CN100475842C - Rhd阴性基因座的分子结构 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及代表恒河猴基因座的核酸分子结构，其包括RHD、SMP1和RHCE基因和/或恒河猴框，优选杂合恒河猴框、恒河猴框上游区和/或恒河猴框下游区。另外，本发明涉及普通RHD阴性单元型的特异性检测方法。本发明还涉及在D-阴性个体中检测RHD阳性单元型。已鉴定出RHD基因中的各种突变，从而可以开发各种诊断工具。本发明也涉及寡核苷酸，它们特异性地与杂合框，优选与恒河猴框的断点或断点区域或上游区或下游区杂合。另外，本发明也涉及包含或使用本发明上述化合物的试剂盒。

Description

RHD阴性基因座的分子结构
本发明涉及代表包含RHD，SMP1和RHCE基因的恒河猴基因座和/或恒河猴框，优选杂合恒河猴框，恒河猴框上游区和/或恒河猴框下游区的核酸分子结构。本发明还涉及用于特异性检测普通RHD阴性单元型的方法。本发明还涉及在D-阴性个体中RHD阳性单元型的检测。已鉴定了RHD基因中的多种突变，从而为诊断工具的开发提供了可能。本发明还涉及特异性地与杂合框，优选与断点或断点区域或者与恒河猴框上游区和下游区杂交的寡核苷酸。此外，本发明涉及含有或使用上述本发明化合物的试剂盒。
本说明书的全文引用多篇文献；因此加入本文引用的每一篇文献的公开内容(包括任何制造商的说明、操作等等)作为参考。
恒河猴D抗原(ISBT 004.001；RH1)是由蛋白决定的最重要的血型抗原。抗-D仍是新生儿溶血病的主要原因(Filbey，Acta Obstet GynecolScand，74：687，1995；Bowman，J，Semin Perinatol 21：39，1997)。就人种而言，3％-25％的白种人缺乏抗原D(Mourant，人血型和其他多态性的分布，伦敦，牛津大学出版社，1976)。抗-D免疫法易于出现在D-阴性受体上(Urbaniak，输血21：64，1981)。
RH血型的抗原由两个基因，RHD和RHCE编码的蛋白携带，这两个基因位于染色体1p34.1-1p36位(Cherif-Zahar，人类遗传学86：398，1991；MacGeoch，细胞遗传学(Cytogenet.Cell Genet.)59：261，1992)，可能在小于450,000个碱基对(bp)距离内(Carritt，人类分子遗传学6：843，1997)。两个基因均包含10个外显子，且它们的结构高度同源。基因的相对取向、其距离，和所散布其它基因的可能性是未知的(Flegel，输血医学8：281，1998)。最近，Okuda等人(Okuda，生物化学生物物理学研究通讯263：378，1999)报道了一段约11,000bp的序列，认为此序列代表RHD和RHCE之间的DNA节段。
在白种人中，大部分的D-阴性单元型是由于RHD基因的缺失：所以因为从外显子1到3’非翻译区的RHD特异性序列不存在了这种缺失跨越整个RHD基因，(Gassner，输血37：1020，1997)。缺失的确切范围尚不确定，使得相邻的基因也受到影响也不可知。
作为D抗原分子基础的RHD基因的鉴定允许通过DNA分型进行RHD表型预测(Flegel，输血医学8：281，1998；Lo，Lancet 341：1147，1993)。但是，由于主要的D-阴性单元型的结构是未知的，因而对RHD缺失的特异性检测仍是不可能的，而且从RHD+/RHD-杂合个体中对RHD+/RHD+纯合个体的鉴别仍依赖于间接的方法。这种鉴别在临床上特别有用，因为在含抗-D的D-阴性母体中父体是RHD+/RHD+的儿童受影响的风险为100％，父体是RHD+/RHD-的儿童受影响的风险仅为50％。
已有几种间接的方法用于测定接合性。(i)基于表型的简单猜测在大约95％的情况下是正确的，(ii)测定可能被因子如C抗原的存在而混淆的D抗原密度，和(iii)许多涉及RHD-和RHCE-特异性序列的平行定量扩增的方法(Cossu，电泳17：1911，1996；Infusionsther.transfusionsmed.26(增刊1)：31，1999(摘要)。这些精细的技术在常规的实验室是不实用的。此外，许多研究者鉴定了RHCE基因或与RHD基因的缺失发生遗传连锁的相邻序列的多态性(Carritt，人类分子遗传学6：843，1997；Huang，美国人类遗传学杂志58：133，1996；Fujiwara，人类遗传学104：301，1999；Onda，基因159：225，1995)。这种间接的方法依赖于与具有多态性的RHD缺失相关的连锁不平衡。
而且，RHD PCR的使用受限于对推测的RHD-阴性中罕见的RHD阳性等位基因不完全的了解。RHD阴性中的RHD阳性等位基因是由RHD-CE-D杂合基因(Huang，血液88：2326-33，1996；Faas，输血37：38-44，1997，Faas，输血36：506-11，1996)、无义突变(Avent，血液89：2568-77，1997)、移码(Andrews，血液92：1839-40，1998；Cherif-Zahar英国血液病学杂志102：1263-70，1998)或假基因(Singleton，血液95：12-8，2000)所导致的。这些等位基因常见于非洲人(Faas，输血37：38-44，1997，Singleton，血液95：12-18，2000)和亚洲人(Okuda，临床研究杂志100：373-9，1997)，但在白种人中很少。但是，最近的分析(Avent，血液89：2568-77，1997；Flegel，输血医学8：281-302，1998)表明即使对于白种人，这些等位基因也可能是错误的Rh表型预测的主要原因。在白种人身上进行的许多观测(Avent，血液89：2568-77，1997；Hyland，血液84：321-4，1994)表明这些等位基因聚集在Cde和cdE单元型中。
在分子水平分析RHD基因座的最直接的方法可能是跨越RHD缺失位点的PCR扩增。目前这种试验仍未实现，因为RHD阳性和RHD阴性中的RHD基因座的结构还未完全搞清。
因此本发明所基于的技术问题就是提供用于进行可靠的、基于核酸的分析恒河猴D基因座的手段和方法。也就是说，这些手段和方法应该适于RHD+/RHD+和RHD+/RHD-个体的检测和/或鉴别。
通过提供在权利要求中表述的实施方案解决所述技术问题。
因此，本发明涉及代表恒河猴基因座的核酸分子结构，该基因座包含RHD，SMP1和RHCE基因和/或恒河猴框，优选杂合恒河猴框，恒河猴框上游区和/或恒河猴框的下游区，它们的序列如图8到10所示。
在本发明的上下文中，术语“核酸分子结构”定义为线性DNA节段，该节段广义上含有上述基因的组合，即以5’-3’的顺序排列的RHD，SMP1和RHCE基因和/或恒河猴框，它们共同确定所述恒河猴基因座。产生本发明分子结构的DNA序列包括：此核苷酸序列结构由恒河猴框5′侧翼区、杂合恒河猴框或两个具有间插RHD基因的恒河猴框，和恒河猴框3′侧翼区组成。
以下的序列代表本发明核酸分子结构中所包含的优选的实施方案。
基因组克隆HS465N24(GenBank登录号AL031432.1)中的碱基1-120,156代表恒河猴框5′侧翼区。
GenBank登录号AL252313中的碱基33-9,180代表杂合恒河猴框。
两个具有间插RHD基因的恒河猴框由GenBank登录号AL252311中碱基34-9,175所代表的恒河猴框上游区、RHD基因、和由GenBank登录号AL252312中碱基23-9,177所代表的恒河猴框下游区组成(参见图8到10)。
恒河猴框3′侧翼区由恒河猴框下游区或杂合恒河猴框与SMP1基因之间的小DNA节段、SMP1基因和RHCE基因组成。
RHD基因由以下组成：与基因组克隆HS469D22(GenBank登录号AL031284.9)碱基56,012-51,47同源的RHD 5′区，该区域也由被称为″填充片断″的核苷酸节段(GenBank登录号AB029152)中的碱基7,716-11,005表示；RHD启动子(GenBank登录号AJ252314)碱基1-1,246(参见图11)和由RHD cDNA(GenBank登录号X63097)碱基1-1,371及其内含子序列定义的RHD基因。
所述小DNA节段优选含有15个位于恒河猴框下游区或杂合恒河猴框与SMP1基因之间的核苷酸，并由AL252312中的碱基9,178-9,192表示。
SMP1基因由GenBank登录号AF0811282表示的SMP1 cDNA及其内含子序列定义。
RHCE基因由GenBank登录号X63095所表示的RHCE cDNA及其内含子序列定义，并进一步部分地由基因组克隆HS469D22(GenBank登录号AL031432.1)碱基1-51,471表示，而RHCE 5′侧翼区由基因组克隆HS469D22碱基51,472-84,811表示。
然而恒河猴框上游区位于RHD基因的5′端，恒河猴框下游区位于本发明结构中的RHD和SMP1基因之间。可选择地，术语“核酸分子结构”涉及仅包含所提及恒河猴框的DNA节段。此术语进一步可选择地涉及包含RHD、SMP1和RHCE基因及两个恒河猴框，即恒河猴框上游区和下游RHD框的DNA节段。此术语还进一步可选择地包括含有杂合恒河猴框、SMP1基因和RHCE基因的DNA节段。在另一可选择的方面，此术语涉及包含SMP1基因和杂合恒河猴框的DNA节段。此术语进一步可选择地涉及包含恒河猴框上游区、RHD、恒河猴框下游区和SMP1的DNA节段。
此术语在另一可选择的方面涉及包含恒河猴框下游区和SMP1的DNA节段。为了更好地理解所要求的主题，可参考下述图1和7。
根据本发明，术语“核酸分子结构”还包括任何可能与核酸探针发生杂交的上述核酸结构的可行衍生物。换句话说，本发明的结构可以通过合成或半合成的方法制备，并因此含有或由肽核酸组成。所说的术语还有核酸分子的意思。
根据本发明，术语“恒河猴框”描述了位于RHD基因5′和3′侧翼的上游和下游DNA节段，这三种恒河猴框由其核苷酸序列所定义。GenBank登录号AL252313碱基33-9,180的实施方案表示所述杂合恒河猴框。两个具有间插RHD基因的恒河猴框由GenBank登录号AL252311碱基34-9,175的实施方案表示的恒河猴框上游区，和GenBank登录号AL252312碱基23-9,177的实施方案表示的恒河猴框下游区组成。如在所附的实施例中所例证的那样，恒河猴框优选约长9000bp，具有98,6％的同源性及相同的取向。根据本发明，恒河猴框上游区和下游区至少95％是同源的。这些恒河猴框的长度可以变化。预期这些恒河猴框的长度可以变化，因为已知与其它结构特征并存的复合重复元件其中一些以串联排列，倾向于发生(排列)伸长和缺失事件。如果这些事件发生，则恒河猴框的长度可以收缩至小于1,000个核苷酸长度，或者伸长至大于20,000个核苷酸长度。
根据本发明，术语“同源性”指采用适宜的比较程序，如BLAST进行序列同源性的测定。
如上所述，迄今为止以下事实已经阻碍了分子水平的RHD阴性的诊断分析：未知RHD/RHCE基因座的整体结构。现在已经令人惊奇地发现，两个基因，RHD和RHCE，具有相反地取向且彼此以其3’末端相对。本发明进一步发现了RHD基因被两个高度同源的恒河猴框包围。RHD和RHCE之间的物理距离约为30,000bp，并由恒河猴框和SMP1基因填充。在主要的RHD阴性单元型中的RHD缺失断点位于恒河猴框1,463bp的同源区域。类似的RHD缺失事件可以涉及在高度同源的恒河猴框中任何其它的区域。因此，包含不同于普通RHD缺失的RHD缺失的断点区可以预期在上述的恒河猴框内的任何地方出现。
两个RH基因的相反取向解释了MNS和RH血型中杂合基因的不同特征：编码MNS抗原的血型糖蛋白基因以相同的取向存在(Onda，基因，159：225，1995)，而许多重组可以解释为导致单一杂合基因的不等交换(Blumenfeld，人类突变6：1999，1995)。在以上令人惊奇的发现的基础上，现在可以更为全面地理解导致RHD阴性的分子水平上的事件。在RH基因座中，相反取向的序列不可能触发不等交换，而且如果发生这种事件，则不会造成功能性杂合基因。RH基因座上不可能进行不等交换的结论可以解释大部分的RH杂合基因是RHD-CE-D或RHCE-D-CE类型的，而且包括以前所述的顺式定位的同源DNA的片段(Wagner，血液91：2157，1998)。目前，该RH基因系统是唯一深入研究过的基因座，其中的这两个基因具有相反的取向，使其成为在整个基因组中频繁出现的相邻且相反取向的基因进化的模式系统。
在RH基因座结构(图1)的基础上，提出了一种RHD基因缺失的简约模型(图7)。虽然本申请人不希望拘泥于理论，但下述关于RHD阴性的产生是确信的。该RHD缺失可以通过由包含RHD基因的高度同源的恒河猴框引发的不等交换作出解释。当发生交换导致包含断点区的恒河猴框上游区和恒河猴框下游区的同源性区缺失时，就产生了该RHD阴性的杂合型恒河猴框。因此，该杂合RHD框以由RHD框上游衍生的5’位与由RHD框下游衍生的3’位融合为特征。在一个优选的实施方案中，断点区长903bp。这种优选的杂合恒河猴框的序列如图5所示。在该实施例所述的具体实施方案中，所述的恒河猴框中的903bp断点区位于类似于THE-1B人类转座因子和L2重复DNA因子(图4)的99.9％同源性的1,463bp段序列。有趣的是，RHD阴性单元型中缺失的该＞60,000bp的DNA片断仅由并含有所有在RHD阳性单元型中重复的序列组成。
本发明的上述发现允许创建大量容易操作或改进的与RH基因座相关的个体基因型的分析方法。这些方法的实施例提供如下。
虽然现在导致主要的RHD阴性单元型的分子机理是清楚的，但并不清楚更早的复制事件是如何造成RHD阳性中RH基因结构的。恒河猴框和RH基因的复制可能作为单一事件发生，因为两种恒河猴框的整体同源性与RH基因的同源性非常相似。不拘泥于理论，值得深思的是RHD重复与近乎全长的THE-1B转座子样人类因子的多重插入存在偶然的关联。但是，THE-1B因子的开放阅读框架在复制时可能是非功能性的。
在本发明的优选的实施方案中，所述的核酸分子结构是普通RHD阴性单元型的代表。
根据本发明，术语“是...的代表”涉及包含所有序列和结构特征的核酸分子结构，以使该结构与共享该特征的分子结构相关联。在以上优选的实施方案中，该特征导致普通的RHD阴性单元型。在本发明的上下文中，这优选指包含全部RHD基因及其5′区的RHD基因的缺失，而这段缺失位于恒河猴框上游区和恒河猴框下游区之间。
在本上下文中，这还可能指，RHD基因内终止或消除RHD基因蛋白产物表达的所有共享的无义突变、错义突变、剪接位点突变、部分缺失、部分插入、部分倒位或其组合的结构，均是RHD阴性单元型的代表。
术语“单元型”指在单一母本或父本染色体上所限定区域内的一系列连锁等位基因。
术语“普通RHD阴性单元型”指任何包含杂合恒河猴框的RHD抗原阴性单元型。优选包含位于恒河猴框上游区和恒河猴框下游区之间的全部RHD基因和5’区DNA节段的缺失。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种被称为恒河猴框的核酸分子结构，其在普通RHD阴性单元型中位于RHD缺失断点区域的侧翼区。
根据本发明，术语“RHD缺失的断点区”是指卷入RHD缺失的一个独特的DNA节段。如以上所指出的那样，所述的缺失可能是涉及恒河猴框上游区和下游区的不等交换的结果，缺失散布的序列并最终形成一种RHD框上游区的5’位与RHD框下游区的3’位紧密邻接的核酸分子结构(为更好地将所述的恒河猴框与恒河猴框上游区和恒河猴框下游区区分开来，也将其称为杂合恒河猴框)。如在以上所述和在图7和4中所描述的，该区域优选903bp长，并位于恒河猴框内1,463bp一段，且在此节段内具有99.9％的同源性。在另一个优选的可选择的实施方案中，所述的区域位于该903bp片断的下游，但仍然包含在上述1463bp的一段序列内。优选该片断长556-560bp。实际的断点可以有所变化，以使不同个体中恒河猴框上游区和恒河猴框下游区的贡献有所不同的。但是，根据本发明，断点在任何情况下存在于恒河猴框上游区和恒河猴框下游区。
杂合恒河猴框对分析RHD-阴性单元型特别有用。例如，可以使用与包含由RHD缺失产生的断点的核酸序列杂交的寡核苷酸。可以理解，这种寡核苷酸需与优选包含20个核苷酸的重要部位杂交，所述的重要部位位于实际断点区域的5′和3′以指示缺失事件。例如，当这种寡核苷酸在严谨条件，如65℃的0.2xSSC，0.1SDS，探针可以为943核苷酸长的条件下进行杂交，该杂交区应该包括与断点的3’和5’杂交的部位。
例如，对包含断点区的恒河猴框或其部分进行扩增。然后通过与约6个或更长核苷酸的寡核苷酸杂交，以序列特异的方式分析扩增产物。
优选地，采用两种引物扩增代表包含断点区的恒河猴框或其部分的一段DNA序列。一种引物可以位于恒河猴框同一性区的5’，且对于恒河猴框上游区和杂合恒河猴框具有特异性。另一种引物可以位于该恒河猴框同一性区的3’，且对于恒河猴框下游区和杂合恒河猴框具有特异性。在本申请中，预期大小的扩增产物的存在指示杂合恒河猴框的存在，并从而指示RHD缺失的存在。
另一种可能的引物组合如下：一种引物可以位于恒河猴框同一性区的5’，且对于恒河猴框上游区和杂合恒河猴框具有特异性。另一种引物可以位于该恒河猴框同一性区的3’。在本申请中，可以通过检查从属于该恒河猴框同一性区3’的一段DNA序列的扩增产物部分的特异性来确定杂合恒河猴框的存在。例如，可以通过以下方法实现：通过与能和杂合恒河猴框和恒河猴框下游区杂交但不能和恒河猴框上游区杂交的寡核苷酸杂交；或者通过用能切割杂合恒河猴框和恒河猴框下游区，但不切割恒河猴框上游区的限制酶的消化；或者通过不切割杂合恒河猴框和恒河猴框下游区，但切割恒河猴框上游区的限制酶的消化；或者通过核苷酸测序。
另一种可能的引物组合如下：一种引物可以位于恒河猴框同一性区的5’。另一种引物可以位于该恒河猴框同一性区的3’，且对于恒河猴框下游区和杂合恒河猴框均具有特异性。在本申请中，可以通过检查从属于该恒河猴框同一性区5’的一段DNA序列的扩增产物部分的特异性来确定杂合恒河猴框的存在。例如，可以通过以下方法实现：通过与能和杂合恒河猴框和恒河猴框上游区杂交但不能和恒河猴框下游区杂交的核苷酸杂交；或者通过用能切割杂合恒河猴框和恒河猴框上游区，但不切割恒河猴框下游区的限制酶的消化；或者通过不切割杂合恒河猴框和恒河猴框上游区，但切割恒河猴框下游区的限制酶的消化；或者通过核苷酸测序。
当通过对一个或多个杂交框的实施方案具有特异性的抗DNA抗体、片断或其衍生物如scFvFab或F(ab′)2片断或适体等进行分析时，杂合恒河猴框还可以用作存在RHD缺失的诊断工具。因此，抗体、片断或其衍生物或这种适体可以由本领域技术人员根据常规技术产生(例如，参见Harlow和Lane，″抗体，实验操作手册″，CSH出版社1988，冷泉港)。
在优选的实施方案中，本发明涉及代表RHD阴性单元型的核酸分子结构，该结构包含涉及恒河猴框上游区、恒河猴框下游区或二者的RHD基因缺失。
本发明还涉及位于普通RHD阴性单元型中恒河猴框侧翼区的核酸分子结构。这些结构或序列可以用来衍生用于扩增反应，如用于RHD基因座分子分析的大范围PCR的引物。
例如，使用两种引物扩增包含断点区的代表恒河猴框和其侧翼区部分，或其中一部分的一段DNA序列。一种引物可以位于恒河猴框的5’侧翼区。可选择地，此引物可以位于此恒河猴框同一性区的5’，且对于恒河猴框上游区和杂合恒河猴框均具有特异性。另一种引物可以位于恒河猴框3’侧翼区。可选择地，此引物可以位于此恒河猴框同一性区的3’，且对恒河猴框下游区和杂合恒河猴框具有特异性。在本申请中，预期大小的扩增产物的存在指示杂合恒河猴框的存在，并从而指示RHD缺失的存在。
另一种可能的引物组合如下：一种引物可以位于恒河猴框的5’侧翼区。另一种引物可以位于此恒河猴框同一性区的3’。在本申请中，可以通过检查从属于该恒河猴框同一性区3’的一段DNA序列的扩增产物部分的特异性来确定杂合恒河猴框的存在。例如，可以通过以下方法实现：通过与能和杂合恒河猴框和恒河猴框下游区杂交但不能和恒河猴框上游区杂交的寡核苷酸杂交；或者通过用能切割杂合恒河猴框和恒河猴框下游区，但不切割恒河猴框上游区的限制酶的消化；或者通过不切割杂合恒河猴框和恒河猴框下游区，但切割恒河猴框上游区的限制酶的消化；或者通过核苷酸测序。
另一种可能的引物组合如下：一种引物可以位于此恒河猴框同一性区的5’。另一种引物可以位于此恒河猴框的3’侧翼区。在本申请中，可以通过检查从属于该恒河猴框同一性区5’的一段DNA序列的扩增产物部分的特异性来确定杂合恒河猴框的存在。例如，可以通过以下方法实现：通过与能和杂合恒河猴框和恒河猴框上游区杂交但不能和恒河猴框下游区杂交的寡核苷酸杂交；或者通过用能切割杂合恒河猴框和恒河猴框上游区，但不切割恒河猴框下游区的限制酶的消化；或者通过不切割杂合恒河猴框和恒河猴框上游区，但切割恒河猴框下游区的限制酶的消化；或者通过核苷酸测序。
在优选的实施方案中，该核酸分子结构是RHD阳性单元型的代表。
术语“RHD阳性单元型”指任何包含对RHD基因具有特异性的DNA序列的单元型。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种代表普通RHD阳性单元型的核酸分子结构。
在另一优选的实施方案中，核酸分子结构来自血清学分类为RHD阴性的包含RHD阳性单元型的样品。
在本发明的上下文中，术语“血清学分类为RHD阴性”描述的是一种样品，该样品已用例如，常规血清学试验测定其中RHD抗原的存在，且上述血清学试验的结果为阴性。
在特别优选的实施方案中，归类为RHD阴性的样品来自高加索人种。
在另一更加优选的实施方案中，该核酸分子结构包含部分RHD缺失。
常规诊断为RHD阳性的等位基因产生RHD-阴性表型的一种可选择的解释是部分RHD基因的缺失，或部分RHD基因被对应的来自RHCE基因的DNA节段所取代，而这没能通过常规诊断方法如PCR检测出来。
在优选的实施方案中，该缺失或取代包含产生CcddEe表型的RHD外显子3到7或4到7，或外显子1到9。
在最优选的实施方案中，该取代包含RHD-CE(3-7)-D杂合基因、RHD-CE(4-7)-D杂合基因，上述杂合基因可产生CcddEe表型，或RHCE(1-9)-D(10)杂合基因，所有这些基因都是RHD阴性表型。
在另一个最优选的实施方案中，本发明的核酸分子结构包含RHD-CE-D杂合等位基因(它代表Cdes单元型，但也出现在其它恒河猴单元型中)，携带位于内含子3的5’断点区域(该断点区的序列如图12所示)，和/或位于内含子7的5’断点区域(该断点区的序列如图13所示)，或者这两种断点区。
Cdes也叫r′s，是一种类似于Cde的RH单元型，其最初的特征是表达抗原es而不表达抗原e，表达抗原c，和表达经还原及被改变的抗原C(Issitt，P.D.应用血型血清学，迈阿密：蒙哥马利科学出版物，1985，239页)。目前已阐明了此单元型的分子结构(Blunt，T.，Daniels，G.，和Carritt，B.在部分缺失的RHD基因中的血清型转换Vox Sang.67：397-401，1994；Faas，B.H.W.，Becker，E.A.M.，Wildoer，P.，Ligthart，P.C.，Overbeeke，M.A.M.，Zondervan，H.A.，von dem Borne，A.E.G.K.，和van der Schoot，C.E.在黑人中，VS和弱C表达的分子背景，输血37：38-44，1997；Daniels，G.L.，Faas，B.H.，Green，C.A.，Smart，E.，Maaskant-van Wijk，P.A.，Avent，N.D.，Zondervan，H.A.，von demBorne，A.E.，和van der Schoot，C.E.非洲人种VS和V血型多态性：血清学和分子分析，输血38：951-958，1998)。Cdes单元型含有编码抗原C免疫反应性的RHD-CE-D杂合基因，其中，来自RHCE和外显子3的外显子4到7，具有RHD样结构但其在密码子152处具有RHCE特异的Thr。
在RHD阴性个体中存在的许多其它RHD阳性等位基因先前已被部分或全部描述了(表10)。这十种已公开的RHD等位基因中的三种代表RHD-CE-D杂合等位基因，其中，RHCE特异的一段序列至少包含外显子4到7。对于这三种杂合RHD等位基因的每一种均发现了与其模式相匹配的等位基因(表10)。在本研究中观察的七种RHD阴性模式中，六种与这种类型的杂合RHD等位基因相匹配。十种公开的RHD等位基因中有7种代表缺失、无义突变或假基因。此研究中未发现这些等位基因，这可能表明它们在白种人中罕见。在另一个实施方案中，根据在其内含子7和内含子8部分中缺少RHD特异性序列，本发明提供了对以前描述为RHD外显子9阴性的RHD等位基因的检测或测定(Gassner，输血37：1020ff，1997)，优选代表杂合RHD-CE(9)-D杂合等位基因，在这种方法中进行的特异性步骤可以是任何在本说明书中所述的本发明的进一步方法中所指的步骤，它可以是单独的步骤或步骤的任意组合。
在特别优选的实施方案中，本发明的核酸分子结构中的RHD-CE-D杂合体编码具有抗原C活性的多肽。
抗原C是一种属于现有技术中已知的RH血型的血型抗原，且根据ISBT命名法，将其表示为004.002。在许多有关免疫血液学的教科书中都有所描述，如Reid，M.E.和Lomas-Francis，C.血型抗原证明，圣地亚哥：科学出版社，1997。
进一步地，在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子包含单一的核苷酸取代，所述取代位于在RHD基因的编码区内或者5′或3′剪接位点内。
术语“由RHD基因衍生的核酸分子”意指该核酸分子来源于RHD基因，但在编码区、任何一种剪接位点或非编码区内携带突变、缺失、插入、取代或重复。优选地，所述的核酸分子产生异常多肽。
在进一步优选的实施方案中，该核苷酸取代在密码子16处产生终止密码子。
在更优选的实施方案中，该取代基因产生RHD(W16X)突变。
在另一个更优选的实施方案中，该取代为在48位核苷酸处的G→A取代。
在本发明的进一步优选的实施方案中，该核苷酸取代在密码子330处产生终止密码子。
在本发明的更优选的实施方案中，该取代产生RHD(Y330X)突变。
在本发明的更进一步优选的实施方案中，该取代为在985位核苷酸处的C→G取代。
在本发明的另一个优选的实施方案中，该取代在密码子212处产生错义突变。
在本发明的另一个优选的实施方案中，该取代产生RHD(G212V)错义突变。
在本发明的更优选的实施方案中，该取代为在635位核苷酸处产生的G→T取代。
在本发明的一个不同的优选的实施方案中，该取代在包含外显子8/内含子8边界处共有剪接位点的4-核苷酸序列、6-核苷酸序列或8-核苷酸序列内产生突变。
在本发明的另一个更优选的实施方案中，该取代产生RHD(G1153(+1)A)突变。
在本发明的另一个更优选的实施方案中，该取代为在内含子8的5’剪接位点处的取代，从AGgt到AGat。
在进一步更优选的实施方案中，本发明的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子与RHD-阴性表型相关。
在本发明的另一个优选的实施方案中，该取代在包含外显子3/内含子3边界处包含共有剪接位点的4-核苷酸序列、6-核苷酸序列或8-核苷酸序列内产生突变。
在本发明的进一步优选的实施方案中，该取代产生RHD(G486(+1)A)突变。
本发明的另一个更优选的实施方案中，该取代为在内含子3的5’剪接位点处的取代，从ACgt到ACat。
在本发明的进一步优选的实施方案中，该取代在包含外显子9/内含子9边界处共有剪接位点的4-核苷酸序列、6-核苷酸序列或8-核苷酸序列内产生突变。
在另一个优选的实施方案中，该取代产生RHD(K409K)突变。
在本发明的另一个更优选的实施方案中，该取代为内含子9的5’剪接位点处的取代，从AGgt到AAgt。
在本发明一个更优选的实施方案中，本发明的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子与De1-表型有关。
总之，根据以上所述，RHD阳性等位基因可以包含导致D-抗原表达终止或减弱的单核苷酸取代。采用本发明公开的改进的检测方法，在RHD阴性中发现了四个先前未曾描述过的RHD阳性等位基因。两个等位基因，RHD(W16X)和RHD(Y330X)包含终止密码子，妨碍了全长RHD蛋白的表达。在三个等位基因中发现了剪接位点突变，其可妨碍正确的剪接和RHD表达。在所有的用PCR检测的RHD中这些定型为RHD阳性的等位基因，和正确抗原D预测对于这些等位基因或与这些等位基因相关的多态性的特异性检测是必要的。
以前，区分RHD纯合子和RHD杂合子是困难的。主要的RHD阴性等位基因不能被特异地检测出来(Flegel，输血医学8：281，1998；Cossu，电泳17：1911，1996)。本发明发现的上述突变提供了主要RHD阴性单元型检测的基础，从而使真正的RHD基因定型成为可能。
本发明还涉及一种特异性地检测样品中RHD阴性单元型的方法，该方法用已有技术，优选扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)，更优选采用PCR-RFLP、PCR-SSP或远程PCR，利用任何结构特征、核苷酸序列或上述核酸分子结构两者兼用或某组合进行。
所述的PCR-RFLP和远程PCR方法使用恒河猴框序列或恒河猴框侧翼序列。利用相同DNA片段或其组合，可以开发或应用其它方法，如PCR-SSO或生物芯片。
在本发明的一个优选的实施方案中，该特异性地检测普通RHD阴性单元型的方法包括以下步骤：
(a)从血样或供血者分离DNA；
(b)在严谨条件下将至少两种相反取向的引物与此DNA杂交，以进行PCR；
(c)扩增靶序列；
(d)在凝胶上分离扩增产物；和
(e)分析扩增子。
该样品可以来自血、血清、唾液、粪便或其它体液。其中，可以处理要分析的样品以提取核酸。可以通过修改的盐析法，根据在Gassner，输血37：1020，1997.中所述的技术，从优选由EDTA-或柠檬酸盐凝集的血样中分离DNA。引物优选为天然的或已经纯化的限制酶切消化后的寡核苷酸，或者为合成引物。引物优选为单链，以使本发明方法的效率最高，并优选寡脱氧核苷酸。一般认为该引物在其用于本发明方法之前需进行纯化，该纯化包括高效液相色谱(HPLC)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，所有的技术对于本领域技术人员来说是已知的。扩增方法如PCR或LCR在现有技术中是已知的，并在例如在Flegel，输血医学8(1998)，281-302；Maaskant，输血38(1998)，1015-1021和Legler，输血(1996)，426-31中有述。
根据本发明，一种优选的检测RHD缺失的方法是使用延伸的高保真PCR-系统，和结合于恒河猴框同一性区5’末端的非特异性引物，以及对恒河猴框下游区特异并与恒河猴框同一性区3’末端结合的引物，进行PCR-RFLP。PCR的条件优选包括在65℃下退火，在68℃下延伸10分钟。然后，所述PCR扩增子在37℃下用PstI消化3小时，并用1％的琼脂糖凝胶分离片段。在实施例10和11中还描述了其它的优选的方法。
本发明的另一个实施方案涉及一种包括杂合恒河猴框检测的特异性检测普通RHD阴性单元型的方法。
杂合恒河猴框的检测在相应的RHD等位基因的性质方面给业者提供了明确的结果。如果检测到了杂合恒河猴框，则RHD基因被删除。优选采用与包含断点的区域特异性杂交的寡核苷酸进行杂合恒河猴框的检测。用于杂交的寡核苷酸必须与此断点直接杂交，且与此断点5’和3’的至少943个核苷酸杂交。杂交优选在严谨条件，如65℃下，0.2 X SSC，0.1％SDS的条件下进行。杂合恒河猴框内的实际断点可能因推定的交换事件的确切性质而异。因此，还可以采用大量用于杂交的重叠或非重叠寡核苷酸检测杂合恒河猴框。还可以采用其它方案如限制酶切分析(优选与Southern印迹分析组合)，或PCR技术来检测杂合恒河猴框，如本文以上所述。
而且，本发明的另一实施方案涉及一种特异性检测普通RHD阴性单元型的方法，该方法包括评价含有杂合恒河猴框及其侧翼区的核酸分子结构。
根据本发明，分子核酸结构的评价包括如下分析步骤：例如采用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶的凝胶电泳，用限制酶处理，印迹技术如Southern或Northern印迹，或相关的技术如荧光指示的杂交检测和其它现有技术中已知的技术。
本发明还涉及一种特异性检测样品中RHD阴性单元型的方法，其包括检测在本发明中所述的任何断点区的步骤。
`在一个优选的实施方案中涉及上述的方法，其中，所述的检测或评价包括确定包含杂合恒河猴框或其部分的核酸分子的长度。
另外，本发明方法的优选实施方案利用常规分离技术，如本领域技术人员已知的凝胶电泳或色谱或常规核苷酸测序技术。本发明优选利用从Applied Biosystems商购得的测序试剂盒和自动测序仪(ABI 373A或ABI377)，实施例5将进一步对此进行描述。
本发明的另一优选的实施方案涉及上述的方法，其中通过以下方法进行该检测或评价：采用PCR-RFLP，PCR-SSP或远程PCR或，优选采用Southern印迹分析，凝胶电泳，生物芯片分析，检测分子量或荧光与杂合恒河猴框，优选与图4或5或图12或13中所述的断点或断点区，或恒河猴框上游区或下游区进行特异性杂交的探针。
根据本发明，术语″与......杂交″涉及严谨或非严谨条件。条件的设定对本领域技术人员来说是已知的，并根据所述的方案来确定，如在Sambrook，在上述引文中或Hames和Higgins，″核酸杂交实用方法″，IRC出版社，牛津(1985)中所述。特异杂交序列的检测一般要求严谨的杂交和洗涤条件，如在65℃的0.2 x SSC，0.1％SDS的条件下。用于检测同源且非严格互补序列的非严谨杂交条件可以设定为50℃或65℃6x SSC，1％SDS的条件。已知探针的长度和待测定的核酸组成也是杂交条件的参数。
进一步地，本发明涉及一种包含本发明核酸分子结构或核酸分子的载体。
此载体可以用于增殖和/或表达，或者可被设计用于基因转移或靶向目的。上述载体的生产方法在现有技术中是已知的。同样，将突变的核酸克隆至该载体，并在适宜的宿主中增殖载体等等也是已知的。
此载体可以具体为在遗传工程中常用的包含本发明核酸分子的质粒、粘粒、病毒或噬菌体。来源于病毒如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可以用于将本发明的核酸分子或载体运送到靶细胞群内。可用本领域技术人员已知的方法构建重组病毒载体；例如，参见在以下文献中描述的技术：Sambrook，分子克隆实验手册，冷泉港实验室(1989)N.Y.和Ausubel，现代分子生物学方法，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.(1989)。可选择地，可以将本发明的多核苷酸和载体重新构建到脂质体内以运送到靶细胞。可以通过已知的方法将含有本发明核苷酸分子的载体转移到宿主细胞，这些方法随细胞宿主的类型而异。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔常用于其它细胞宿主，参见Sambrook，见上。
这种载体还可以包含基因如，用于在适宜的条件下于合适的宿主细胞中筛选该载体的标记基因。优选地，本发明的核酸分子可操作地连接到使其能在原核或真核细胞内表达的表达调控序列上。该多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录为可翻译的mRNA。确保在真核细胞内，优选在哺乳动物细胞内表达的调控元件对本领域技术人员是已知的。它们一般包括确保转录起始的调控序列和确保转录终止和转录物稳定的可选的poly-A信号。此外的调控元件可以包括转录和翻泽增强子，和/或天然相关的或异源启动子区。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括如大肠杆菌(E.Coli)中的PL、lac、trp或tac启动子，而允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的例子有酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(Rous肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。除了负责起始转录的元件以外，这种调控元件还可以包括核酸分子下游的转录终止信号，如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。而且，根据所用的表达系统，还可以向本发明的多核苷酸编码序列中加入能够引导所述多肽到细胞区室或分泌进入介质中的前导序列，这些序列在现有技术中是已知的。此前导序列在适宜的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起，并且优选，能够指导翻译后的蛋白或其部分分泌到周质空间或细胞外介质中的前导序列。可选择地，异源序列可以编码包括赋予所需特性，如可使表达的重组产物稳定或纯化简化的C-或N-末端鉴别肽的融合蛋白。在上下文中，适宜的表达载体在现有技术中是已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
表达调控序列在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可以使用原核宿主的调控序列。
如上述，本发明的载体还可以是基因转移或靶向载体。基于通过体外或体内技术将治疗基因导入细胞的基因治疗是基因转移的一种最重要的应用。用于体外或体内基因治疗的适宜的载体和方法已在文献有所描述，并且对本领域技术人员来说是已知的；例如参见Giordano，天然医药2(1996)，534-539；Schaper，循环研究79(1996)，911-919；Anderson，科学256(1992)，808-813；Isner，柳叶刀348(1996)，370-374；Muhlhauser，循环研究77(1995)，1077-1086；Wang，天然医药2(1996)，714-716；WO94/29469；WO 97/00957或Schaper，生物技术现代观7(1996)，635-640，及其引用的参考文献。可将本发明的多核苷酸和载体设计为直接引入或通过脂质体或病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)引入细胞。优选地，该细胞为种系细胞，胚胎细胞或卵子或其衍生物，更优选该细胞为干细胞。
此外，本发明涉及一种采用本发明载体转化的非人宿主。
适宜的宿主包括转基因动物，细胞如细菌、酵母细胞、动物(优选哺乳动物细胞)、真菌细胞或昆虫细胞。已知的转化方法包括转染，显微注射，电穿孔等等。
进一步地，本发明涉及一种生产RHD基因蛋白产物的方法，此方法包括在适宜的条件下培养本发明的宿主，并分离RHD基因的蛋白产物。
优选将RHD基因的蛋白产物转运到培养基中，再通过常规/方法将其从培养基中收集起来。本发明所用的术语“培养”还包括饲养转基因动物。例如，采用适宜的载体结构和可选的适宜的饲料，可以从转基因牛乳中分离抗原。
本发明还涉及一种由本发明的核酸分子编码或由本发明方法生产的RHD基因的蛋白产物。
蛋白优选以同样的方式进行翻译后修饰，并具有与天然存在的抗原相同的化学结构。因此，当由本发明的方法生产该蛋白时，此蛋白优选在人细胞中生产。
而且，本发明涉及一种在严谨条件下，与本发明的核酸分子结构或核酸分子部分(其中所述的部分包含所述的(错义)突变或所述的终止密码子)或其互补部分杂交，或与本文以上鉴定的基因转变的断点杂交的寡核苷酸。
在本发明的这一实施方案中，可知寡核苷酸直接与突变序列或断点杂交。例如在以下文献中详细描述了严谨的杂交条件的设定：Sambrook等人，″分子克隆，实验操作手册″CSH出版社，冷泉港1989或Hames和Higgins，″核酸杂交，实用方法″，IRL出版社，牛津(1985)。因此，检测特异性杂交序列通常要求如：65℃下0.2 x SSC，0.1％SDS的杂交和洗涤条件。已知，探针的长度和待测的核酸分子的组成构成了严谨杂交条件的进一步的参数。优选的寡核苷酸为脱氧核苷酸。进一步优选的寡核苷酸包含12到50个核苷酸，更优选15到24个核苷酸。与断点的杂交可以在严谨或非严谨条件下。非严谨杂交条件的一个例子是在50℃下，在4 x SSC，0.1％SDS中进行杂交和洗涤。
进一步地，本发明涉及一种与本发明的RHD基因的蛋白产物特异性结合的抗体或适体。
抗体可以以任何现有技术中已知的血清技术进行试验和使用，如在试管、凝胶、固相，和采用或不采用第二抗体的捕获技术中的凝集技术，或在存在或不存在免疫荧光增强的情况下的流式血细胞计数。
本发明的抗体可以是单克隆抗体或者来源于或包含在多克隆抗血清中的抗体。本发明所用的术语“抗体”还包括该抗体的片断如Fab、F(ab′)2、Fv或scFv片断；例如，参见Harlow和Lane，″抗体，实验手册″CSH出版社1988，冷泉港，N.Y。抗体或其片断可以是天然的或(半)合成的。这种合成产物还包括与本发明抗体具有相同或基本相同的结合特异性的非蛋白和半蛋白物质。这些产物可以，例如由拟肽得到。
术语“适体”在现有技术中是已知的，并且在例如Osborne等人，生物化学现代观I(1997)，5-9或Stall和Szoka，药学研究12(1995)，465-483中有述。
进一步地，本发明涉及一种用于检测样品中是否存在编码突变恒河猴D抗原的核酸分子或携带RHD基因缺失的核酸分子的方法，这些核酸分子具有本发明的核酸分子结构或核酸分子的特征，此方法包括在严谨条件下将本发明的寡核苷酸与包含在从人上得到的样品中的核酸分子杂交，并检测该杂交。
优选地，本发明的方法进一步包括用限制性核酸内切酶消化该杂交产物，或用限制性核酸内切酶将该杂交产物消化并分析该消化产物。
本发明的优选的实施方案允许通过简便的方法区分有效杂交和无效杂交。例如，如果野生型RHD基因包含核酸内切酶限制性酶切位点，则杂交产物可被合适的限制酶切割，而突变序列不产生双链产物或不包括可识别的酶切位点，因此不能被切割。可选择地，杂交寡核苷酸可能仅与突变序列杂交。在这种情况下，合适的限制酶仅切割包含突变序列，而非野生型序列的杂合体。可以通过常规方法分析消化产物，如通过凝胶电泳，其可选择地用如溴化乙锭进行核酸染色相结合。还可以预期与其它技术如Southern印迹法相结合。
例如，可以通过抗DNA双链抗体或通过使用标记的寡核苷酸检测所述的杂交。通常将本发明的方法与印迹技术如Southern或Northern印迹和相关的技术一起使用。例如，可以通过常规方案进行标记，包括用放射性标记物、荧光、磷光、化学发光、酶标记物等进行标记。
本发明还涉及一种同时检测RHDψ和本发明的任何RHD分子结构存在的方法，该方法包括在严谨条件下将本发明的寡核苷酸及至少一种可与RHDψ结构杂交的其它寡核苷酸，与包括在来自人的样品中的核酸分子杂交，并对所述杂交进行检测。
本发明还涉及一种用于同时检测样品中RHDψ和本发明的任何RHD分子结构存在的方法，该方法包括确定至少一部分本发明的核酸分子结构或核酸分子的核酸序列，该部分编码所述(错义)突变、所述终止密码子或所述杂合基因的断点，并确定至少一部分RHDψ结构。
本发明还涉及一种用于检测样品中存在编码突变恒河猴D抗原的核酸分子或携带RHD基因缺失的核酸分子的方法，这些核酸分子具有本发明的核酸分子结构或核酸分子的特征，所述方法包括确定至少一部分本发明的核酸分子结构或核酸分子的核酸序列，所述的部分编码所述(错义)突变的部分、所述终止密码子或所述杂合基因的断点。
本发明的方法进一步优选包括在确定核酸序列之前，至少对所述核酸分子结构的所述部分进行扩增。
本发明还涉及一种用于同时检测样品中存在RHDψ和本发明的任何RHD分子结构的方法，该方法包括用一组引物进行扩增反应，至少扩增出所述序列的一部分，其中至少用于所述扩增反应的引物之一是本发明的寡核苷酸，和至少一种扩增(如通过特异性杂交)RHDψ结构的引物，及对扩增产物进行分析。
RHDψ是一种在D阴性中检测到的RHD等位基因，它已由Singleton等人表征(Singleton，B.K.，Green，C.A.，Avent，N.D.，Martin，P.G.，Smart，E.，Daka，A.，Narter-Olaga，E.G.，Hawthorne，L.M.，和Daniels，G.包含37个碱基对重复的RHD假基因的存在和具RHD-阴性血型表型的非洲人中的无意突变。血液95(1)：12-18，2000)。
本发明还涉及一种用于检测样品中存在编码突变恒河猴D抗原的核酸分子或携带RHD基因缺失的核酸分子的方法，这些核酸分子具有本发明的核酸分子结构或核酸分子的特征，该方法包括用一组引物进行扩增反应，至少扩增出所述序列的一部分，其中至少用于扩增反应的引物之一是本发明的寡核苷酸。
而且，在本发明方法的进一步的实施方案中，用于所述扩增反应的至少一种引物为本发明的寡核苷酸。
优选通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。还可以使用其它的扩增方法如连接酶链式反应。
在本发明方法的优选实施方案中，所述PCR为PCR-RFLP、PCR-SSP或远程PCR。
此外，在本发明的另一个优选的实施方案中，分析了扩增产物的分子量。所述分子量分析利用常规技术，如琼脂糖凝胶电泳，SDS-PAGE，质谱如用于此目的MALDI-TOF进行，这些技术对于本领域技术人员来说是已知的。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述检测RHD阳性等位基因的方法，包括以下步骤：
(a)分离来自血样或供血者的DNA；
(b)在严谨条件下用至少两个相反取向的引物与该DNA进行杂交以进行PCR；
(c)扩增靶序列；
(d)从凝胶上分离扩增产物；
(e)分析扩增子。
关于在各步骤中应用的具体条件，它是指本文以上相应的说明。
在一个优选的实施方案中，RHD阳性等位基因来源于血清学上的RHD阴性种群。在另一个优选的实施方案中，RHD-阴性样品选自高加索人种。
如果所述靶序列携带此突变或至少一种突变的话，本发明的方法将导致仅扩增此靶序列。这是因为该寡核苷酸在优选的严谨杂交条件下，将不与野生型序列杂交(结果是没有得到扩增产物)，而仅与突变序列杂交。天然情况下，与一个或多个作为一个整体的序列，如两个突变序列杂交的引物寡核苷酸可以用于本发明方法。后者的实施方案可能在检测突变的组合时是有利的。重要的是要注意到，不是所有的或没有任何一个所述突变必须是错义突变。这在其它类型的突变与以上错义突变或以上基因转变组合出现时也是正确的。
优选地，在本发明的方法中，所述扩增或扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)或通过聚合酶链式反应(PCR)完成。还可以使用其它扩增方法如连接酶链式反应。
本发明进一步涉及一种检测样品存在本发明RHD基因的蛋白产物的方法，所述方法包括检测来自人的样品与本发明的抗体或适体或噬菌体的特异性结合。
结合检测，可能又一次涉及常规技术如ELISAs的应用；例如，参见Harlow和Lane，″抗体，实验操作手册″CSH出版社1988，冷泉港。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及一种用于检测存在编码本发明的核酸分子结构或核酸分子的RHD基因蛋白产物的方法，此方法包括采用直接凝集方法、间接抗球蛋白试验、单克隆抗-D抗体和吸附/洗脱技术。
因此，此实施方案可包括与两种单克隆抗-D抗体的直接凝集，可选择的使用包含寡克隆抗-D抗体的凝胶基质的间接抗球蛋白检测，在进一步的可选择方案中使用单克隆抗-恒河猴抗体，在另一个可选择的实施方案中将多克隆抗-D抗体吸附到红细胞上并使用氯仿技术进行洗脱。实施例18给出了这些方法的进一步说明。
在本发明的方法中，所述的样品优选血液，血清，血浆，胎儿组织，唾液，尿液，粘膜组织，粘液，阴道组织，和从阴道，皮肤，毛发，毛囊获得的胎儿组织或其它人的组织。
进一步地，本发明的方法优选包括胎儿细胞的富集步骤。这种富集可以通过以下方法实现：使用适宜的抗体、凝集素或其它特异性结合胚胎细胞的试剂，或通过任何尝试将母细胞和胚胎细胞差别分离的技术，如采用密度梯度。在该方法中，还优选根据常规方法从母组织如外周血液、血清或血浆中提取胎儿DNA或mRNA。
在另一个本发明方法的优选的实施方案中，将来自所述样品的核酸分子或蛋白物质固定到固体支持物上。
所述固体支持物优选芯片。
芯片的好处在现有技术中是已知的，这里无需详细讨论。其体积小且易于对待测物进行基于计算机的分析。
而且，本发明涉及将本发明的核酸分子结构或核酸分子用于阴性或阳性恒河猴D表型的分析。
例如，这种分析可以在本文上述方法的基础上完成。
本发明涉及本发明的核酸分子结构或核酸分子、本发明的载体或本发明的RHD基因的蛋白产物在评价单克隆抗-D或抗-C抗体，或者多克隆抗-D或抗-C抗血清，或者球蛋白或抗-人-抗球蛋白抗血清，或者它们的制剂的亲合力、亲和性和/或反应性上的用途。
抗-C是一种结合到抗原C上的单克隆抗体或多克隆抗血清。
本发明还涉及来自携带本发明的核酸分子结构或核酸分子的先证者的细胞，优选红细胞在评价单克隆抗-D或抗-C抗体，或者多克隆抗-D或抗-C抗血清，或者抗球蛋白或抗-人-球蛋白抗血清，或者它们的制剂的亲合力、亲和性和/或反应性上的用途。
可以根据现有技术提供所述的制剂。所述的制剂可以包含稳定剂如白蛋白，叠氮化钠、盐离子、缓冲剂等。如在现有技术中已知的那样，这种制剂的配方可以影响抗体的结合特征。
例如，第一步，分析携带者或供血者的恒河猴D基因及其等位状态，并确定所述基因是否包含本发明发现的突变。第二步，将所述突变与红细胞表面的某一RHD抗原密度关联。可以由本发明提供的数据(如自身突变)和现有技术(例如，参见Jones等人1996，Flegel和Wagner，1996)方便地建立所述的关联。第三步，采用适宜的血型血清学技术，优选使用如步骤2所述的红细胞的分子特征和RHD抗原表面密度特征，测定抗体或抗血清的特征，如反应性、敏感性、亲合力、亲和性和/或特异性。例如，可以在质量控制、标准化等中使用这些数据。
本发明最适于单克隆和多克隆抗血清，优选抗-D单克隆或抗血清的表征、标准化和质量控制。例如，还可以在本发明所述的基础上表征抗球蛋白和抗-人-球蛋白抗血清。适当表征的抗-D单克隆抗体可以方便地用于RHD诊断。例如，适宜表征的单克隆抗体用于测定血细胞表面的D抗原密度。因此可以建立用于诊断的单克隆抗体的截断值。这对于RHD诊断中所用的抗体的质量控制是重要的。
因此，本发明还涉及一种用于表征单克隆抗体或多克隆抗血清或其制剂的方法，所述方法包括：
(a)检测来自先证者的样品中是否存在如本发明所定义的断点或突变；
(b)根据突变或缺失状态和RHD基因的等位状态将所述的核酸与所述先证者红细胞表面的RHD基因的蛋白产物的密度相关联；
(c)使所述的单克隆抗体或多克隆抗血清或其制剂与表面带有RHD基因蛋白产物的细胞起反应；
(d)根据步骤(c)的结果表征所述单克隆抗体或多克隆抗血清或其制剂。
关于术语“等位状态”，此术语描述的是先证者中的RHD等位基因可能以纯合、杂合或半合状态存在的可能性。此术语还包括两种等位基因携带本文上述的两种不同突变(包括转换)的可能性。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述表征表包括测定抗体和抗血清的反应性、敏感性、亲和性、亲合力、特异性和/或其它特征。
在进一步优选的方法中，表面携带RHD基因的蛋白产物的细胞为红细胞。
本发明也涉及一种确定需要输血的病人是否要从供血者输入RHD阴性血液的方法，该方法包括检测来自所述病人的样品中是否存在一种或多种本发明的核酸分子结构或核酸分子，其中检测出两种不同的所述核酸分子结构或核酸分子为阳性，表明需要对其输入Rh阴性血液。可选择地，指示所述核酸分子结构或核酸分子之一的两个相同拷贝共存的阳性试验结果表明需要输入Rh阴性血。
可选择地，存在代表普通RHD阴性单元型的核酸分子结构或核酸分子的阴性检测，与或不与存在代表本发明的其它RHD阴性核酸分子结构或核酸分子的一种或多种核酸分子结构或核酸分子的阴性检测，允许输归为RHD阳性的血。本发明具有设计用于人的输血治疗的重要含义。例如，现在可以方便地检测出患者是否真正需要输入RHD阴性血，或是否无需进行这种预防。
本发明还涉及一种用于确定供血者的血液是否适于输入到需要输血但不适合接触抗原C的患者的方法，所述方法包括：检测所述供血者样品中是否存在本发明的核酸分子结构的步骤，其中本发明的核酸分子结构的阳性检测则不能输入供血者的血液。
进一步地，本发明涉及一种用于确定供血者的血液是否可以用于输入到需要输血的患者的方法，所述方法包括：检测所述供血者样品中是否存在一种或多种本发明的核酸分子结构或核酸分子，其中，存在代表普通RHD阴性单元型的核酸分子结构的阴性检测，与或不与存在代表本发明的其它RHD阴性单元型的一种或多种核酸分子结构或核酸分子的阴性检测，不能将供血者的血液输入归为RhD阴性的患者。
本发明还涉及一种用于确定供血者的血液是否可以输入到归为RhD阴性的患者的方法，所述方法包括：检测所述供血者样品中是否存在一种或多种本发明的核酸分子结构或核酸分子的步骤，其中对这两种不同核酸分子结构或核酸分子的阳性检测表明将供血者的血液输入到归为RhD阴性患者的可能性。
可选择地，一种所述核酸分子结构或核酸分子的两个相同拷贝共存的阳性检测表明将供血者的血液输到归为RhD阴性患者的可能性。
上述方法中所指的样品可以是整个说明书中所指的样品，如血液、血清等等。
关于在任何上述方法的基础上对患者输血的指导方面，必须小心避免次最优输血策略。主治内科医师应该能够总是考虑到这种风险因素。在所有的情况下，都应将患者的潜在风险最小化。
本发明还涉及一种估计怀有RhD阳性胎儿的RhD阴性的母亲或者怀有抗-D滴度胎儿的母亲可发生新生儿溶血的危险性的方法，该方法包括估计来自胎儿父亲的样品中是否存在一种或多种本发明所述的核酸分子结构或核酸分子的步骤，其中，代表普通RHD阴性单元型的核酸分子结构或核酸分子的阴性检测，与或不与代表本发明的其它RHD阴性单元型的一种或多种核酸分子结构或核酸分子的阴性检测，表明孕育RhD阳性胎儿的高风险性。
在本发明方法的优选的实施方案中，所述核酸分子携带突变或缺失。
本发明还涉及一种用于确定此父体是否为RHD阴性的方法，此方法包括：检测来自父体的样品是否存在一种或多种本发明的核酸分子结构或核酸分子的步骤，其中，两种不同的核酸分子结构或核酸分子的阳性检测表明父体为RHD阴性。
可选择地，指示代表RHD阴性单元型的核酸分子结构或核酸分子之一的两种相同拷贝同时存在的阳性检测表明父体为RHD阴性。
另外，本发明还涉及一种通过分析来自一男性的样品中是否存在本发明所述的一种或多种核酸分子结构或核酸分子，估计该男性是某个孩子父亲的可能性的方法，其中，所述的试验结果用于确定代表本发明的RHD阴性单元型的任意一项的核酸分子结构或核酸分子的纯合性，杂合性或不存在，并用于推断上述男性是所述孩子的父亲的可能性。
此制剂可以是诊断或药物制剂。
本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。适宜的药学上可接受的载体在现有技术中是已知的，并包括磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳剂，如水/油型乳剂，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。包含这些载体的组合物可由已知的常规方法制成。这些药物组合物可以适宜的剂量施用于受试者。
非肠道给药制剂包括无菌含水或非水溶液，悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例为丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水，乙醇/水溶液，乳剂或悬浮剂，包括盐水和缓冲的介质。非肠道赋形剂包括氯化钠溶液，林格氏右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸化林格氏右旋糖或不挥发油。静脉内赋形剂包括流动的营养补充剂，电解补充剂(如基于林格氏右旋糖的物质)等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。而且，本发明的药物组合物还可以包含的试剂如内白细胞素或干扰素，这取决于此药物组合物的预期用途。
本发明还涉及一种用于治疗恒河猴D阴性怀孕妇女的方法，其中胎儿不携带本发明的两种核酸分子结构或核酸分子，或本发明的任何核酸分子结构或核酸分子均不是纯合的，所述方法包括给所述妇女施用抗-D。
当恒河猴阴性母体怀有RhD阳性胎儿时，目前采用抗-D预防治疗怀孕妇女。本发明提供对抗-D预防要求的鉴别，它取决于含有本发明RHD蛋白的母体和/或胎儿的状态。本发明的一种或多种RhD蛋白可能倾向于其载体的免疫，从而指示母体的治疗。类似地，当胎儿携带一种或多种本发明的RhD蛋白时，这些蛋白已知可能对母体具有低免疫性，从而表明忽略了目前临床治疗与抗-D预防的差别。
可以通过常规途径和主治内科医师所规定的剂量进行给药；Mollison，1993。对于静脉内或肌内给药，优选以50μg或者超过500μg抗-D抗体/抗血清的剂量施用单克隆抗-D或单克隆抗-D的组合物/混合物(Bowman，1998)。可以有效利用本发明提供的结果和方法对这些抗-D抗体/抗血清进行质量控制。
本发明还涉及本发明表征的噬菌体、适体、单克隆抗体或多克隆抗血清或其制剂在测定RHD基因的蛋白产物中的用途。
在该所述用途的一个优选的实施方案中，所述的RHD基因的蛋白产物的测定与血型分型一起进行。
而且，本发明涉及一种包含本发明抗体或适体或噬菌体的制剂。
本发明还涉及一种鉴定可与本发明的RHD基因的蛋白产物特异结合的抗体VH或VL链或其组合或者适体的方法，该方法包括：
(a)将本发明的RHD基因的蛋白产物与在噬菌体表面显示VH或VL链或其组合的噬菌体文库相接触，或者与适体相接触；
(b)鉴定与所述RHD基因的蛋白产物相结合的噬菌体或适体；和可选择地
(c)重复步骤(a)和(b)一次或多次。
噬菌体文库的制备和靶抗体(链)的筛选/鉴定本身在现有技术中是已知的，例如，相关讨论见于Winter等人，免疫学年评12(1994)，433-455及其引用的参考文献。而且，可以根据常规方案在噬菌体内制备和克隆适体。同时，可以通过本发明的方法以与本发明RHD基因的蛋白产物相结合鉴定单VH或VL链，优选鉴定由此噬菌体表达的VH-VL组合，因为这种状态与天然抗体结合的状态相似。通过重复步骤(a)和(b)一次或多次，可以鉴定较好的结合特异性。包括除去结合的噬菌体的洗脱步骤的，用于优化结合特性，如亲和性的方案在现有技术中已经建立。例如，一旦发现具有方便结合能力的VH链，即可鉴定VL链，从而显著地提高抗体的结合能力，例如，通过用更适宜的VL链代替在第一次选择步骤中与VH链相关的VL链。
本发明还涉及一种用于鉴定特异性结合到本发明的RHD基因的蛋白产物上的单克隆抗体的方法，所述方法包括：
(a)使本发明的RHD基因的蛋白产物与一种或多种单克隆抗体接触；
(b)鉴定结合到所述RHD基因的蛋白产物上的单克隆抗体；和可选择地，
(c)重复步骤(a)和(b)一次或多次。
本发明还涉及一种鉴定可特异结合到本发明的RHD基因的蛋白产物上的抗体VH或VL链或其组合，或适体的方法，所述方法包括：
(aa)将所述RHD基因的蛋白产物和
(ab)正常的D多肽
与在噬菌体表面显示VH或VL链或其组合的噬菌体文库相接触，或者与适体相接触，
其中所述的正常D多肽的摩尔质量高于、等于或小于(aa)中的RHD基因的蛋白产物；
(b)鉴定与(a)中所述RHD基因蛋白产物相结合的噬菌体或适体；和可选择地
(c)重复步骤(a)和(b)一次或多次。
特别优选在步骤(ab)中，正常D多肽的摩尔质量大于(aa)的RHD基因的蛋白产物的摩尔质量。
在仅用一轮选择进行鉴定的情况下(即，当不用步骤(c)时)，优选(aa)的RHD基因的蛋白产物的摩尔数超过噬菌体粒子数。上述的鉴定抗体VH或VL链或其组合或适体的方法的优选的实施方案同样适用于本发明实施方案。
本发明还涉及一种鉴定特异性结合到本发明RHD基因的蛋白产物上的单克隆抗体的方法，所述方法包括：
(aa)将RHD基因的蛋白产物和
(ab)一种正常的D多肽
与一种或多种单克隆抗体相接触，
其中所述的正常D多肽的摩尔质量高于、等于或小于(aa)中RHD基因的蛋白产物；
(b)鉴定与(aa)中所述的RHD基因的蛋白产物相结合的单克隆抗体；和可选择地
(c)重复步骤(a)和(b)一次或多次。
优选使RHD基因的蛋白产物暴露于细胞表面。适宜的表面为红血球的表面。但是，可以用适于表达本发明RHD基因的蛋白产物的载体转染其它宿主细胞，并在其表面表达同一蛋白产物。抗体也可以与D抗原蛋白和纯化蛋白的重组蛋白或其部分蛋白相结合。
进一步优选将多肽或宿主细胞固定到固体支持物上。用于固体支持物的适宜的实例为微滴定板或玻璃珠。
在另一个优选的抗体中，在步骤(b)或(c)之后，进行以下步骤：
(d)鉴定VH或VL链的氨基酸序列和/或鉴定编码该氨基酸序列的核酸序列。
可以根据常规的方案进行氨基酸/核酸序列的鉴定；例如，参见Sambrook等人，在上述引文中。
因此总之，本发明提供了用于检测上述的RHD单元型，包括普通RHD阴性单元型，以及推定为血清学上RHD阴性种群中稀少的RHD阳性等位基因的途径和方法。后一包含RHD序列因而被测定为RHD阳性的等位基因，可包含终止或减少RHD抗原表达的RHD/RHCE杂合基因、终止密码子、剪接位点突变或基因缺失。实施本发明的改进的检测方法，惊人地发现一些以常规的血清学技术确定为RHD阴性的样品可以鉴定为具有RHD阳性等位基因。而且，这些样品中的一些在基于吸附和洗脱的检测中，甚至为RHD抗原阳性，这表明RHD阴性中的RHD阳性等位基因的分子基础比预期的更具异源性。有利的是，现在本发明公开的内容提供了新的和实用的核酸扩增技术，以确定是否RHD特异性序列导致RHD阳性或RHD阴性表型。
在本发明方法的一个特别优选的实施方案中，在该鉴定仅使用一轮选择时，(a)的RHD基因的蛋白分子的摩尔数超过噬菌体粒子数。
而且，本发明涉及来自先证者的细胞，优选包含本发明的RHD基因的蛋白产物或由本发明方法生产的红细胞，在评价本发明的单克隆抗-D或抗-C抗体，或多克隆抗-D或抗-C抗血清，或抗球蛋白或抗-人-球蛋白抗血清，或它们的制剂的亲合力、亲和性和/或反应性中的应用。
而且，本发明涉及使用SMP1多态性以确定与该基因多态性遗传连锁的特定的RH(RHD-RHCE)-单元型。
由包括三种基因：RHD、RHCE和SMP1的RH基因座的独特结构提供了本发明该实施方案的基础。后一基因的核苷酸序列已作为推定的18kDa小膜蛋白族的成员在Genbank中保藏。其功能未知。其与染色体21上的一个开放阅读框表现出同源性(Reboul，基因组研究9：242，1999)。它位于两个RH基因之间，表明任何SMP1基因的多态性均可能与特定的RH单元型紧密连锁，而且可以预期SMP1基因的功能相关突变可能造成针对或抗特定RH单元型的选择压力。这些因素可能解释某些以前未解决的RH单元型分布的问题，如在欧洲RH阴性的高频性。因此，在SMP1中筛选多态性对于理解RH基因座及其诊断应用是非常重要的。
根据本发明，术语“多态性”涉及种群中存在一种以上单元型或DNA区段的遗传结构或基因。但是，有时这种遗传多态性并不总是导致不同的表型，可能仅在遗传水平上检测出来。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种检测特定RH(RHD-RHCE)-单元型的方法，所述方法包括利用RH基因座的任何结构特征或核苷酸序列或二者或其与现有技术，优选采用PCR-RFLP、PCR-SSP或远程PCR相结合确定SPM1基因中的SMP1-多态性。
进一步地，本发明涉及一种试剂盒，此试剂盒包含：
(a)本发明的寡核苷酸；和/或
(b)本发明的抗体；
(c)本发明的适体；和/或
(d)本发明的噬菌体；
(e)一对用于进行本发明扩增反应的引物。
可以将试剂盒中的部分组分单独包装在小瓶中或组合装在容器或多容器单元中。本发明的试剂盒优选执行本发明的方法，并且本身可以用于上述的多种应用。优选根据本领域技术人员已知的常规方法生产该试剂盒。
本发明还涉及一种确定是否存在由RHD基因编码的抗原C的方法，所述方法包括检测任何本发明所述的断点区的步骤。
最后，本发明涉及一种确定是否存在抗原C的方法，所述方法包括本发明的方法的步骤。
这样，引用本说明书中引述的文献的公开内容作为参考。
附图表示：
图1RH基因座的结构图。这些基因和恒河猴框的位置和取向分别由开放的箭头和三角表示(A面)。外显子以垂直条显示，并表明了外显子的号。两RH基因具有相反的取向，彼此用其3’端相对，相距约30,000bp。第三种基因，SMP1，与RHD具有相同的取向，并位于RHD和RHCE之间。RHD基因的两侧翼区为两个高度同源的恒河猴框(b)。除了RHD和SMP1 3′末端的外显子外，所有的外显子短于200bp。用于构建此结构(B面)的数据包括，在cDNAs(水平箭头)中显示的基因组序列的延伸，与基因组克隆的同一性和同源性(条a：与dJ465N24的同一性；b：RHD与dJ469D22的同源性；c：RHD 3′端部分与dJ465N24的同源性；d：与dJ469D22的同一性)。显示了桥连(bridging)PCR反应的位置。已由Okuda等人(Okuda，生物化学与生物物理学研究通讯263：378，1999)报道为RHD和RHCE之间的“间隔区”序列的一段核苷酸的正确位置由此标记为s的条所示。
图2位于RHD和RHCE基因的5’的DNA区的染色体结构。描述了推定的RHCF和RHD 5′侧翼区的结构(A面)。RHCE和RHD基因中紧接着ATG起始密码子5’端的总共4,941bp的片段是同源的(垂直的细线条)。这一同源区域外的部分没有同源性(对角细线条)。两个基因组克隆，dJ469D22和dJ465N24，用于引物设计。DJ469D22包括所示的RHCE区，而dJ465N24仅有466bp延伸到同源区。显示了几个PCR引物的位置(a，rey14a；b，rend32；c，rey15a；d，re014；e，re011d)。这一推定的结构受多种PCR反应支持(B面)。用引物a(RHCE特异的，泳道1-3)，引物b(RHD特异的，泳道4-6)，和引物c(RHCE和RHD同源区，泳道7-9)进行正向扩增。对引物a，扩增子缺乏RHD特异性反向引物e(泳道2)；对引物b，扩增子缺乏RHD阴性DNA(泳道6)。其它7种PCR反应得到与A面所示的基因组结构一致的预期大小的扩增子。
图3SMP1基因的染色体结构。SMP1基因具有7个外显子。显示了此内含子的位置和大概大小。公布的cDNA(GenBank登录号AF081282)的起点与恒河猴框下游区被15个核苷酸分离开。外显子1仅包含5’非翻泽区的序列，SMP1起始密码子位于外显子2。外显子7含16个密码子和1,656bp的3′非翻译区序列，并与RHCE外显子10的3’非翻译区序列相邻。
图4恒河猴框的染色体结构。恒河猴框上游区(RHD的5′)的物理延伸为9,145bp(黑条)。框内大约63％的核苷酸序列由重复DNA组成；重复家族的类型被标明。恒河猴框上游区和下游区之间的整体同源性为98.6％，但在1,463bp同一性区(水平箭头)内，仅有一个4bp的插入(双垂直线)。CpG-岛(双箭头)位于3’末端，并在与SMP1启动子相邻的恒河猴框下游区内(RHD的3′)。
图5Rh阴性单元型中的RHD基因缺失。显示了恒河猴框的三个3,100bp的片断。上方线表示在D-阳性中的恒河猴框上游区的核苷酸序列，下方线表示D-阳性中的恒河猴框下游区的核苷酸序列。中间线给出了由Rh阴性携带的单一恒河猴框的核苷酸序列。星号表示相同的核苷酸。此RHD缺失出现在作为1,463bp同一性区的一部分的绝对同一的903bp节段内。显示了引物rez7和rnb31的位置(m指错配)。PstI限制酶切位点由脱字条号(^)表示。这三种恒河猴框保藏于EMBL中，登录号为AJ252311(恒河猴框上游区)，AJ252312(恒河猴框下游区)，和AJ252313(杂合恒河猴框)。
图6在普通RHD阴性单元型中特异检测RHD缺失的两种技术方法。显示了采用位于非恒河猴框序列内的引物的远程PCR扩增(A面)，和采用位于恒河猴框内的引物的PCR-RFLP(B面)。显示了推定的基因型。远程PCR的引物(引物rez4)位于恒河猴框上游区的5’，和位于SMP1外显子1内(引物sr9)。特异性地检测到了RHD阴性单元型(A面，泳道1-6)。RHD基因的DNA纯合为阴性，因为PCR不能扩增RHD基因的70,000bp DNA段序列。在PCR-RFLP法中，用PstI消化PCR扩增子(引物rez7和rnb31)。在D-阴性中，由于扩增子中存在三个PstI位点(见图5)，因此产生了1,888bp、564bp、397bp和179bp的片断(泳道1-3)。D-阴性的恒河猴框下游区缺少一个PstI位点，因此形成了1,888bp、744bp和397bp的片断(泳道7到9)。RHD+/RHD-杂合子给出744和564bp的两个片断(泳道4-6)。该564bp片断似乎较弱，因为异源二聚体不能被PstI切割。引物rnb31不能扩增D-阳性的恒河猴框上游区。
图7在白种人中引起主要的RHD阴性单元型的推定机理模型。描述了RHD和RHCE基因座的物理结构(A面)。恒河猴框上游区和下游区之间的不等交换可由它们的高度同源性引发(B面)。发现恒河猴框中的断点区有903bp为100％同源(见图5)。分解交换的染色体得到现存RHD阴性单元型的RH基因结构(C面)。
图8RHD阴性的杂合恒河猴框的DNA序列。
图9D-阳性的恒河猴框上游区的DNA序列。
图10D-阳性的恒河猴框下游区的DNA序列。
图11RHD启动子的DNA序列。最后三个核苷酸代表RHD基因的密码子1。
图12RHD内含子3内的Cdes断点区。显示了Cdes在内含子3中的部分，外显子3/内含子3连接处3′端的RHD和RHCE 2,938到3,636bp的核酸序列。将来自含有RHCE基因(GenBank登录号AL031284)的5’端的染色体1p35.1-36.13上的克隆RP3-469D22的人DNA序列作为参考；数字表示此序列中相对于RHCE基因内的内含子3的第一个碱基的位置。对应的RHD基因序列来源于GenBank登录号AL139426。代表Cdes序列RHD或RHCE起源的核苷酸高亮显示。星号表示一段154bpDNA序列，其包括Cdes的断点区。
图13RHD内含子7内的Cdes断点区。显示了Cdes在内含子7中的部分，外显子7/内含子7连接处3′端的RHD和RHCE约2,726到3,719bp的核酸序列。将来自含有RHCE基因(GenBank登录号AL031284)的5’端的染色体1p35.1-36.13上的克隆RP3-469D22的人DNA序列作为参考，数字表示此序列中相对于RHCE基因内的内含子7的第一个碱基的位置。对应的RHD基因序列来源于GenBank登录号AL139426。代表Cdes序列RHD或RHCE起源的核苷酸高亮显示。星号表示一段666bpDNA序列其包括Cdes的断点区。
图14通过PCR-SSP进行Cdes的特异性检测。显示了内含子7中的Cdes断点区的3’端的PCR-SSP检测。RHD阴性样品(泳道1，ccddee)和正常RHD阳性样品(泳道2，ccD.EE)均仅得到来源于HGH基因的434bp对照产物。相反，Cdes样品(CcddEe，泳道3)得到来源于内含子7的断点区的338bp的特异性产物，和此外的434bp对照片断。该反应对Cdes具有特异性；两个部分D表型DIVa(泳道4)和DIII型IV(泳道5)没有得到特异性产物。如果Cdes反式存在于其它RHD等位基因的话，如在RHDψ/Cdes样品中(泳道6)，该反应也会特异性地检测Cdes。
图15用于常规DNA定型的RHD PCR-SSP。PCR作为模式系统进行，其由两个多重反应，内含子4/外显子7多重PCR-SSP(A面)和由RHD(W16X)和RHDψ的特异性检测加强的内含子7PCR(B面)组成。显示了关于正常D阳性样品(泳道1)、正常D阴性样品(泳道2)、几个稀有D阴性样品(泳道3到6)和主要D阳性RHD变异体(泳道7和8)的结果。在反应A中确认了标准D阳性和D阴性样品和D类别IV和VI。由于缺少内含子7的带，在反应B中检测出了RHD-CE(8-9)-D。还在反应B中检测出了RHD(W16X)和RHDψ的存在。带的大小为A面，对照，434bp(HGH基因)；内含子4,226bp；外显子7,123bp；B面，对照，659bp(染色体1基因组序列恒河猴框5′端约90,000bp)；内含子7,390bp；RHD(W16X)，248bp；RHDψ，154bp。如果特异性产物被扩增的话，设计成大于特异性扩增子的内部对照扩增子，可能由于竞争而受到抑制。
实施例例证本发明：
实施例1：血样和DNA分离
从白细胞供血者身上收集EDTA-或柠檬酸盐-抗凝血样，并在常规定型中包括采用抗-D的抗球蛋白试验表征为D阴性(WissenschaftlicherBeirat der
Figure C0081777700431
Paul-Ehrlich-Institut.Richtlinienzur Blutgruppenbestimmung und Bluttransfusion
Figure C0081777700432
Deutscher-Verlag；1996；Wagner，InfusionstherTransfusionsmed 22：285-90，1995)。如果需要，随机收集特异的CcEe表型的样品。总共试验了314个ccddee、433个Ccddee、271个ccddEe、19个CcddEe、24个CCddee、1个CcddEE和6个ccddEE样品。通过如在Gassner等人，输血37；1020，1997中所述的修正的盐析法分离DNA。
实施例2：分子检验
用PCR-SSP法测试所有样品中是否存在位于RHD启动子、内含子4、外显子7和外显子10的3’非翻译区的四种不同的RHD特异性多态性。检测了具有至少一次阳性PCR反应的48份样品(表5)。进一步研究了这些样品中在外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、内含子7和外显子9处是否存在RHD特异性多态性。26份样品表明包括阳性和阴性反应混合的8个不同的PCR模式之一(表6)。22份样品对于所有研究的RHD特异的多态性来说为阳性，并通过来自基因组DNA的10个RHD外显子的RHD特异性测序指定了8个RHD等位基因(表7)。血清学研究了一份样品的每一种PCR模式和每一种RHD等位基因测定其表型代表弱D、部分D和De1，或通过吸附/洗脱确证为血清学D阴性(表6和7)。
实施例3：DNA数据库检索和分析
用BLAST程序，在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和Sanger中心的染色体1数据库(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/nph-Blast_Server.html)检索了代表RHD(RhXIII，登录号X63097)和RHCE(RhVI，X63095)的cDNA序列。鉴定了84,810bp的基因组克隆dJ469D22(GenBank登录号AL031284)、129,747bp的基因组克隆dJ465N24(GenBank登录号AL031432)和2,234bp的SMP1 cDNA(GenBank登录号AF081282)。dJ469D22代表RHCE基因的主要片断，起始于RHCE起始密码子5’的33,340bp，终止于外显子9的3’的1,142bp。在dJ465N24中，位于120,158和121,568之间的1,418bp的一段内部序列与RHD cDNA的3’末端具有96％的同源性。SMP1 cDNA的3’端与RHCE cDNA的3’末端互补，重叠58bp。
实施例4：PCR
如果没有另外指出，PCR反应条件如下：60℃退火，68℃下延伸10分钟，并在92℃下变性，采用延伸的长模板或扩展的高保真PCR系统(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)，及所列的引物(表1)。三种PCR反应用于跨越RH基因的3’侧翼区的缺口。PCR 1采用引物rea7和rend31(PCR 2，rend32，sf1c；PCR 3，rea7，sf3)完成。通过利用有义引物rend32、rey14a、rey15a和反义引物re011d和re014的PCR扩增证明了5′侧翼区的结构。用rb10b和rr4对RHD(对RHCE用re96和rh7)进行PCR扩增，估计出内含子9的大小约为9,000bp。
实施例5：核苷酸测序
用DNA测序单元(Prism BigDye终止子循环测序即时反应试剂盒；ABI373A，Applied Biosystems，Weiterstadt，德国)进行核苷酸测序。
实施例6：表征RH基因座
得到RH基因的基因座的物理结构(图1)。根据以下考虑推断出该结构：(i)3’侧翼区。RHD的3’侧翼区与dJ465N24的3’部分(图1B，区域c)高度同源。这种同源在RHD cDNA的末端继续，并延伸至少8,000bp，这可以由能够得PCR扩增子(图1B，PCR 1)的事实证明。与dJ465N24的3’部分同源的序列与SMP1基因的5’区相邻(图1B；PCR 2)。如各个cDNAs的3’末端的互补性所示，并由PCR(图1B，PCR 3)证明，SMP1基因的3’末端直接与RHCE基因相邻。以下显示了RHD 3′侧翼区(恒河猴框)和SMP1基因的进一步的细节。(ii)5’侧翼区。dJ469D22包含RHCE5’侧翼区的33,340bp。对于RHD，dJ465N24和dJ469D22的3’末端之间的466bp同源表明dJ465N24可能代表RHD的5’侧翼序列。这种假设得到PCR的证实(图2)。(iii)分析YAC 38A-A10。通过常规方法(http://hdklab.wustl.edu/lab_manual/yeast)在单一生长阶段之后从YAC 38A-A10(UK HGMP资源中心，剑桥，UK)分离出DNA。该YAC被证明含有RH DNA。而且，鸟枪法克隆实验表明其某些插入片段可能来源于X染色体(没有显示数据)。已知该YAC含有RHCE外显子2到10和RHD外显子1到10(Carritt，人类分子遗传学6：843，1997)，并因此预期含有散布在RHD和RHCE之间的DNA片断。在该YAC中观察到代表RH基因座不同部分的DNA节段的存在(表2)。该结果与图1，A面所示的RH基因座推定的结构一致。
实施例7：鉴定RHD启动子中的RHD特异性序列
通过染色体步移建立了大约2,000bp的RHD启动子序列(GenomeWalker试剂盒，Clontech，Heidelberg，德国)。采用引物re04和re11d(表1)扩增D-阳性和D-阴性样品，并用内部引物测序建立了起始密码子的5’1,200bp的RHD-和RHCE-特异性序列。鉴定了RHD基因中的短缺失，并将其用于产生RHD-特异性引物re011d。已将包含RHD启动子的该1,200bp序列保藏到EMBL，登录号为AJ252314。
实施例8：恒河猴框的表征
两段大约9,000bp，位于RHD基因的5′和3′的DNA节段高度同源，具有相同的取向，并被称作“恒河猴框”(图4)。采用两段重叠片断中的内引物，使用PCR引物对rez4/rend31和rend32/re011d(恒河猴框上游区)，rea7/rend31和rend32/sr9(恒河猴框下游区)，和rez4/rend31和rend32/sr9(RHD-阴性的杂合恒河猴框)对该恒河猴框扩增并测序。恒河猴框上游区(RHD的5′)大约长9,142bp并终止于RHD起始密码子的5’4,900bp处。恒河猴框下游区(RHD的3′)长9,145bp，并在RHD终止密码子后104bp处开始。此恒河猴框实际包含与RHCE同源的RHD部分。两个恒河猴框的中心部位含有人转座子样元件(THE-1B)的几乎完整的残迹。但是，在THE-1B元件中常见的单一开放阅读框由于平行发生在两个恒河猴框中的多种核苷酸异常而破坏，其包括密码子4中的无义突变。虽然在两个恒河猴框之间具有98.6％的同源性，位于5,701和7,163位之间的1,463bp“同一性区”除了在poly-T片段中有4bp T插入之外是完全相同的。
实施例9：SMP1基因组结构的评价
通过采用内引物的PCR法和核苷酸测序(图3)对SMP1基因的基因组结构进行了评价。采用由引物rend32、sr9、sf1c、sf1、sm19、sr45、sr47、sr47c、sr5、sr5c、sr55、sr55c、sr3、sr3kp、rea7得到的PCR扩增子估计SMP1内含子的大小。通过核苷酸测序确定了内含子/外显子连接处的位置和其它内含子的缺失。可以鉴定六个内含子。外显子1仅含有5′非翻译序列，并距恒河猴框15bp。外显子7的长3′非翻译序列与RHCE外显子10重叠。估计总基因大小为20,000bp，与恒河猴框下游区结合导致RHD和RHCE之间约30,000bp的距离(图1)。
实施例10：RHD阴性单元型中RHD基因缺失的定位
据推论，两种恒河猴框的同源性可能对普通RHD阴性单元型中RHD缺失机理有用。测定了RHD阴性DNA中恒河猴框的核苷酸序列(图5)。在RHD阴性中检测到的单一恒河猴框具有杂合结构。该恒河猴框的5’端代表恒河猴框上游区，3′端代表恒河猴框下游区。确定了RHD缺失的903bp断点区位于恒河猴框的同一性区(图4，左向箭头)。
实施例11：用PCR特异性检测RHD缺失
开发两种基于PCR的方法以特异性检测在主要RHD阴性单元型中出现的RHD基因缺失(图6)。采用延伸的长模板PCR系统和缓冲剂3与引物rez4(恒河猴框上游区的5′)和sr9(SMP1外显子1)进行远程PCR-SSP。60℃下退火并在68℃下延时20分钟。用1％琼脂糖凝胶分离PCR扩增子。用延伸的高保真PCR系统和引物rez7(非特异性，恒河猴框同一性区的5′)和rnb31(对恒河猴框下游区特异性，恒河猴框同一性区的3′)。65℃下退火并在68℃下延时10分钟。37℃下用PstI将PCR扩增子消化3小时，并用1％琼脂糖凝胶分离所得片断。
这些技术可对普通RHD阴性单元型进行即时直接检测，即使它们是反式RHD阳性单元型。PCR-RFLP应用于更多数的样品(表3)。如所预期的，总共33个已知基因型的样品被正确定型。在68份代表最普通的表型的其它样品中，其结果与种群中的已知单元型频率一致。
实施例12：RHD PCR-SSP
PCR-SSP反应(表4)是由前述的RHD外显子特异性PCR-SSP方法(Gassner，输血37：1020-6，1997)经修改并延伸而得的，并在相同的热循环条件下启动工作。除了外显子6(0.1μM)，内含子7(0.4μM)和外显子9(0.4μM)以外，所有反应中特异性引物的浓度为0.2μM。对于大部分的样品，内含子4/外显子7作为含有0.2μM外显子7(引物对ga71/ga72)和0.1μM内含子4引物的多重反应物进行了测试。每反应包含一组HGH引物(Gassner，输血37：1020-6，1997)作为内部对照，对启动子、内含子4和用ga71/ga72的外显子7浓度为0.05μM；对外显子10为0.075μM；对内含子7为0.1μM；对外显子3、外显子4、用rb26/re71的外显子7、和外显子9为0.15μM；对外显子5和外显子6为0.2μM。Mg2+浓度对于内含子7为0.4μM，而对于所有其它反应为0.15μM。对于外显子6，加入了20％溶液Q(Qiagen，Hilden，德国)。
实施例13.改进的用于常规DNA定型的RHD PCR-SSP
在该研究检测的等位基因和上述等位基因的基础上，我们设计了一种改进的用于常规DNA定型的RHD PCR-SSP，它包括在单一PCR管中特异性检测RHDψ和本研究所检测的等位基因，如RHD(W16X)。反应A含0.3μM的引物ga71和ga72，0.1μM的rb12和re41，和0.1μM的HGH引物。Mg2+浓度为0.175μM。反应B含有0.5μM的引物RhPsiF和RhPsiB，0.3μM的re11d和RhX1f1，0.2μM的re721和rb9，和0.2μM作为对照引物的rend9b1和rend 9b2。
引物序列为：
ga71，gttgtaaccgagtgctggggattc；ga72，tgccggctccgacggtatc；rb12，tcctgaacctgctctgtgaagtgc；re41，cgatacccagtttgtctgccatgc；RhPsiF，agacagactaccacatgaacttac；RhPsiB，tctgatctttatcctccgttccctc；re11d，agaagatgggggaatctttttcct；RhX1f1，cgctgcctgcccctctga；re721，ctggaggctctgagaggttgag；rb9，aagctgagttccccaatgctgagg；rend9b1，cactgcacttggcaccattgag；rend9b2，ttccgaaggctgcttttccc。
可以在两个管内完成PCR反应(图15)，测试5种多态性，并预期假阳性率小于1∶10,000(表11)。
实施例14：用于Cdes的PCR反应
通过PCR-SSP反应，使用0.3μM的特异性引物Rh152Tb和ga31，检测Cdes单元型中存在的具有N152T取代的杂合外显子3。用0.2μM的特异性引物Rh223Vf和Rh245Vb检测在Cdes中观察到的L245V取代。HGH引物浓度为0.1μM。其它PCR条件与以上段落所述相同。引物序列为Rh152Tb，gatattactgatgaccatcctcatgg；Rh223Vf，ttgtggatgttctggccaagtg；和Rh245Vb，gctgtcaccactctgactgctac.Cdes单元型，常见于非洲人(Faas，输血37：38-44，1997；Singleton，血液95：12-8，2000)，具含有RHCE特异性N152T取代的杂合外显子3(Faas，输血37：38-44，1997)。该杂合外显子预期通过RHD外显子3特异性PCR定型为RHD阳性，上述PCR检测出在第383位(密码子128)为A并用于人口调查。由于模式4和模式8与已知的关于Cdes单元型的数据相吻合，在两份样品中通过对外显子3的3’部分的测序和对代表Cdes的外显子3杂合体进行特异性的PCR-SSP来估计杂合外显子3的存在。模式4样品具有正常的RHD外显子3，而模式8样品具有如对Cdes单元型所述的杂合外显子了。而且，还检测了作典型存在于Cdes单元(Daniels，输血38：951-8，1998)并也现在D类III型IV中的410位的T(A137V取代)。还通过PCR-SSP检测733位的G(L245V取代)确证了模式8和Cdes的同一性。
实施例15：内含子3中的Cdes的5′断点区
根据它的cDNA，Cdes已被表征为RHD-CE(3-7)-D杂合基因，其中，外显子3的5’部分来源于RHD，而包括密码子152的外显子3的3’部分来源于RHCE。我们注意到在以下物质中发现了具有N152T取代的类似杂合外显子3：D类III型IV(Wagner，F.F.，Frohmajer，A.，Ladewig，B.，Eicher，N.I.，Lonicer，C.B.，Müller，T.H.，Siegel，M.H.，和Flegel，W.A.表达不同表型的弱D等位基因。血液95：2699-2708，2000)和D类IVa(Rouillac，C.，Colin，Y.，Hughes-Jones，N.C.，Beolet，M.，D′Ambrosio，A.-M.，Cartron，J.P.，和Le Van Kim，C.D类表型转录物分析预测与D表位改变相关的杂合Rh D-CE-D蛋白。血液85：2937-2944，1995)，外显子4到7来源于RHD的两种异常RHD等位基因。我们的解释是，N152T取代可能先于Cdes中RHD外显子4到7的取代。在这种情况下，5′断点区预期位于内含子3而不是根据cDNA预测的外显子3内。因此，我们估计在Cdes内含子3中存在RHD特异性多态性。
为了估计在核苷酸752位(RHD特异性)和2872位(RHCE特异性)存在EcoRV-位点，在核苷酸1777位(RHCE特异性)是否存在PvuII位点，采用引物rb3和rb33扩增RHD和RHCE的内含子3的5′部分，并用EcoRV或PvuII将其消化。为了估计在核苷酸7797位(RHCE特异性)是否存在SacI位点，和在核苷酸8550位(RHD特异性)是否存在Alw44I位点，采用引物rb34和rb5扩增RHD和RHCE的内含子3的3′部分，并用SacI或Alw44I将其消化。引物序列为rb3，aaggtcaacttggcgcagttggtgg；rb33，gtgagactgagttctgtattctgg；rb34，ccagaatacagaactcagtctcac；rb5，ggcagacaaactgggtatcgttgc。
这些内含子3多态性的PCR-RFLP分析表明，在至少到内含子32872位处存在RHD特异性序列。为了进一步确定Cdes的5′断点区，我们对包含该断点区的一段DNA序列进行了测序。采用引物rb3和re37扩增DNA，并用引物rb33、rb34和Cdes+1进行测序。引物序列为re37，gggttaaagtcacatacacagatg；Cdes+1，atacagaactcagtctcacaacttag。我们确定该断点区位于内含子3内，如图12所示。
实施例16：内含子7内的Cdes的3′断点区
为了测定内含子7内的Cdes的3′断点区，我们测定了内含子7的部分序列。用有义引物rb8、re77和rex1和反义引物rb51和re711b扩增DNA。引物rb43、rex19c、Cdes7b2，和Cdes7f2用于核苷酸测序。引物序列为rb8，gtgttgtaaccgagtgctgggg；re77，tctccacagctccatcatggg；rex1，ggctgtaaaaatggctgaagcag；rb51，gcatgacgtgttctgcctcttg；re711b，ctatcagcattctgatctcaacg；rb43，gaatagcagagaaaacctcagactgcc；rex19c，gctccattcttgacaatacaggc；Cdes7b2，gcttatactatataagttgggttttttgg；Cdes7f2，gtttgaatcccaagagccactcat。我们建立了图13所示的断点区。3′断点区的结构十分有趣，因为在RHCE和RHD特异性序列之间存在多重开关。那些特征对于断点区是不同寻常的，可以用于Cdes的特异性诊断。它们可能表明，父本等位基因不同于标准的RHCE和RHD序列，或者在主要基因转变以后，引入了其它小基因转变。
实施例17：特异性检测Cdes的PCR-SSP
通常，Cdes的存在通过在RHD外显子特异性PCR中的RHD-CE-D杂合方式鉴定。如果RHD阳性单元型以反式存在的话，这种方法不能进行D阴性Cdes单元型的特异性检测。由于Cdes不含杂合恒河猴框，RHD/Cdes杂合的人可能被错误定型为RHD+/RHD+纯合体。在启动子、内含子2、外显子2和外显子3中存在Cdes的几个不同特征，其可用于特异性检测。但是，这些特征被D阳性等位基因D类IVa共享，并被D类III型IV部分共享，从而可能混淆这些检测方法。
在内含子7中的Cdes特异性DNA序列的基础上，我们开发了特异性检测Cdes的PCR-SSP。采用PCR-SSP法，使用0.4μM的特异性引物Cdes7f2和Cdes7b2和0.15μM的HGH对照引物检测内含子7中的Cdes的3′断点区。另一种PCR条件与实施例12所述相同。引物序列为Cdes7f2，gtttgaatcccaagagccactcat；Cdes7b2，gcttatactatataagttgggttttttgg。我们用指标Cdes样品(图14)，其它两种Cdes样品和RHDψ/Cdes杂合样品(图14)得到了特异性产物。正常RHD阳性和RHD阴性样品以及D类III型IV和D类IVa样品没有产生特异性PCR产物(图14)。我们得出结论，我们的PCR-SSP方法可以进行特异性检测Cdes，即使它对于另一种RHD阳性等位基因以反式存在。而且，这种检测方法不会与用Cdes共享N152T取代的D类III型IV或D类Iva混淆。应该注意到，后一单元型常见于包含非洲人种背景的人中，其中Cdes占优势。我们在此实施例中所述的方法允许特异性检测Cdes，且不会被其它单元型混淆，因此代表了一种对现有技术的相当大的改进。同样，我们对5′断点区(实施例15)的表征允许通过现有技术中已知的任何适宜的方法特异性检测Cdes，如PCR-SSP、PCR-LP、PCR-RFLP、PCR-SSO、Southern印迹法等等。
Cdes的特异性检测对正确预测抗原C也是重要的。Cdes的RHD基因编码抗原C，其在基于DNA预测抗原C的方法中经常被忽略。
实施例18：免疫血液学
通过与两种单克隆抗-D(Seraclon抗-D，克隆BS226；Biotest，Dreieich，德国，和Frekaklon抗-D，克隆MS201；Gull，Bad Homburg，德国)的直接凝集来评估每一份RHD阳性等位基因样品。在凝胶基质试验(LISS-Coombs 37℃，DiaMed-ID微定型系统，DiaMed，Cressier sur Morat，瑞士)中，采用寡克隆抗-D(Seraclon抗-D blend，克隆H41 11B7，BS221和BS232；Biotest)进行间接抗球蛋白试验。采用单克隆抗-D HM10、HM16、P3x61、P3x35、P3x212 11F1、P3x212 23B10、P3x241、P3x249、P3x290(Diagast，Loos，法国)和H41 11B7(Biotest)进一步研究了在凝胶基质技术中反应的样品。通过在37℃将500μl的多克隆抗-D(Humanincomplete抗-D；Lorne Laboratories，Reading，英国)吸附到500μl红细胞中持续1小时，并采用氯仿技术进行洗脱(Flegel，输血40：428-434，2000)，测定De1表型的存在。对常规分在D阴性组的样品的分析表明16份De1样品和3份D阳性样品具有微弱或部分D。这些样品集中在以前认定为具有C或E的D阴性样品中(表9)。在测试内含子4和外显子7的常规血清学方法和PCR方法之间的27个差异样品中，有19个是被血清学方法忽略了的D阳性样品，而只有8个是由于假阳性PCR引起的。
实施例19：单元型频率
对于被观察到一次以上的等位基因，它们的单元型联系没有什么价值。推定仅被观察到一次的等位基因与Cde或cdE单元型相关，而不是与cde单元型相关，因为在任何ccddee样品中都没有检测到RHD阳性等位基因。存在于单一CCddEe样品中的等位基因形式上视为一半Cde和一半cdE。推定CCddee样品带有一种异常和一种正常Cde等位基因。计算给定的异常RHD等位基因在其单元型中的频率是通过：观察到的样品数除以相应的观察的单元型数(500Cde，302cdE)。由在这种等位基因其单元型中的频率和在当地人口中的已知单元型频率计算RHD等位基因的人口频率(Wagner，Infusionsther.输血医学22：285-90，1995)。计算了各PCR模式和各RHD等位基因的单元型频率(表8)。根据以前在英国Avent等人的研究(Avent，血液89：2568-77，1997)，在我们的人口中，4.9％的Cde单元型和1.5％的cdE单元型为RHD阳性。由于在314份ccddee样品中没有检测到RHD阳性等位基因，因此cde单元型的频率小于0.5％(单方上限为95％置信区间，泊松分布)。三种频率彼此存在统计学上的显著差异(p＜0.05；为每一个按Bonferoni-Holm校正的成对比较而进行的双边Fisher精确试验)。任何D阴性RHD阳性单元型的人口频率估计为1∶1,606。仅在假定的Cde单元型中可以观察到De1等位基因。在通常由De1表示的血库中，大约3％的携带抗原C的样品被定型为D-阴性De1。等位基因的人口频率为1∶3,030。
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Figure C0081777700551
D：用序列特异的引物通过聚合酶链式反应进行恒河猴D/CE分型，输血37：1020，1997。
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Figure C0081777700571
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45.Wissenschaftlicher Beirat der
Figure C0081777700573
Paul-Ehrlich-Institut.Richtlinien zur Blutgruppenbestimmung undBluttransfusion
Figure C0081777700574
Deutscher
Figure C0081777700575
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表1.引物
Figure C0081777700581
Figure C0081777700591
Figure C0081777700601
Figure C0081777700611
Figure C0081777700621
Figure C0081777700631
Figure C0081777700641
表8.在种群中的估计频率
Figure C0081777700651
*假定Cde单元型；a cdE单元型将在cdE中导致1∶302的频率在种群中为1∶53,929。统计总频率，正式计算再内单元型为0.5Cde和0.5cdE。
在Cde中为1∶20，在cdE中为1∶67。
Figure C0081777700653
相对于Cde单元型为1∶33。
表9在常规抗原D定型中假阴性的比率
Figure C0081777700661
*CCddee，CcddEe，ccddEE，和CCddEe
Figure C0081777700662
上限为95％置信区间0.95％(Poisson分配)
Figure C0081777700663
N.A.-不适用。所述频率是基于种群41中的表型频率估算的。
表10事先描述的D阴性，RHD阳性等位基因
*获自具有慢性骨髓白细胞过多症的妇女的体突变并限制于骨髓细胞谱系的等位基因
Figure C0081777700681
序列表
<110>巴登-符腾堡DRK血库有限公司
<120>RHD阴性基因座的分子结构
<130>D 2600 PCT
<140>PCT/EP00/10745
<141>2000-10-31
<160>66
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>100
<212>DNA
<213>人
<400>1
gcatgcgcga ctgagccggg tggatggtac tgctgcatcc gggtgtctgg aggctgtggc 60
cgttttgttt tcttggctaa aatcggggga gtgaggcggg                       100
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人
<400>2
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<213>人
<400>3
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<211>26
<212>DNA
<213>人
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<210>8
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<213>人
<400>8
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<213>人
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<213>人
<400>13
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<400>14
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ttgtcttgtt tttgaacagg ccttgttttt cttggatgct tttgcttaaa atccaacagc 240
caaatgagg                                                         249
<210>15
<211>3093
<212>DNA
<213>人
<400>15
attcactatc acaagaacag cacgggtaag acctgtcccc atgattcagt tacctcccac 60
tgggtccctc ccacaacgca tgggaattca ggatgagatt tgggtgggga cacaaccaaa 120
ccctatcatt ccacccatgg cccctcccaa atttcatgtc ctcacatttc aaaaccaatc 180
acaccatccc aacagtccct caaagtctta aatgatttca gcattaactc aaaagtccac 240
agtctaatgt ctcatctgag acaaggcaag tcctttccat ttatgagcct ataaaatcca 300
aagcaagtta gttacttcct agatacaatg ggggtacagg cattgggtaa atacagccat 360
tccaaatggg ataaattggt caaaacaaag aggctacagg cccatgagag tccaaaatcc 420
agtggggcag tcaaatctta aagctccaaa atgatctcct ttgactccac atctcacatc 480
caggtcacgc agatggaagg ggtgggttcc catggtcttg ggcagctctg cccctgtacc 540
tttgcagggt acagcctccc tctcagctgc tttcatgggc tggcattgag tgtctgcagc 600
ttttccaggt acacggtgca agctgtcggt ggatctacca ttctggggtc tggaggacct 660
cttctcacag ctccactagg tggtgcccca gtagggactg tgtgtggggt ctctgacccc 720
acatttccct tctgcactgc cctggcagag gatctccatg agggccctgc tcctgcagca 780
aacttctgac tgggcatcca ggcatttccg cacatcctct ttaatctagg cgaaggtttc 840
caaaccccaa ttcttgactt ctgtgcactc gcagtctcaa caccacatgg aagctgtcaa 900
ggcttggggc ttgcactccc cgaagctaca gcccaagctc taccttgcct cccgtcagtc 960
atggttggga gtggctggga tgcagggcac caagtcccta ggctgcacac agcatgagga 1020
ccccgggcct ggccaacaaa accatttttt cctgatacct ctggacctgt gatgggaggg 1080
gttgccataa agacctctga catgccctgg agacattttc cccattgtct tgggaattag 1140
catttggctc ctgttactca tgcaaatttc tgcagccagc ttgaatttct cctcagaaaa 1200
tgggaatttt tcttttctat cacattgtca ggctgcaaat tttccgaact tttatgctct 1260
gcttccctta taaaactgaa tgtctttaac agcacccaag tcacctcttg aatgctttgc 1320
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aaatatctcg tgcaggggca aaatgccgcc agtatctttg ctaaaacata acaagagtcc 1440
cctttgctcc agttcccaac aagttcctca tttccgtctg agaccacctc agcctatgga 1500
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<211>3099
<212>DNA
<213>人
<400>16
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ctgcttcatt catttctttt tccagacagc atcatataga atgagttgtg gggtggcagt 480
cagcaggttt gggtttatcc tctattctgc cacttattac ttaaaaaaac cccaaaaaac 540
ccaacttata tagtataagc tatatccaga aaagtgcaaa tatcatacaa gtaccatttg 600
atgaatcttc tgatatcccc acataaccaa cacccagaac ctcttcttgt ctcattccag 660
gataaccact aacctgactt ctaacagcat cagtcagttt tgtctgtttt tgtacattat 720
atatgtgatg gtttgaatgt gtcccccaaa tttcatgtgc tggaaactta atccttcaat 780
tcatatgttg atggtttttg gaggaagggc ctttgggaag taattaggat tagataaggt 840
catggggtga ggtatgatgg cactggtgac ttataagaag agaaagagaa atctgagctg 900
gcatgctctt gccctctcac tgtgtgatga cttctccatg tcatgatgca gcaagaaggc 960
cctcaccaga tggtggcacc atgcttttgg acttcccag                        999
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ggctaaatat tttgatgacc aagtt                                      25
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gcagccaact tcccctgtg                                              19
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gctctacctt ggtcacctcc                                            20
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aggtcacatc catttatccc actg                                        24
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agaagatggg ggaatctttt tcct                                        24
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ttgtgactgg gctagaaaga aggtg                                       25
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tgttgcctgc atttgtacgt gag                                         23
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ttctgtctgg gttggggagg g                                           21
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ggaggggtta atatgggtgg c                                          21
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tttgtcctgg ttgcctgtgg tc                                          22
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caaatcctgt tgactggtct cgg                                         23
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aacggctcca tcacccctaa ag                                          22
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cccactccta gataccaacc caag                                        24
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ctttatgcac tgcctcgttg aatc                                        24
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ttgactggtg tggttgctgt tg                                          22
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gcagaaaggg gagttgatgc tg                                          22
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ctgacaaagt tgagagccca ctg                                         23
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ttaagcctac atccacatgc tgag                                        24
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ccttggtctg ccagaatttt ca                                          22
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primer
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gtttggcatc ataggagatt tggc                                        24
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cctgtcccca tgattcagtt acc                                         23
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acgtacaaat gcaggcaac                                              19
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cctttttttg tttgtttttg gcggtgc                                     27
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agcttactgg atgaccacca                                             20
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gactgggggg aaaagcgcaa tac                                        23
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gtattgcgct tttcccccca gtc                                         23
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tgacttgctc tcatcccaca tg                                          22
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gggcttgaag caagtaaatg gaag                                        24
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gctatcaata ttttcttggt tacagacac                                   29
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gttcactgcc ataagtcttc agtgc                                       25
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tggccgcact gaagacttat gg                                          22
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cagctgcatc tatgataatc cacc                                        24
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atggacaagt ccgaggtgat ag                                          22
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atcacctcgg acttgtccat tc                                          22
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gcaatcagag atccaaaggc caac                                        24
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gttggccttt ggatctctga ttgc                                        24
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gacatagtat accctggaat tgctgt                                      26
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acagcaattc cagggtatac tatgtc                                      26
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ctcccccgat tttagccaag aa                                          22
1
17

Claims (66)

1.一种核酸分子结构，其代表具有图8所示序列的恒河猴杂合框、具有图9所示序列的恒河猴框上游区或具有图10所示序列的恒河猴框下游区。
2.如权利要求1所述的核酸分子结构，其代表普通RHD阴性单元型。
3.如权利要求1所述的核酸分子结构，其代表普通RHD阳性单元型。
4.如权利要求3所述的核酸分子结构，其来自包含RHD阳性单元型且血清学分类为RhD阴性的样品。
5.如权利要求4所述的核酸分子结构，其包含RHD-CE-D杂合等位基因，该核酸分子结构代表Cdes单元型，但也出现在其它恒河猴单元型中，其携带位于内含子3的5’断点区域，该断点区的序列如图12所示，和/或携带位于内含子7的5’断点区域，该断点区的序列如图13所示，或者携带这两种断点区。
6.如权利要求1，3或4所述的核酸分子结构，其包含RHD-CE(3-7)-D杂合等位基因，RHD-CE(4-7)-D杂合等位基因，其可引起CcddEe表型，或RHCE(1-9)-D(10)杂合等位基因。
7.如权利要求5所述的核酸分子结构，其中权利要求5中的RHD-CE-D杂合等位基因编码抗原C反应性的多肽。
8.如权利要求3-4中任意一项所述的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子，其在RHD基因编码区内或者5′或3′剪接位点内具有单一核苷酸取代，其中所述的核苷酸取代引起密码子16处形成终止密码。
9.如权利要求8所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代基因引起RHD的W16X突变。
10.如权利要求9所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代是在第48位核苷酸处的G→A取代。
11.如权利要求3-4中任意一项所述的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子，其在RHD基因编码区内或者5′或3′剪接位点内具有单一核苷酸取代，其中所述的核苷酸取代引起密码子330处形成终止密码。
12.如权利要求11所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代引起RHD的Y330X突变。
13.如权利要求12所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代是在第985位核苷酸处的C→G取代。
14.如权利要求3-4中任意一项所述的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子，其在RHD基因编码区内或者5′或3′剪接位点内具有单一核苷酸取代，其中，所述的核苷酸取代引起密码子212处形成错意突变。
15.如权利要求14所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代引起RHD的G212V错意突变。
16.如权利要求15所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代是在第635位核苷酸处的G→T取代。
17.如权利要求3-4中任意一项所述的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子，其在RHD基因编码区内或者5′或3′剪接位点内具有单一核苷酸取代，其中，所述的取代引起包含外显子8/内含子8交界处的共有剪接位点的4-核苷酸序列，6-核苷酸序列或8-核苷酸序列内的突变。
18.如权利要求17所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代引起RHD的G1153(+1)A突变。
19.如权利要求18所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代是在内含子8的5′剪接位点的取代，由AGgt变为AGat。
20.如权利要求3-4中任意一项所述的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子，其在RHD基因编码区内或者5′或3′剪接位点内具有单一核苷酸取代，其中，所述的取代引起包含外显子3/内含子3交界处的共有剪接位点的4-核苷酸序列，6-核苷酸序列或8-核苷酸序列内的突变。
21.如权利要求20所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代引起RHD的G486(+1)A突变。
22.如权利要求21所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代是在内含子3的5′剪接位点的取代，由ACgt变为ACat。
23.如权利要求3-4中任意一项所述的核酸分子结构或由RHD基因衍生的核酸分子，其在RHD基因编码区内或者5′或3′剪接位点内具有单一核苷酸取代，其中，所述的取代引起包含外显子9/内含子9交界处的共有剪接位点的4-核苷酸序列，6-核苷酸序列或8-核苷酸序列内的突变。
24.如权利要求23所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代引起RHD的K409K突变。
25.如权利要求24所述的核酸分子结构或核酸分子，其中，所述的取代在内含子9的5′剪接位点的取代，由AGgt变为AAgt。
26.如权利要求20到25之任一项所述的核酸分子结构或核酸分子，其与Del-表型相关。
27.一种特定地检测样品中由可终止或消除RHD基因蛋白产物的表达的无意突变，错意突变，剪接位点突变，部分缺失，部分插入，部分倒位或其组合所引起的RHD阴性单元型的方法，该方法结合现有技术中的技术，优选PCR-RFLP，PCR-SSP或远程PCR，通过利用下述进行：杂合恒河猴框和/或恒河猴框上游区和/或恒河猴框下游区，所述恒河猴框的序列如图8到10所示，或如权利要求2到26中任意一项或其组合所描述的结构特征或核苷酸序列或两者兼具。
28.如权利要求5到26中任意一项所定义的由可终止或消除RHD基因蛋白产物的表达的RHD基因内无意突变，错意突变，剪接位点突变，部分缺失，部分插入，部分倒位或其组合所引起的普通RHD阴性单元型的特异性检测方法，该方法包括下述步骤：
(a)从血液样品或供血者分离DNA；
(b)在严谨条件下用至少两个相反方向的引物与所述DNA杂交以进行PCR；
(c)扩增靶序列；
(d)在凝胶上分离扩增产物；
(e)分析扩增子。
29.一种在样品中特异地检测RHD阴性单元型的方法，该方法包括检测权利要求5中所述的任何断点区的步骤。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述的检测或分析是通过下述进行的：通过PCR-RFLP，PCR-SSP或远程PCR，或者通过探针与如图4或5或12或13所描述的断点或断点区域进行特异性的杂交，或者通过探针在Southern blot分析中与恒河猴框上游或下游区进行特异性的杂交。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述探针与如图4或5或12或13所描述的断点或断点区杂交。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中，检测所述的杂交是通过Southern blot分析，凝胶电泳，生物芯片-分析，荧光或分子量鉴定进行的。
33.一种包含如权利要求1到26中任意一项所述的核酸分子结构或核酸分子的载体。
34.一种包含如权利要求5到26中任意一项所述的核酸分子结构或核酸分子的载体。
35.一种用权利要求33的载体转化的非人宿主。
36.一种用权利要求34的载体转化的非人宿主。
37.一种寡核苷酸，其可在严谨条件下与如权利要求1的核酸分子结构或权利要求8-26中任意一项的核酸分子的部分或与该部分互补的部分杂交，其中所述的部分包括权利要求8-26中定义的突变或终止密码子。
38.一种同时检测RHDΨ和权利要求1到26中任意一项中的任意RHD分子结构存在的方法，该方法包括在严谨条件下将来自人的样品所包含的核酸分子与权利要求37所述的寡核苷酸和至少一种可与RHDΨ结构杂交的其它寡核苷酸杂交，及对所述杂交进行检测。
39.一种检测样品中编码突变的恒河猴D抗原的核酸分子或如权利要求1到26中任意一项所描述的核酸分子结构或核酸分子所表征的带有RHD基因缺失的核酸分子存在的方法，该方法包括在严谨条件下将来自人的样品所包含的核酸分子与权利要求37所述的寡核苷酸杂交，及对所述杂交进行检测。
40.如权利要求39所述的方法，进一步包括用限制性内切酶消化所述杂交产物，及对所消化的产物进行分析。
41.一种同时检测样品中RHDΨ和权利要求1到26中任意一项中的RHD分子结构存在的方法，该方法包括测定至少部分权利要求1到26中任意一项中的核酸分子结构或核酸分子的核酸序列，所述的部分编码所述(错意)突变或所述终止密码子或所述杂合基因的断点，以及测定至少部分RHDΨ结构。
42.一种检测样品中编码突变的恒河猴D抗原的核酸分子或如权利要求1到26中任意一项所描述的核酸分子结构或核酸分子所表征的带有RHD基因缺失的核酸分子存在的方法，该方法包括测定至少部分权利要求1到26中任意一项中的核酸分子结构或核酸分子的核酸序列，所述的部分编码所述(错意)突变或所述终止密码子或所述杂合基因的断点。
43.如权利要求42所述的方法，进一步包括，在测定所述的核酸序列之前，至少对所述核酸分子或所述核酸分子结构的所述部分进行扩增。
44.一种同时检测样品中RHDΨ和如权利要求1到26中任意一项中的RHD分子结构存在的方法，该方法包括用一组引物进行扩增反应，至少扩增出所述序列的一部分，其中至少用于扩增反应的引物之一是权利要求37所述的寡核苷酸，至少一种引物扩增RHDΨ结构，及对扩增产物进行分析。
45.一种检测样品中编码突变的恒河猴D抗原的核酸分子或如权利要求1到26中任意一项所描述的核酸分子结构或核酸分子所表征的带有RHD基因缺失的核酸分子存在的方法，该方法包括用一组引物进行扩增反应，至少扩增出所述序列的一部分，其中至少用于扩增反应的引物之一是权利要求37所述的寡核苷酸。
46.如权利要求43到45中任意一项所述的方法，其中所述的扩增是通过聚合酶链式反应完成或所述的扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述的PCR是PCR-RFLP，PCR-SSP或远程PCR。
48.如权利要求43到45中任意一项所述的方法，其中，分析了扩增产物的分子量。
49.一种检测如权利要求4到26中任意一项所述编码RHD阳性等位基因的核酸分子结构或核酸分子存在的方法，该方法包括下列步骤：
(a)分离来自血样或供血者的DNA；
(b)在严谨条件下用至少两个相反取向的引物与所述DNA进行杂交以进行PCR；
(c)扩增靶序列；
(d)在凝胶上分离扩增产物；和
(e)分析扩增子。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述的RHD阳性等位基因来自血清学上为RhD阴性的样品。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述的样品选自高加索人种。
52.如权利要求27-29、38-45和49中任意一项所述的方法，其中，所述的样品是血液，血清，血浆，胎儿组织，唾液，尿液，粘膜组织，粘液，阴道组织，和从阴道，皮肤，毛发，毛囊获得的胎儿组织或其它人的组织。
53.如权利要求52所述的方法，包括从母体组织，如外周血，血清，血浆中富集胎儿细胞或抽提胎儿DNA或mRNA。
54.如权利要求27-29、38-45和49中任意一项所述的方法，其中，所述的核酸分子固定到固体支持物上。
55.如权利要求54所述的方法其中所述的固体支持物是芯片。
56.权利要求1到26中任意一项所述的核酸分子结构或核酸分子在分析阴性或阳性恒河猴D表型中的应用。
57.一种确定需要输血的病人是否要输入RhD阴性血液的方法，该方法包括检测来自所述病人的样品中是否存在一种或多种如权利要求2和4到26所描述的核酸分子结构或核酸分子的步骤，其中检测出两种不同的所述核酸分子为阳性表明需要对其输入RhD阴性血液。
58.一种确定供血者是否适合输血给需要输血但不能暴露于抗原C的病人的方法，其包括检测来自供血者的样品是否存在如权利要求5所述的核酸分子结构的步骤，其中，权利要求5的核酸分子结构的阳性检测排除该供血者输血。
59.一种确定供血者是否适合输血给需要输血的病人的方法，其包括检测来自供血者的样品是否存在一种或多种如权利要求1到26中任意一项所述的核酸分子结构的步骤，其中，具有或不具有权利要求4到26中的核酸分子结构或核酸分子中的一个或多个的阴性检测的权利要求2的核酸分子结构的阴性检测排除该供血者输血给定型为RhD阴性的病人。
60.一种估计孕育或携带RhD阳性胎儿的RhD阴性的母亲或者具有抗-D滴度的孕育或携带胎儿的母亲可发生新生儿溶血的危险性的方法，该方法包括估计来自胎儿父亲的样品中是否存在如权利要求1到26中任意一项中所定义的一种或多种核酸分子结构或核酸分子。
61.如权利要求60所述的方法，其中，所述的核酸分子结构带有突变或缺失。
62.一种通过分析来自一男性的样品中是否存在如权利要求1到26中任意一项中所定义的一种或多种核酸分子结构或核酸分子估计该男性是某个孩子父亲的可能性的方法，其中，所述的试验结果用于鉴定如权利要求2和4到26中任意一项的核酸分子结构或核酸分子的纯合性，杂合性或不存在，并用于推断上述男性是所述孩子的父亲的可能性。
63.抗-D在制备用于治疗恒河猴D阴性的怀孕妇女的药物中的用途，其中，所述胎儿不带有如权利要求2和4到26中任意一项所述核酸分子结构或核酸分子中的两个或对如权利要求2和4到26的核酸分子结构是非纯合的。
64.一种试剂盒，包括
(a)如权利要求37所述的寡核苷酸；和/或
(b)用于如权利要求43到46中任意一项所述的扩增反应的一对引物。
65.一种确定由RHD基因所编码的抗原C存在的方法，该方法包括检测如权利要求5所述的任何断点区域的步骤。
66.一种确定抗原C存在的方法，该方法包括如权利要求29所述方法的步骤。
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