à celle du gène COMTII endogène, suivie par la mesure de l'activité catalytique des protéines correspondantes. Le promoteur COMTII est induit précocement par la blessure et présente un maximum d'activité à 16h. Le même pic d'activité est observé à 16h au cours de l'infection virale et est dû à la blessure des feuilles provoquée par l'inoculation du virus. Dans les feuilles inoculées, l'activité GUS est fortement stimulée à
partir du Sème jour et progresse jusqu'au 7ème jour. L'induction locale et systémique du promoteur lors de l'infection virale a été mesurée à 3 et 7 jours après l'inoculation du VMT. Les activités GUS exprimées en pmol MU/min.mg, sont rapportées dans le Tableau 5 et représentent une moyenne des valeurs obtenues dans 9 transformants. Le témoin T correspond à l'activité GUS des plantes non traitées.

WO 00/56897 1 g PCT/FR00/00714 Tableau 5 - Induction locale et systémique (SAR) de l'activité GUS
Activit GUS

Feuilles inocules aprs 3 jours 3800 Feuilles inocules aprs 7 jours 7100 Feuilles SAR aprs 7 jours 2700 Ces résultats montrent une induction de 1100% du promoteur à 7 jours dans les feuilles inoculées. L'activité GUS mesurée à 7 jours dans les feuilles SAR est plus faible mais très significative. Cependant, dans les feuilles non inoculées les facteurs d'induction calculés à partir des activités GUS sont plus fortes que celles obtenues à
partir des activités COMTII (Tableau 6). Ceci est dû, d'une part au fait que le test d'activité GUS est plus sensible que celui de la COMTII et, d'autre part au fait que la protéine GUS est extrêmement stable et que l'activité GUS mesurée correspond à
une accumulation de cette protéine après le traitement. La comparaison des activités GUS et COMTII est rapportée dans le Tableau 6 ci-dessous. Les feuilles non inoculées où se développe la résistance systémique acquise sont appelées " feuilles SAR ".
Tableau 6 -Facteurs d'induction des activités GUS et COMTII 3 et 7 jours après inoculation par le VMT dans les feuilles infectées et les feuilles SAR
Induction Induction des des activits activits COMTII
GUS

Feuilles InoculesFeuilles SAR Feuilles InoculesFeuilles SAR

3 jours 5,8 - S~g _ 7 jours 11 3,9 15 1,8 Analyse histochimique de l'activité GUS lors d'une infection virale et après blessure.
Une analyse histochimique de l'activité GUS dans des feuilles inoculées par le VMT, 7 jours après virose, montre que l'expression du gène GUS est localisée dans les cellules entourant le site d'infection. Des coupes transversales des feuilles au niveau des lésions ont été réalisées afin de déterminer les types cellulaires impliqués et, montrent que l'induction du gène GUS n'est pas tissu spécifique mais concerne toutes les cellules autour des lésions.
L'analyse histochimique de l'expression du gène GUS dans des feuilles blessées, 2 jours après traitement, montre une induction du gène GUS dans les tissus non blessés entourant les sites de blessure par piqûres ou à l'aide de forceps. Ces résultats impliquent qu'un signal est émis à partir des tissus blessés vers les tissus intacts induisant une expression systémique du gène GUS. Le méthyle jasmonat~ synthétisé dans les tissus blessés pourrait induire à distance le gène GUS, car une application exogène de méthyle jasmonate induit une activité GUS. Le test histochimique réalisé sur des feuilles issues de plantes transgéniques 35S/GUS est le contrôle positif de l'expérience. Des coupes transversales de feuilles blessées montrent également que tous les types cellulaires sont induits par la blessure.
Activité de fragments du promoteur de taille variable et compris entre les bases -1215 et - 406.
Liste des construits possédant le gène rapporteur GUS sous contrôle des séquences promotrices comprises entre -1215 et - 406 (par rapport au site + 1 d'initiation de la transcription) Constructions contrôles Gène rapporteur GUS dépourvu de promoteur Gène rapporteur GUS sous le contrôle du promoteur minimum du RNA 35 S du CaMV
(p min).
Constructions COMTII / GUS utilisées COMT II - 956 à + 24 COMT II - 937 à + 24 COMT II - 882 à + 24 COMT II - 746 à + 24 COMT II - 676 à + 24 COMT II - 560 à + 24 COMT II - 435 à + 24 COMT II - 1073 à - 406 + promoteur minimum du RNA 35 S du CaMV (p min).
Ces constructions correspondent respectivement aux fragments 815 à 1795, 834 à 1795, 889 à 1795, 1025 à 1795, 1095 à 1795, 1211 à 1795, 1336 à 1795 et 698 à 1365 de la SEQ ID NO 1.

L'analyse fonctionnelle de ces différentes constructions a été réalisée sur des tabacs transgéniques en expression stable.
Les études ont d'abord été réalisées sur une population d'environ 20 vitroplants ayant permis la sélection de 3 à 7 lignées par construction qui ont analysés à
l'âge de 20 à 45 jours après transfert en serre.
Tableau 7 : Induction par la blessure, le méthyl jasmonate, les UV et le VMT
de l'activité GUS dans des vitroplants de tabac transformés par les différentes constructions COMTII / GUS.
Nombre de plantes rpondant au signal / nombre total de plantes analyses Constructions Tmoin BlessureMthyl UV VMT
COMTII / GUS en survie jasmonate COMTII-1215+24 4/15 3/7 9/15 10/15 7/15 COMTII-956+24 4/20 6/15 9/20 15/20 7/20 COMTII-937+24 0/20 5/10 0/20 0/20 8/20 + 24 COMTII -746+24 0/20 0/4 0/20 0/20 0/20 COMTII -676+24 0/20 0/13 0/20 0/20 0/20 COMTII -560+24 0/20 0/8 0/20 0/20 0/20 COMTII -435+24 0/20 0/5 0/20 0/20 0/20 pBI101 0/20 0/5 0/20 0/20 0/20 (sans promoteur) Lmin/GUS 0/20 0/11 0/20 0/20 0/20 Pour tester la réponse à la blessure, des feuilles de vitroplants (âgées de 4 à 6 semaines après repiquage) ont été blessées à l'aide de pinces et l'activité
histochimique GUS a été révélée 16 heures après blessure.
Pour tester la réponse à l'infection, des feuilles de vitroplants ont été
inoculées avec une solution de VMT, et l'activité GUS a été révélé 7 jours après inoculation.
Les traitements par les UV et le méthyl jasmonate ainsi que le contrôle non induit ont été effectués sur des feuilles de vitroplants mises en survie dans de l'eau pendant 16 heures.

Tableau 8 : Induction de l'activité GUS par les fragments de pectine, chitine ou par la mégaspermine dans des plantes de tabac cultivées en serre et transformées par les différentes constructions COMTII / GUS
Nombre de plantes rpondant au signal /
nombre total de plantes analyses Constructions PectinesChitines Mgaspermine COMTII / GUS

COMTII-1215+24 5/6 4/6 4/6 COMTII-956+24 4/5 4/5 4/5 COMTII-937+24 1/3 1/3 2/3 COMTII -882+24 0/5 0/5 0/5 COMTII -746+24 0/5 0/5 0/5 COMTII -676+24 0/5 0/5 0/5 COMTII -560+24 0/5 0/5 0/5 COMTII -435+24 0/5 0/5 0/5 pBI101 0/5 0/5 0/5 (sans promoteur) ~pmin/GUS IO/6 I ~/6 I0/6 Les délétions correspondant aux constructions (-882 à + 24), (- 746 à + 24), (-676 à + 24), (- 560 à + 24) et (- 435 à + 24) entraînent une perte complète de finductibilité du promoteur COMTII pour l'ensemble des stress étudiés dans les tableaux 7 et 8. Ceci indique que les séquences nécessaires à l'activité du promoteur se situent entre les bases - 1215 et - 882 par rapport au site d'initiation de la transcription.
Dans les cas de l'induction du promoteur par la blessure, le VMT, la mégaspermine, ainsi que par les fragments de pectine et de chitine, seuls les fragments de promoteur (- 956 à + 24), (- 937 à + 24) et (- 1073 à - 406) permettent l'expression de l'activité GUS. De plus, le fragment ( - 1073 à - 406) permet l'induction du gène rapporteur par les différents traitements cités ci-dessus, la partie proximale du promoteur comprise entre -406 et +24 ne s'avère donc pas indispensable à
l'activité du promoteur. Le fragment -1071 à - 406 pb apparaît donc nécessaire et suffisant pour conférer la sensibilité aux inducteurs étudiés.
L'analyse de la réponse du promoteur vis à vis du méthyl jasmonate et des UV
indique que seul le fragment promoteur de - 956 à + 24 pb est fonctionnel. En effet, lorsque le fragment (- 1073 à - 406) est analysé hors du contexte du promoteur total (-1215 à + 24 pb), aucune induction n'est observée. Il existe donc plusieurs régions nécessaires à finductibilité du promoteur COMTII par le methyl jasmonate et les UV
la région comprise entre -956 et - 937 pb ainsi qu'une ou plusieurs régions situées dans la partie plus proximale du promoteur.
Exemple 4 : Activité anti-infectieuse de COMTII/mégaspermine dans le tabac 4.1. Clonage d'un ADNc codant pour la (3 mégaspermine.
Le clonage de gènes d'élicitine tels que ceux de la parasiticéine et de la cryptogéine ont montré que ces gènes codaient pour une préprotéine (Kamoun et al., 1993 ; Panabières et al., 1995). La séquence codante de ces élicitines comprend un peptide signal de 20 acides aminés, permettant leur excrétion dans le milieu extra-cellulaire suivi d'une séquence de 98 acides aminés correspondant à la protéine mature.
La séquence protéique de la (3 mégaspermine, préalablement déterminée (Kauffmann S., résultats non publiés), montre une forte homologie avec celle de la cryptogéine (Kamoun et al., 1993). Nous avons émis l'hypothèse que les séquences nucléotidiques des gènes correspondants pouvaient être très proches. Des amorces dérivées de la séquence nucléotidique du gène de la cryptogéine ont été
synthétisées afin d'isoler par PCR un ADNc codant pour la (3 mégaspermine. Ces amorces se placent au niveau de la séquence codant pour le peptide signal et contiennent le codon d'initiation de la traduction. Des réactions d'amplification ont été effectuées sur les reverse transcrits de Phytophthora megasperma en utilisant une amorce sens dérivée de la séquence nucléotidique de la cryptogéine et foligodT comme amorce antisens. Un fragment amplifié d'environ 450 nucléotides a été obtenu. Ce fragment a été
cloné dans un vecteur bactérien afin d'être séquencé.
L'analyse des séquences a révélé que le clone ainsi obtenu code pour une préprotéine comprenant une séquence signal de 20 acides aminés et une séquence de 98 acides aminés correspondant à la (3 mégaspermine (SEQ ID NO 12). La séquence nucléotidique correspondant au peptide signal présente par ailleurs 100%
d'identité avec celle de la cryptogéine.
L'ADNc natif de la (3 mégaspermine a été fusionné d'une part au promoteur COMT II et d'autre part au promoteur 35S. Le promoteur COMT II de 1239 pb a été
utilisé car il possède tous les éléments régulateurs nécessaires à son induction.
4.2. Obtention des tabacs transgéniques WO 00/568
8; WO 92/14822). These proteins enriched with sulfur amino acids will have also has the function of trapping and storing cysteine and / or methionine excess, to avoid possible toxicity problems related to a overproduction of these sulfur amino acids by trapping them. We can cite also genes coding for peptides rich in sulfur amino acids and more particularly in cysteines, said peptides also having antibacterial activity and or antifungal. Mention will be made more particularly of the defensins of plants, same as the lytic peptides of any origin, and more particularly peptides following lytics androctonine (WO 97/30082 and PCT / FR98 / 01814, filed on August 18, 1998) or drosomicine (PCT / FR98 / 01462, filed July 8, 1998.
These other genes of interest can be combined with the chimeric gene according to the invention either by conventional crossing of two plants containing each one genes (the first the chimeric gene according to the invention and the second the gene coding for the protein of interest) either by transforming cells vegetable of a plant containing the gene coding for the protein of interest with the gene chimera according to the invention.
The examples below illustrate the invention, without however seek to limit its scope.
All the methods or operations described below in these examples are given as examples and correspond to a choice made from among different methods available to achieve the same result. This choice has no affect the quality of the result and therefore any suitable method can be used by skilled in the art to achieve the same result. Most methods engineering DNA fragments are described in "Current Protocol in Molecular Biology "
Volumes 1 and 2, Ausubel FM et al or in Sambrook et al 1989.
Description of Figure 1: GUS activity kinetics (lA) corresponding to the COMTII promoter construction (-1215 to +24) / GUS and COMTII (1B) during a viral infection (VMT) or during an injury.
EXAMPLE 1 Isolation of the Class II COMT Gene Screening of a tobacco genomic bank allowed the isolation of 6 clones different containing COMT class II genes (COMTII). These first summer characterized by their restriction profiles which revealed some heterogeneity among the different clones.
COMTIIs form a multigene family composed of six to seven genes including only one is transcribed in defense reactions since only one type of cDNA
has been characterized in a bank elaborated from leaves inoculated by the virus Tobacco mosaic (VMT) (Pellegrini & al. 1993). In order to identify the clones containing the gene expressed during defense reactions, PCR reactions have been made using primers derived from the 3 'non-coding region of cDNA. In conditions of high selectivity a single clone is then amplified. The products amplifications have been sequenced. The sequences obtained presented a homology perfect with those of the 3 'non-coding regions of the cDNA.
Example 2 Analysis of the COMT gene promoter sequences of class II
The selected genomic clone was subcloned into a bacterial vector (puc 18) and represents a 14 kb insert of which 9 kb are located upstream of the ATG of the gene COMTII.
The transcription initiation site was determined by the technique extension primer and it is placed at 90 nucleotides from the initiation site of the translation.
The promoter was sequenced over a length of 1771 kilobases. Elements non-specific and common to the eukaryotic genes involved in the initiation of the transcripts such as the TATA box and the CAT box were found in the promoter COMTII (SEQ ID NO 1). Regulation sites have been highlighted by comparison of promoter sequences of the COMTII gene with those of genes intervening in defense mechanisms. The COMTII promoter contains specific elements of the phenylpropanoid metabolism genes involved in the stress response such as the three boxes P, A, L (initially identified in the gene PAL parsley) (SEQ ID NO 1). These three boxes are involved in the response to the elicitors and the P and L boxes are also involved in responding to UV. The box E originally identified in the CCoAOMT gene of parsley and extremely stored in the genes of phenylpropanoid metabolism also plays a role in the answer to the elicitors.
The COMTII promoter also has elements playing an important role in the induction of PR genes by elicitors such as the W box (SEQ ID NO 1 ).

General regulatory elements are found in the promoter of the COMTII such as G, GT boxes and the activator element of the simiens SV40 virus (SEQ ID
NO 1). Box G is an element present in a wide variety of promoters plants. Box G, associated with specific cis elements, is involved in the regulation of many genes responding to different physiological signals and environmental. The promoter region, responsible for the regulation of genes speak methyl jasmonate, consists of a G box associated with sequences rich in nucleotides C. A similar organization is found at the level of the promoter of genes specifically induced during the injury. The L boxes, present in the promoter of COMTII, could intervene in this kind of interaction because they are patterns rich in nucleotides C.
GT boxes, represented several times in promoters, seem to be playing a role in modulating the expression of certain plant genes, namely so much as an activator or as a repressor.
Example 3 Functional Analysis of the Promoter Regions of the COMTII Gene The functional analysis of the COMTII promoter was carried out by transgenesis in stable expression. The transgene was obtained by transcriptional fusion between the promoter and a reporter gene, the GUS ((3-glucuronidase) gene.
constructions corresponding to different deletions of the promoter have been carried out in order to specify the nature of the important promoter sequences responsible for the regulation of uncomfortable.
These constructions correspond to the promoter sequences from -1215 to +24 pairs of bases (bp), from -420 to +24 bp, from -313 to + 24bp and from -121 to +24 bp (compared to the site +1 of transcription), 557 to 1795, 1352 to 1795, 1459 to 1795 and 1651 to 1795 respectively on SEQ ID NO 1 introduced upstream of the GUS gene in the vector pBi101 (Clontech).
The different constructions were introduced via Agrobacterium tumefaciens in the plant genome. A population of ten tobacco plants transformed has been regenerated for each construction. The level of expression of the transgene has been determined by assay of enzyme activity and by tests histochemicals.
At the same time, the expression of the COMTII genes was analyzed by measuring activity of corresponding enzymes.

Results:
GUS activity has been tested in these plants under different conditions induction defense reactions, by a fungal elicitor injected into the leaves (megaspermine), or after exposure to UV. The results obtained are reported in Tables I and 2 below. The GUS activity is expressed in pmol MU / min.
mg.
For Table I, the control (T) consists of the infiltration of water into the leaves of transformed plants. Control plants transformed with an empty vector had an activity of about 10-30 pmoles / min.mg. For Table 2, the control (T) corresponds to basal GUS activity in untreated plants.
Table 1 - Expression of the GUS activity corresponding to the different COMT II / GUS constructions: induction with megaspermine GUS activity COMT II / GUST Mgaspermine construction COMT II -1215 +24 150 1150 COMT II -420 +24 2 6 COMT II -313 +24 0.4 0.8 COMT II -121 +24 0.2 0.8 Table 2 - The expression of the GUS activity corresponding to the different COMT II / GUS constructions: UV induction GUS activity COMT II / GUST UV construction COMT II -1215 +24 90 900 COMT II -420 +24 10 12 COMT II -313 +24 10 11 COMT II -121 +24 1 II 0 IS These results show that the size of the promoter must be greater than 600bp, in the occurrence 1239 bp to allow induction and strong expression of the GUS gene.
The promoter's deletions corresponding to constructions (-420 to +24), from (-313 to +24) and (-121 to +24) cause complete loss of gene expression GUS
under all the conditions tested. The activity of the GUS gene under the control of promoter 1239 bp is 1000 times higher than that observed for the others constructions.

Activation of the COMTII promoter by the injury and methyl jasmonate and by elicitors of various origins and nature.
Transgenic plants with the COMTII (- 1215 to +24) / GUS construction have been treated with different chemicals, reaction regulators defense, with salicylic acid (SA) and methyl-2-6-dichloroisonicotinic (INA), by fungal elicitors like glucans or chitin fragments and a elicitor of plant origin such as pectin. GUS activity was measured in leaves 4 p.m.
after infiltration of these compounds and the results reported in the Table 3 below.
The GUS activity is expressed in pmole MU / min.mg. The witness (T) corresponds to basal GUS activity in untreated transformed plants.
Table 3 - Induction of GUS activity by elicitors GUS Induction Activity SA (1mM) 1200 200 INA (1mM) 1700 200 Chitins (100 ~ g / ml) 1200 200 Glucans (ZOOpg / ml) 1400 200 Pectins (200 ~, g / ml) 3700 600 The strongest increase in GUS activity (of the order of 3) is obtained in plants infiltrated with pectic fragments compared to the control.
The 1239 bp promoter induction was studied at or after injury treatment with methyl jasmonate (molecule playing a role in the signaling of defense responses to injury) and benzothiadiazole (BTH) (inductor SAR chemical). The GUS activity is measured 16 hours after treatment. The results are reported in Table 4 below.
Table 4 - Induction of GUS activity by different compounds and stress Induction of GUS activity WO 00/56897 1 ~ PCT / FR00 / 00714 Injury 600 Methyl jasmonate 1450 The witness fTl corresponds to 1 ~ 'aCtlVtiPi ~ rTJ ~ (IPC n ~ antPC nnn traitPPe TP nrnmntPr is activated by the different treatments.
Induction factors range from 2.5 (BTH) to 14.5 (methyl jasmonate).
Activation of the COMTII promoter during viral infection.
VMV inoculation in tobacco requires the production of micro-wounds at level of leaves allowing the entry of the virus and its multiplication.
The GUS activity and COMTII activity were measured in the injured leaves and in the leaves inoculated by the virus. The results (Figure 1) show that the GUS gene under the COMTII promoter control has an induction kinetics identical to that of uncomfortable COMTII endogenous, followed by the measurement of the catalytic activity of proteins corresponding. The COMTII promoter is induced early by the injury and presents maximum activity at 4 p.m. The same peak of activity is observed at 4 p.m.
at during viral infection and is due to the leaf injury caused by inoculation of the virus. In inoculated leaves, GUS activity is strongly stimulated go from 5th day and progresses to the 7th day. Local and systemic induction of promoter during viral infection was measured 3 and 7 days after inoculation of VMT. The GUS activities expressed in pmol MU / min.mg, are reported in the Table 5 and represent an average of the values obtained in 9 transformants. The control T corresponds to the GUS activity of the untreated plants.

WO 00/56897 1 g PCT / FR00 / 00714 Table 5 - Local and systemic induction (SAR) of GUS activity GUS activity Leaves inoculated after 3 days 3800 Leaves inoculated after 7 days 7100 SAR sheets after 7 days 2700 These results show an 1100% induction of the promoter at 7 days in the inoculated leaves. The GUS activity measured at 7 days in the SAR sheets is weaker but very significant. However, in uninoculated leaves the factors induction calculated from GUS activities are stronger than those obtained at from COMTII activities (Table 6). This is due, on the one hand to the fact that the test GUS activity is more sensitive than that of COMTII and, on the other hand, makes that the GUS protein is extremely stable and the measured GUS activity corresponds to a accumulation of this protein after treatment. The comparison of GUS activities and COMTII is reported in Table 6 below. Uninoculated leaves where is develops acquired systemic resistance are called "SAR leaves".
Table 6 - Induction factors for GUS and COMTII activities 3 and 7 days after inoculation with VMT in infected leaves and SAR leaves Induction Induction of COMTII activities GUS

Inocule Sheets SAR Sheets Inocule Sheets SAR Sheets 3 days 5.8 - S ~ g _ 7 days 11 3.9 15 1.8 Histochemical analysis of GUS activity during and after viral infection injury.
Histochemical analysis of GUS activity in leaves inoculated with VMT, 7 days after virosis, shows that the expression of the GUS gene is localized in the cells surrounding the site of infection. Cross sections of leaves at the level of lesions were performed to determine the cell types involved and, show that the induction of the GUS gene is not specific tissue but concerns all cells around the lesions.
Histochemical analysis of GUS gene expression in leaves injured 2 days after treatment, shows induction of the GUS gene in non-wounded surrounding the sites of puncture injury or using forceps. These results imply that a signal is sent from injured tissue to intact tissue inducing a systemic expression of the GUS gene. Methyl jasmonat ~ synthesized in fabrics injured could induce the GUS gene from a distance, because an exogenous application methyl jasmonate induces GUS activity. The histochemical test performed on leaves from of 35S / GUS transgenic plants is the positive control of the experiment. Of cuts crosses of injured leaves also show that all types cell are injury-induced.
Activity of promoter fragments of variable size and between bases -1215 and - 406.
List of constructs possessing the GUS reporter gene under the control of promoter sequences between -1215 and - 406 (relative to the site + 1 initiation of the transcript) Control constructions GUS reporter gene without promoter GUS reporter gene under the control of the minimum promoter of RNA 35 S of CaMV
(p min).
COMTII / GUS constructions used COMT II - 956 to + 24 COMT II - 937 to + 24 COMT II - 882 to + 24 COMT II - 746 to + 24 COMT II - 676 to + 24 COMT II - 560 to + 24 COMT II - 435 to + 24 COMT II - 1073 to - 406 + minimum promoter of RNA 35 S of CaMV (p min).
These constructions correspond respectively to fragments 815 to 1795, 834 to 1795, 889 to 1795, 1025 to 1795, 1095 to 1795, 1211 to 1795, 1336 to 1795 and 698 to 1365 of SEQ ID NO 1.

The functional analysis of these different constructions was carried out on of transgenic tobacco in stable expression.
The studies were first carried out on a population of around 20 vitroplants allowing the selection of 3 to 7 lines per construction which analyzed at the age of 20 45 days after transfer to the greenhouse.
Table 7: Injury induction, methyl jasmonate, UV and VMT
of GUS activity in tobacco vitroplants transformed by different COMTII / GUS constructions.
Number of plants answering at the signal / number total of plants analyzes Constructions Tmoin BlessureMthyl UV VMT
COMTII / GUS in jasmonate survival COMTII-1215 + 24 4/15 3/7 9/15 10/15 7/15 COMTII-956 + 24 4/20 6/15 9/20 15/20 7/20 COMTII-937 + 24 0/20 5/10 0/20 0/20 8/20 + 24 COMTII -746 + 24 0/20 0/4 0/20 0/20 0/20 COMTII -676 + 24 0/20 0/13 0/20 0/20 0/20 COMTII -560 + 24 0/20 0/8 0/20 0/20 0/20 COMTII -435 + 24 0/20 0/5 0/20 0/20 0/20 pBI101 0/20 0/5 0/20 0/20 0/20 (without promoter) Lmin / GUS 0/20 0/11 0/20 0/20 0/20 To test the response to the injury, leaves of vitroplants (aged 4 at 6 weeks after transplanting) were injured with forceps and activity histochemical GUS was revealed 16 hours after injury.
To test the response to infection, leaves of vitroplants were inoculated with a solution of VMT, and the GUS activity was revealed 7 days after inoculation.
UV and methyl jasmonate treatments as well as non-control induced were carried out on leaves of vitroplants put in survival in some water for 16 hours.

Table 8: Induction of GUS activity by fragments of pectin, chitin or by megaspermine in tobacco plants grown in greenhouses and processed through the different COMTII / GUS constructions Number of plants answering at the signal /
number total of plants analyzes Constructions PectinsChitines Mgaspermine COMTII / GUS

COMTII-1215 + 24 5/6 4/6 4/6 COMTII-956 + 24 4/5 4/5 4/5 COMTII-937 + 24 1/3 1/3 2/3 COMTII -882 + 24 0/5 0/5 0/5 COMTII -746 + 24 0/5 0/5 0/5 COMTII -676 + 24 0/5 0/5 0/5 COMTII -560 + 24 0/5 0/5 0/5 COMTII -435 + 24 0/5 0/5 0/5 pBI101 0/5 0/5 0/5 (without promoter) ~ pmin / GUS IO / 6 I ~ / 6 I0 / 6 The deletions corresponding to the constructions (-882 to + 24), (- 746 to + 24), (-676 to + 24), (- 560 to + 24) and (- 435 to + 24) result in a complete loss of finductibility of the COMTII promoter for all the stresses studied in the Tables 7 and 8. This indicates that the sequences necessary for the activity of the promoter lie between the bases - 1215 and - 882 in relation to the initiation site of the transcription.
In the case of induction of the promoter by the injury, the VMT, the megaspermine, as well as by the fragments of pectin and chitin, only the fragments of promoter (- 956 to + 24), (- 937 to + 24) and (- 1073 to - 406) allow the expression of GUS activity. In addition, the fragment (- 1073 to - 406) allows induction of the gene protractor by the different treatments mentioned above, the proximal part of promoter between -406 and +24 is therefore not essential to the activity of promoter. The fragment -1071 to - 406 bp therefore appears necessary and sufficient for confer sensitivity to the inducers studied.
Analysis of the promoter's response to methyl jasmonate and UV
indicates that only the promoter fragment from - 956 to + 24 bp is functional. In effect, when the fragment (- 1073 to - 406) is analyzed outside the context of the promoter total (-1215 to + 24 bp), no induction is observed. There are therefore several regions necessary for the finductibility of the COMTII promoter by methyl jasmonate and UV
the region between -956 and - 937 bp as well as one or more regions located in the more proximal part of the promoter.
EXAMPLE 4 Anti-Infectious Activity of COMTII / Megaspermine in Tobacco 4.1. Cloning of a cDNA encoding (3 megaspermine.
Cloning of elicitin genes such as those of parasiticin and cryptogeine have shown that these genes code for a preprotein (Kamoun and al., 1993; Panabières et al., 1995). The coding sequence of these elicitins includes a signal peptide of 20 amino acids, allowing their excretion in the medium extra-cell followed by a sequence of 98 amino acids corresponding to the mature protein.
The protein sequence of (3 megaspermine, previously determined (Kauffmann S., unpublished results), shows a strong homology with that of the cryptogeine (Kamoun et al., 1993). We hypothesized that the sequences nucleotides of the corresponding genes could be very close. Of primers derived from the nucleotide sequence of the cryptogen gene have been synthesized so to isolate by PCR a cDNA coding for (3 megaspermine. These primers are place at level of the sequence encoding the signal peptide and contain the codon initiation of the translation. Amplification reactions were carried out on the reverse transcripts of Phytophthora megasperma using a sense primer derived from the nucleotide sequence of cryptogeine and foligodT as an antisense primer. A
amplified fragment of approximately 450 nucleotides was obtained. This fragment was cloned into a bacterial vector to be sequenced.
Analysis of the sequences revealed that the clone thus obtained codes for a preprotein comprising a signal sequence of 20 amino acids and a sequence from 98 amino acids corresponding to (3 megaspermine (SEQ ID NO 12).
nucleotide corresponding to the signal peptide also present 100%
identity with that of cryptogeine.
The native cDNA of (3 megaspermine was firstly merged with the promoter COMT II and on the other hand to the promoter 35S. The 1239 bp COMT II promoter has summer used because it has all the regulatory elements necessary for its induction.
4.2. Obtaining transgenic tobacco WO 00/568

9? 23 PCT/FR00/00714 Des plants de tabac Nicotiana tabacum Samsun NN ont été transformés avec les deux constructions via Agrobacterium tumefaciens. Six transformants primaires pour chaque construction ont été régénérés et autofécondés. Les plantes issues de la seconde génération présentent un phénotype normal excepté certains individus possédant le gène de la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S. Ces plantes présentent un délai de croissance et ont également un système racinaire peu développé.
Cependant aucune nécrose tissulaire rappelant celle développée par l'infiltration foliaire et pouvant être liée à l'expression de félicitine n'est observée dans les plantes transgéniques.
4.3. Analyse de l'expression de la (3 mégaspermine dans les tabacs transgéniques.
L'expression de la (3 mégaspermine a été analysée dans les feuilles des plantes transgéniques possédant fADNc de félicitine sous le contrôle du promoteur 35S
par Western-Blot (figure 2A) et par Northern-Blot (figure 2B). De façon surprenante, la (3 mégaspermine est indétectable dans tous les transformants analysés (figure 2A). Le niveau de transcription de l'élicitine a donc été examinée dans ces plantes par Northern-Blot (figure 2B). Les transcrits ont pu être détectés et le niveau d'expression varie d'un transformant à l'autre. Il apparaît que dans 2 types de plantes (E et F) la taille des transcrits est plus petite que la taille du messager complet. Dans ce cas, l'absence de protéine pourrait être expliquée par le fait que l'ADNc est tronqué. Pour les plantes A, B, C, D la taille des transcrits correspond à celle de l'élicitine exprimée par le champignon et le taux de transcrits n'est pas négligeable, sauf pour la plante B montrant une très faible proportion de transcrits. Les plantes A qui possèdent les niveaux de transcrits les plus élevés montrent également un retard de croissance. Par la suite, seuls les transformants présentant les transcrits complets de (3 mégaspermine ont été testés pour leur résistance.
De la même manière, l'expression de la (3 mégaspermine sous contrôle du promoteur COMT II a été analysée par Western-Blot dans les feuilles des tabacs transgéniques (figure 3). L'expression a été étudiée dans les plantes saines non traitées pour déterminer le niveau de base d'expression de l'élicitine et après blessure pour analyser le niveau d'induction obtenu. Dans les tissus non traités, le niveau de la (3 mégaspermine est indétectable. Par contre, l'élicitine est détectée en très faible quantité
dans les tissus blessés. Ceci est dû à l'activation du promoteur COMT II par la blessure.

L'accumulation de la COMT II a été également examinée dans les mêmes plantes transgéniques en utilisant des anticorps anti-COMT II. De façon surprenante la COMT
II est détectée à un niveau non négligeable dans les tissus non traités, alors que normalement seule une très faible activité COMT II est détectée dans les plantes saines non transformées ou transformées avec le gène chimérique COMT II::GUS
(Collendavelloo et al., 1981 ; Pellegrini et al., 1993). La vCOMT II est également produite en quantité plus grande dans les tissus blessés par comparaison aux plantes contrôles blessées de la même façon.
Le promoteur COMT II permet une expression induite de félicitine dans les tabacs transgéniques. Ceci a été vérifié pour les 6 transformants. Cependant la quantité
d'élicitine détectée dans les plantes après induction est très faible. La présence de COMT II dans les plantes non traitées laisse supposer qu'une très faible quantité
d'élicitine (non détectée par la méthode utilisée) est produite dans la plante saine et que cette synthèse est suffisante pour induire le gène COMT II endogène. De plus, il semblerait qu'une expression induite de félicitine lors de la blessure permette également une plus forte induction du gène COMT II endogène.
Par ailleurs, l'analyse de la (3 mégaspermine sur gel dénaturant montre une migration électrophorétique inférieure à celle de la (3 mégaspermine mature purifiée (figure 3). Cette différence de migration a été évaluée à 3 kD ce qui correspond à la taille du peptide signal. Ce résultat semble indiquer que le peptide signal n'a pas été
clivé. Cependant il est possible que la protéine mature soit produite en plus petite quantité par les cellules végétales et que cette quantité se situe en dessous du seuil de détection sur ce Western-Blot.
L'étude de l'expression de la (3 mégaspermine dans des tabacs transgéniques semble indiquer qu'une expression constitutive d'élicitine ne soit pas tolérée par les plantes et par conséquent ne permette pas son accumulation dans les cellules végétales.
Seule une expression induite permet une synthèse de la (3 mégaspermine à un niveau détectable. Ces résultats pourraient être liés au caractère toxique de la protéine.
4.4. Analyse du niveau de résistance des plantes transgéniques vis à vis de différents agents pathogènes.
Résistance antivirale.
a) Résistance vis à vis du Virus de la Mosaïque du Tabac (VMT).

Les tabacs transformés possèdent le gène de résistance N et réagissent donc par une HR lors de l'inoculation par le VMT. Dans ces expériences la résistance au virus est quantifiée par la mesure de la taille des lésions 7 jours après infection, lorsqu'elles ont atteint leur taille presque définitive. Plus la résistance développée par la plante est grande, plus les tailles des lésions sont petites, illustrant ainsi un confinement plus important du pathogène au site d'infection. Le promoteur du gène COMT II étant fortement induit autour des lésions lors de la HR au VMT, il devrait permettre une forte expression de la (3 mégaspermine au site d'infection. Pour le vérifier, les plantes transgéniques a,b,c,d,e et f exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur COMT II
et les transformants A, B, C, D possédant fADNc de la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S ont été inoculés par le VMT. Les plantes témoins sont des plantes transgéniques pour le gène chimérique "promoteur COMT II::GUS".
Sept jours après virose, les lésions développées sur les plantes exprimant la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S ne semblent pas différentes de celles des plantes témoins. Par contre des lésions plus petites sont observées sur les plantes transgéniques exprimant la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II par rapport à celles obtenues sur les plantes témoins.
Une analyse statistique de la taille des lésions a été effectuée en mesurant le diamètre de 100 à 150 lésions chez les plantes témoins et chez les plantes transgéniques pour la (3 mégaspermine. La figure 4 représente la distribution de la taille des lésions mesurées sur les plantes témoins et pour une lignée exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur 35S (plantes A) et une lignée exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur COMT II (plantes b). Cette distribution suit une courbe de Gauss ce qui autorise l'analyse statistique des résultats. Les plantes témoins présentent une taille de lésions dont la moyenne est de 3,30,5 mm. La moyenne de la taille des lésions obtenue pour les plantes A n'est pas significativement différente de celle des témoins (3,10,6 mm) par contre celle obtenue pour les plantes b est fortement inférieure au témoins (1,40,6 mm). Les résultats obtenus pour chaque lignée indépendante sont regroupés sur la figure 5 et montrent que tous les transformants (plantes A, B, C et D) possédant l'ADNc de la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S présentent une taille de lésions ne différant pas de celle des témoins. En revanche, toutes les plantes exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur COMT II présentent une taille moyenne de lésions significativement inférieure à celle des plantes témoins.
Cette diminution est plus ou moins importante selon les transformants. Une forte réduction, d'environ 60%, de la taille des lésions est obtenue pour les transformants COMT II::meg a, b, et f et la plus faible observée est de 36% et correspond au transformant COMT
II::meg e.
L'ensemble des résultats obtenus montrent que les plantes exprimant la b mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S présentent un niveau de résistance antiviral équivalent à celui des plantes témoins. Par contre, une résistance accrue au VMT est obtenue pour les tabacs transgéniques exprimant la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II. Cependant tous les lignées transgéniques ne présentent pas le même niveau de résistance. Ceci pourrait être lié à des niveaux d'expression différents de la (3 mégaspermine dans ces différentes plantes transgéniques.
b) Résistance au Virus de la Mosaïque de la Luzerne (VML).
Nous avons testé la résistance des tabacs transgéniques COMT II::mégaspermine vis à vis d'un autre virus, le VML, qui infecte le tabac de façon systémique.
Une dizaine de jours après virose, le VML s'est propagé dans toute la plante et produit au niveau des feuilles non inoculées des symptômes de mosaïque.
Les plantes exprimant la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II
choisies pour ce test correspondent à la lignée b qui présente un niveau de résistance élevé au VMT. Les plantes A possédant l'ADNc de la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S ont été également inoculées ainsi que des plantes témoins COMT
II::GUS. Pour chaque lignée transgénique, 5 plantes ont été inoculées. Nous avons examiné le phénotype des différentes plantes quinze jours après traitement. A
ce stade les symptômes de mosaïque sont bien développés sur les plantes COMT II::GUS.
Les plantes transgéniques A montrent une mosaïque similaire aux plantes témoins.
Par contre, une réduction de ces symptômes est observée dans les plantes transgéniques b.
La charge virale a été examinée dans les feuilles systémiques de même niveau (3 ème feuille au dessus de la feuille inoculée). Cette analyse a été effectuée par Western-Blot en utilisant des anticorps dirigés contre la coque protéique du virus (figure 6). La quantité de virus présente dans les différentes plantes transgéniques est évaluée par rapport à la quantité de virus présente dans les plantes témoins. Les résultats obtenus montrent que les plantes exprimant la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur WO 00/56897 2~ PCT/FR00/00714 35S ont de 10 à 15 fois moins de virus que les plantes témoins. Cette réduction de la quantité de virus peut paraître importante. Il faut savoir cependant que les quantités de virus produites dans les plantes sauvages peuvent varier dans les mêmes proportions.
Par contre les plantes transgéniques exprimant la mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II contiennent 1000 à 10000 fois moins de virus que les plantes témoins. Ceci représente une réduction considérable et très significative de la charge virale.
Ces résultats suggèrent que seules les plantes transformées avec la ~3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur inductible COMT II sont moins sensibles vis à vis d'une infection systémique virale. Ceci montre également une corrélation entre la réduction des symptômes d'infection et la diminution de la charge virale dans ces feuilles.
Résistance antifongigue.
Nous avons examiné si la production d'élicitines in planta conférait une résistance induite vis à vis d'un champignon du sol, Phytophthora parasitica var.nicotianae. Ce champignon infecte les plants de tabac par les racines envahissant le système racinaire puis vasculaire provoquant ainsi une sclérose des vaisseaux conducteurs. Les symptômes d'infection se traduisent par une pourriture noire au niveau du collet. Ce mode d'infection est difficile à mettre en oeuvre car il nécessite une concentration en zoospores adéquate et répond à des conditions strictes de température et d'humidité. Un mode "artificiel" d'inoculation consiste à appliquer après décapitation des tabacs le mycélium du champignon au niveau de la tige sectionnée. Après 7 jours les tiges sont prélevées et les symptômes d'infection sont examinés à l'intérieur des tiges.
L'inoculation a été effectuée sur 7 plantes témoins COMT II::GUS. Pour chaque lignée transgénique pour la (3 mégaspermine, cinq plantes ont été inoculées.
Les plantes A, B, C et D possédant la construction "promoteur 35S-mégaspermine" ont été
testées.
Pour les plantes possédant le gène de la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II, les lignées a et b présentant une forte résistance accrue au VMT ont été
choisies ainsi que la lignée e présentant un niveau plus faible de résistance.
La progression des symptômes mesurée dans les tiges des plantes témoins atteint une longueur moyenne de 5,3 cm. Un ralentissement des symptômes d'infection est observé dans les tiges des plantes transgéniques exprimant la (3 mégaspermine sous le WO 00/56897 2g PCT/FR00/00714 contrôle du promoteur 35S. Cette diminution est variable d'un génotype à
l'autre (figure 7). La progression du champignon est fortement ralentie dans les plantes 35S::meg A
(d=0,8cm) et plus faiblement dans les plantes 35S::meg B (d=3,8cm) par rapport au plantes témoins (d=5,3cm). Les plantes A correspondent aux plantes qui présentent la plus forte proportion de transcrits de (3 mégaspermine, alors que les plantes B ont un taux très faible de transcrits codant pour l'élicitine. Ceci pourrait suggérer une corrélation entre les niveaux de transcrits d'élicitine détectés (et sans doute les niveaux de /3 mégaspermine produits même si ceux ci restent sous le seuil de détection) et le niveau de résistance antifongique induit.
La progression du champignon est également fortement ralentie dans les tiges des plantes transgéniques exprimant la (3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II. Nous avons montré par ailleurs que le promoteur COMT II était induit lors de l'infection par P. parasitica. Les tiges des transformants COMT II::meg a, b et e sont respectivement infectées sur une longueur de 0,7 cm, 1 cm et de 3,5 cm. Les plantes a et b sont les plus résistantes à l'infection par P. nicotianae et correspondent également aux plantes présentant la plus forte résistance au VMT. Ainsi, il apparaît que les mêmes niveaux de résistance relatifs sont détectés avec les deux agents pathogènes testés. Nous pouvons supposer que les niveaux de résistance induits dans ces plantes sont liés au taux d'expression de l'élicitine. Une analyse des niveaux de transcrits par Northern-Blot permettrait peut être de confirmer cette hypothèse, sachant la difficulté de détecter la protéine par Western-Blot.
Ces résultats montrent que l'expression constitutive ou induite de (3 mégaspermine dans des tabacs transgéniques permet de conférer un niveau de résistance accru vis à vis de d'une infection fongique.
Résistance antibactérienne Nous avons également testé la résistance des plantes transgéniques exprimant la /3 mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II vis à vis d'une bactérie, Erwinia carotovora. Cette bactérie est un agent pathogène bien connu de la pomme de terre et est capable de macérer les tissus végétaux par la synthèse d'enzymes pectinolytiques. Cependant elle peut également infecter d'autres plantes tel le tabac.
Pour ce test, une suspension d'E carotovora a été infiltrée dans les feuilles des plantes transgéniques COMT II::mégaspermine ainsi que dans les feuilles des plantes contrôles (correspondant aux plantes transgéniques pour le gène chimérique COMT
II::GUS). Une population de 7 plantes a été inoculée pour chacun des transformants.
Deux jours après inoculation des bactéries, 60% des plantes contrôles (4 plantes sur 7) présentent des symptômes d'infection sévères, les feuilles inoculées sont entièrement macérées et l'infection tend à se propager au niveau de la plante entière. A
l'inverse 85%
des plantes transgéniques exprimant la (3 mégaspermine sous ;fie contrôle du promoteur COMTII (6 plantes sur 7) sont résistantes à l'infection bactérienne.
Ces résultats montrent que l'expression induite de félicitine accroît fortement la résistance vis à vis d'E carotovora. Nous avons précédemment montré que le promoteur COMT II était inductible par des éliciteurs secondaires parmi lesquels les fragments pectiques. Ainsi nous pouvons supposer que les fragments pectiques produits lors de la lyse des tissus végétaux induisent le promoteur COMT II et par conséquent la synthèse de (3 mégaspermine. Cependant le mécanisme permettant la mise en place de la résistance antibactérienne reste encore à déterminer.
Matériel et méthodes Criblage d'une banque génomique et identification du clone correspondant au gène exprimé pendant la réponse de défense.
Une banque d'ADN génomique de tabac (Nicotiana tabacum var. Xanthi) construite dans ~,-EMBL3 (Clontech) a été criblée avec une sonde radioactive d'ADNc de COMT II (Pellegrini & al., 1993). Six clones génomiques positifs ont été
isolés après quatre tours de purification. Ces clones purifiés ont été testés par PCR pour identifier celui qui comprend le gène COMT exprimé pendant la réponse d'hypersensibilité
(HR) des feuilles de tabac au VMT. Les amorces 5' et 3' pour l'analyse PCR sont représentés par les oligonucléotides 1 et 2 ci-dessous (SEQ ID NO 4 et SEQ ID NO 5 respectivement) Oligo 1 : 5' CGTTTCGCAA TGTGATTTGA TC 3' Oligo 2 : 5' CTCAAAATGA CATCCTTTCA TAC 3' Ils sont dérivés de la région non traduite en 3' de l'ADNc de COMT II.
L'analyse PCR est effectuée à 62 °C (température de fusion théorique) de manière à promouvoir une hybridation spécifique. Un seul clone permet l'amplification du fragment attendu de 400 paires de bases comme le fait l'ADNc employé comme contrôle positif. Le clone WO 00/56897 3~ PCT/FR00/00714 génomique de COMT II a été purifié sur Quiagen tip selon le protocole décrit par le fabriquant et sous cloné dans le site de restriction Sall du vecteur plasmide puc 18.
Séquençage de l'ADN.
Le séquençage de l'ADN a été effectué sur l'ADN double brin dénaturé selon la méthode de Sànger & al. (1977) en employant le le kit " rhodamin dye terminator cycle ready " avec l'ADN polymérase FS ampliPaq (Perkin-Elmer, P/N402078) et un séquenceur Applied Biosystems 373 (Perkin-Elmer). La séquence a été déterminée sur les deux brins avec des recouvrements en employant des amorces synthétisées à
partir de séquences déjà déterminées.
Analyse des produits d'extension d'amorces.
La réaction d'extension des amorces a été effectuée sur l'ARN total selon la méthode décrite dans Carrent Protocols in Molecular Biology (Trienzenberg, 1992).
L'ARN total isolé de feuilles de tabacs infectées par le VMT et de feuilles de tabacs non infectées (comme contrôle négatif] a été hybridé à l'oligonucléotide suivant (SEQ ID
NO 6), complémentaire de l'ARNm du COMT II et marqué à l'extrémité 5' Oligo 3 : 5' CTGAAGATGT CAATAGTTGC ATGGC 3' Le produit de l'extension a été séparé sur un gel de polyacrylamide à 6 %. La localisation du site d'initiation de la transcription a été déterminée sur la base de la comigration des produits d'extension avec l'échelle de séquence de la obtenue à partir de la région correspondante du gène (Sànger & al., 1977).
Construction des plasmides.
Les versions tronquées du promoteur COMTII ont été amplifiés par PCR en employant les amorces PAS 1 en 3' et PS 1, PS2, PS3 et PS4 en 5' représentés ci-après (SEQ ID NO 7 à 11 respectivement), conduisant respectivement à l'amplification des fragments nucléotidiques de longueurs suivantes : -1215/+24, (nouveaux construits dupérieurs à 600 bp) -420/+24, -313/+24 et -121/+24 (numérotation relative au site d'initiation de la transcription).
PAS1 . 5' GGTCTAGAGG GCCTTTTAGA GTGTTTTTGT TAG 3' PS1 . 5' AAAGTCGACC GTCCACCTGT GCCAACAAT 3' PS2 . 5' TGTTTGGTGT TATGCTTCCG TCCT 3' PS3 . 5' AAAAAGCTTT TTTAGGATGG AGTACAGCC 3' PS4 . 5' TTTAAGCTTA AAGAGAACCA GACAATATT 3' Les construits -1728/+24, -1471/+24, -956/+24, -937/+24, -882/+24, -746/+24, -676/+24, -560/+24, -435/+24, ont été obtenus avec les amorces PAS2 en 3' et respectivement les amorces PSS, PS6, PS7, PSB, PS9, PS10, PS11, PS12 et PS13 en 5' présentées ci après (SEQ ID NO 15 à 24 respectivement):
PAS2: 5' CGCGGATCCC CTTTTAGAGT GTTTTTGTTA GGC 3' PS5 . 5' ACGCGTCGAC GTTAGGGACA ATCTATAGTG TCAC 3' PS6 . 5' ACGCGTCGAC GCTCCGAGGA TTTGGCTGTC GCGG 3' PS7 . 5' ACGCGTCGAC GCTGGTTAGG TGAAGTAAAG CATG 3' PS8 . 5' ACGCGTCGAC GCATGTTATA TGAGGAAAGT ACG 3' PS9 . 5' ACGCGTCGAC GCAGCCAGCA CAAGCAAATT CGC 3' PS10: 5' ACGCGTCGAC GACTTTAACA CACCAACTCC C 3' PS11: 5' ACGCGTCGAC CGGATCTAGA ATTTGGGTTC ATTC 3' PS12: 5' ACGCGTCGAC GTGTATACTC CACGTCTCCG GATAC 3' PS13: 5' ACGCGTCGAC GTTCAATGTT AGGTGTGTTT GG 3' La séquence -1073/-406 qui a été placée en amont du promoteur 35S minimum a été obtenue en utilisant l'amorce PAS3 en 3' et l'amorce PS14 en 5' (SEQ ID NO
25 et 26):
PAS3 . 5' CGCGGATCCG CTTAACACCA AACACACCTA ACATTG 3' PS14 . 5' ACGCGTCGAC CAGTGGTGAG TTTAGCTGTC 3' L'amplification a été effectuée pendant 30 cycles avec une étape initiale de 4 min à 95°C et une étape finale de 5 min à 72°C, en utilisant le clone génomique comme matrice.Chaque cycle consiste en 1 min à 95°C suivie d' 1 min d'hybridation puis de 1,5-2 min à 72°C.L'étape d'hybridation est réalisée à 54°C, 59°C, 55°C, et 50°C pour amplifier ,respectivement,les fragments -1215/+24, -420/+24, -313/+24 et -121/+24.
Pour tous les autres fragments du promoteur, la température d'hybridation est de 60°C.Après sous-clonage dans le plasmide pGEM-T (Promega) et amplification dans E.
Coli, le fragment de promoteur -1215/+24 est digéré par Sall et Xbal, les sites correspondants étant présents dans les amorces PSl et PSAI respectivement. Les fragments de promoteur de 420, 313 et 121 paires de bases sont digérés avec Hindlll et Xbal (le site pour Hindlll est présent dans les amorces PS2, PS3 et PS4, et le site Xbal dans l'amorce PASI).Les fragments -1768/+24, -1471/+24,-956/+24, -937/+24, -882/+24, -746/+24, -676/+24, -560/+24 et -435/+24 sont digérés par BamHl present dans PAS2 et PAS3 et par Sall present dans les amorces PSS à PS14. Tous les fragments sont clonés dans le plasmide pBIIOl (Qiagen) de façon à créer une fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS. Tous les construits sont séquencés pour confirmer leur structure et les frontières de jonction.
Le construit constitué du promoteur 35S du CaMV en amont du gène de la mégaspermine a été obtenu en remplaçant le gène Gus par le gène de la mégaspermine (SEQ ID NO 12) dans le plasmide pBi121(Clontech).
Clonage de l'ADNc de Phytophthora megasperma mg d'ARN totaux de Phytophthora megasperma sont utilisés comme matrice pour la synthèse du premier brin. Les ARN totaux sont chauffés 3 min à
65°C, refroidis sur glace, et incubés 2 h à 42°C dans 50 ml de tampon de transcription inverse (50 mM
9? 23 PCT / FR00 / 00714 Nicotiana tabacum Samsun NN tobacco plants were transformed with two constructions via Agrobacterium tumefaciens. Six primary transformants for each construction were regenerated and self-fertilized. Plants from the second generation have a normal phenotype except some individuals with the gene (3 megaspermine under the control of the 35S promoter. These plants present a stunted growth and also have an underdeveloped root system.
However no tissue necrosis reminiscent of that developed by infiltration leaf and capable to be linked to the expression of felicitin is only observed in plants transgenic.
4.3. Analysis of the expression of (3 megaspermine in tobacco transgenic.
The expression of (3 megaspermine was analyzed in the leaves of plants transgenics with feline cDNA under the control of the 35S promoter through Western-Blot (Figure 2A) and by Northern-Blot (Figure 2B). In a way surprisingly, the (3 megaspermine is undetectable in all the transformants analyzed (figure 2A). The transcription level of elicitin was therefore examined in these plants by Northern-Blot (Figure 2B). Transcripts could be detected and the level expression varies from transforming to another. It appears that in 2 types of plants (E and F) the size of transcribed is smaller than the size of the complete messenger. In that case, the absence of protein could be explained by the fact that the cDNA is truncated. For the plants A, B, C, D the size of the transcripts corresponds to that of the expressed elicitin speak fungus and the transcribed rate is not negligible, except for the plant B showing a very small proportion of transcripts. Plants A which have the levels of the highest transcripts also show stunting. Over there next, only transformants with complete transcripts of (3 megaspermine have been tested for their resistance.
Similarly, the expression of (3 megaspermine under the control of COMT II promoter was analyzed by Western-Blot in tobacco leaves transgenic (Figure 3). The expression has been studied in healthy plants untreated to determine the baseline level of elicitin expression and after injury for analyze the level of induction obtained. In untreated tissue, the level from the (3 megaspermine is undetectable. On the other hand, elicitin is detected in very small amount in injured tissue. This is due to the activation of the COMT II promoter by the injury.

The accumulation of COMT II was also examined in the same plants transgenic using anti-COMT II antibodies. Surprisingly the COMT
It is detected at a non-negligible level in untreated tissue, so than normally only very low COMT II activity is detected in the healthy plants not transformed or transformed with the chimeric COMT II :: GUS gene (Collendavelloo et al., 1981; Pellegrini et al., 1993). VCOMT II is also produced in greater quantities in injured tissue compared to plants injured controls the same way.
The COMT II promoter allows an induced expression of felicitin in the tobacco transgenic. This was verified for the 6 transformants. However the amount elicitin detected in plants after induction is very low. The presence of COMT II in untreated plants suggests that a very low amount elicitin (not detected by the method used) is produced in the plant healthy and that this synthesis is sufficient to induce the endogenous COMT II gene. Moreover, he seems to be an induced expression of felicity during injury also allows stronger induction of the endogenous COMT II gene.
Furthermore, the analysis of (3 megaspermine on denaturing gel shows a electrophoretic migration lower than that of (3 megaspermine mature purified (figure 3). This difference in migration was evaluated at 3 kD which corresponds to the size of the signal peptide. This result seems to indicate that the signal peptide was not cleaved. However it is possible that the mature protein is produced in addition small quantity by plant cells and that quantity is below from the threshold of detection on this Western-Blot.
Study of the expression of (3 megaspermine in transgenic tobacco seems to indicate that a constituent expression of elicitin is not tolerated by the plants and therefore does not allow its accumulation in cells vegetable.
Only an induced expression allows a synthesis of (3 megaspermine to a level detectable. These results could be linked to the toxic nature of the protein.
4.4. Analysis of the level of resistance of transgenic plants towards of different pathogens.
Antiviral resistance.
a) Resistance to the Tobacco Mosaic Virus (VMT).

Processed tobacco has the resistance gene N and therefore reacts through HR during inoculation by VMT. In these experiments resistance to virus is quantified by measuring the size of the lesions 7 days after infection, when they have reaches their almost final size. The higher the resistance developed by the plant is large, the smaller the size of the lesions, thus illustrating a containment more important pathogen at the site of infection. The promoter of the COMT II gene being strongly induced around lesions during HR at VMT, it should allow a strong expression of (3 megaspermine at the site of infection. To verify this, the plants transgenic a, b, c, d, e and f expressing elicitin under the control of COMT II promoter and transformants A, B, C, D having the cDNA of (3 megaspermine under the control of the 35S promoter were inoculated by VMT. Control plants are plants transgenic for the chimeric gene "COMT II promoter :: GUS".
Seven days after virosis, the lesions developed on plants expressing the (3 megaspermine under the control of the 35S promoter do not seem different of those of control plants. On the other hand, smaller lesions are observed on the transgenic plants expressing (3 megaspermine under the control of promoter COMT II compared to those obtained on the control plants.
A statistical analysis of the size of the lesions was carried out by measuring the diameter of 100 to 150 lesions in control plants and in plants transgenic for the (3 megaspermine. Figure 4 shows the size distribution lesions measured on the control plants and for a line expressing elicitin under Control of the 35S promoter (plants A) and a line expressing elicitin under the control of COMT II promoter (plants b). This distribution follows a Gauss curve this who authorizes statistical analysis of the results. Control plants show a size of lesions with an average of 3.30.5 mm. Average lesion size obtained for plants A is not significantly different from that of the controls (3.10.6 mm) on the other hand that obtained for plants b is much lower than witnesses (1.40.6 mm). The results obtained for each independent line are grouped on Figure 5 and show that all transformants (plants A, B, C and D) possessing the cDNA for (3 megaspermine under the control of the 35S promoter has a cut of lesions not different from that of the controls. However, all plants expressing elicitin under the control of the COMT II promoter have a cut mean lesions significantly lower than that of control plants.
This decrease is more or less important according to the transformants. A strong reduction, about 60%, the size of the lesions is obtained for the transformants COMT II :: meg a, b, and f and the lowest observed is 36% and corresponds to the transformant COMT
II :: meg e.
All the results obtained show that the plants expressing b megaspermine under the control of the 35S promoter exhibit a level of resistance antiviral equivalent to that of control plants. However, resistance increased at VMT is obtained for transgenic tobacco expressing (3 megaspermine under the COMT II promoter control. However, not all transgenic lines present not the same level of resistance. This could be linked to levels expression different from the (3 megaspermine in these different transgenic plants.
b) Resistance to Alfalfa Mosaic Virus (VML).
We tested the resistance of COMT II :: megaspermine transgenic tobacco vis-à-vis another virus, VML, which infects tobacco systemically.
About ten days after viral infection, MLV has spread throughout the plant and level of leaves not inoculated with mosaic symptoms.
Plants expressing (3 megaspermine under the control of the COMT II promoter chosen for this test correspond to line b which has a level of resistance raised to VMT. Plants A having the cDNA for (3 megaspermine under the control of the 35S promoter were also inoculated as well as control plants COMT
II :: GUS. For each transgenic line, 5 plants were inoculated. We we have examined the phenotype of the different plants fifteen days after treatment. AT
this stage mosaic symptoms are well developed on COMT II :: GUS plants.
The A transgenic plants show a mosaic similar to the control plants.
Through against, a reduction of these symptoms is observed in plants transgenic b.
Viral load was examined in systemic leaves of the same level (3 th sheet above the inoculated sheet). This analysis has been performed by Western-Blot using antibodies directed against the protein shell of the virus (figure 6). The amount of virus present in different transgenic plants is assessed by compared to the amount of virus present in the control plants. The results obtained show that plants expressing (3 megaspermine under the control of promoter WO 00/56897 2 ~ PCT / FR00 / 00714 35S have 10 to 15 times less virus than the control plants. This reduction of the amount of virus may seem significant. However, you should know that quantities of viruses produced in wild plants can vary in the same proportions.
On the other hand, the transgenic plants expressing megaspermine under the control of COMT II promoter contains 1,000 to 10,000 times less virus than plants witnesses. This represents a considerable and very significant reduction in load viral.
These results suggest that only plants transformed with ~ 3 megaspermine under the control of the inducible COMT II promoter are less susceptible to a systemic viral infection. This also shows a correlation between reduced symptoms of infection and decreased load viral in these leaves.
Antifungal resistance.
We examined whether elicitin production in planta conferred resistance induced with respect to a soil fungus, Phytophthora parasitica var.nicotianae. This fungus infects tobacco plants through the roots invading the system root then vascular, thus causing sclerosis of the conducting vessels. The symptoms of infection result in black rot in the collar. This mode of infection is difficult to implement because it requires a concentration in adequate zoospores and meets strict temperature conditions and humidity. A
"artificial" mode of inoculation consists in applying after decapitation of tobacco on mycelium of the fungus at the level of the severed stem. After 7 days stems are removed and symptoms of infection are examined inside the stems.
The inoculation was carried out on 7 COMT II :: GUS control plants. For each transgenic line for (3 megaspermine, five plants were inoculated.
Plants A, B, C and D with the "35S-megaspermine promoter" construct have been tested.
For plants with the gene for (3 megaspermine under the control of promoter COMT II, lines a and b with strong increased resistance to VMT have summer chosen as well as the line e exhibiting a lower level of resistance.
The progression of symptoms measured in the stems of control plants achieved an average length of 5.3 cm. Slower symptoms of infection East observed in the stems of transgenic plants expressing (3 megaspermine under the WO 00/56897 2g PCT / FR00 / 00714 35S promoter control. This decrease is variable from genotype to the other (figure 7). The progression of the fungus is greatly slowed down in plants 35S :: meg A
(d = 0.8cm) and weaker in plants 35S :: meg B (d = 3.8cm) compared at control plants (d = 5.3 cm). Plants A correspond to plants which present the higher proportion of transcripts of (3 megaspermine, while plants B have a very low rate of transcripts coding for elicitin. This could suggest a correlation between the levels of elicitin transcripts detected (and without doubt the levels of / 3 megaspermine products even if these remain below the threshold of detection) and the level of antifungal resistance induced.
The progression of the fungus is also greatly slowed down in the stems of transgenic plants expressing (3 megaspermine under the control of promoter COMT II. We have also shown that the COMT II promoter was induced during infection with P. parasitica. The rods of the COMT II transformants :: meg a, b and e are infected respectively over a length of 0.7 cm, 1 cm and 3.5 cm. The plants a and b are the most resistant to infection with P. nicotianae and correspond also to plants with the highest resistance to VMT. Thus, it appears that the same relative resistance levels are detected with the two pathogens tested. We we can assume that the resistance levels induced in these plants are linked to rate expression of elicitin. An analysis of the levels of transcribed by Northern-blot would perhaps confirm this hypothesis, knowing the difficulty of detect the protein by Western-Blot.
These results show that the constitutive or induced expression of (3 megaspermine in transgenic tobacco allows to confer an increased level of resistance opposite of a fungal infection.
Antibacterial resistance We also tested the resistance of transgenic plants expressing the / 3 megaspermine under the control of the COMT II promoter with respect to a bacterium, Erwinia carotovora. This bacterium is a well-known pathogen of apple earth and is able to macerate plant tissue through the synthesis of enzymes pectinolytics. However, it can also infect other plants such as the tobacco.
For this test, a suspension of E carotovora was infiltrated into the leaves of COMT II :: megaspermine transgenic plants as well as in the leaves of plants controls (corresponding to transgenic plants for the chimeric gene COMT
II :: GUS). A population of 7 plants was inoculated for each of the transformants.
Two days after inoculation of the bacteria, 60% of the control plants (4 plants out of 7) show symptoms of severe infection, inoculated leaves are entirely macerated and the infection tends to spread throughout the whole plant. AT
the reverse 85%
transgenic plants expressing the (3 megaspermine under;
promoter COMTII (6 plants out of 7) are resistant to bacterial infection.
These results show that the induced expression of felicitin increases strongly the resistance to E carotovora. We have previously shown that the promoter COMT II was inducible by secondary elicitors among which the fragments pectics. So we can assume that the pectic fragments produced when lysis of plant tissue induces the COMT II promoter and therefore the synthesis of (3 megaspermine. However, the mechanism allowing the establishment of the Antibacterial resistance remains to be determined.
Material and methods Screening of a genomic library and identification of the corresponding clone to the gene expressed during the defense response.
A tobacco genomic DNA bank (Nicotiana tabacum var. Xanthi) built in ~, -EMBL3 (Clontech) was screened with a radioactive probe cDNA
from COMT II (Pellegrini & al., 1993). Six positive genomic clones were isolated after four purification rounds. These purified clones were tested by PCR for identify one who understands the COMT gene expressed during the hypersensitivity response (HR) tobacco leaves at VMT. Primers 5 'and 3' for PCR analysis are represented with oligonucleotides 1 and 2 below (SEQ ID NO 4 and SEQ ID NO 5 respectively) Oligo 1: 5 'CGTTTCGCAA TGTGATTTGA TC 3' Oligo 2: 5 'CTCAAAATGA CATCCTTTCA TAC 3' They are derived from the 3 'untranslated region of the COMT II cDNA.
The analysis PCR is carried out at 62 ° C (theoretical melting temperature) so to promote specific hybridization. A single clone amplifies the fragment expected from 400 base pairs as does the cDNA used as a positive control. The clone WO 00/56897 3 ~ PCT / FR00 / 00714 COMT II genomics was purified on Quiagen tip according to the protocol described speak manufacturing and subcloned into the Sall restriction site of the plasmid vector puc 18.
DNA sequencing.
DNA sequencing was carried out on denatured double-stranded DNA according to the method of Sànger & al. (1977) using the rhodamin dye kit terminator cycle ready "with ampliPaq FS DNA polymerase (Perkin-Elmer, P / N402078) and a Applied Biosystems 373 sequencer (Perkin-Elmer). The sequence has been determined sure both strands with overlaps using primers synthesized at go already determined sequences.
Analysis of primer extension products.
The primer extension reaction was carried out on total RNA according to the method described in Carrent Protocols in Molecular Biology (Trienzenberg, 1992).
Total RNA isolated from VMT-infected tobacco leaves and tobacco no infected (as negative control] was hybridized to the following oligonucleotide (SEQ ID
NO 6), complementary to the COMT II mRNA and labeled at the 5 'end Oligo 3: 5 'CTGAAGATGT CAATAGTTGC ATGGC 3' The extension product was separated on a 6% polyacrylamide gel. The location of the transcription initiation site was determined on the base of the comigration of extension products with the sequence scale of the obtained from of the corresponding region of the gene (Sànger & al., 1977).
Construction of plasmids.
The truncated versions of the COMTII promoter were amplified by PCR in using the primers PAS 1 in 3 'and PS 1, PS2, PS3 and PS4 in 5' shown below (SEQ ID NO 7 to 11 respectively), leading respectively to amplification of nucleotide fragments of following lengths: -1215 / + 24, (new built less than 600 bp) -420 / + 24, -313 / + 24 and -121 / + 24 (numbering relating to site transcription initiation).
PAS1. 5 'GGTCTAGAGG GCCTTTTAGA GTGTTTTTGT TAG 3' PS1. 5 'AAAGTCGACC GTCCACCTGT GCCAACAAT 3' PS2. 5 'TGTTTGGTGT TATGCTTCCG TCCT 3' PS3. 5 'AAAAAGCTTT TTTAGGATGG AGTACAGCC 3' PS4. 5 'TTTAAGCTTA AAGAGAACCA GACAATATT 3' Constructed -1728 / + 24, -1471 / + 24, -956 / + 24, -937 / + 24, -882 / + 24, -746 / + 24, -676 / + 24, -560 / + 24, -435 / + 24, were obtained with the primers PAS2 in 3 'and primers PSS, PS6, PS7, PSB, PS9, PS10, PS11, PS12 and PS13 respectively in 5 ' presented below (SEQ ID NO 15 to 24 respectively):
PAS2: 5 'CGCGGATCCC CTTTTAGAGT GTTTTTGTTA GGC 3' PS5. 5 'ACGCGTCGAC GTTAGGGACA ATCTATAGTG TCAC 3' PS6. 5 'ACGCGTCGAC GCTCCGAGGA TTTGGCTGTC GCGG 3' PS7. 5 'ACGCGTCGAC GCTGGTTAGG TGAAGTAAAG CATG 3' PS8. 5 'ACGCGTCGAC GCATGTTATA TGAGGAAAGT ACG 3' PS9. 5 'ACGCGTCGAC GCAGCCAGCA CAAGCAAATT CGC 3' PS10: 5 'ACGCGTCGAC GACTTTAACA CACCAACTCC C 3' PS11: 5 'ACGCGTCGAC CGGATCTAGA ATTTGGGTTC ATTC 3' PS12: 5 'ACGCGTCGAC GTGTATACTC CACGTCTCCG GATAC 3' PS13: 5 'ACGCGTCGAC GTTCAATGTT AGGTGTGTTT GG 3' The sequence -1073 / -406 which has been placed upstream of the minimum 35S promoter has was obtained using the 3 'PAS3 primer and the 5' PS14 primer (SEQ ID NO
25 and 26):
PAS3. 5 'CGCGGATCCG CTTAACACCA AACACACCTA ACATTG 3' PS14. 5 'ACGCGTCGAC CAGTGGTGAG TTTAGCTGTC 3' Amplification was carried out for 30 cycles with an initial step of 4 min at 95 ° C and a final step of 5 min at 72 ° C, using the genomic clone like matrix. Each cycle consists of 1 min at 95 ° C followed by 1 min then hybridization 1.5-2 min at 72 ° C. The hybridization step is carried out at 54 ° C, 59 ° C, 55 ° C, and 50 ° C for amplify, respectively, the fragments -1215 / + 24, -420 / + 24, -313 / + 24 and -121 / + 24.
For all the other fragments of the promoter, the hybridization temperature is of 60 ° C. After subcloning into the plasmid pGEM-T (Promega) and amplification in E.
Coli, the promoter fragment -1215 / + 24 is digested with Sall and Xbal, Site (s corresponding being present in the primers PS1 and PSAI respectively. The promoter fragments of 420, 313 and 121 base pairs are digested with Hindlll and Xbal (the site for Hindlll is present in the primers PS2, PS3 and PS4, and the Xbal site in the primer PASI). The fragments -1768 / + 24, -1471 / + 24, -956 / + 24, -937 / + 24, -882 / + 24, -746 / + 24, -676 / + 24, -560 / + 24 and -435 / + 24 are digested with BamHI
present in PAS2 and PAS3 and by Sall present in primers PSS to PS14. All fragments are cloned into the plasmid pBIIOl (Qiagen) so as to create a fusion transcriptional with the reporter gene GUS. All constructs are sequenced for confirm their structure and the junction boundaries.
The construct consisting of the CaMV 35S promoter upstream of the gene for megaspermine was obtained by replacing the Gus gene with the gene for megaspermine (SEQ ID NO 12) in the plasmid pBi121 (Clontech).
Cloning of Phytophthora megasperma cDNA
mg of total Phytophthora megasperma RNA is used as a template for the synthesis of the first strand. Total RNAs are heated 3 min to 65 ° C, cooled on ice, and incubated for 2 h at 42 ° C in 50 ml of transcription buffer reverse (50 mM

10 Tris-HCL pH 8,3 - 15 mM MgCl2 - 75 mM KCL - 1 mM DTT) contenant 1 mM de chaque dNTP, 40 pmol d'amorce anti-sens correspondant à l'oligodT, et 20 U de transcriptase inverse d'AMV (virus de la myéloblastose aviaire). Le mélange est chauffé
a 94°C pour stopper la réaction. Après précipitation du mélange réactionnnel à
l'éthanol, le culot est dissous dans de l'eau stérile distillée.
La synthèse du second brin est initiée par la Taq ADN polymérase. 1/20 du produit de transcription inverse est utilisé pour l'amplification par PCR dans 50 ml de tampon (10 mM Tris-HCL pH 8,3 - 50 mM KCL - 1,5 mM MgCl2 - 0,01% BSA), 200 mM de dNTP, 0,1 mM d' amorces sens et anti-sens et 1 unité de Taq. L' amorce sens (5' ATGAACTTCACCGCTCTGCT 3') dérive de la séquence nucléotidique de la cryptogéine, l'amorce anti-sens correspond à l'oligodT possédant les sites de restriction SstI-EcoRI-HindIII à son extrémité 5'. Le mélange réactionnel est chauffé
pendant 3 min à 94°C, puis est soumis à 30 cycles de réaction comprenant chacun 3 étapes : 1 min à 94°C, 1 min à 49°C et 1 min à 72°C. Après le dernier cycle, l'élongation est poursuivie 10 min à 72°C. Le produit d'amplification obtenu est ensuite cloné dans le vecteur pGEM (Promega) afin d'être séquencé.
Transformation des plantes Les différents construits promoteur COMTII-GUS obtenus précédemment dans le plasmide pBI101 sont introduits dans une souche d'Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pPM6000) (Rossi & al., 1993) par électroporation (Nagel & al., 1990).
Les plants de tabac (Nicotiana tabacum cv Samsun NN) sont transformés par infiltration d'Agrobacterium sur des plants de 10 jours (Rossi & al., 1993). Les plantes sont régénérées sur un milieu Murashige & Skoog (MS) (GIBCO BRL) supplémenté avec du saccharose (30 g/1 pour la formation des tiges et 15 g/1 pour la formation des racines), de la 6-benzylaminopurine (Serva) (2 mg/ml), et de l'acide naphtalène acétique (Serva) (0,05 mg/ml). La kanamycine (150 mg/ml) est employée comme agent de sélection durant les étapes de régénération in vitro et de propagation. Des plantes contrôles ont été
préparées par transformation avec le vecteur vide pBI101 ou le vecteur p min GUS
(contenant le gène rapporteur GUS sous contrôle du promoteur minimum du RNA 35 S
du CaMV). Sept à 20 transformants indépendants sont régénérés pour chaque construit.
Les transformants primaires sont auto fécondés et les graines F 1 sont germées sur un milieu MS comprenant 300 mg/1 de kanamycine.
Essais enzymatiques La localisation histochimique du GUS dans les plantes transgéniques est effectuée selon la méthode décrite par Jefferson & al. (1987). La réaction histochimique est incubée dans l'obscurité à 37°C pendant 12 heures. Les tissus sont rincés, d'abord avec un tampon phosphate 50 mM pour terminer la réaction, puis plusieurs fois avec de l'éthanol de 70% à 90% pour éliminer la pigmentation des tissus. Après la réaction histochimique, les tissus sont rincés dans l'éthanol à 70% et sont inclus dans une historésine de fixation (Jung) pour des sections transversales de feuilles.
Les blocs d'historésines sont coupés avec un microtome et des photographies sont prises à un grossissement de 10 à 40 fois par un microscope binoculaire.
Le dosage des activités COMTII et GUS a été effectué sur 100mg de tissus. Le tissu est homogénisé dans un tampon phosphate de sodium 100mM à pH 7,5 et 10 mM
de DTT après addition de polyclar AT (Serva) et de quartz. Les extraits bruts sont clarifiés par centrifugation et par filtration sur de la laine de verre. La mesure des activités GUS et COMTII est effectuée sur les même extraits bruts. Pour la mesure de l'activité COMTII, un aliquote de l'extrait protéique est ajouté à 1 ml de tampon phosphate comprenant 100p,M de catéchol, SOp.M de S-adénosyl-L-méthionine tritiée (1,5 105 cpm/ml) et incubé pendant 3 heures à 37°C. La réaction est stoppée par addition de 1001 d'acide sulfurique 9M. Le produit radioactif de la réaction, l'acide ferulique, est extrait par 5 ml d'une solution NA de scintillation (Beckman) et la radioactivité est comptée sur un appareil Beckman LS 9000. La mesure fluorimétrique de l'activité GUS
est effectuée sur les mêmes échantillons selon la procédure de Jefferson & al.
(1987). Le contenu protéique est déterminé par la méthode de Bradford ( 1976) en employant les réactifs Biorad.
Construits COMTII-meg et 355-meg Le vecteur pGEM (Promega) ne possédant pas les sites de clonage compatibles ceux du pBI101, une étape de sous clonage dans le vecteur Bluescript (pSK) a été
nécessaire. L'insert BamHI/SstI provenant du pSK::mégaspermine a été purifié
pour le clonage dans le vecteur binaire pBi101 (Clontech).
Le vecteur pBilO1::COMT II GUS précédemment construit et correspondant au promoteur -1215/+24 fusionné au gène rapporteur GUS a été utilisé pour obtenir le gène chimérique court II meg. Le gène GUS est excisé par digestion du plasmide binaire par BamHI et SstI. Un site SnabI présent dans le gène GUS permet de couper celui-ci et évite qu'il se religue avec le plasmide binaire puisque aucune étape de purification du vecteur n'est effectuée. Les enzymes de restriction sont inactivées par la chaleur. L'ADN
digéré est extrait par un mélange phénol : chloroforme (1 : 1), puis chloroforme : alcool isoamilique (24 : 1) et précipité à l'éthanol. L'ADN digéré est remis en suspension dans de l'eau stérile et ligué avec l'insert.
Le vecteur pBi121 (Clontech) portant le gène 355-GUS a été utilisé pour obtenir le gène chimérique 355 meg. Le clonage est effectué selon la méthode décrite précédemment.
Les constructions ont été ensuite vérifiées par séquençage.
Plants de tabac.
Les plants de tabac transgéniques (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sont cultivés in vitro sous un cycle de lumière de 12h(24°C)/12(20°C) pendant 5 semaines après la germination. Ils sont propagés sur un milieu MS avec addition de kanamycine (150 mg/1) comme agent de sélection. Ils sont ensuite transférés en serre et cultivés en sol sous un cycle de lumière 16h/8h à 22°+2°C.
Analyse des ARN de plantes par Northern Extraction des AR1V totaux Les tissus sont finement broyés dans de l'azote liquide, puis dans 1 à 2 volumes de tampon d'extraction (0,2 M borate de sodium pH 9 - 30 mM EGTA - SDS 1% - 5 mM DTT). Le mélange est versé dans un tube contenant 1 volume de phénol/chloroforme (1:1), vortexé, puis centrifugé 10 min à SOOOg. Une deuxième extraction au phénol/chloroforme (1:1) est réalisée, suivie d'une troisième au chloroforme/alcool isoamylique (24:1). Les ARN présents dans le surnageant sont spécifiquement précipités par addition de 1 volume d'une solution de LiCI (4 M) EDTA
(10 mM) pendant une nuit à 0°C. Le tout est centrifugé 30 min à 10000g et le culot est lavé avec une solution de LiCI (2 M), EDTA (5 mM). Les ARN totaux sont repris dans de l'eau et à nouveau précipités à l'éthanol 70%, NaCI (0,2 mM). Après centrifugation 30 min à 10000 g, le culot est lavé deux fois à l'éthanol 70%, puis repris dans 50 ~,l d'eau. Les ÄRN sont dosés en mesurant l'absorbance d'une solution diluée à 260 (1 unité
D0260 = 40 ~g/ml d'ARN), et leur intégrité est vérifiée par migration sur un gel d'agarose non dénaturant coloré au BET.
Electrophorèse Les ARN sont séparés sur gel d'agarose dénaturant préparé dans un tampon MOPS xl contenant 16% de formaldéhyde. Des gels de 1,2% d'agarose (p/v) ont été
utilisés. Les échantillons d'ARN sont dénaturés 15 min à 65°C en présence de 3 volumes de solution de dénaturation (MOPS x5 101, formamide 501, formaldéhyde 161) par volume d'ARN, et refroidis rapidement dans la glace. Du tampon de charge est ajouté (MOPSxI, glycérol 50 % , bleu de bromophénol 0,05 %) à raison de 1/10 du volume. Après migration dans du tampon MOPS xl, le gel peut être coloré au BET
(0,5 ~g/ml) 1 à 2 min, puis abondamment lavé à l'eau stérile. Les ARN sont alors visualisés sous lumière IJV.
"Northern Blot"
La technique du "Northern-blot" permet de détecter, parmi les ARN totaux, les messagers homologues à une sonde d'ADN radioactive. Celle ci est réalisée à
l'aide du kit de "Random Priming" (Amersham) en suivant le protocole fourni.
10 ~g d'ARN totaux de tige ou de feuille sont déposés sur gel d'agarose 1,2%
(p/v) dénaturant ainsi qu'un marqueur de taille d'ARN (Promega) déposé en bordure du gel. Après migration, le gel est rincé à l'eau stérile afin d'enlever l'excès de formaldéhyde. La bande de migration correspondant au marqueur de taille est découpée, colorée au BET et photographiée.
Les ARN sont transférés par capillarité pendant 5 h sur une membrane de Nylon positivement chargée (Hybond N+, Amersham) avec du tampon SSC x20. Après transfert la membrane est rincée dans le tampon SSC x2 et les ARN sont fixés de façon covalente sur la membrane de nylon par exposition à la lumière ultraviolette (1200 J, UV Stratalinker 2400, Stratagene). La membrane est hybridée à une sonde radioactive et traitée comme decrit dans Sambrook et al..
Analyse des protéines de plantes par Western Extraction des protéines foliaires L'extraction peut se faire immédiatement après la récolte ou sur des échantillons congelés. 1 SO g de tissus foliaires sont broyés au mortier dans du tampon acétate de sodium 0.5 M pH 5.2 contenant du 2-13-mercaptoéthanol (15 mM) et du charbon actif.
Le volume de tampon est ajusté de manière à obtenir un broyât fin et homogène.
Celui-ci est ensuite filtré sur gaze puis centrifugé pendant 30 min à 15 000 g. Le surnageant constituant l'extrait brut est alors analysé.
Dosage des protéines La concentration protéique des extraits bruts est dosée par la méthode de Bradford (1976) dans des plaques de microtitration : à 10 ~l d'un extrait à
tester sont ajoutés 200 ~1 de réactif de Bradford xl (Biorad). 2 ~l d'extrait brut de feuille sont complétés à 10 ~1 par du tampon. Chaque échantillon est testé trois fois.
Après 5 à 10 min, la plaque est lue au spectrophotomètre MR 700 (Dynatech) avec le filtre 5 (660 nm). Le blanc est constitué de 10 ~l de tampon et les valeurs sont comparées à
une gamme étalon réalisée avec de la sérum-albumine bovine (SAB, Sigma).
Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant L'analyse sur gel permet de déterminer la masse moléculaire des protéines en comparant leur mobilité relative à celles de protéines de masse moléculaire connue. A
l'extrait protéique est ajouté 20% (v/v) de tampon de charge (60 mM Tris-HC1 pH 6.8, 5% (v/v) 2-13-mercaptoéthanol, 10% (v/v) glycérol, 0.01% (v/v) bleu de bromophénol, 1% SDS). Les échantillons sont chauffés à 100°C pendant 1 min avant d'être déposés.
Les gels (0.75 mm x 7 cm x 9 cm) sont coulés entre une plaque de verre et une plaque d'alumine. Le tampon d'électrophorèse est composé de 192 mM glycine, 25 mM
Tris et 0.1 % SDS. La migration verticale est réalisée dans une cuve d'électrophorèse Hoeffner à
une intensité de 20 mA par gel pour une tension de 100 à 160 V.
Transfert et immunodétection des protéines sur nitrocellulose (Western-Blot) WO 00/56897 3~ PCT/FR00/00714 Après migration électrophorétique sur gel d'acrylamide, les protéines peuvent être transférées, en milieu liquide dans le tampon de transfert (0,16 M Tris -1,20 M
glycine), sur membrane de type nitrocellulose ou nylon PVDF (Immobilon, Millipore).
Avant le transfert le gel est équilibré dans le tampon de transfert. La membrane PVDF
est activée 1 min dans le méthanol puis équilibrée également dans le tampon de transfert. L'électrotransfert s'effectue pendant 90 min à 150 mA.
L'immunodétection a été réalisée grace à des anticorps spécifiques dirigés contre la mégaspermine ou la protéine de coque du VML. La révélation est effectuée par chimioluminescence avec le kit ECL (Amersham).
Traitement des plantes.
Avant le traitement, les plantes sont conditionnées quelques jours dans une logette climatisée à 22°C ~ 1 °C, sous une luminosité de 5000 lux et une photopériode J/N de 16h/8h. Ces conditions sont maintenues durant l'infection, à
l'exception de l'infection par Erwinia carotovora.
Inoculation du virus de la mosaïque du tabac (VMT) Les feuilles de plants de tabac cultivées en serre et âgées de 6 semaines, sont frottées à l'aide d'un coton préalablement imbibé dans une suspension de VMT
purifié
(souche commune U1 0,1 à 1 ~g/ml) contenant un abrasif, la célite (10 mg/ml).
Les feuilles de vitroplants de tabac, âgés de 6 à 7 semaines après repiquage, sont frottées à
l'aide d'une spatule en verre fritté préalablement immergée dans une suspension de VMT purifié (souche commune U1 à 4 pg/ml, filtrée sur membrane de 0,45 gym) et un abrasif, la célite (10 mg / ml). Après quelques minutes de contact, les feuilles sont rincées à l'eau pour enlever l'excès de célite et de particules virales.
Inoculation du virus de la mosaïque de la luzerne (VML) Les feuilles de plants de tabac, âgés de 6 semaines, sont frottées à l'aide d'une spatule en verre trempée dans une solution tampon contenant l'ARN viral (1 à 5 ~g/ml) et un abrasif, la célite (10 mg/ml). L'inoculum par feuille (pour une plante) correspond à
200 ml de solution tampon : Kpi , pH 7,2, 0,04M, 1 ml RNAsine, DTT 1mM final, Macaloïd (0,05%), ARN total de levure 0,25 mg/ml, ARN viral (1 à 5 pg/ml) Inoculation de Phytophthora parasitica var. nicotianae Le mycélium de P. p. nicotianae est cultivé sur boîte de Pétri contenant un milieu solide (milieu avoine : 100 g de graines d'avoine broyées sont mises en suspension dans 1 1 d'eau distillée. Le milieu est filtré sur gaze. Le milieu est autoclavé
après addition de 15 g d'agar).
L'inoculation a été effectuée après décapitation des plants de tabac. La tige de plants de tabac âgés de 10 semaines est sectionnée sous le bourgeon apical.
Une pastille de mycélium de P. p. nicotianae est prélevée en périphérie d'une culture de 7 jours sur milieu d'avoine et est déposée sur la section de la tige. La tige mise en contact avec la pastille de mycélium est en capsulée dans une feuille d'aluminium afin d'éviter une dessiccation trop rapide des tissus au site d'inoculation.
Inoculation d'Erwinia carotovora La souche d'Erwinia carotovora est mise en culture toute une nuit à
28°C dans du milieu LB. Après centrifugation, le culot bactérien est repris dans une solution de MgS04 (IOmM) pour obtenir une concentration bactérienne approximative de 1.10 cfu (colony-forming units)/ml. Les feuilles de plants de tabac âgés de 4 à 5 semaines sont infiltrées par cette suspension bactérienne. Un seul site est inoculé par feuille, en infiltrant à l'aide d'un pipette-man SO ml de la suspension bactérienne. Les plantes sont placées ensuite en logettes en condition d'humidité élevée et à une température de 26°C
~ 1 °C pendant l'infection.
Traitement par un éliciteur : Des solutions sont infiltrées par un seringue équipée d'une aiguille fine dans le mésophyle des feuilles. Les zones infiltrées sont délimitées avec un marqueur " felt-tip ". Les zones infiltrées sont récoltées 16 heures après le traitement. Les feuilles sont traitées avec une solution de /3-mégaspermine, un éliciteur protéique purifié d'un milieu de culture de Phytophthora megasperma (Kauffmann & al., 1993), ou d'oligosaccharides comme les oligomères de chitine (100 ~g/ml), des fragments de glucane (200 ~g/ml), et des fragments de pectines (200 ~g/ml). Les plantes témoins sont infiltrées avec de l'eau.
Blessure : Des feuilles totalement développées sont blessées avec un hémostat ou percées avec des aiguilles. Les feuilles blessées sont ensuite récoltées 16 ou 24 heures après blessure pour les analyses fluorimétriques ou histochimiques.
Traitement UV : La partie supérieure de plantes transgéniques âgées de 5 semaines est exposée aux rayons UV (1=254nm) pendant 10 minutes puis les plantes sont placées dans l'obscurité jusqu'à la collecte des tissus 16 heures suivant le traitement.
Traitements chimiques : (1) Des solutions de SA (1mM) ou de INA (SOmM) sont infiltrées dans les feuilles de tabac en employant le protocole décrit pour le traitement par des éliciteurs. (2) Sous des conditions de culture identiques, on pulvérise sur les plantes transgéniques des solutions de SA (IOmM), INA (1mM) ou BTH (SOmM). Les tissus sont recueillis 16 heures après traitement. Les plantes traitées avec de l'eau sont utilisées comme témoin. (3) Des plantes âgées de sept semaines ou des feuilles de vitroplants en survie sur de l'eau sont transférées dans des boites transparentes et hermétiques et soumises à une atmosphère de 3,SmM de MeJa (Serva). Les tissus sont prélevés à différents temps suivant le traitement. Les plantes témoins sont placées dans les même boites sans MeJa.
Références Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (1998) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons.
Bradford M.M. (1976). A rapide and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding, Anal.
Biochem. 72, 248-254.
Collendavelloo J, Legrand M, Geoffroy P, Barthelemy J & Fritig B (1981).
Purification and properties of the three o-diphenol O-methyltransferases of tobacco leaves.
Phytochemistry 20, 611-616.
Jefferson R.A., Kavanagh T.A. & Bevan M.W. (1987). GUS fusions : b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907.
Kamoun S, Young M, Glascock CB & Tyler BM (1993). A gene encoding a host-specific elicitor protein of Phytophthora: host specificity and induction of resistance to bacterial and fungal pathogens. Mol. Plant Microbe Interact. 6, 15-25.
Kauffmann S., Baillieul F., Genetet L, Kopp M. & Fritig B. (1993). Two proteins secreted by Phytophthora megasperma elicit and defense-related responses in tobacco.
In Mechanisms of plant defense responses, B. Fritig and M. Legrand, Dordrecht Kluwer Academic Publishers, 140-143.

Nagel R., Eliott A., Masel A., Birch R.G. & Manners J.M. (1990).
Electroporation of binary Ti plasmid vector into Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. FEMS Microbiol. Lett. 67, 325-328.
Panabières F, Marais A, Berre JYL, Penot I, Fournier D & Ricci P (1995).
Characterization of a gene cluster of Phytophthora cryptogea which codes for elicitins, proteins inducing a hypersensitive-like response in tobacco. Mol. Plant Microbe Interact. 8, 1995.
Pellegrini L., Geoffroy P., Fritig B. & Legrand M. (1993). Molecular cloning and expression of a new clans of ortho-diphenol-O-methyltransferases induced in tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves by infection or elicitor treatment. Plant Physiol. 103, 509-517.
Rossi L., Escudero J., Hohn B. & Tinland B. (1993). Efftcient and sensitive assay for T
DNA dependant transient gene expression. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 220-229.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Singer F., Nicklens S. & Coulson A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467.
Trienzenberg S.J. (1992). Primer extension. In Current Protocole in Molecular Biology.
J. Wiley & Sons eds. 20.4.8.1 LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DÉPOSANT:
(A) NOM: RHOBIO
(B) RUE: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69009 (ii) TITRE DE L'INVENTION: Promoteur inductible COMTII, gène chimère le comprenant et plantes transformées (iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 26 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: l:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1863 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN (génomique) (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:667..672 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite W inverse"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:820..830 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite L inverse"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: enhancer (B) EMPLACEMENT:845..852 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1034..1047 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite P"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1221..1226 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite G"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1343..1356 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite L inverse"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc signal (B) EMPLACEMENT:1369..1374 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite A"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1377..1382 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite GT"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1483..1488 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite GT"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1562..1567 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite W inverse"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1600..1614 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite L"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CAAT_signal (B) EMPLACEMENT:1675..1679 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT:1681..1690 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "boite E"
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CAAT_signal (B) EMPLACEMENT:1695..1699 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TATA_signal (B) EMPLACEMENT:1735..1739 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: transcription origin (B) EMPLACEMENT:1772 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 1:

(2) INFORMATIONS LA SEQ
POUR ID N0:
2:

(i) CARACTRISTIQUES
DE LA
SQUENCE:

(A) LONGUEUR:

paires de bases (B) TYPE:
nuclotide (C) NOMBRE
DE BRINS:
double (D) CONFIGURATION:
linaire (ii) TYPE
DE MOLCULE:
ADN (gnomique) (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: promoteur (B) EMPLACEMENT:1..1860 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: transcription origine (B) EMPLACEMENT:1772 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: exon (B) EMPLACEMENT:1861..2281 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: intron (B) EMPLACEMENT:2282..3633 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: exon (B) EMPLACEMENT:3634..3944 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: intron (B) EMPLACEMENT:3945..4726 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: exon (B) EMPLACEMENT:4727..5089 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: terminateur (B) EMPLACEMENT:5090..5371 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 2:

CGGTCAAACTTTCAAAAGAGAAAGAAATAACTAGACAAACTTCAACAACCy~IACCTGCCCA1620 ATCAGGTATT

WO 00/56897 g PCT/FR00/00714 WO 00/56897 ~ PCT/FR00/00714 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1095 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1095 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:

ACC AGC ACA

MetGluSerSer ThrLysSerGln IleProThr GlnSerGlu GluGlu ArgAsnCysThr TyrAlaMetGln LeuLeuSer SerSerVal LeuPro PheValLeuHis SerThrIleGln LeuGluVal PheGluIle LeuAla LysSerAsnAsp ThrLysLeuSer AlaSerGln IleValSer GlnIle ProAsnCysThr LysProGluAla ProThrMet LeuAsnArg MetLeu TyrValLeuAla SerTyrSerLeu PheThrCys SerIleVal GluAsp GluLysAsnAsn GlyGlyGlnLys ArgValTyr GlyLeuSer GlnVal GlyLysPhePhe ValLysAsnGlu AsnGlyAla SerMetGly ProLeu LeuAlaLeuLeu GlnAsnLysVal PheIleAsn SerTrpPhe GluLeu LysAspAlaVal LeuGluGlyGly ValProPhe AspArgVal HisGly ValHisAlaPhe GluTyrProLys SerAspPro LysPheAsn AspVal WO 00/56897 g PCT/FR00/00714 PheAsnLys AlaMetIle AsnHis ThrThrValVa1 MetLysLysIle LeuGluAsn TyrLysGly PheGlu AsnLeuLysThr LeuValAspVal GlyGlyGly LeuGlyVal AsnLeu LysMetIleThr SerLysTyrPro ThrIleLys GlyThrAsn PheAsp LeuProHisVal ValGlnHisAla ProSerTyr ProGlyVal GluHis ValGlyGlyAsp MetPheGluSer ValProGlu GlyAspAla IlePhe MetLysTrpIle LeuHisAspTrp SerAspSer HisAsnLeu LysLeu LeuLysAsnCys TyrLysAlaLeu ProAspAsn GlyLysVal IleVal ValGluAlaIle LeuProValLys ProAspIle AspThrAla ValVal GlyValSerGln CysAspLeuIle MetMetAla GlnAsnPro GlyGly LysGluArgSer GluGluGluPhe ArgAlaLeu AlaThrGlu AlaGly PheLysGlyVal AsnLeuIleCys CysValCys AsnPheTrp ValMet GluPheCysLys (2)INFORMATIONS N0:4:
POUR
LA
SEQ
ID

(i)CARACTRISTIQUES SQ UENCE:
DE
LA

(A) 22 LONGUEUR: paires de bases (B) nucloti de TYPE:

(C) BRINS:
NOMBRE simple DE

(D) linaire CONFIGURATION:

(ii)TY PE synthtique n MOLCULE:
Oligonuclotide (xi)DESCRI PTION LA SEQ NO:4:
DE SQUENCE: ID

TC

(2)INFORMATIONS UR N0:5:
PO LA
SEQ
ID

(i)CARACTRISTIQUES SQ UENCE:
DE
LA

(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique n° 2 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 5:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique n° 3 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 6:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PAS1 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 7:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 8:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PSl (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 8:
AAAGTCGACC GTCCACCTGT GCCAACAAT 2g (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS2 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 9:

WO 00/56897 1 ~ PCT/FR00/00714 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 10:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 292 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS3 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 10:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 11:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS4 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 354 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..60 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= preproteine (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:61..60 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= preproteine (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 12:
atgaacttc accgctctgctc gctgccgtc gccgccgcc ttggtcgga 48 MetAsnPhe ThrAlaLeuLeu AlaAlaVal AlaAlaAla LeuValGly tctgccaac gccaccgcgtgc accgccacc cagcagacc gctgcgtac 96 SerAlaAsn AlaThrAlaCys ThrAlaThr GlnGlnThr AlaAlaTyr aagacactc gtgagcatcctg tcggacgcg tcgttcaac aagtgctct 144 LysThrLeu ValSerIleLeu SerAspAla SerPheAsn LysCysSer acggattcg ggctactccatg ctgacggcc aaggccctc cccaccacg 192 ThrAspSer GlyTyrSerMet LeuThrAla LysAlaLeu ProThrThr
10 Tris-HCL pH 8.3 - 15 mM MgCl2 - 75 mM KCL - 1 mM DTT) containing 1 mM of each dNTP, 40 pmol of antisense primer corresponding to oligodT, and 20 U of AMV reverse transcriptase (avian myeloblastosis virus). The mixture is heated at 94 ° C to stop the reaction. After precipitation of the mixture reactionary to ethanol, the pellet is dissolved in sterile distilled water.
The synthesis of the second strand is initiated by Taq DNA polymerase. 1/20 of reverse transcript is used for PCR amplification in 50 ml of buffer (10 mM Tris-HCL pH 8.3 - 50 mM KCL - 1.5 mM MgCl2 - 0.01% BSA), 200 mM dNTP, 0.1 mM sense and antisense primers and 1 unit of Taq. The primer sense (5 ' ATGAACTTCACCGCTCTGCT 3 ') is derived from the nucleotide sequence of the cryptogeine, the antisense primer corresponds to oligodT having the sites of restriction SstI-EcoRI-HindIII at its 5 'end. The reaction mixture is heated for 3 min at 94 ° C, then is subjected to 30 reaction cycles each comprising 3 steps: 1 min at 94 ° C, 1 min at 49 ° C and 1 min at 72 ° C. After the last cycle, the elongation is continued 10 min at 72 ° C. The amplification product obtained is then cloned in the vector pGEM (Promega) in order to be sequenced.
Transformation of plants The different COMTII-GUS promoter constructs previously obtained in the plasmid pBI101 are introduced into a strain of Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pPM6000) (Rossi & al., 1993) by electroporation (Nagel & al., 1990).
The tobacco plants (Nicotiana tabacum cv Samsun NN) are transformed by infiltration Agrobacterium on 10-day-old plants (Rossi & al., 1993). Plants are regenerated on Murashige & Skoog (MS) medium (GIBCO BRL) supplemented with of sucrose (30 g / 1 for the formation of stems and 15 g / 1 for the formation of roots), of 6-benzylaminopurine (Serva) (2 mg / ml), and naphthalene acetic acid (Serva) (0.05 mg / ml). Kanamycin (150 mg / ml) is used as a screening agent during the stages of in vitro regeneration and propagation. Plant checks were prepared by transformation with the empty vector pBI101 or the vector p min GUS
(containing the reporter gene GUS under control of the minimum promoter of RNA 35 S
of CaMV). Seven to 20 independent transformants are regenerated for each built.
The primary transformants are self-fertilized and the F 1 seeds are germinated on a MS medium comprising 300 mg / l of kanamycin.
Enzyme assays The histochemical localization of GUS in transgenic plants is performed according to the method described by Jefferson & al. (1987). Histochemical reaction East incubated in the dark at 37 ° C for 12 hours. The fabrics are rinsed, first with 50 mM phosphate buffer to terminate the reaction, then several times with of ethanol from 70% to 90% to remove pigmentation from the tissues. After the reaction histochemical, the tissues are rinsed in 70% ethanol and are included in a fixing historesin (Jung) for cross sections of sheets.
Blocks of historesins are cut with a microtome and photographs are taken has a magnification 10 to 40 times with a binocular microscope.
The COMTII and GUS activities were assayed on 100 mg of tissue. The tissue is homogenized in a 100mM sodium phosphate buffer at pH 7.5 and 10 mM
of DTT after addition of polyclar AT (Serva) and quartz. Raw extracts are clarified by centrifugation and by filtration on glass wool. The measure of GUS and COMTII activities are carried out on the same raw extracts. For the measure of COMTII activity, an aliquot of the protein extract is added to 1 ml of buffer phosphate comprising 100p, M of catechol, SOp.M of S-adenosyl-L-methionine tritiate (1.5 105 cpm / ml) and incubated for 3 hours at 37 ° C. The reaction is stopped by addition 1001 9M sulfuric acid. The radioactive product of the reaction, the acid ferulic, is extracted with 5 ml of an NA scintillation solution (Beckman) and the radioactivity is counted on a Beckman LS 9000 device. The fluorimetric measurement of GUS activity is performed on the same samples according to the procedure of Jefferson & al.
(1987). The protein content is determined by the method of Bradford (1976) in employing the Biorad reagents.
COMTII-meg and 355-meg built The vector pGEM (Promega) without the compatible cloning sites those of pBI101, a subcloning step in the Bluescript vector (pSK) a summer necessary. The BamHI / SstI insert from pSK :: megaspermine has been purified for the cloning into the binary vector pBi101 (Clontech).
The vector pBilO1 :: COMT II GUS previously constructed and corresponding to the promoter -1215 / + 24 fused to the reporter gene GUS was used to obtain the gene chimeric short II meg. The GUS gene is excised by digestion of the plasmid binary by BamHI and SstI. A SnabI site present in the GUS gene makes it possible to cut this one here and prevents it from religionizing with the binary plasmid since no step of purification of vector is performed. Restriction enzymes are inactivated by heat. DNA
digested is extracted with a phenol: chloroform mixture (1: 1), then chloroform: alcohol isoamilic (24: 1) and precipitated with ethanol. Digested DNA is put back in suspension in sterile water and ligated with the insert.
The vector pBi121 (Clontech) carrying the 355-GUS gene was used to get the 355 meg chimeric gene. Cloning is carried out according to the method described previously.
The constructions were then verified by sequencing.
Tobacco plants.
Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) are grown in vitro under a 12h (24 ° C) / 12 (20 ° C) light cycle for 5 weeks after germination. They are propagated on an MS medium with the addition of kanamycin (150 mg / 1) as a screening agent. They are then transferred to the greenhouse and grown in soil under a 16h / 8h light cycle at 22 ° + 2 ° C.
Analysis of plant RNA by Northern Extraction of total AR1V
The tissues are finely ground in liquid nitrogen, then in 1 to 2 volumes extraction buffer (0.2 M sodium borate pH 9 - 30 mM EGTA - SDS 1% - 5 mM DTT). The mixture is poured into a tube containing 1 volume of phenol / chloroform (1: 1), vortexed, then centrifuged 10 min at SOOOg. A
second phenol / chloroform extraction (1: 1) is performed, followed by a third chloroform / isoamyl alcohol (24: 1). The RNAs present in the supernatant are specifically precipitated by adding 1 volume of a LiCl solution (4 M) EDTA
(10 mM) overnight at 0 ° C. The whole is centrifuged 30 min at 10000g and the base is washed with a solution of LiCI (2 M), EDTA (5 mM). Total RNAs are taken over in water and again precipitated with 70% ethanol, NaCl (0.2 mM). After centrifugation 30 min at 10,000 g, the pellet is washed twice with 70% ethanol, then taken up in 50 ~, l of water. The ÄRNs are dosed by measuring the absorbance of a solution diluted to 260 (1 unit D0260 = 40 ~ g / ml of RNA), and their integrity is verified by migration on a gel non-denaturing agarose colored with BET.
Electrophoresis The RNAs are separated on denaturing agarose gel prepared in a buffer MOPS xl containing 16% formaldehyde. 1.2% agarose (w / v) gels have summer used. The RNA samples are denatured for 15 min at 65 ° C. in presence of 3 volumes of denaturing solution (MOPS x5 101, formamide 501, formaldehyde 161) by volume of RNA, and quickly cooled in ice. Buffer charge is added (MOPSxI, glycerol 50%, bromophenol blue 0.05%) at a rate of 1/10 of volume. After migration in MOPS xl buffer, the gel can be stained with BET
(0.5 ~ g / ml) 1 to 2 min, then thoroughly washed with sterile water. The NRAs are then viewed under IJV light.
"Northern Blot"
The "Northern-blot" technique makes it possible to detect, among the total RNAs, the messengers homologous to a radioactive DNA probe. This is done at help from Random Priming kit (Amersham) following the protocol provided.
10 ~ g of total stem or leaf RNA are deposited on 1.2% agarose gel (w / v) denaturing as well as an RNA size marker (Promega) deposited in border of gel. After migration, the gel is rinsed with sterile water in order to remove the excess of formaldehyde. The migration band corresponding to the size marker is cut out, BET stained and photographed.
The RNAs are transferred by capillary action for 5 h on a nylon membrane positively charged (Hybond N +, Amersham) with SSC x20 buffer. After transfer the membrane is rinsed in the SSC x2 buffer and the RNAs are fixed in a way covalent on the nylon membrane by exposure to ultraviolet light (1200 J, UV Stratalinker 2400, Stratagene). The membrane is hybridized to a probe radioactive and treated as described in Sambrook et al.
Plant protein analysis by Western Leaf protein extraction Extraction can be done immediately after harvest or on samples frozen. 1 SO g of leaf tissue is ground in a mortar in buffer acetate sodium 0.5 M pH 5.2 containing 2-13-mercaptoethanol (15 mM) and carbon active.
The volume of buffer is adjusted so as to obtain a fine and homogeneous ground material.
The one-it is then filtered through gauze and then centrifuged for 30 min at 15,000 g. The supernatant constituting the raw extract is then analyzed.
Protein determination The protein concentration of the crude extracts is determined by the method of Bradford (1976) in microtiter plates: at 10 ~ l of an extract to test are added 200 ~ 1 of Bradford reagent xl (Biorad). 2 ~ l of crude extract sheet are supplemented to 10 ~ 1 with buffer. Each sample is tested three times.
After 5 to 10 min, the plate is read with a spectrophotometer MR 700 (Dynatech) with the filter 5 (660 nm). The blank consists of 10 ~ l of buffer and the values are compared with a standard range produced with bovine serum albumin (SAB, Sigma).
Separation of proteins on denaturing polyacrylamide gel The gel analysis makes it possible to determine the molecular mass of the proteins in comparing their relative mobility to that of molecular weight proteins known. AT
the protein extract is added 20% (v / v) loading buffer (60 mM Tris-HC1 pH 6.8, 5% (v / v) 2-13-mercaptoethanol, 10% (v / v) glycerol, 0.01% (v / v) blue bromophenol, 1% SDS). The samples are heated at 100 ° C for 1 min before to be dropped off.
The gels (0.75 mm x 7 cm x 9 cm) are poured between a glass plate and a plate alumina. The electrophoresis buffer is composed of 192 mM glycine, 25 mM
Tris and 0.1% SDS. Vertical migration is carried out in an electrophoresis tank Hoeffner to an intensity of 20 mA per gel for a voltage of 100 to 160 V.
Protein transfer and immunodetection on nitrocellulose (Western-Blot) WO 00/56897 3 ~ PCT / FR00 / 00714 After electrophoretic migration on acrylamide gel, the proteins can be transferred, in liquid medium to the transfer buffer (0.16 M Tris -1.20M
glycine), on a nitrocellulose or PVDF nylon membrane (Immobilon, Millipore).
Before the transfer, the gel is balanced in the transfer buffer. The PVDF membrane is activated for 1 min in methanol and then equilibrated in the buffer of transfer. The electrotransfer takes place for 90 min at 150 mA.
Immunodetection was carried out using specific antibodies directed against megaspermine or the VML shell protein. The revelation is carried out through chemiluminescence with the ECL kit (Amersham).
Plant treatment.
Before treatment, the plants are conditioned for a few days in a air-conditioned cubicle at 22 ° C ~ 1 ° C, under a brightness of 5000 lux and a photoperiod J / N from 4 p.m. / 8 a.m. These conditions are maintained during infection, the exception of infection with Erwinia carotovora.
Tobacco Mosaic Virus (VMT) Inoculation The leaves of tobacco plants grown in a greenhouse and 6 weeks old, are rubbed with a cotton pad previously soaked in a suspension of VMT
purified (common strain U1 0.1 to 1 ~ g / ml) containing an abrasive, celite (10 mg / ml).
The tobacco vitroplant leaves, 6 to 7 weeks old after transplanting, are rubbed to using a sintered glass spatula previously immersed in a suspension of Purified VMT (common strain U1 at 4 pg / ml, filtered on 0.45 gym membrane) and a abrasive, celite (10 mg / ml). After a few minutes of contact, the leaves are rinsed with water to remove excess celite and virus particles.
Alfalfa mosaic virus (MLV) inoculation The leaves of tobacco plants, 6 weeks old, are rubbed using of a glass spatula soaked in a buffer solution containing viral RNA (1 to 5 ~ g / ml) and an abrasive, celite (10 mg / ml). Inoculum per leaf (for one plant) correspond to 200 ml of buffer solution: Kpi, pH 7.2, 0.04M, 1 ml RNAsin, DTT 1mM final, Macaloid (0.05%), total yeast RNA 0.25 mg / ml, viral RNA (1 to 5 pg / ml) Inoculation of Phytophthora parasitica var. nicotianae The mycelium of P. p. nicotianae is grown on a petri dish containing a solid medium (oat medium: 100 g of crushed oat seeds are placed in suspension in 1 1 of distilled water. The medium is filtered on gauze. The middle is autoclaved after addition of 15 g of agar).
The inoculation was carried out after decapitation of the tobacco plants. The rod of 10-week-old tobacco plants are sectioned under the apical bud.
Pellet mycelium of P. p. nicotianae is collected at the periphery of a culture of 7 days on oat medium and is deposited on the stem section. The rod put in contact with mycelium tablet is encapsulated in aluminum foil so to avoid a too rapid drying of tissues at the site of inoculation.
Inoculation of Erwinia carotovora The strain of Erwinia carotovora is cultivated overnight in 28 ° C in from the middle LB. After centrifugation, the bacterial pellet is taken up in a solution of MgS04 (IOmM) to obtain an approximate bacterial concentration of 1.10 cfu (colony-forming units) / ml. The leaves of tobacco plants aged 4 to 5 weeks are infiltrated by this bacterial suspension. Only one site is inoculated by leaf in infiltrating using a pipette-man SO ml of the bacterial suspension. The plants are then placed in cubicles in high humidity conditions and at a temperature of 26 ° C
~ 1 ° C during infection.
Treatment by an elicitor: Solutions are infiltrated by a syringe equipped with a fine needle in the leaf mesophyle. The areas infiltrated are delimited with a felt-tip marker. Infiltrated areas are harvested 16 hours after treatment. The leaves are treated with a solution of / 3-megaspermine, a purified protein elicitor of a Phytophthora megasperma culture medium (Kauffmann & al., 1993), or oligosaccharides such as chitin oligomers (100 ~ g / ml), glucan fragments (200 ~ g / ml), and pectin fragments (200 ~ g / ml). Control plants are infiltrated with water.
Injury: Fully developed leaves are injured with a hemostat or pierced with needles. The injured leaves are then harvested 16 or 24 hours after injury for fluorimetric or histochemical analyzes.
UV treatment: The upper part of transgenic plants aged 5 weeks is exposed to UV rays (1 = 254nm) for 10 minutes and then plants are placed in the dark until the tissue collection 16 hours following the treatment.
Chemical treatments: (1) Solutions of SA (1mM) or INA (SOmM) are infiltrated into tobacco leaves using the protocol described for treatment by elicitors. (2) Under identical culture conditions, spray on transgenic plants solutions of SA (IOmM), INA (1mM) or BTH (SOmM). The tissues are collected 16 hours after treatment. Plants treated with water are used as a witness. (3) Seven week old plants or leaves of vitroplants surviving on water are transferred to boxes transparent and airtight and subjected to an atmosphere of 3, SmM from MeJa (Serva). Tissues are taken at different times after treatment. Control plants are placed in the same boxes without MeJa.
References Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, Struhl, K. (1998) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons.
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding, Anal.
Biochem. 72, 248-254.
Collendavelloo J, Legrand M, Geoffroy P, Barthelemy J & Fritig B (1981).
Purification and properties of the three o-diphenol O-methyltransferases of tobacco leaves.
Phytochemistry 20, 611-616.
Jefferson RA, Kavanagh TA & Bevan MW (1987). GUS mergers: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907.
Kamoun S, Young M, Glascock CB & Tyler BM (1993). A gene encoding a host-specific elicitor protein of Phytophthora: host specificity and induction of resistance to bacterial and fungal pathogens. Mol. Plant Microbe Interact. 6, 15-25.
Kauffmann S., Baillieul F., Genetet L, Kopp M. & Fritig B. (1993). Two proteins secreted by Phytophthora megasperma elicit and defense-related responses in tobacco.
In Mechanisms of plant defense responses, B. Fritig and M. Legrand, Dordrecht Kluwer Academic Publishers, 140-143.

Nagel R., Eliott A., Masel A., Birch RG & Manners JM (1990).
Electroporation of binary Ti plasmid vector into Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. FEMS Microbiol. Lett. 67, 325-328.
Panabières F, Marais A, Berre JYL, Penot I, Fournier D & Ricci P (1995).
Characterization of a gene cluster of Phytophthora cryptogea which codes for elicitins, proteins inducing a hypersensitive-like response in tobacco. Mol. Plant Microbe Interact. 8, 1995.
Pellegrini L., Geoffroy P., Fritig B. & Legrand M. (1993). Molecular cloning and expression of a new clans of ortho-diphenol-O-methyltransferases induced in tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves by infection or elicitor treatment. Plant Physiol. 103, 509-517.
Rossi L., Escudero J., Hohn B. & Tinland B. (1993). Efftcient and sensitive assay for T
DNA dependent transient gene expression. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 220-229.
Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Singer F., Nicklens S. & Coulson AR (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467.
Trienzenberg SJ (1992). Primer extension. In Current Protocol in Molecular Biology.
J. Wiley & Sons eds. 20.4.8.1 SEQUENCE LIST
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: RHOBIO
(B) STREET: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) CITY: LYON
(E) COUNTRY: France (F) POSTAL CODE: 69009 (ii) TITLE OF THE INVENTION: COMTII inducible promoter, chimeric gene including and transformed plants (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 26 (iv) COMPUTER-DETACHABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: l:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 1863 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics) (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 667..672 (D) OTHER INFORMATION: / function = "reverse W box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 820..830 (D) OTHER INFORMATION: / function = "reverse L box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: enhancer (B) LOCATION: 845..852 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1034..1047 (D) OTHER INFORMATION: / function = "P box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1221..1226 (D) OTHER INFORMATION: / function = "G box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1343..1356 (D) OTHER INFORMATION: / function = "reverse L box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc signal (B) LOCATION: 1369..1374 (D) OTHER INFORMATION: / function = "box A"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1377..1382 (D) OTHER INFORMATION: / function = "GT box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1483..1488 (D) OTHER INFORMATION: / function = "GT box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1562..1567 (D) OTHER INFORMATION: / function = "reverse W box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1600..1614 (D) OTHER INFORMATION: / function = "L box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CAAT_signal (B) LOCATION: 1675..1679 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc_signal (B) LOCATION: 1681..1690 (D) OTHER INFORMATION: / function = "E box"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CAAT_signal (B) LOCATION: 1695..1699 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: TATA_signal (B) LOCATION: 1735..1739 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: original transcription (B) LOCATION: 1772 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 1:

(2) INFORMATION FROM THE SEQ
FOR ID N0:
2:

(i) CHARACTERISTICS
OF THE
SQUENCE:

(A) LENGTH:

pairs of basics (B) TYPE:
nucleotide (C) NUMBER
OF BRINS:
double (D) CONFIGURATION:
linear (ii) TYPE
OF MOLCULE:
DNA (genomic) (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: promoter (B) LOCATION: 1..1860 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: origin transcription (B) LOCATION: 1772 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: exon (B) LOCATION: 1861..2281 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: intron (B) LOCATION: 2282..3633 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: exon (B) LOCATION: 3634..3944 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: intron (B) LOCATION: 3945..4726 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: exon (B) LOCATION: 4727..5089 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: terminator (B) LOCATION: 5090..5371 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 2:

CGGTCAAACTTTCAAAAGAGAAAGAAATAACTAGACAAACTTCAACAACCy ~ IACCTGCCCA1620 ATCAGGTATT

WO 00/56897 g PCT / FR00 / 00714 WO 00/56897 ~ PCT / FR00 / 00714 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 3:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 1095 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..1095 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

ACC AGC ACA

MetGluSerSer ThrLysSerGln IleProThr GlnSerGlu GluGlu ArgAsnCysThr TyrAlaMetGln LeuLeuSer SerSerVal LeuPro PheValLeuHis SerThrIleGln LeuGluVal PheGluIle LeuAla LysSerAsnAsp ThrLysLeuSer AlaSerGln IleValSer GlnIle ProAsnCysThr LysProGluAla ProThrMet LeuAsnArg MetLeu TyrValLeuAla SerTyrSerLeu PheThrCys SerIleVal GluAsp GluLysAsnAsn GlyGlyGlnLys ArgValTyr GlyLeuSer GlnVal GlyLysPhePhe ValLysAsnGlu AsnGlyAla SerMetGly ProLeu LeuAlaLeuLeu GlnAsnLysVal PheIleAsn SerTrpPhe GluLeu LysAspAlaVal LeuGluGlyGly ValProPhe AspArgVal HisGly ValHisAlaPhe GluTyrProLys SerAspPro LysPheAsn AspVal WO 00/56897 g PCT / FR00 / 00714 PheAsnLys AlaMetIle AsnHis ThrThrValVa1 MetLysLysIle LeuGluAsn TyrLysGly PheGlu AsnLeuLysThr LeuValAspVal GlyGlyGly LeuGlyVal AsnLeu LysMetIleThr SerLysTyrPro ThrIleLys GlyThrAsn PheAsp LeuProHisVal ValGlnHisAla ProSerTyr ProGlyVal GluHis ValGlyGlyAsp MetPheGluSer ValProGlu GlyAspAla IlePhe MetLysTrpIle LeuHisAspTrp SerAspSer HisAsnLeu LysLeu LeuLysAsnCys TyrLysAlaLeu ProAspAsn GlyLysVal IleVal ValGluAlaIle LeuProValLys ProAspIle AspThrAla ValVal GlyValSerGln CysAspLeuIle MetMetAla GlnAsnPro GlyGly LysGluArgSer GluGluGluPhe ArgAlaLeu AlaThrGlu AlaGly PheLysGlyVal AsnLeuIleCys CysValCys AsnPheTrp ValMet GluPheCysLys 355,360 (2) INFORMATION N0: 4:
FOR
THE
SEQ
ID

(i) SQ UENCE FEATURES:
OF
THE

(A) 22 LENGTH: pairs of basics (B) nucleotide of TYPE:

(C) STRANDS:
NUMBER single OF

(D) linear CONFIGURATION:

(ii) TY PE synthetic n MOLCULE:
Oligonuclotide (xi) DESCRIPTION OF SEQ NO: 4:
OF SQUENCE: ID

TC

(2) INFORMATION UR N0: 5:
PO LA
SEQ
ID

(i) SQ UENCE FEATURES:
OF
THE

(A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide n ° 2 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 5:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 6:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 25 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide n ° 3 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 6:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 7:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PAS1 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 7:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 8:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 29 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS1 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 8:
AAAGTCGACC GTCCACCTGT GCCAACAAT 2g (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS2 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

WO 00/56897 1 ~ PCT / FR00 / 00714 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 10:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 292 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS3 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 10:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 11:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 29 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS4 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 12:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 354 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..60 (D) OTHER INFORMATION: / function = preprotein (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 61..60 (D) OTHER INFORMATION: / function = preprotein (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
atgaacttc accgctctgctc gctgccgtc gccgccgcc ttggtcgga 48 MetAsnPhe ThrAlaLeuLeu AlaAlaVal AlaAlaAla LeuValGly tctgccaac gccaccgcgtgc accgccacc cagcagacc gctgcgtac 96 SerAlaAsn AlaThrAlaCys ThrAlaThr GlnGlnThr AlaAlaTyr aagacactc gtgagcatcctg tcggacgcg tcgttcaac aagtgctct 144 LysThrLeu ValSerIleLeu SerAspAla SerPheAsn LysCysSer acggattcg ggctactccatg ctgacggcc aaggccctc cccaccacg 192 ThrAspSer GlyTyrSerMet LeuThrAla LysAlaLeu ProThrThr

11 gcgcagtac aag ctc atg tgc gcg tcc tgc aac acc atg 240 acg gca atc AlaGlnTyr Lys Leu Met Cys Ala Ser Cys Asn Thr Met Thr Ala Ile aagaagatc gtg acg ctg aac ccg ccc gac ctg acg gtg 288 aac tgc ccc LysLysIle Val Thr Leu Asn Pro Pro Asp Leu Thr Val Asn Cys Pro acgagcggc ctg gtg ctc aac gtg tac gcg aac ggc ttc 336 tcg tac tcg ThrSerGly Leu Val Leu Asn Val Tyr Ala Asn Gly Phe Ser Tyr Ser gacaagtgc tcg tcg ctg 354 AspLysCys Ser Ser Leu (2)INFORMATIONS
POUR
LA
SEQ
ID
N0:
13:

(i)CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

(A) LONGUEUR: 354 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii)TYPE
DE
MOLCULE:
ADN

(ix)CARACTRISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT:1..294 (xi)DESCRIPTION DE LA SQUENCE: N0: 13:
SEQ ID

accgcg tgcaccgcc acccag cagacc gctgcg tacaagacactc gtg 48 ThrAla CysThrAla ThrGln GlnThr AlaAla TyrLysThrLeu Val agcatc ctgtcggac gcgtcg ttcaac aagtgc tctacggattcg ggc 96 SerIle LeuSerAsp AlaSer PheAsn LysCys SerThrAspSer Gly tactcc atgctgacg gccaag gccctc cccacc acggcgcagtac aag 144 TyrSer MetLeuThr AlaLys AlaLeu ProThr ThrAlaGlnTyr Lys ctcatg tgcgcgtcc acggca tgcaac accatg atcaagaagatc gtg 192 LeuMet CysAlaSer ThrAla CysAsn ThrMet IleLysLysIle Val acgctg aacccgccc aactgc gacctg acggtg cccacgagcggc ctg 240 ThrLeu AsnProPro AsnCys AspLeu ThrVal ProThrSerGly Leu gtgctc aacgtgtac tcgtac gcgaac ggcttc tcggacaagtgc tcg 288 ValLeu AsnValTyr SerTyr AlaAsn GlyPhe SerAspLysCys Ser tcgctg 294 SerLeu (2)INFORMATIONS IDN0: 14:
POUR
LA
SEQ

(i) CARACTRISTIQUES LASQ UENCE:
DE

(A) 1620pairesde bases LONGUEUR:

(B) nucloti de TYPE:

(C) BRINS: simple NOMBRE
DE

WO 00/56897
11 gcgcagtac aag ctc atg tgc gcg tcc tgc aac acc atg 240 acg gca atc AlaGlnTyr Lys Leu Met Cys Ala Ser Cys Asn Thr Met Thr Ala Ile aagaagatc gtg acg ctg aac ccg ccc gac ctg acg gtg 288 aac tgc ccc LysLysIle Val Thr Leu Asn Pro Pro Asp Leu Thr Val Asn Cys Pro acgagcggc ctg gtg ctc aac gtg tac gcg aac ggc ttc 336 tcg tac tcg ThrSerGly Leu Val Leu Asn Val Tyr Ala Asn Gly Phe Ser Tyr Ser gacaagtgc tcg tcg ctg 354 AspLysCys Ser Ser Leu (2) INFORMATION
FOR
THE
SEQ
ID
N0:
13:

(i) FEATURES OF THE SQUENCE:

(A) LENGTH: 354 pairs of basics (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE
OF
MOLCULE:
DNA

(ix) FEATURE:

(A) NAME / KEY: CDS

(B) LOCATION: 1..294 (xi) DESCRIPTION OF THE SQUENCE: N0: 13:
SEQ ID

accgcg tgcaccgcc acccag cagacc gctgcg tacaagacactc gtg 48 ThrAla CysThrAla ThrGln GlnThr AlaAla TyrLysThrLeu Val agcatc ctgtcggac gcgtcg ttcaac aagtgc tctacggattcg ggc 96 SerIle LeuSerAsp AlaSer PheAsn LysCys SerThrAspSer Gly tactcc atgctgacg gccaag gccctc cccacc acggcgcagtac aag 144 TyrSer MetLeuThr AlaLys AlaLeu ProThr ThrAlaGlnTyr Lys ctcatg tgcgcgtcc acggca tgcaac accatg atcaagaagatc gtg 192 LeuMet CysAlaSer ThrAla CysAsn ThrMet IleLysLysIle Val acgctg aacccgccc aactgc gacctg acggtg cccacgagcggc ctg 240 ThrLeu AsnProPro AsnCys AspLeu ThrVal ProThrSerGly Leu gtgctc aacgtgtac tcgtac gcgaac ggcttc tcggacaagtgc tcg 288 ValLeu AsnValTyr SerTyr AlaAsn GlyPhe SerAspLysCys Ser tcgctg 294 SerLeu (2) IDN0 INFORMATION: 14:
FOR
THE
SEQ

(i) LASQ UENCE FEATURES:
OF

(A) 1620 pairs of bases LENGTH:

(B) nucleotide of TYPE:

(C) STRANDS: simple NUMBER
OF

WO 00/56897

12 PCT/FR00/00714 (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: promoteur COMTII
(B) EMPLACEMENT:1..1263 (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS Mégaspermine (B) EMPLACEMENT:1264..1630 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:
cgtccacctg tgccaacaat atagagacaa tttgctcgta tagtcagaaa gagtgtttta 60 ctttttagtt gctttttagt gaatctactc ggtataaagt taaattagtg ggtcaataag 120 tcgggtgaat agttaaagaa aacagtggtg agtttagctg tcaaataatt tcttcttttt 180 cttgttttca cattagaaat caaaataaaa cacaagcttt ttgtatttat tttaacacaa 240 gctaattata tgtttatatg ctggttaggt gaagtaaagc atgttatatg aggaaagtac 300 gaagaaaatg tgccaattgt cgtgtacagc aaagcagcca gcacaagcaa attcgcactt 360 gataagtggc taagtccact ttctagtgga cctagtggtt cactaacttt taccaaaaag 420 gcaataattt gcaattcaaa aagaaaaaag gaaaaaagaa aactagacag actttaacac 480 accaactccc acaggaagca acaatgcaac tcacaaaagg aaaccgagtt tttccgcgac 540 ggatctagaa tttgggttca ttctttacgc tttttcgtat taaactcatt atatttgtat 600 aattatgggt ttatattttt tatttattgt aatttttgta aaattttata tataagtgta 660 tactccacgt ctccggatac tacattagcc tctagggttc ttaatactct tgttaaattg 720 tccaggctcc aaacgcatgt tcgtttcaat tttaacggat gtttccgaac aactccaaat 780 gttcaatgtt aggtgtgttt ggtgttaagc ttccgtccta ggttaataga atagataatt 840 gttgtttctt atatagtttt gaacaatcgt cgccataaac taatttttag gatggaagct 900 aatttttagg atggagtaca gcctaaggtt aaaatataac tataaaaaat atccataaaa 960 ggtgaaattt aattagtaac atgaaaagat aaaactagtg ttatcggtca aactttcaaa 1020 agagaaagaa ataactagac aaacttcaac aaccaacctg cccaacatgc tactgtgcaa 1080 ttgaaaaata aacaaaagag aaccagacaa tatttcaacc aatattccat caagaaaacc 1140 aattatgaca attcttaacc aaagtcacaa ctaacactta taaaaagcac taactcaact 1200 gtacatgatt gtgaagccta acaaaaacac tctaaaaggc ctctagagga tccccggggt 1260 acc atg aac ttc acc gct ctg ctc gct gcc gtc gcc gcc gcc ttg gtc 1308 Met Asn Phe Thr Ala Leu Leu Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Val gga tct gcc aac gcc acc gcg tgc acc gcc acc cag caa acc gct gcg 1356 Gly Ser Ala Asn Ala Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gln Gln Thr Ala Ala WO 00/56897
12 PCT / FR00 / 00714 (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: COMTII promoter (B) LOCATION: 1..1263 (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS Megaspermine (B) LOCATION: 1264..1630 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
cgtccacctg tgccaacaat atagagacaa tttgctcgta tagtcagaaa gagtgtttta 60 ctttttagtt gctttttagt gaatctactc ggtataaagt taaattagtg ggtcaataag 120 tcgggtgaat agttaaagaa aacagtggtg agtttagctg tcaaataatt tcttcttttt 180 cttgttttca cattagaaat caaaataaaa cacaagcttt ttgtatttat tttaacacaa 240 gctaattata tgtttatatg ctggttaggt gaagtaaagc atgttatatg aggaaagtac 300 gaagaaaatg tgccaattgt cgtgtacagc aaagcagcca gcacaagcaa attcgcactt 360 gataagtggc taagtccact ttctagtgga cctagtggtt cactaacttt taccaaaaag 420 gcaataattt gcaattcaaa aagaaaaaag gaaaaaagaa aactagacag actttaacac 480 accaactccc acaggaagca acaatgcaac tcacaaaagg aaaccgagtt tttccgcgac 540 ggatctagaa tttgggttca ttctttacgc tttttcgtat taaactcatt atatttgtat 600 aattatgggt ttatattttt tatttattgt aatttttgta aaattttata tataagtgta 660 tactccacgt ctccggatac tacattagcc tctagggttc ttaatactct tgttaaattg 720 tccaggctcc aaacgcatgt tcgtttcaat tttaacggat gtttccgaac aactccaaat 780 gttcaatgtt aggtgtgttt ggtgttaagc ttccgtccta ggttaataga atagataatt 840 gttgtttctt atatagtttt gaacaatcgt cgccataaac taatttttag gatggaagct 900 aatttttagg atggagtaca gcctaaggtt aaaatataac tataaaaaat atccataaaa 960 ggtgaaattt aattagtaac atgaaaagat aaaactagtg ttatcggtca aactttcaaa 1020 agagaaagaa ataactagac aaacttcaac aaccaacctg cccaacatgc tactgtgcaa 1080 ttgaaaaata aacaaaagag aaccagacaa tatttcaacc aatattccat caagaaaacc 1140 aattatgaca attcttaacc aaagtcacaa ctaacactta taaaaagcac taactcaact 1200 gtacatgatt gtgaagccta acaaaaacac tctaaaaggc ctctagagga tccccggggt 1260 acc atg aac ttc acc gct ctg ctc gct gcc gtc gcc gcc gcc ttg gtc 1308 Met Asn Phe Thr Ala Leu Leu Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Val gga tct gcc aac gcc acc gcg tgc acc gcc acc cag caa acc gct gcg 1356 Gly Ser Ala Asn Ala Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gln Gln Thr Ala Ala WO 00/56897

13 PCT/FR00/00714 tac aaa aca ctc gtg agc atc ctg tcg gac gcg tcg ttc aac aag tgc 1404 Tyr Lys Thr Leu Val Ser Ile Leu Ser Asp Ala Ser Phe Asn Lys Cys tct acg gat tcg ggc tac tcc atg ctg acg gcc aag gcc ctc ccc acc 1452 Ser Thr Asp Ser Gly Tyr Ser Met Leu Thr Ala Lys Ala Leu Pro Thr acg gcg cag tac aag ctc atg tgc gcg tcc acg gca tgc aac acc atg 1500 Thr Ala Gln Tyr Lys Leu Met Cys Ala Ser Thr Ala Cys Asn Thr Met atc aaa aaa atc gtg acg ctg aac ccg ccc aac tgc aac ctg acg gtg 1548 Ile Lys Lys Ile Val Thr Leu Asn Pro Pro Asn Cys Asn Leu Thr Val ccc acg agc ggc ctg gtg ctc aac gtg tac tcg tac cca aac ggc ttc 1596 Pro Thr Ser Gly Leu Val Leu Asn Val Tyr Ser Tyr Pro Asn Gly Phe tcg gac aag tgc tcg tcg ctg taa 1620 Ser Asp Lys Cys Ser Ser Leu (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 15:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PAS2 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS5 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 16:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 17:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS6 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 17:

WO 00/56897
13 PCT / FR00 / 00714 tac aaa aca ctc gtg agc atc ctg tcg gac gcg tcg ttc aac aag tgc 1404 Tyr Lys Thr Leu Val Ser Ile Leu Ser Asp Ala Ser Phe Asn Lys Cys tct acg gat tcg ggc tac tcc atg ctg acg gcc aag gcc ctc ccc acc 1452 Ser Thr Asp Ser Gly Tyr Ser Met Leu Thr Ala Lys Ala Leu Pro Thr acg gcg cag tac aag ctc atg tgc gcg tcc acg gca tgc aac acc atg 1500 Thr Ala Gln Tyr Lys Leu Met Cys Ala Ser Thr Ala Cys Asn Thr Met atc aaa aaa atc gtg acg ctg aac ccg ccc aac tgc aac ctg acg gtg 1548 Ile Lys Lys Ile Val Thr Leu Asn Pro Pro Asn Cys Asn Leu Thr Val ccc acg agc ggc ctg gtg ctc aac gtg tac tcg tac cca aac ggc ttc 1596 Pro Thr Ser Gly Leu Val Leu Asn Val Tyr Ser Tyr Pro Asn Gly Phe tcg gac aag tgc tcg tcg ctg taa 1620 Ser Asp Lys Cys Ser Ser Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 15:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PAS2 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS5 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 17:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 34 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS6 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 17:

WO 00/56897

14 PCT/FR00/00714 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 18:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS7 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 18:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 19:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS8 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 19:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS9 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 20:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS10 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 21:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS11 WO 00/56897
14 PCT / FR00 / 00714 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 18:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 34 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS7 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 18:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 19:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS8 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS9 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 31 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS10 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 21:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 34 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS11 WO 00/56897

15 PCT/FR00/00714 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 22:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 23:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ,v (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS12 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 23:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 24:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS13 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 24:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 25:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PAS3 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 25:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 26:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Oligonucléotide synthétique PS14 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 26:
15 PCT / FR00 / 00714 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 22:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 23:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 35 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear , v (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS12 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 24:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 32 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS13 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 24:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 25:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PAS3 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0: 26:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Synthetic oligonucleotide PS14 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N0: 26:

Claims (32)

41~
Revendications
41~
Claims
1. Fragment d'acide nucléique comprenant un promoteur de plante inductible, caractérisé en ce que ledit promoteur inductible est constitué par le promoteur d'un gène d'O-méthyltransférase de classe II (COMT II) de plante. 1. Nucleic acid fragment comprising a plant promoter inducible, characterized in that said inducible promoter consists of the promoter of a plant O-methyltransferase class II (COMT II) gene. 2. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un promoteur de COMT II de plante. 2. Nucleic acid fragment according to claim 1, characterized in that that it consists of a plant COMT II promoter. 3. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le promoteur est activé par les blessures, les infections virales, les agressions aux rayons UV, les agressions chimiques, ou les agressions par pathogène, un insecte ou un nématode 3. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 or 2, characterized in that the promoter is activated by wounds, viral infections, attacks by UV rays, chemical attacks, or attacks by pathogenic, an insect or a nematode 4. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la COMTII de plante est une COMT de plante qui n'est pas exprimée dans les plantes saines non traitées, mais qui est exprimée à la suite d'une agression mécanique, chimique, ou par un pathogène, un insecte ou un nématode. 4. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 3, characterized in that the plant COMTII is a plant COMT which is not expressed in untreated healthy plants, but which is expressed at the following a mechanical or chemical aggression, or by a pathogen, an insect or a nematode. 5. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la plante est une plante monocotylédone ou dicotylédone, en particulier choisie parmi le riz, le blé, l'orge, le tournesol, le maïs, le tabac, le colza, le soja ou Arabidopsis thaliana. 5. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 4, characterized in that the plant is a monocotyledonous or dicotyledonous plant, in particular selected from rice, wheat, barley, sunflower, corn, tobacco, rapeseed, soy or Arabidopsis thaliana. 6. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la plante est une plante dicotylédone, de préférence le tabac. 6. Nucleic acid fragment according to claim 5, characterized in that that the plant is a dicotyledonous plant, preferably tobacco. 7. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence en 5' du site d'initiation de la traduction ou codon " start " (ATG) de la séquence codante de la COMTII
permettant la transcription et l'expression de ladite séquence codante.
7. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 6, characterized in that the promoter comprises a sequence 5' of the site of initiation of the translation or "start" codon (ATG) of the COMTII coding sequence allowing transcription and expression of said coding sequence.
8. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1 à 7, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence de plus de 600 nucléotides en amont de l'ATG de la COMTII, de préférence de plus de 1000 nucléotides en amont de l'ATG, plus préférentiellement de plus de 1200 nucléotides en amont de l'ATG. 8. Nucleic acid fragment according to claim 1 to 7, characterized in that that the promoter comprises a sequence of more than 600 nucleotides upstream of the ATG of COMTII, preferably more than 1000 nucleotides upstream of the ATG, more preferably more than 1200 nucleotides upstream of the ATG. 9. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le promoteur comprend un site d'initiation de la transcription situé
à moins de 100 nucléotides en amont de l'ATG, avantageusement à environ 90 nucléotides en amont.
9. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 8, characterized in that the promoter comprises an initiation site of the transcript located less than 100 nucleotides upstream of the ATG, advantageously about 90 upstream nucleotides.
10. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'extrémité 3' du promoteur est située entre le site d'initiation de la transcription et l'ATG. 10. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 9, characterized in that the 3' end of the promoter is located between the site of initiation of the transcription and the ATG. 11. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé ce que l'extrémité 3' du promoteur est située entre 10 et 50 nucléotides en aval du site d'initiation de la transcription, plus préférentiellement entre 20 et 40 nucléotides en aval, encore plus préférentiellement entre 20 et 30 nucléotides en aval. 11. Nucleic acid fragment according to claim 10, characterized in that the 3' end of the promoter is located between 10 and 50 nucleotides downstream of the site transcription initiation, more preferably between 20 and 40 nucleotides in downstream, even more preferably between 20 and 30 nucleotides downstream. 12. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il est constitué par le promoteur COMTII de tabac défini par la séquence nucléotidique en amont de l'ATG représentée par l'identificateur de séquence 1 (SEQ ID NO 1), les séquences capables de s'hybrider de manière sélective à
ladite séquence et les séquences homologues.
12. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 11, characterized in that it consists of the tobacco COMTII promoter defined over there nucleotide sequence upstream of the ATG represented by the identifier of sequence 1 (SEQ ID NO 1), the sequences capable of hybridizing selectively to said sequence and homologous sequences.
13. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 12, caractérise en ce qu'il est constitué, par la séquence comprise entre les nucléotides 557 et 1796 de l'identificateur de séquence no 1 13. Nucleic acid fragment according to claim 12, characterized in that that it consists of the sequence between nucleotides 557 and 1796 of sequence identifier #1 14. Gène chimère (ou cassette d'expression) fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5', une séquence codante et une séquence de régulation en 3', caractérisé
en ce que la séquence de régulation en 5' comprend le fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.
14. Chimeric gene (or expression cassette) functional in cells plants and plants comprising in the sense of transcription a sequence of 5' regulation, a coding sequence and a 3' regulation sequence, characterized in that the 5' regulatory sequence comprises the acid moiety nucleic according to one of claims 1 to 13.
15. Gène chimère selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence codante comprend une séquence codante pour un gène rapporteur ou une séquence codante pour une protéine d'intérêt. 15. Chimeric gene according to claim 14, characterized in that the sequence coding sequence comprises a coding sequence for a reporter gene or a sequence coding for a protein of interest. 16. Gène chimère selon la revendication 15, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une protéine conférant aux plantes des propriétés de résistance aux maladies ou aux insectes. 16. Chimeric gene according to claim 15, characterized in that the protein of interest is a protein which confers resistance properties on plants to diseases or insects. 17. Gène chimère selon la revendication 16, caractérisé en ce que la protéine ou peptide d'intérrêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines. 17. Chimeric gene according to claim 16, characterized in that the protein or peptide of interest is chosen from fungal elicitor peptides, in especially the elictins. 18. Gène chimère selon la revendication 17, caractérisé en ce que le peptide éliciteur fongique est la mégaspermine. 18. Chimeric gene according to claim 17, characterized in that the peptide fungal elicitor is megaspermine. 19. Gène chimère selon la revendication 18, caractérisé en ce que la mégaspermine est représentée par l'identificateur de séquence no 13 (SEQ ID
13).
19. Chimeric gene according to claim 18, characterized in that the megaspermine is represented by sequence identifier No. 13 (SEQ ID
13).
20. Gène chimère selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence no 14 (SEQ ID
14).
20. Chimeric gene according to claim 19, characterized in that it comprises the DNA sequence represented by sequence identifier No. 14 (SEQ ID
14).
21. Gène chimère fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes caractérisé en ce qu'il comprend dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur inductible, une séquence codante pour un éliciteur et une séquence de régulation en 3'. 21. Functional chimeric gene in plant cells and plants characterized in that it comprises in the sense of transcription a sequence of 5' regulator comprising an inducible promoter, a coding sequence for a elicitor and a 3' regulatory sequence. 22. Gène chimère selon la revendication 21, caractérisé en ce l'éliciteur est défini dans les revendications 17 à 19. 22. Chimeric gene according to claim 21, characterized in that the elicitor is defined in claims 17 to 19. 23. Gène chimère selon l'une des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce que le promoteur inductible est choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB, le promoteur HMG2, le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme. 23. Chimeric gene according to one of claims 21 or 22, characterized in that that the inducible promoter is chosen from phenylalanine promoters ammonia lyase (PAL), HMG-CoA reductase (HMG), chitinases, glucanases, inhibitors proteinase (PI), PR1 family genes, nopaline synthase (nos) or gene vspB, HMG2 promoter, apple beta-galactosidase (ABG1) promoter Where the amino cyclopropane carboxylate synthase (ACC synthase) promoter of apple. 24. Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère selon les revendications 14 à 23. 24. Cloning and/or expression vector for cell transformation plants or plants, characterized in that it contains at least one gene chimera according to claims 14 to 23. 25. Procédé de transformation des cellules végétales, caractérisé en ce qu'il consiste à intégrer au génome des dites cellules végétales au moins un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 23.~ 25. Process for transforming plant cells, characterized in that it consists in integrating into the genome of said plant cells at least one gene chimera according to one of claims 14 to 23.~ 26. Cellules végétales transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 23. 26. Transformed plant cells characterized in that they comprise a chimeric gene according to one of claims 14 to 23. 27. Plantes transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent un gène chimère selon les revendications 14 à 23. 27. Transformed plants characterized by comprising a gene chimera according to claims 14 to 23. 28. Plantes, caractérisées en ce qu'elles contiennent des cellules transformées selon la revendication 26 ou obtenues par le procédé selon la revendication 25. 28. Plants, characterized by containing cells transformed according to claim 26 or obtained by the process according to claim 25. 29. Plantes selon la revendication 28, caractérisées en ce qu'elles sont régénérées à partir des cellules transformées selon la revendication 19 ou obtenues par le procédé selon la revendication 18. 29. Plants according to claim 28, characterized in that they are regenerated from transformed cells according to claim 19 or obtained by the method according to claim 18. 30. Plantes issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 29. 30. Plants resulting from the cultivation and/or crossing of regenerated plants according to claim 29. 31. Plantes selon l'une des revendications 27 à 30, caractérisées en ce qu'elles sont du type monocotylédones, en particulier les céréales, la canne à
sucre, le riz et le maïs, ou dicotylédones, en particulier le tabac, la soja, le colza, le coton, le tournesol, la betterave, le trèfle.
31. Plants according to one of claims 27 to 30, characterized in that that they are of the monocotyledonous type, in particular cereals, cane sugar, the rice and maize, or dicots, in particular tobacco, soya, rapeseed, the cotton, the sunflower, beet, clover.
32. Graines des plantes selon l'une des revendications 27 à 31. 32. Seeds of the plants according to one of claims 27 to 31.
CA002366217A 1999-03-22 2000-03-22 Inducible comtii promoter, chimera gene containing same and transformed plants Abandoned CA2366217A1 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR99/03700 1999-03-22
FR9903700A FR2791359A1 (en) 1999-03-22 1999-03-22 Inducible promoter for plants, useful for controlling expression of e.g. disease-resistance genes, is derived from an O-methyltransferase gene and is induced by injury or infection
FR99/07646 1999-06-11
FR9907646A FR2791360B1 (en) 1999-03-22 1999-06-11 INDUCTIBLE PROMOTER, COMTII, CHIMERIC GENE COMPRISING SAME AND TRANSFORMED PLANTS
PCT/FR2000/000714 WO2000056897A1 (en) 1999-03-22 2000-03-22 Inducible comtii promoter, chimera gene containing same and transformed plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CA2366217A1 true CA2366217A1 (en) 2000-09-28

Family

ID=26234879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CA002366217A Abandoned CA2366217A1 (en) 1999-03-22 2000-03-22 Inducible comtii promoter, chimera gene containing same and transformed plants

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1163348A1 (en)
AU (1) AU3438000A (en)
CA (1) CA2366217A1 (en)
FR (1) FR2791360B1 (en)
WO (1) WO2000056897A1 (en)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7122718B2 (en) 2000-07-28 2006-10-17 Dairy Australia Limited Modification of plant resistance to diseases and/or pests
ES2584316T3 (en) * 2004-04-06 2016-09-27 Fibria Celulose S/A Preferred promoters of cambium / xylem and uses thereof
CA2837664C (en) 2011-05-31 2022-12-06 Keygene N.V. Pest resistant plants with 7-epizingiberene synthase activity and methods of making same
US20150059018A1 (en) 2011-10-19 2015-02-26 Keygene N.V. Methods and compositions for producing drimenol
WO2013095125A1 (en) 2011-12-16 2013-06-27 Keygene N.V. Method for producing a plant having enhanced disease resistance to nematodes
WO2014142647A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Wageningen Universiteit Fungals strains with improved citric acid and itaconic acid production
JP6978152B2 (en) 2015-09-04 2021-12-08 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ Multiphase spore reproductive gene
CN113874388A (en) 2019-05-29 2021-12-31 主基因有限公司 Parthenogenesis genes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9000773A (en) * 1990-04-02 1991-11-01 Rijkslandbouwhogeschool PROCESS FOR PROTECTING PLANTS AGAINST PATHOGENS
GB9119279D0 (en) * 1991-09-10 1991-10-23 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
US5670349A (en) * 1993-08-02 1997-09-23 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. HMG2 promoter expression system and post-harvest production of gene products in plants and plant cell cultures
US6100451A (en) * 1995-05-18 2000-08-08 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Pathogen-inducible regulatory element
AU9072298A (en) * 1997-08-13 1999-03-08 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Tissue-specific poplar promoters

Also Published As

Publication number Publication date
EP1163348A1 (en) 2001-12-19
AU3438000A (en) 2000-10-09
FR2791360A1 (en) 2000-09-29
WO2000056897A1 (en) 2000-09-28
FR2791360B1 (en) 2003-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0951537A1 (en) Recombinant collagen and derived proteins produced by plants, methods for obtaining them and uses
FR2889540A1 (en) SAME-SPECIFIC CHLOROPHYLL A / C PROTEIN PROMOTER
CA2366217A1 (en) Inducible comtii promoter, chimera gene containing same and transformed plants
EP1196581B1 (en) Promoter expressed specifically in the cells of plant roots, recombinant vectors and host cells comprising same and transgenic plants obtained
EP2627667B1 (en) Production of plants having improved water-deficit tolerance
FR2775000A1 (en) INDUCIBLE PROMOTER IN PLANTS, SEQUENCE INCORPORATING THIS PROMOTER AND PRODUCT OBTAINED
FR2913694A1 (en) EXPRESSION REGULATORY ELEMENTS
EP1185669B1 (en) Promoter enabling transgene expression in the whole plant except in the seed
US20040029167A1 (en) Inducible COMT_II promoter, chimeric gene containing same and plants transformed therewith
FR2791359A1 (en) Inducible promoter for plants, useful for controlling expression of e.g. disease-resistance genes, is derived from an O-methyltransferase gene and is induced by injury or infection
CA2737405A1 (en) Importation of a ribozyme into vegetable mitochondria by a pseudo-trna that can be aminoacylated by valine
EP1121451B1 (en) Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by agrobacterium rhizogenes
FR2811680A1 (en) INDUCTIBLE LIPOXYGENASE PROMOTER, EXPRESSION CASSETTES COMPRISING THE SAME AND TRANSFORMED PLANTS
WO2002099112A2 (en) Lipoxygenase overexpression in plants and reduction in plant sensitivity to diseases and attacks from pathogenic organisms
WO2003106670A1 (en) Recombinant triacylglycerol lipase of <i>arabidopsis thaliana</i>, nucleotide sequences coding for same or corresponding to antisense sequences and uses thereof
WO2005063989A1 (en) Promoter nucleotidic sequences inducible by infection by pathogens
WO2012049661A1 (en) Production of plants with improved tolerance to water deficit
FR2995613A1 (en) New nucleic acid sequence having specified nucleotide sequence, useful as promoter to control the expression of reporter genes in plants of coffee/tobacco and to control transgene expression in response to biotic/abiotic stress in coffee
WO2005116214A2 (en) Destructive insect-inducible promoters and uses thereof
WO2003012106A2 (en) Regulating nucleic acid for expressing a polynucleotide of interest specifically in the endothelium of a plant seed and uses thereof
EP1525217A1 (en) Plant peptide with antimicrobial activity
WO2007096534A1 (en) Plants with increased resistance to biotic and abiotic stresses
FR2825578A1 (en) Reducing sensitivity of plants to diseases and pathogens, by overexpressing a lipoxygenase, also vectors and cassettes for the process and transformed plants
FR2796394A1 (en) New SGS3 gene from Arabidopsis thaliana, useful for increasing virus resistance in plants and, when inhibited, for increasing transgene expression
FR2796395A1 (en) NEW PLANT SGS3 GENE AND ITS USE

Legal Events

Date Code Title Description
FZDE Discontinued