CN102762096A

CN102762096A - 修饰的cry1ca杀虫cry蛋白

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Publication number: CN102762096A
Application number: CN2010800640116A
Authority: CN
Inventors: T.米德; K.纳瓦; T.海伊; I.拉里努阿; A.T.伍斯利; S.L.伯顿
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-10-31
Also published as: MX345224B; RU2012130019A; JP2013514772A; AU2010339916A1; IL220335A; EP2512224A2; AU2010339916B2; CO6592053A2; EP2512224A4; NZ601094A; KR101854478B1; UA112286C2; US20130025006A1; WO2011084627A2; MX2012007124A; AR079502A1; KR20120101546A; ZA201204918B; BR112012015005A2; US9284573B2

Abstract

本发明包括修饰的杀虫B.t.Cyr1Ca蛋白，包括本发明称为DIG-109和DIG-152的蛋白，以及DIG-109和DIG-152的变体，编码这些蛋白的核酸，用这些蛋白控制害虫的方法，在转基因宿主细胞中生产这些蛋白的方法，以及生产这些蛋白的转基因植物。DIG-109和DIG-152蛋白包含由B.t.Cry1Ca的核心毒素片段和Cry1Ab原毒素片段组成的嵌合肽。也描述了DIG-109和DIG-152蛋白的杀虫活性变体。

Description

修饰的CRY1CA杀虫CRY蛋白

发明领域

本发明涉及新的Cry杀虫蛋白及其用于控制害虫的用途。

发明背景

秋粘虫[Fall armyworm，FAW；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)]引起对玉米和其他作物例如大豆和棉花的严重损害。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，B.t.)是一种土壤媒介的细菌，它产生杀虫晶体蛋白，后者被称为δ内毒素或Cry蛋白。Cry蛋白是口毒性的，其通过对易感昆虫的中肠细胞起作用而发挥功能。在该网站维护并规律地更新大量δ内毒素的列表：lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html。

表达编码Cry蛋白的基因的转基因玉米，特别是Cry1F，提供了商业化水平的抗FAW效果。

尽管FAW抗性转基因玉米获得成功，抗性昆虫种群发展的可能性仍威胁着Cry蛋白在FAW控制中的长期耐用性，并带来发现和发展新的Cry蛋白以控制FAW和其它昆虫的需求。对B.t.Cry蛋白有抗性的昆虫能通过数种机制而发展(Heckel et al.，2007，Pigott和Ellar，2007)。已经在昆虫中鉴别出Cry蛋白的多种受体蛋白类别，而每种受体类别中存在多种实例。对流行的Cry蛋白的抗性可能通过受体蛋白的钙粘蛋白结构域的毒素结合部分的突变而发展。抗性的进一步的方法是通过原毒素处理蛋白酶来介导。因而，鳞翅目的物种中对Cry毒素的抗性具有复杂的遗传学基础，具有至少4种不同的，主要的抗性基因。对Cry蛋白抗性的鳞翅目昆虫已经在以下范围发展起来：小菜蛾(Plutella xylostella)(Tabashnik，et al.，1994)，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Janmaat and Myers 2003，2005)，和玉米夜蛾(Helicoverpa zeae)(Tabashnik etal.，2008)。发展新的高潜力Cry蛋白将提供管理FAW和其它害虫的额外工具。在转基因玉米中联合产生的具有不同类型作用的Cry蛋白将限制FAW昆虫抗性的发展，并保护B.t.技术在害虫控制中的长期效用。

发明概述

本发明提供了杀虫B.t.Cry蛋白，包括本文指定为DIG-109和DIG-152的蛋白，以及DIG-109和DIG-152的变体，编码这些蛋白的核酸，用这些蛋白控制害虫的方法，在转基因宿主细胞中产生这些蛋白的方法，以及生产这些蛋白的转基因植物。

如实施例1所述，DIG-109和DIG-152蛋白包含由B.t.Cry1Ca核心毒素片段和Cry1Ab原毒素片段组成的嵌合肽。也描述了DIG-109和DIG-152蛋白的杀虫活性变体。

本文报告的一个惊人的发现是DIG-109和DIG-152蛋白对Cry1F抗性的秋粘虫幼虫和甘蔗螟虫幼虫种群具有活性。从而，DIG-109和DIG-152蛋白是用于控制鳞翅目害虫的理想候选者。该蛋白可以单独或与其它Cry蛋白例如Cry1F，Cry1Ab，和Cry1Ac联合使用，以控制抗性昆虫种群的发展。对于这些害虫的讨论，参见例如Tabashnik，PNAS(2008)，vol.105 no.49，19029-19030。

DIG-109和DIG-152的杀虫活性片段，以及编码这些片段的核苷酸，是本发明的另一个方面。

在一个实施方式里本发明提供了分离的DIG-109蛋白多肽，包含选自以下的核心毒素片段：

包含SEQ ID NO:1的28-619残基的氨基酸序列的多肽；

包含具有与SEQ ID NO:1的28-619残基的氨基酸序列至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；

包含SEQ ID NO:1的28-619残基的氨基酸序列并具有最多20个氨基酸的取代、删除或改变且不反向影响SEQ ID NO:1编码的蛋白的表达或活性的多肽。

在另一个实施方式里本发明提供了分离的DIG-109毒素蛋白，包含选自以下的核心毒素片段：

包含SEQ ID NO:1的1-619残基的氨基酸序列的多肽；

包含具有与SEQ ID NO:1的1-619残基的氨基酸序列至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；

包含SEQ ID NO:1的1-619残基的氨基酸序列并具有最多20个氨基酸的取代、删除或改变且不反向影响SEQ ID NO:1编码的蛋白的表达或活性的多肽。

在另一个实施方式里本发明提供了包含DIG-109蛋白的植物。

在另一个实施方式里本发明提供了控制害虫种群的方法，包括使所述种群与杀虫有效量的DIG-109蛋白接触。

在另一个实施方式里本发明提供了编码DIG-109蛋白的分离的核酸。

在另一个实施方式里本发明提供了DNA构建体，其包含编码DIG-109蛋白的核苷酸序列可操作地连接至启动子，其中所述启动子不源自苏云金芽孢杆菌并能够在植物中驱动表达。本发明也提供了包含该DNA构建体稳定整合进其基因组的转基因植物，以及保护植物免于虫害的方法，包括将该构建体引入所述植物中。

序列概述

SEQ ID NO:1 Cry1Ca核心毒素片段；619aa

SEQ ID NO:2 第一Cry1Ab原毒素片段；545aa

SEQ ID NO:3 DIG-152嵌合蛋白；1164aa(Pf版本)

SEQ ID NO:4 第二Cry1Ab原毒素片段；545aa

SEQ ID NO:5 DIG-109嵌合蛋白；1164aa(玉米版本)

SEQ ID NO:6 Cry1Ca436多肽；10aa

SEQ ID NO:7 Cry1Ca591多肽；10aa

SEQ ID NO:8 编码DIG-109的玉米-优化的CDS；3492bp

SEQ ID NO:9 ZGP3S寡核苷酸；21nt

SEQ ID NO:10 ZGP3A寡核苷酸；21nt

SEQ ID NO:11 TQZGP3寡核苷酸；23nt

SEQ ID NO:12 DSM2S寡核苷酸；17nt

SEQ ID NO:13 DSM2A寡核苷酸；19nt

SEQ ID NO:14 DSM2FQ寡核苷酸；20nt

SEQ ID NO:15 CRY1CaS寡核苷酸；18nt

SEQ ID NO:16 CRY1CaA寡核苷酸；18nt

SEQ ID NO:17 Cry1Ca寡核苷酸；23nt

SEQ ID NO:18 AAD1S寡核苷酸；20nt

SEQ ID NO:19 AAD1A寡核苷酸；22nt

SEQ ID NO:20 AAD1寡核苷酸；24nt

SEQ ID NO:21 Y1CAS寡核苷酸；18nt

SEQ ID NO:22 Y1CAR寡核苷酸；18nt

SEQ ID NO:23 F6Y1CA寡核苷酸；23nt

SEQ ID NO:24 IVF-Taq寡核苷酸；18nt

SEQ ID NO:25 IVR-TAQ寡核苷酸；19nt

SEQ ID NO:26 IV-Probe寡核苷酸；26nt

SEQ ID NO:27 DIG-110；1079aa

SEQ ID NO:28 玉米-优化的DIG-110编码区域；3237bp

SEQ ID NO:29 DIG-111；543aa

SEQ ID NO:30 玉米-优化的DIG-111编码区域；1629bp

SEQ ID NO:31 DIG-112；1044aa

SEQ ID NO:32 玉米-优化的DIG-112编码区域；3132bp

SEQ ID NO:33 DIG-113；508aa

SEQ ID NO:34 玉米-优化的DIG-113编码区域；1524bp

SEQ ID NO:35 DIG-114；582aa

SEQ ID NO:36 玉米-优化的DIG-114编码区域；1746bp

发明详述

DIG-109和DIG-152蛋白，及其杀虫活性变体。除了全长的SEQ ID NO:5的DIG-109蛋白和SEQ ID NO:3的DIG-152蛋白之外，本发明包含杀虫活性变体。对于术语“变体”，申请人想要包括片段，某些删除或插入的突变体，及某些融合蛋白。DIG-109和DIG-152的Cry1Ca核心毒素片段是经典的三结构域Cry蛋白(classic three-domain Cry protein)。作为描述包括在本发明内的DIG-109和DIG-152蛋白变体的前言，有必要简要地回顾通常的和特别是DIG-109和DIG-152蛋白毒素的三结构域Cry蛋白的结构。

大部分的苏云金芽孢杆菌δ内毒素晶体蛋白分子由两个功能性片段组成。蛋白酶抗性核心毒素是第一片段并对应于所述蛋白分子的约前一半。全长约130kDa的原毒素分子在昆虫肠道内被通过蛋白酶快速加工为抗性核心片段。在该过程中被删除的片段在本文中被称为“原毒素片段”。原毒素片段被认为参与毒素晶体形成(Arvidson et al.，(1989))。原毒素片段从而可能通过减少毒素分子的蛋白酶加工(Haider et al.，(1986))或降低毒素可溶性(Aronsonet al.，(1991))来限制核心到昆虫的接近从而传达部分昆虫特异性。B.t.毒素，即使在某个类中，也在其长度和从核心毒素片段向原毒素片段转变的精确定位上有所不同。核心毒素片段向原毒素片段的转变典型地发生在毒素全长的约50%至约60%之间。SEQ ID NO:3公开了DIG-152多肽全长的1164个氨基酸的序列，其中N-端619个氨基酸包含以SEQ ID NO:1公开的Cry1Ca核心毒素。SEQ ID NO:5公开了DIG-109多肽全长的1164个氨基酸的序列，其中N-端619个氨基酸包含Cry1Ca核心毒素。

已经确定了Cry1Aa1，Cry2Aa1，Cry3Aa1，Cry3Bb1，Cry4Aa，Cry4Ba和Cry8Ea1的三维晶体结构。这些核心毒素的结构非常相似并由三个具有下文所述特征的不同结构域组成(综述于de Maagd et al.，2003)。

结构域I是七α-螺旋束，其中螺旋5被6个两性螺旋所包围。该结构域涉及孔的形成并与其它孔形成蛋白包括溶血素和大肠杆菌素具有同源性。Cry1Ca核心毒素蛋白的结构域I包含SEQ ID NO:1的36-254位氨基酸残基。[应当理解DIG-109和DIG-152嵌合蛋白包含Cry1Ca核心毒素片段，从而分配给如SEQID NO:1中公开的Cry1Ca核心毒素片段的氨基酸序列的等同物也适用于SEQID NO:5中公开的DIG-109嵌合蛋白的氨基酸序列和SEQ ID NO:3中公开的DIG-152嵌合蛋白的氨基酸序列。]

结构域II由3个反平行β折叠组装在一个β三棱柱而形成。该结构域的环在结合昆虫中肠受体中扮演重要角色。在Cry1A蛋白中，在结构域IIβ折叠顶端暴露环的表面涉及结合鳞翅目钙粘蛋白受体。Cry3Aa结构域II环以类似的方式结合马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata，也称为科罗拉多马铃薯甲虫)的膜相关金属蛋白酶(Ochoa-Campuzano et al.，2007)。结构域II与某些碳水化合物结合蛋白包括卵黄和jacaline具有同源性。Cry1Ca核心毒素蛋白包含SEQ ID NO:1的262-458位氨基酸残基。

结构域III是2个反平行β折叠的β三明治结构。结构上该结构域与蛋白质例如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等的碳水化合物结合结构域有关。结构域III结合受体蛋白的某些类并可能参与与第二个类的受体作用的寡聚毒素前核的插入，其实例是在Cry1A蛋白的情况下的氨基肽酶和碱性磷酸酶(Pigott and Ellar，2007)。类似的Cry结构域III受体也在鞘翅目中鉴别出来。保守的B.t.序列块2和3分别位于结构域II的N-端和C-端附近。因此，这些保守序列块2和3是3个功能性结构域之间大致的边界区域。这些保守DNA的区域和蛋白同源性已经被用于开发工程性重组B.t.毒素(US Patent No.6090931，WO 1991/01087，WO 1995/06730，WO 1998/022595)。Cry1Ca蛋白的结构域III包含SEQ ID NO:1的468-617位氨基酸残基。

已经报道结构域I的α-螺旋1被移除之后受体结合。Aronson et al.(1999)证明了结合至BBMV的Cry1Ac被保护免受蛋白酶K从残基59开始的切断，即正好在α-螺旋1之后；类似的结果也被Cry1Ab所引用。Gomez et al.，(2002)发现在BBMV受体结合上形成的Cry1Ab寡聚体缺乏结构域I的α-螺旋1部分。同样，Soberon et al.，(2007)已经展示了Cry1Ab和Cry1Ac的缺少在Cry三维结构上包含α-螺旋1的约60个氨基酸的N-端缺失突变体能够将分子量约60kDa的单体组装进前核心，在钙粘蛋白结合缺失的情况下。这些N-端缺失突变体被报道对Cry抗性昆虫幼虫有活性。进一步，Diaz-Mendoza et al.，(2007)描述了43kDa和46kDa的Cry1Ab片段，其保留对地中海玉米螟(蛀茎夜蛾，Sesamia nonagrioides)的活性。这些片段被证实包括氨基酸残基116-423；然而其精确的氨基酸序列并未被阐明，而这些蛋白水解片段的活性机理也是未知的。Gomez et al.，(2002)，Soberon et al.，2007和Diaz-Mendoza et al.，(2007)的结果与Hofte et al.，(1986)的形成对照，后者报道了缺失Cry1Ab的N-端36个氨基酸会导致杀虫活性的丢失。

由于其结构已知，通过比较Cry1Ca氨基酸序列和Cry8Ea1的氨基酸序列，我们已经推论出Cry1Ca核心毒素的结构域I中的螺旋1，2A，2B，3和4的起始和结束点，以及他们之间的空隙(spacer)区域的位置。这些位置描述于表1。

表1.Cry1Ca核心毒素蛋白的计划的α-螺旋的氨基酸坐标。

DIG-109和DIG-152的氨基末端缺失突变体。在一个方面本发明提供了DIG-109和DIG-152的突变体，其中α-螺旋1，2A和2B的全部或部分被删除以改进杀虫活性并避免昆虫发展抗性。这些改变用于提供具有改进的性能的DIG-109和DIG-152的突变体，例如改进的目标昆虫型谱，潜力，和昆虫抗性管理。在本发明的一些实施方式里，对象的改变可能影响原毒素活性的效果和核心形成，导致昆虫中毒。更特别地，为了提供具有改进的性能的DIG-109和DIG-152的突变体，描述了逐步删除以去除编码N-端的基因的部分。该删除去除了结构域I中α-螺旋1的全部和α-螺旋2的全部或部分，同时保留α-螺旋3至7的结构完整性。该发明方案从而部分涉及通过操作结构域I的α-螺旋组分以改进Cry蛋白效果，为了更有效的核心形成。更特别地，该发明的方案部分涉及改进的DIG-109和DIG-152蛋白，其设计为具有N-端缺失，该区域具有推定的与Cry1蛋白的结构域I中α-螺旋1和2二级结构的同源性。

为改进DIG-109和DIG-152毒素的杀虫特性的删除可以在预测的α-螺旋2A起始点之前开始，并可以在α-螺旋2B的末端之后结束，但是优选不延伸至α-螺旋3。

在设计N-端缺失突变体的编码序列时，将一个编码蛋氨酸的ATG起始密码子插入设计为表达所述缺失突变体的核苷酸序列的5’端。对于设计为用于转基因植物中的序列，最好根据Varshavsky(1997)的“N-端法则”来粘合。其教导某些氨基酸当其作为蛋白质的N-端残基时可以为蛋白在真核细胞中的不稳定性和降解做出贡献。例如，由酵母和哺乳动物细胞收集的数据显示N-端不稳定氨基酸残基是F，L，W，Y，R，K，H，I，N，Q，D，E和可能的P。尽管特定蛋白的降解机制可以在物种之间有所不同，上文所述的N-端不稳定氨基酸的同一性的保守性暗示了类似的机制可能在植物细胞中起作用。例如，Worley et al.，(1998)发现在植物中，N-端法则包括碱性和芳香残基。很可能在B.t.杀虫蛋白对象的α-螺旋3的起始点附近植物蛋白酶的蛋白水解切断可以暴露不稳定N-端氨基酸。这样的过程可以导致切断的蛋白质的快速衰变并限制B.t.杀虫蛋白积累至足以有效控制昆虫的水平。从而，对于由一个不稳定氨基酸起始的N-端缺失突变体，申请人优选在翻译起始的蛋氨酸和不稳定氨基酸之间增加指定G(甘氨酸)氨基酸的密码子。

实施例13和14给出了依照本发明的DIG-109和DIG-152的氨基端缺失突变体的特定实例。其它有用的片段可以通过全长可溶性晶体蛋白经胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化获得的片段的昆虫生物鉴定来鉴别，以确定哪个片段保留毒性，或者可以通过确定由Cry蛋白编码区域的DNA片段编码的毒蛋白片段来鉴别。该蛋白将主要地具有短的N-端和长的C-端截断，相比于原毒素。最小毒素片段的N末端通过本领域已知的技术经胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理的可溶性晶体蛋白的N-端氨基酸序列测定来确定。

嵌合毒素。已经报道的嵌合蛋白利用一个Cry毒素的核心毒素与另一个Cry毒素的原毒素片段融合。DIG-109和DIG-152变体包括这样的毒素，其包含一个Cry1Ca毒素的N-端毒素核心片段(其可以是全长或具有上文所述的N-端缺失)融合于一个异种的原毒素片段，在该核心毒素片段末端之后的某个位点上。向所述异种原毒素片段的转变可以发生在大约核心毒素/原毒素结合点，或者可选地，自身原毒素的部分(延伸超过核心毒素片段)可以被保留，而向异种原毒素的转变则发生在下游。例如，本发明的嵌合毒素具有Cry1Ca的全长核心毒素片段(氨基酸1-619)和异种原毒素(氨基酸620-C末端)。在优选实施方式里，原毒素的异种片段源自Cry1Abδ内毒素，如SEQ ID NO:2和SEQID NO:4所示。

蛋白酶敏感性变体。昆虫肠道蛋白酶典型地起作用于帮助昆虫从食物蛋白中获得需要的氨基酸。研究最为透彻的昆虫消化蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其以最常见的类型出现(Englemann and Geraerts，1980)，尤其是在鳞翅目物种中。鞘翅目昆虫具有比鳞翅目肠道更中性至酸性的肠道。鞘翅目幼虫和成虫的主要成员，例如科罗拉多马铃薯甲虫，具有微酸性中肠，半胱氨酸蛋白酶提供了主要的蛋白水解活性(Wolfson and Murdock，1990)。更精确地，Thie和Houseman(1990)分离并表征了科罗拉多马铃薯甲虫中的半胱氨酸蛋白酶，组织蛋白酶B样和组织蛋白酶H样，和天冬酰胺蛋白酶，组织蛋白酶D样。Gillikin et al.，(1992)表征了西部玉米根虫肠道中的蛋白水解活性，并发现了主要的半胱氨酸蛋白酶。US专利号7230167公开了丝氨酸蛋白酶，组织蛋白酶G，存在于西部玉米根虫中。昆虫肠道蛋白酶的多样性和不同活性可以影响昆虫对特定的B.t.毒素的敏感性。

在本发明的另一个实施方式里，蛋白酶切割位点可以加工在确定的位点上以影响特定昆虫害虫的易感幼虫的中肠中的蛋白质处理(Walters et al.，2008)。这些蛋白酶切割位点可以通过例如化学基因合成或剪接重叠PCR(Horton et al.，1989)等方法来引入。例如，丝氨酸蛋白酶识别序列，可以可选地插入Cry蛋白结构的特定位点以影响易感幼虫的中肠内蛋白在确定的删除位点上的处理。可以由这种方式开发的丝氨酸蛋白酶包括鳞翅目中肠丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶，胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶，等等(Christeller et al.，1992)。进一步，通过未分级幼虫中肠蛋白酶处理而产生的Cry蛋白消化产物的测序或者通过结合至刷状缘膜载体而经验性鉴定的删除位点可以被加工以影响蛋白活性。通过基因删除或通过引入蛋白酶切割位点而产生的改变的Cry蛋白具有对鳞翅目害虫改进的活性，包括欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)，棉铃虫(Helicoverpa zea)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，小蔗螟(Diatraea saccharalis)，Loxagrotis albicosta，和其它靶标害虫。

鞘翅目丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G样蛋白酶，鞘翅目半胱氨酸蛋白酶例如组织蛋白酶(B样，L样，O样，和K样蛋白酶)(Koiwa et al.，(2000)和Bown et al.，(2004))，鞘翅目金属蛋白酶例如ADAM10(Ochoa-Campuzano et al.，(2007))，和鞘翅目天冬氨酸蛋白酶例如组织蛋白酶D样和E样，胃蛋白酶，plasmepsin，和凝乳酶可以进一步通过在确定的处理位点加工合适的识别序列以影响Cry蛋白在特定昆虫害虫的易感幼虫的中肠内的处理。

引入这样的蛋白酶切割位点的一个优选位置是α-螺旋2B和α-螺旋3之间的“空隙”区域，例如Cry1Ca核心毒素蛋白(SEQ ID NO:1和表1)的氨基酸85-90之内。通过基因缺失或通过引入蛋白酶切割位点而改变的Cry蛋白具有对昆虫害虫改进的活性，包括但不限于秋粘虫，甘蔗螟虫等等。

存在多种技术可以测定包含多肽的N-端或C-端残基的氨基酸的序列。例如，自动Edman降解方法学可以用于测序方法以测定N-端氨基酸序列至30个氨基酸残基并具有每个残基98%的准确性。进一步，测定包含多肽的羧基端的氨基酸的序列也是可能的(Bailey et al.，(1992)；US Patent No.6046053)。因此，在一些实施方式里，已经被通过蛋白水解处理的方法，例如，通过昆虫肠道制备的蛋白酶，所激活的B.t.Cry蛋白，可以被表征，并且鉴别所述激活的毒素片段的N-端或C端氨基酸。通过在编码序列的合适位置引入或消除蛋白酶处理位点以允许或消除昆虫、植物或微生物蛋白酶的更大变体蛋白的蛋白水解切割的DIG-109和DIG-152变体也在本发明的范围之内。这样的操作的最终结果被理解为是产生具有与完整(全长)毒素蛋白相同或更好活性的活性毒素片段分子。

DIG-109和DIG-152毒素的结构域。在DIG-109和DIG-152毒素中例举的Cry1Ca核心毒素片段的分离的结构域，(以及与这些结构域有90%，95%或97%同一性的变体)被期望用于与来自其它Cry毒素的结构域结合以提供具有增加的害虫毒性谱型、改进的潜力或增加的蛋白稳定性的新毒素。Cry1Ca核心毒素蛋白的结构域I由SEQ ID NO:1的36-254位氨基酸组成。Cry1Ca核心毒素蛋白的结构域II由SEQ ID NO:1的262-458位氨基酸组成。Cry1Ca核心毒素蛋白的结构域III由SEQ ID NO:1的468-617位氨基酸组成。结构域交换或移动是产生可变的δ-内毒素蛋白的机制。结构域II和III可以在δ-内毒素蛋白之间交换，导致产生具有改进的杀虫活性或目标谱的杂合或嵌合毒素。结构域II涉及受体结合。结构域III结合某些类的受体蛋白并可能在寡聚毒素前核心的插入中起作用。其它毒素中的一些结构域III取代物已经显示出产生针对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的超级活性(de Maagd et al.，(1996))并且存在设计Cry毒素结构域交换的启示(Knight et al.，(2004))。

产生重组蛋白和检测其杀虫活性的方法是本领域公知的(参见，例如，Naimov et al.，(2001)，de Maagd et al.，(1996)，Ge et al.，(1991)，Schnepf etal.，(1990)，Rang et al.，(1999))。已经研究了Cry1A和Cry3A蛋白的结构域I的插入和在膜中形成孔的能力。结构域I的α-螺旋4和5在膜插入和孔形成中起着关键作用(Walters et al.，1993，Gazit et al.，1998；Nunez-Valdez et al.，2001)，而其它螺旋推测接触膜的表面，就像伞的肋骨那样(Bravo et al.，(2007)；Gazit et al.，(1998))。

通过少数氨基酸缺失、取代或添加而创建的DIG-109和DIG-152变体。SEQ ID NO:1的Cry1Ca核心毒素片段的氨基酸序列的氨基酸缺失、取代或添加可以通过序列方式而容易地进行，这些突变体的杀虫活性的效果可以通过生物分析来检测。如果改变的数目是少数，这样的检测不会包含过度的实验。本发明包括核心毒素(SEQ ID NO:1的1-619位氨基酸)的杀虫活性变体，其中具有最多10个，最多15个，或最多20个独立的氨基酸的添加，缺失或取代。

本发明包括DIG-109和DIG-152变体，其具有与SEQ ID NO:1的1-619位氨基酸90%，95%或97%同一性的核心毒素片段。变体可以通过随机突变产生，或者可以设计变体。在设计的突变的情况下，具有很高可能性产生具有与本体毒素相似活性的变体，如果在毒素的重要区域保持氨基酸同一性，所述重要区域对生物学活性起作用或者涉及三维构象的确定，其最终也为生物活性服务。氨基酸可以位于下列类别中：非极性；不带电极性，碱性，和酸性。保守性取代，即其中一类的一个氨基酸替换为同样类型的另一个氨基酸，具有基本上改变所述变体的生物学活性的最低可能性。表2提供了属于每个类的氨基酸的实例的列表。

表2.

在一些实例中，也可以进行非保守取代。一个重要事实是这些取代不应该显著地损害毒素的生物学活性。变体包括由于突变而在氨基酸序列上有所不同的多肽。本发明包含的变体蛋白是生物学活性的，即它们继续拥有本体蛋白的生物学活性，即，保留杀虫活性。

变体蛋白也可以设计为在序列水平上不同但是保持了相同或类似的总体上基本的三维结构，表面电荷分布，等等。参见例如US专利号7058515；Larson et al.，(2002)；Stemmer(1994a,1994b，1995)；和Crameri et al.，(1996a，1996b，1997)。

核酸。编码DIG-109毒素或编码DIG152毒素的分离的核酸是本发明的一个方面。这包括编码SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的核酸，及其互补物，以及编码SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的杀虫变体的其它核酸。用“分离的”申请人意指该核酸分子已经从其本来的环境中移出并用人手将其置于不同的环境中。由于遗传密码子的冗余性，多种不同的DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。本领域技术人员很容易建立编码同样的或基本同样的毒素的可选DNA序列。

基因合成。编码本文描述的改进的Cry蛋白的基因可以通过多种本领域公知的方法来制作。例如，合成基因片段和合成基因可以通过亚磷酸三酯和亚磷酸胺化学来制作(Caruthers et al，1987)，并且允许通过商业供应商来根据需求进行基因合成。全长基因可以通过多种途径来装配，包括例如，通过连接限制性片段或聚合酶链式反应装配重叠的寡核苷酸(Stewart and Burgin，2005)。进一步，末端基因缺失可以通过使用位点特异性末端寡核苷酸的PCR扩增来实现。

编码DIG-109毒素或DIG-152毒素的核酸可以通过例如多个商业供应商的任何一个提供的方法来合成性构建。(参见例如，US Patent No.7482119B2)。这些基因，或其部分或变体，也可以通过例如使用基因合成和指定的方法例如US Patent No.5380831来合成性构建。可选地，合成的或自然存在的基因的变体可以用制造点突变的标准分子生物学技术方便地构建。这些基因的片段也可以用商业上允许的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准过程来制备。例如，酶例如Bal3I或点定向突变可以用于从这些基因的末端系统地切断核苷酸。另外，编码活性毒素片段的基因片段可以用多种限制性酶来获得。

已知DIG-109毒素或DIG-152毒素的氨基酸序列，可以通过以下方法来设计编码序列，即用目标宿主优选的密码子反翻译该蛋白质序列，然后用可选(冗余)密码子来修正序列以移除可能引起问题的序列。进一步，定期终止密码子可以加工进非编码阅读框以消除长的、无意的开放阅读框。

定量序列同一性。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，以最佳比较目的对该序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位点的数目的函数(即，百分比同一性=相同位点数/总位点数(例如，重叠位点)X100)。在一个实施方式里，这两个序列是同样长度的。两个序列之间的百分比同一性可以用下文描述的类似的技术来确定，包含或不包含允许间隙。在计算百分比同一性时，典型地计算精确配对。

两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。这种算法的一个非限制性实例是BLAST(Altschul et al.，1990，和Karlin and Altschul，1990)，由Karlin and Altschul(1993)所修改，并并入BLASTN和BLASTX程序。BLAST搜索可以方便地用于在核酸或蛋白质数据库中鉴别与查询序列同源(相似)的序列。BLASTN搜索可以进行，(得分=100，字长=12)用于鉴别与本发明要求的核酸分子具有同源性的核苷酸序列。BLASTX搜索可以进行，(得分=50，字长=3)用于鉴别与本发明要求的杀虫蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。

间隙BLAST(Altschul et al.，(1997))可以用于获得比较目的的间隙比对。可选地，PSI-Blast可以用于进行重复搜索，其探测两个分子之间较远的关系(Altschul et al.，(ibid.))。当使用BLAST，Gapped BLAST，和PSI-Blast程序时，可以使用各自程序的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

用于比较序列的数学算法的一个非限制性实例是ClustalW算法(Thompson et al.，1994)。ClustalW比较序列并比对氨基酸或DNA序列的整体，因而能够提供关于整体氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于多种商业允许的DNA/氨基酸分析软件包，例如Vector NTIProgram Suite (Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。当用ALIGNX比对氨基酸序列时，可以方便地使用默认设置，包括间隙开放罚分10分，间隙延伸罚分0.1分和blosum63mt2比较矩阵以评估两个序列之间的百分比氨基酸相似性(一致性)或同一性。当用ALIGNX比对DNA序列时，可以方便地使用默认设置，包括间隙开放罚分15分，间隙延伸罚分6.6分和swgapdnamt比较矩阵以评估两个序列之间的百分比同一性。

用于序列对比的数学算法的另一个非限制性实例是Myers and Miller(1988)的。这样的算法被并入wSTRETCHER程序，这是wEMBOSS序列比对软件包的一部分(允许从http://emboss.sourceforge.net/获得)。wSTRETCHER使用线性空间的经典动态程序算法的修改算法来计算两个序列的最优全球比对。可以指定用于计算比对的替换矩阵、间隙插入罚分和间隙延伸罚分。当使用wSTRETCHER程序来比较核苷酸序列时，可以使用间隙开放罚分16分和间隙延伸罚分4分以及得分矩阵文件EDNAFULL。当用于比较氨基酸序列时，可以使用间隙开放罚分12分和间隙延伸罚分2分以及得分矩阵文件EBLOSUM62。

用于对比序列的数学算法的进一步的非限制性实例是Needleman andWunsch(1970)的，其并入序列比对软件包GAP Version 10和wNEEDLE(http://emboss.sourceforge.net/)。GAP Version 10可以用于确定序列同一性或相似性，使用下列参数：对于核苷酸序列，%同一性和%相似性使用GAP Weight为50和Length Weight为3，和nwsgapdna.cmp得分矩阵。对于氨基酸序列，%同一性和%相似性使用GAP Weight为8和Length Weight为2，和BLOSUM62得分矩阵。

wNEEDLE阅读两个输入序列，找到沿着整个序列的最优比对(包括间隙)，并写出其最优全球序列比对并提交。该算法使用所有可能的比对并选择最好的，使用包含每个可能的残基或核苷酸配对的数值的矩阵。wNEEDLE找到具有最大可能的得分的比对，其中一个比对的得分等于来自得分矩阵的配对的总和，减去在比对序列中开放和延伸间隙得到的罚分。取代矩阵和间隙开放和延伸罚分可以用户指定。当比较氨基酸序列时，默认间隙开放罚分为10分，间隙延伸罚分为0.5分，并使用EBLOSUM62比较矩阵。当使用wNEEDLE比较DNA序列时，默认间隙开放罚分为10分，间隙延伸罚分为0.5分，并使用EDNAFULL比较矩阵。

也可以使用等效程序。“等效程序”是指任何序列对比程序，其对任何两个对象序列，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基配对的比对和相同百分比序列同一性，相比于由ALIGNX，wNEEDLE或wSTRETCHER产生的对应的比对。%同一性是两个序列之间的相同配对相对报告的比对区域的百分比(包括在长度上的任何间隙)而%相似性是两个序列之间的配对相对报告的比对区域的百分比(包括在长度上的任何间隙)。

比对也可以通过人工检查来进行。

重组宿主。本发明的毒素编码基因可以引入多种微生物或植物宿主。毒素基因的表达直接或间接导致细胞内产生和保持杀虫蛋白。对于合适的微生物宿主，例如假单胞菌，微生物可提供于害虫的环境，其中它们将增殖和被摄入。其结果是控制了害虫。可选地，含有毒素基因的微生物可以在一定条件下处理，该条件能延长毒素活性和稳定细胞。处理的细胞，其保留毒素活性，随后可以提供于目标害虫的环境。

当B.t.毒素基因被通过合适的载体引入微生物宿主，并且所述宿主以生活状态提供于环境，有必要使用特定的微生物。选择被认为占有一或多种感兴趣的作物的“植物圈phytosphere”(叶面phylloplane，叶圈phyllosphere，根圈rhizosphere，和/或根面rhizoplane)的微生物宿主。选择这些微生物以能够在特定的环境(作物和其它昆虫居住地)与野生本土微生物竞争获胜，以提供稳定维持和表达的编码多肽杀虫剂的基因，并且，期望地，提供杀虫剂免受环境降解和失活的改进保护。

已知大量的微生物存在于多种重要作物的叶面(植物叶的表面)和/或根圈(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌，藻类，和真菌。特别吸引人的是微生物，例如细菌，例如以下属：假单胞菌属Pseudomonas，欧文氏菌属Erwinia，沙雷氏菌属Serratia，克雷伯氏菌属Klebsiella，黄单胞菌属Xanthomonas，链霉菌属Streptomyces，根瘤菌属Rhizobium，中华根瘤菌属Sinorhizobium，红假单胞菌属Rhodopseudomonas，Methylophilius，土壤杆菌属Agrobacterium，醋酸菌属Acetobacter，乳酸菌属Lactobacillus，节杆菌属Arthrobacter，固氮菌属Azotobacter，明串珠菌属Leuconostoc，和产碱菌属Alcaligenes；真菌，尤其是酵母，例如下列属：酿酒酵母属Saccharomyces，隐球菌属Cryptococcus，克鲁维酵母属Kluyveromyces，掷孢酵母属Sporobolomyces，蔷薇色酵母属Rhodotorula，和短梗霉属Aureobasidium。特别感兴趣的是这些植物圈细菌种例如丁香假单胞菌Pseudomonas syringae，荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens，粘质沙雷菌Serratia marcescens，木醋酸菌Acetobacter xylinum，根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens，放射性农杆菌Agrobacterium radiobacter，球形红假单胞菌Rhodopseudomonas spheroides，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris，苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti(原来的苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti)，真养产碱杆菌Alcaligeneseutrophus，和棕色固氮菌Azotobacter vinelandii；和植物圈酵母种例如深红酵母Rhodotorula rubra，粘红酵母R.glutinis，牧草红酵母R.marina，橙红酵母R.aurantiaca，浅白隐球酵母Cryptococcus albidus，C.diffluens，罗伦隐球酵母C.laurentii，罗氏酵母Saccharomyces rosei，有孢圆酵母S.pretoriensis，酿酒酵母S.cerevisiae，掷孢酵母Sporobolomyces roseus，香气掷孢酵母S.odorus，Kluyveromyces veronae，和Aureobasidium pollulans。特别感兴趣的是有颜色的微生物。

控制昆虫害虫的方法

当昆虫接触经转基因植物表达、配方的蛋白质组合物、喷雾蛋白质组合物、诱饵基质或其它递送系统递送的有效量的毒素时，结果是昆虫的显著的死亡，或者害虫不再进食其来源，这使得毒素对昆虫不适用。

对象蛋白质毒素可以通过多种途径而“应用”或提供于接触目标昆虫。例如，可以使用转基因植物(其中蛋白由植物产生并存在于植物中)，这是本领域公知的。毒素基因的表达也可以实现选择性地在植物的特定组织中，例如根，叶，等等。这可以通过使用例如组织特异性启动子来实现。喷洒应用是另一个实例并且也是本领域公知的。对象蛋白可以根据需要的最终用途而方便地配方，然后喷洒(或其它方式提供)在要保护的植物上和/或在植物周围/或植物附近——在害虫被发现前，目标昆虫被发现后，发现前和发现后，等等。例如，诱饵颗粒，也可以使用并且是本领域公知的。

转基因植物

对象蛋白质可以用于保护几乎任何类型的植物免受鳞翅目昆虫的伤害。这样的植物的实例包括玉米，向日葵，大豆，棉花，油菜，水稻，高粱，烟草，小麦，大麦，蔬菜，观赏植物，胡椒(包括辣椒)，甜菜，水果和草皮，除了一小部分。转化植物的方法是本领域公知的，说明性的转化方法描述于实施例中。

本发明的一个优选实施方式是用编码对象杀虫蛋白或其变体的基因转化植物。由于在转化的植物的细胞中存在控制量的对象杀虫蛋白或其变体，转化的植物对昆虫目标害虫的侵袭是有抗性的。通过将编码B.t.杀虫毒素的杀虫特性的遗传材料整合进入植物基因组，所述植物被特定的昆虫害虫吃下，则成虫或幼虫将在消耗食物植物之后死亡。单子叶植物和双子叶植物分类的多种成员可以被转化。转基因农作物以及水果和蔬菜具有商业吸引力。这样的作物包括但不限于玉米，水稻，大豆，油菜，向日葵，苜蓿，高粱，小麦，棉花，花生，番茄，马铃薯，等等。存在多种技术将外源遗传材料引入植物细胞，以及获得稳定维持并表达所引入的基因的植物。这些技术包括遗传材料包被为微颗粒后加速直接进入细胞(US专利号4945050和US专利号5141131)。可以使用农杆菌技术转化植物，参见US专利号5177010，US专利号5104310，欧洲专利申请No.0131624B1，欧洲专利申请No.120516，欧洲专利申请No.159418B1，欧洲专利申请No.176112，US专利号5149645，US专利号5469976，US专利号5464763，US专利号4940838，US专利号4693976，欧洲专利申请No.116718，欧洲专利申请No.290799，欧洲专利申请No.320500，欧洲专利申请No.604662，欧洲专利申请No.627752，欧洲专利申请No.0267159，欧洲专利申请No.0292435，US专利号5231019，US专利号5463174，US专利号4762785，US专利号5004863，和US专利号5159135。其它转化技术包括WHISKERS^TM技术，参见US专利号5302523和US专利号5464765。电穿孔技术也被用于转化植物，参见WO 1987/06614，US专利号5472869，US专利号5384253，WO 1992/09696，和WO 1993/21335。所有这些转化专利和公开并入本文作为参考。除了转化植物的多种技术之外，与外源基因接触的组织的类型也可以不同。这样的组织可以包括但不限于胚胎发生组织，愈伤组织类型I和II，胚轴，分裂组织，等等。几乎所有植物组织都可以在反分化期间使用本领域技术人员范围内合适的技术来进行转化。

编码DIG-109和DIG-152毒素或其变体的基因可以通过使用如上文公开的本领域公知的多种技术而插入植物细胞。例如，包含用于允许筛选转化的微生物细胞的标签和在大肠杆菌有功能的复制系统的大量克隆载体可以用于制备和修改外源基因以插入高等植物中。这样的操作可以包括，例如，插入突变，截断，添加，或取代，根据需要的用途来进行。所述载体包括，例如，pBR322，pUC series，M13mp series，pACYC184，等等。从而，编码Cry蛋白或其变体的序列可以插入载体中的合适的限制性位点。获得的质粒用于转化大肠杆菌，其细胞在合适的营养培养基下培养，然后收获并溶解以回收得到可用量的质粒。序列分析，限制性片段分析，电泳，和其它生物化学-分子生物学方法作为分析方法常规地进行。在每次操作之后，可以切断DNA序列并加入下一个DNA序列。每个操作的DNA序列可以在相同或另外质粒中克隆。

含T-DNA载体用于植物细胞的转化已经得到深入研究并充分地描述于欧洲专利申请No.120516；Lee and Gelvin(2008)，Fraley et al.，(1986)，和An et al.，(1985)，并已经在该领域建立完善。

一旦插入DNA被整合进入植物基因组，其就会在后代中相对稳定。用于转化植物细胞的载体通常含有一个选择标签基因，其编码使得所转化的植物细胞对一种除草剂或抗生素有抗性的蛋白，例如双丙氨膦，卡那霉素，G418，博来霉素，或潮霉素，等等。从而个体性拥有的选择标签基因可以允许筛选转化的细胞，而不含有插入基因的细胞的生长将被筛选化合物所抑制。

多种技术可用于将DNA插入宿主植物细胞。这些技术包括用通过根瘤农杆菌或发根农杆菌作为转化试剂递送的T-DNA进行转化。此外，植物原生质与包含需要递送的DNA的脂质体的融合，DNA的直接注射，生物枪转化(微颗粒轰击)，或电穿孔，以及其它可能的方法，都可以使用。

在本发明的一个优选实施方式里，植物被用基因所转化，其中所述基因中蛋白编码区域的密码子使用被向植物方向优化。参见，例如，US专利号5380831，其在此并入作为参考。另外，方便地，可以使用编码截短的毒素的植物。截短的毒素典型地编码约55%至约80%的全长毒素。建立用于植物的合成性B.t.基因的方法是本领域已知的(Stewart 2007)。

不限于转化技术，基因优选整合进入适合在植物细胞中表达B.t.杀虫毒素基因或其变体的穿梭载体，该载体中包含植物启动子。除了植物启动子，来自多种来源的启动子也可以有效用于植物细胞中表达外源基因。例如，可以使用细菌来源的启动子，例如章鱼碱合成酶启动子，胭脂碱合成酶启动子，甘露碱合成酶启动子；植物病毒来源的启动子，例如花椰菜花叶病毒的35S和19S启动子，等等。植物启动子包括，但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)，β-伴大豆球蛋白启动子，菜豆球蛋白启动子，ADH(乙醇脱氢酶)启动子，热激启动子，ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子，和组织特异性启动子。启动子也可以包含某些增强子序列元件，其促进转录效率。典型的增强子包括但不限于ADH1-内含子1和ADH1-内含子6。可以使用构成性启动子。构成性启动子在几乎所有细胞类型中和几乎所有时间里引导持续的基因表达(例如，肌动蛋白，泛素，CaMV 35S)。组织特异性启动子在特定的细胞或组织中形成基因表达，例如叶和种子(例如，玉米蛋白，油脂蛋白，油菜种子储藏蛋白(napin)，ACP(酰基运转蛋白))，可以使用这些启动子。也可以使用在植物发育过程的某些阶段期间以及在特定植物组织和器官中有活性的启动子。这样的启动子的实例包括但不限于根特异性、花粉特异性、胚芽特异性、玉米穗丝特异性、棉花纤维特异性、种子胚乳特异性、韧皮部特异性的启动子等等。

在特定的环境下可以使用合适的诱导性启动子。诱导型启动子响应特定信号并从而引起表达，所述信号例如：物理刺激(例如热激基因)；光(例如RUBP羧化酶)，激素(例如糖皮质激素)；抗生素(例如四环素)；代谢物；以及压力(例如干旱)。还可以使用其它在植物中起功能的需要的转录和翻译元件例如5’不翻译前导序列，RNA转录终止序列和聚腺苷添加信号序列。多种植物特异性基因穿梭载体是本领域已知的。

含有抗虫(IR)特性的转基因作物在玉米和棉花等植物中很普遍并遍及北美，并且这些特性的使用正在全球扩张。多家种子公司已经发展了结合IR和耐除草剂(HT)特性的商业化转基因作物。这包括通过B.t.杀虫蛋白赋予的IR特性和HT特性的结合，所述HT特性例如对乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂耐受例如磺酰脲类，咪唑啉酮，三唑嘧啶，磺酰替苯胺，等等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂如双丙氨膦，草铵膦，等等；4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂如甲基磺草酮，异恶唑草酮，等等；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂如草甘膦等等；和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂如盖草能，禾草灵，精喹禾灵等等。已知的其它实例中转基因提供的蛋白给植物提供了对除草剂的耐受性，所述除草剂的化学种类例如苯氧基酸除草剂和吡啶氧乙酸生长素除草剂(参见WO 2007/053482A2)，或苯氧基酸除草剂和芳氧苯氧丙酸酯除草剂(参见WO 2005107437A2，A3)。通过IR特性控制多种害虫问题的能力是一种商业上有价值的概念，而且这种产品的便利性将得到增强，如果昆虫控制特性和杂草控制特性结合在同样的植物中。此外，可以通过单独的植物结合B.t.杀虫蛋白例如本发明的方案提供的IR特性和一或多种额外的HT特性例如上文所提及的，并加入一或多种额外的输入特性(例如，由B.t.延伸物或其它杀虫蛋白提供的昆虫抗性，像RNAi等机制提供的昆虫抗性，B.t.延伸物或其它杀线虫蛋白提供的线虫抗性，像RNAi等机制提供的线虫抗性，疾病抗性，压力耐受性，改进的营养利用，等等)，或者输出特性(例如，高油含量，健康油组分，营养改进，等等)，从而获得进一步的价值。这样的结合可以通过传统的饲养(饲养堆，breeding stack)或作为新的转化事件加入，包括多种基因(分子堆)的同时引入。好处包括能够在作物植物中管理昆虫害虫和促进杂草控制并提供向生产者和/或消费者第二好处。从而，本发明也可以用于与其它特性的结合以提供具有改进的作物品质的完整的农学包，其能够灵活地和成本有效地控制任何数量的农学事件。

目标害虫

本发明的DIG-109毒素和DIG-152毒素尤其适合于控制鳞翅目昆虫。鳞翅目是一类重要的农业、园艺和家庭害虫，其每年引起非常大量伤害。该昆虫目包含叶-和根-进食的幼虫和成虫。鳞翅目昆虫包括，但不限于：Achoroiagrisella，Acleris gloverana，Acleris variana，Adoxophyes orana，Agrotis ipsilon(小地老虎)，Alabama argillacea，Alsophila pometaria，Amyelois transitella，Anagasta kuehniella，Anarsia lineatella，Anisota senatoria，Antheraea pernyi，Anticarsia gemmatalis，Archips sp.，Argyrotaenia sp.，Athetis mindara，Bombyxmori，Bucculatrix thurberiella，Cadra cautella，Choristoneura sp.，Cochyllshospes，Colias eurytheme，Corcyra cephalonica，Cydia latiferreanus，Cydiapomonella，Datana integerrima，Dendrolimus sibericus，Desmia feneralis，Diaphania hyalinata，Diaphania nitidalis，Diatraea grandiosella(西南玉米螟)，Diatraea saccharalis(甘蔗螟)，Ennomos subsignaria，Eoreuma loftini，Esphestiaelutella，Erannis tilaria，Estigmene acrea，Eulia salubricola，Eupocoelliaambiguella，Eupoecilia ambiguella，Euproctis chrysorrhoea，Euxoa messoria，Galleria mellonella，Grapholita molesta，Harrisina americana，Helicoverpasubflexa，Helicoverpa zea(棉铃虫)，Heliothis virescens，Hemileuca oliviae，Homoeosoma electellum，Hyphantia cunea，Keiferia lycopersicella，Lambdinafiscellaria fiscellaria，Lambdina fiscellaria lugubrosa，Leucoma salicis，Lobesiabotrana，Loxagrotis albicosta(西方豆夜蛾)，Loxostege sticticalis，Lymantriadispar，Macalla thyrisalis，Malacosoma sp.，Mamestra brassicae，Mamestraconfigurata，Manduca quinquemaculata，Manduca sexta，Maruca testulalis，Melanchra picta，Operophtera brumata，Orgyia sp.，Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟)，Paleacrita vernata，Papiapema nebris(常见的钻心虫)，Papiliocresphontes，Pectinophora gossypiella，Phryganidia californica，Phyllonorycterblancardella，Pieris napi，Pieris rapae，Plathypena scabra，Platynotaflouendana，Platynota stultana，Platyptilia carduidactyla，Plodia interpunctella，Plutella xylostella(小菜蛾)，Pontia protodice，Pseudaletia unipuncta(行军虫)，Pseudoplasia includens，Sabulodes aegrotata，Schizura concinna，Sitotrogacerealella，Spilonta ocellana，Spodoptera frugiperda(秋粘虫)，Spodopteraexigua(甜菜夜蛾)，Thaurnstopoea pityocampa，Ensola bisselliella，Trichoplusiani，Udea rubigalis，Xylomyges curiails，和Yponomeuta padella。

使用DIG-109毒素和DIG-152毒素及其变体以控制作物植物的鞘翅目害虫也在预期之中。在一些实施方式里，Cry蛋白可以经济地配置于昆虫害虫的控制，包括但不限于，例如，根虫例如Diabrotica undecimpunctata howardi(南方玉米根虫)，Diabrotica longicornis barberi(北方玉米根虫)，和Diabrotica virgifera(西方玉米根虫)，以及蛆虫例如Cyclocephala borealis(北蒙面金龟子)，Cyclocephala immaculate(南蒙面金龟子)，和Popillia japonica(日本甲虫)的幼虫.

DIG-109和DIG-152毒素的抗体检测

抗毒素抗体。本文公开的针对B.t.毒素的抗体，或针对等效毒素，或这些毒素的片段的，可以通过本领域的标准过程来容易地制备，例如由Coliganet al.，2007的教导及其更新。这样的抗体对检测DIG-109毒素、DIG-152毒素及其变体的存在是很有用的。

一旦B.t.杀虫毒素被分离，对毒素特异的抗体就可以通过本领域公知的传统方法来获取。向选择的宿主重复注射持续数周或数月的时间将引起免疫反应并导致显著的抗-B.t.毒素血清滴度。优选的宿主是哺乳动物物种，更优选的物种是兔，山羊，绵羊和小鼠。从这些免疫的动物中取得的血液可以通过现成方法处理以获得能与B.t.杀虫毒素反应的抗血清(多克隆抗体)。抗血清可以然后根据本领域已知的技术通过吸附至毒素而进行亲和力纯化。亲和力纯化的抗血清可以通过使用本领域已知的方法分离抗血清中的免疫球蛋白部分来进一步纯化。获得的材料是与B.t.杀虫蛋白反应的免疫球蛋白的异源种群。

抗-B.t.毒素抗体可以通过制备由B.t.杀虫毒素的合成性肽片段与免疫原载体缀合而形成的半合成免疫原而产生。制作肽片段的多种方案和手段都是本领域公知的。很多合适的免疫原载体例如牛血清白蛋白或Keyhole Limpet血蓝蛋白也是本领域公知的，以及耦合免疫原和载体蛋白的技术。一旦半合成免疫原被构建，制作对B.t.杀虫毒素片段特异性的抗体的方法与用于制作与天然B.t.毒素反应的抗体的技术是相同的。

抗-B.t.毒素单克隆抗体(MAbs)可以使用纯化的B.t.杀虫毒素而容易地制备。产生MAb的方法已经实践了超过15年并对本领域技术人员而言是公知的。纯化的B.t.杀虫毒素在佐剂中重复腹腔内或皮下注射将在大多数动物中引起免疫反应。从动物中移出超免疫B-淋巴细胞并与能够无限培养的合适的融合伴侣细胞系融合。优选的动物即B-淋巴细胞能被超免疫并用于产生MAb的是哺乳动物。更优选的动物是大鼠和小鼠以及最优选的是BALB/c小鼠株。

多种哺乳动物细胞系都是产生杂交瘤的合适融合伴侣。很多这样的细胞系都可以从美国典型培养物收藏中心(ATCC，Manassas，VA)和商业供应者获得。优选的融合伴侣细胞系是源自小鼠的骨髓瘤，而

Friendlymyeloma-653细胞系(Ventrex，Portland，ME)是最优选的。一旦融合后，获得的杂交瘤在选择性生长培养基中培养一到两周。可以使用两个公知的筛选体系来从混合杂交瘤培养液中排除未融合的骨髓瘤细胞，或骨髓瘤细胞之间的融合。筛选体系的选择取决于免疫的小鼠的株和使用的骨髓瘤融合伴侣。可以使用由Taggart and Samloff，(1983)描述的aaT筛选体系；然而，由Littlefield(1964)描述的HAT(次黄嘌呤氨蝶呤，胸苷)筛选体系是优选的，因为与上文描述的优选的小鼠株和融合伴侣更为兼容。用过的生长培养基随后筛选免疫特异性MAb分泌。酶联免疫吸附分析(ELISA)方法对该目的是最合适的；尽管如此，适合大体积筛选的放射免疫分析也是可以接受的。可以进行设计为连续减少可观数目的无关的或更低需要的培养物的多重筛选。分泌与B.t.杀虫毒素反应的MAb的培养物可以通过与已知的B.t.杀虫毒素的交叉反应来筛选。优先结合至优选的B.t.杀虫毒素的MAb可以用商业上可获得的分析方法来确定类型。优选的MAb是IgG类，更优选的MAb是IgG₁和IgG_2a亚型。

分泌优选的MAb的杂交瘤培养物可以亚克隆多次以建立单克隆性和稳定性。亚克隆真核细胞，非粘附细胞培养的公知方法包括限制性稀释，软琼脂糖和荧光活化的细胞拣选技术。每次亚克隆后，获得的培养物优选再分析抗体分泌和类型以确定已经建立稳定的优选的MAb分泌培养物。

抗-B.t.毒素抗体可用于检测本发明要求的B.t.杀虫毒素、其变体和片段的多种方法。已知用一个报告组分标记的抗体可以用于鉴别各种环境中抗原的存在。放射性同位素标记的抗体已经用于放射免疫分析数十年了，其用于分析各种生物环境中抗原的存在并具有很高的精确性和灵敏性。近来，酶标记的抗体已经被作为放射标记抗体的替代用于ELISA检测中。进一步，对本发明的B.t.杀虫毒素免疫反应的抗体可以结合至固定化基质例如聚苯乙烯孔或颗粒并用于免疫分析以确定B.t.毒素是否存在于一个测试样品中。

检测所用的探针

鉴别本发明的毒素和基因的进一步的方法是使用寡核苷酸探针。这些探针是可探测核苷酸序列。这些序列可以通过依靠合适的放射性标记或可以通过固有的荧光来实现可探测性，描述于US专利号6268132。本领域公知，如果探针分子和核酸样品通过形成两个分子间强烈的碱基配对键而杂交，则可以推定该探针和样品具有基本的序列同源性。优选地，杂交是在严紧条件下通过本领域公知的技术来进行，描述与例如Keller and Manak (1993)。探针的检测提供了用已知方式确定杂交是否发生的方法。这样的探针分析提供了鉴别本发明的毒素编码基因的快速方法。根据本发明的用作探针的核苷酸片段可以使用DNA合成器和标准过程来合成。这些核苷酸序列也可以用做PCR引物以扩增本发明的基因。

杂交

分子生物学领域众所周知，两个核酸的相似性可以通过它们杂交的倾向性来表征。如本文所用术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”是指这样的条件，在此条件下探针将与其靶序列杂交(退火)至相比于其它序列可探测的更高程度(例如，至少超过背景2倍)。严紧条件是序列依赖性的并在不同环境下是不同的。通过控制杂交和/或冲洗条件的严紧性，可以鉴别出与探针100%互补的靶序列(同源探测)。可选地，严紧条件可以改变以允许序列中的一些错配，从而可以检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针是少于1000核苷酸的长度，优选少于500核苷酸的长度。

典型地，严紧条件是指其中盐浓度低于1.5M Na离子，典型地约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)在pH 7.0至pH 8.3并且温度为对短探针(例如10-50核苷酸)至少约30℃和对长探针(例如大于50核苷酸)至少约60℃。严紧条件也可以通过添加减稳定试剂例如甲酰胺。示例性的低严紧条件包括用以下条件杂交：缓冲溶液为30%-35%甲酰胺，1M NaCl，1%SDS(十二烷基硫酸钠)在37℃下，并用1X至2X SSC(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)在50℃-55℃下洗涤。示例性的中等严紧条件包括用以下条件杂交：缓冲溶液为40%-45%甲酰胺，1.0M NaCl，1%SDS(十二烷基硫酸钠)在37℃下，并用0.5X至1X SSC在55℃-60℃下洗涤。示例性的高严紧条件包括用以下条件杂交：缓冲溶液为50%甲酰胺，1M NaCl，1%SDS(十二烷基硫酸钠)在37℃下，并用0.1X SSC在60℃-65℃下洗涤。可选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1%至约1%的SDS。杂交时间一般小于约24小时，通常约4-12小时。

特异性典型地是杂交后洗涤的函数，其最重要的因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对DNA/DNA杂交，其热力学熔点(T_m)是50%的互补靶序列杂交于完美匹配的探针的温度(在确定的离子强度和pH下)。每错配1%，T_m将降低约1℃；因此，T_m，杂交条件，和/或洗涤条件可以调整为有利于指定同一性的序列的退火。例如，如果要搜索>90%同一性的序列，T_m可以降低10℃。通常，严紧条件选为比特定序列和其互补体在确定的离子强度和pH下的T_m低约5℃。然而，高严紧条件能使用低于T_m 1℃，2℃，3℃，或4℃的杂交和/或洗涤；中等严紧条件能使用低于T_m 6℃，7℃，8℃，9℃或10℃的杂交和/或洗涤；而低严紧条件能使用低于T_m 11℃，12℃，13℃，14℃，15℃，或16℃的杂交和/或洗涤。

T_m(以℃计)可以通过实验确定或者近似地计算。对于DNA-DNA杂交，T_m可以从Meinkoth and Wahl方程式(1984)来近似地计算：

T_m(℃)=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%甲酰胺)-500/L；

其中M是单价离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，%甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是杂交以碱基对计的长度。

可选地，T_m由下式描述(Beltz et al.，1983)。

T_m(℃)=81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(%GC)-0.61(%甲酰胺)-600/L

其中[Na+]是钠离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，%甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是杂交以碱基对计的长度。

使用这些方程式，杂交和洗涤组合物，以及需要的T_m，本领域普通技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严紧性的变化被本质地描述。如果需要的错配程度导致T_m低于45摄氏度(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以可以使用更高的温度。对核酸的杂交的广泛的教导参见Tijssen(1993)和Ausubel et al.，1995及其更新。也参见Sambrook et al.，(1989)及其更新。

固定化DNA在DNA印迹上与放射性标记的基因特异性探针的杂交可以通过标准技术(Sambrook et al.，supra.)来进行。用于标记多核苷酸探针的放射性同位素可以包括32P，33P，14C，或3H。放射性同位素整合进入多核苷酸探针分子可以由分子生物学领域技术人员公知的多种方法的任意来完成(参见，例如，Sambrook et al.，supra.)。通常，杂交和后续的洗涤可以在这样的严紧条件下进行，其允许检测到与要求的毒素的编码基因具有同源性的靶序列。对双链DNA基因探针，杂交可以在低于DNA杂交的T_m 20-25℃下进行过夜，其中的T_m是在6X SSPE，5X Denhardt's溶液，0.1%SDS，0.1mg/mL变性DNA下DNA杂交的T_m[20X SSPE是3M NaCl，0.2M NaHPO₄，和0.02MEDTA(乙二胺四乙酸钠盐)；100X Denhardt's溶液是20gm/L聚乙烯吡咯烷酮，20gm/L聚蔗糖400(Ficoll type 400)和20gm/L牛血清白蛋白(片段V)]。

洗涤典型地如下进行：

2次在室温下15分钟在1X SSPE，0.1%SDS中进行(低严紧洗涤)。

1次在T_m-20℃下15分钟在0.2X SSPE，0.1%SDS中进行(高严紧洗涤)。

对寡核苷酸探针，杂交可以在低于杂交的T_m 10-20℃下进行过夜，其中的T_m是在6X SSPE，5X Denhardt's溶液，0.1%SDS，0.1mg/mL变性DNA下杂交的T_m。寡核苷酸探针的T_m可以通过下式来确定(Suggs et al.，1981)。

T_m(℃)=2(T/A碱基对的数目)+4(G/C碱基对的数目)

洗涤典型地如下进行：

2次在室温下15分钟在1X SSPE，0.1%SDS中进行(低严紧洗涤)。

1次在杂交温度下15分钟在1X SSPE，0.1%SDS中进行(更高严紧洗涤)

盐浓度和温度的结合的一些实例如下(为了增加严紧性)：2X SSPE或SSC在室温下；1X SSPE或SSC在42℃下；0.1X SSPE或SSC在42℃下；0.1XSSPE或SSC在65℃下。

杂交的探针分子和探针与目标分子之间形成的杂交分子可以呈现放射性标记之外的方式的可检测性。这样的可选方法也试图在本发明的范围之内。

应当理解本文描述的实施例和实施方式是仅仅出于示范性目的，而其各种修改或改变将由本领域技术人员所建议并且包含在本申请的精神和范围之内和所附的权利要求的范围之内。

除非特别指明或暗示，本文使用的术语“一(a)”，“一个(an)”和“这些(the)”意指“至少一个”。

下面是说明本发明的实践方式的实施例。这些实例不应当被解释为限制性。所有百分比是以重量计的，所有溶液混合物比例是以体积计，除非另外声明。所有温度是摄氏温度。

实施例1

设计嵌合的Cry1Ca核心毒素与Cry1Ab原毒素

嵌合毒素。用一个Cry毒素的核心毒素结构域与另一个Cry毒素的原毒素片段融合的嵌合蛋白质在之前已经被报道，例如US专利号5593881和US专利号5932209。一个Cry1Ca3δ外毒素蛋白序列存放在GenBank登记号AAA22343，在一个叫CryIC(b)的旧名称下。

本发明的Cyr1Ca嵌合蛋白变体包括这样的毒素，其包含源自Cry1Ca3杀虫毒素的N-端核心毒素片段与一个异源δ外毒素原毒素片段在所述核心毒素片段的末端之后几个点后的位置融合。从核心毒素向异源原毒素片段的转变可以发生在大约自身的核心毒素/原毒素连接或者，可选地，自身原毒素的部分(延伸过核心毒素片段)可以被保留，而向异源原毒素的转变发生在下游。在变体类型中，核心毒素和原毒素片段可以精确地包含其来源的自身毒素的氨基酸序列，或者可以包括氨基酸添加，删除，或取代，其不会减少，或者可能增强所述片段的生物学功能，当其与另一个融合的时候。

例如，本发明的嵌合蛋白包含源自Cry1Ca3的核心毒素片段和异源原毒素。在本发明的一个优选实施方式里，源自Cry1Ca3的核心毒素片段，如SEQID NO:1(619个氨基酸)中作为Cry1Ca核心毒素片段公开的，与包含源自Cry1Abδ-外毒素的原毒素片段的异源片段融合。SEQ ID NO:2公开了源自Cry1Ab的一个原毒素片段的545氨基酸序列并用于本发明的Cry1Ca变体。注意SEQ ID NO:2的这个原毒素片段的最后约100-150个氨基酸，将其包括在本发明的嵌合毒素的之内是很重要的。从而，本发明的一个优选实施方式包含这样的嵌合蛋白，其中SEQ ID NO:1公开的Cry1Ca核心毒素片段结合于SEQID NO:2公开的源自Cry1Ab的原毒素片段。这个嵌合蛋白的1164氨基酸序列，本文称为DIG-152，在SEQ ID NO:3中公开(pMYC2547版本)。本发明的第二优选的实施方式包含这样的嵌合蛋白，其中SEQ ID NO:1公开的Cry1Ca核心毒素片段结合于SEQ ID NO:4显示的的源自Cry1Ab的第二个545氨基酸的原毒素片段。注意这个原毒素片段的最后约100-150个氨基酸，将其包括在本发明的嵌合毒素的之内是很重要的。这第二个嵌合蛋白的1164氨基酸序列，本文称为DIG-109，在SEQ ID NO:5中公开(玉米优化的版本)。应当理解包含Cry1Ca核心毒素变体和源自Cry1Ab的原毒素的其它嵌合融合体也在本发明的范围之内。

注意SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4展示的源自Cry1Ab的原毒素片段相互之间基本上是功能等同物，序列上的不同仅在于一个(第一个)位置。

实施例2

构建编码嵌合Cry1Ca核心/Cry1Ab原毒素蛋白的表达质粒并在假单胞菌中表达

标准克隆技术[例如描述于Sambrook et al.，(1989)和Ausubel et al.，(1995)，及其更新]被用于构建荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，Pf)表达构建体pMYC2547，该构建体加工为产生包含Cry1Ca核心融合于Cry1Ab原毒素的全长嵌合蛋白(DIG-152；SEQ ID NO:3)。在荧光假单胞菌菌株MB214(菌株MB101的衍生株；荧光假单胞菌生物变型I)中进行，该菌株具有插入的修改的lac操纵子，如US专利号5169760中所公开。基本克隆策略包括将编码DIG-152的DNA片段亚克隆进质粒载体，其中其置于来自pKK223-3质粒(PL Pharmacia，Milwaukee，WI)的Ptac启动子和rrnBT1T1终止子的控制之下。一个这样的质粒被命名为pMYC2547，而筛选的具有该质粒的MB214被命名为Dpf108。

摇瓶中的生长和表达分析用于表征和昆虫生物分析的DIG-152的生产通过摇瓶生长的荧光假单胞菌菌株Dpf108来完成。Ptac启动子驱动的DIG-152蛋白的生产如先前的US专利号5527883描述的那样来操作。摇瓶30℃起始培养24小时后通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。培养物在诱导时和诱导后不同的时间取样。通过在600nm的光密度(OD600)来测量细胞密度。

摇瓶样品的细胞分离和SDS-PAGE分析在每个取样时间，样品的细胞密度调节至OD₆₀₀=20，1mL的部分在14000xg下离心5分钟。细胞小块在-80°下冷冻。使用EasyLyse^TM细菌蛋白提取溶液(

生物技术，Madison，WI)来产生来自冷冻的摇瓶细胞小块样品的可溶和不溶部分。每个细胞小块重悬于EasyLyse^TM溶液并在溶菌缓冲液中进一步以1:4稀释，并在室温下振荡孵育30分钟。溶菌液在14000rpm下4°离心20分钟，回收上清液作为可溶部分。颗粒(不溶部分)然后重悬于等体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS；11.9mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)。

样品与包含β-巯基乙醇的2X Laemmli样品缓冲液(Sambrook et al.，supra.)以1:1混合并煮沸5分钟之后上样于Criterion XT Bis-Tris 12%凝胶(Bio-Rad Inc.，Hercules，CA)。在推荐的XT MOPS缓冲液中进行电泳。凝胶用Bio-Safe Coomassie Stain根据生产商(Bio-Rad)的步骤来染色并用AlphaInnotech成像系统(San Leandro，CA)照相。

包涵体制备。DIG-152蛋白包涵体(IB)的制备在生产可溶性B.t.杀虫蛋白的荧光假单胞菌发酵的细胞上进行，并通过SDS-PAGE和MALDI-MS(基质辅助激光解吸/电离质谱)来验证。荧光假单胞菌发酵菌体在37°水浴中解冻。细胞以25%w/v重悬于溶菌缓冲液[50mM Tris，pH 7.5，200mM NaCl，20mMEDTA二钠盐(乙二胺四乙酸)，1%Triton X-100，和5mM二硫苏糖醇(DTT)；5mL/L的细菌蛋白酶抑制剂混合物(编号#P8465；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在使用前加入]。细胞用手持式均化器在最低设置下悬浮(Tissue Tearor，BioSpec Products，Inc.，Bartlesville，OK)。溶菌酶(25mg的Sigma L7651，来自鸡蛋白)通过金属勺加入细胞悬浮液，悬浮液在室温下孵育1小时。悬浮液在冰上冷却15分钟，然后用Branson Sonifier 250(两次1-分钟过程，在50%负载循环，30%输出下)超声破碎。细胞溶菌液用显微镜检查。如果需要的话加入额外的25mg溶菌酶，重复孵育和超声破碎过程。通过显微镜确认细胞溶菌之后，溶菌液在11500xg下离心14分钟(4°)以形成IB小块，弃去上清液。IB小块用100mL溶菌缓冲液重悬，用手持式混合器均匀化并离心如前所述。IB小块重复用重悬液洗涤(在50mL溶菌缓冲液中)，均匀化，超声，然后离心直到上清液变得无色而IB小块变得稳定并发白的颜色。最后的洗涤后，IB小块重悬于包含2mM EDTA的无菌过滤(0.22μm)的蒸馏水，并离心。最后的小块重悬于包含2mM EDTA的无菌过滤的蒸馏水，并以1mL的分量在-80°下储存。

IB制备中蛋白质的SDS-PAGE分析与定量通过解冻1mL分量的IB小块并用无菌过滤的蒸馏水以1:20稀释来进行。稀释的样品随后用4X还原样品缓冲液[250mM Tris，pH6.8，40%甘油(v/v)，0.4%溴酚蓝(w/v)，8%SDS(w/v)和8%β-巯基乙醇(v/v)]煮沸并上样于

4-20%Tris-甘氨酸，12+2孔凝胶(Invitrogen)用1X Tris/甘氨酸/SDS(BioRad)跑胶。在200伏特下跑胶60分钟然后用考马斯蓝(50%G-250/50%R-250在45%甲醇，10%乙酸中)染色，然后用7%乙酸，5%甲醇的蒸馏水溶液脱色。目标条带的定量通过对比该条带与在同样的凝胶上跑的牛血清白蛋白(BSA)标准条带的密度值以产生标准曲线。

包涵体的溶解。6mL来自Pf克隆DPf108的DIG-152包涵体悬浮物在Eppendorf model 5415C微离心的最高速设置(约14000xg)下离心以使包涵体成小块。移除储存缓冲液上清液并用25mL的pH11的100mM碳酸钠缓冲液代替，在50mL锥形管中。包涵体用移液管重悬并涡旋以充分混合。试管置于轻柔摇晃的平台上在4°下过夜以萃取目标蛋白。萃取物在30000xg下4°离心30分钟，获得的上清液用Amicon Ultra-15再生纤维素离心过滤设备(30,000分子量切断；微孔)浓缩5倍。样品缓冲液然后改变为10mM CAPS[3-(环己胺)1-丙磺酸]pH 10用可置换的PD-10柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。

包涵体蛋白的溶解和胰蛋白酶活化。在某些实例中，来自Pf克隆DPf108的DIG-152包涵体悬浮液在Eppendorf model 5415C微离心的最高速设置(约14000xg)下离心以使包涵体成小块。移除储存缓冲液上清液并用pH11的100mM CAPS代替以提供蛋白质浓度为约50mg/mL。试管在室温下摇动3小时以充分溶解蛋白质。胰蛋白酶以等于5%-10%(w:w，基于IB粉末的初始重量)的量加入并通过孵育同时摇动在4°下过夜或在室温下摇动90-120分钟来完成消化。通过10000xg下离心15分钟来移除不溶物质，上清液用于MonoQ离子交换柱(10mm乘10cm)。活化的DIG-152蛋白用0%至100%的1M NaCl梯度经25个柱体积来洗脱。合并包含活化蛋白的部分，并且需要的话，用如前所述的Amicon Ultra-15重生纤维素离心过滤设备浓缩至少于10mL。材料然后通过Superdex 200柱(16mm乘60cm)，所用缓冲液包含100mM NaCl.10%甘油，0.5%Tween-20和1mM EDTA。通过SDS-PAGE分析确定了活化的(酶截短的)蛋白洗脱液为65-70mL。合并包含活化蛋白的部分并用上文所述的离心浓缩器浓缩。

凝胶电泳。浓缩的蛋白制备物通过用

LDS样品缓冲液(Invitrogen)以1:50稀释后用于电泳，所述缓冲液含5mM DTT作为还原试剂并加热至95°4分钟。样品上样于4-12%

凝胶的双倍泳道上，旁边是5个BSA标准，从0.2μg至2μg/泳道的范围(用于制作标准曲线)。提供200V的电压并用MOPS SDS跑胶缓冲液(Invitrogen)直到示踪染料到达凝胶底部。凝胶用0.2%考马斯蓝G-250的45%甲醇和10%乙酸的溶液染色，并脱色，第一次简单地用45%甲醇，10%乙酸，然后长时间用7%乙酸，5%甲醇直到背景被清除。脱色之后，凝胶用BioRad Fluor-S MultiImager扫描。该仪器的QuantityOne Software v.4.5.2用于获得染色蛋白条带的去背景的体积并产生BSA标准曲线，其用于计算储存的溶液中嵌合DIG-152蛋白的浓度。

实施例3

荧光假单胞菌中生产的DIG-152的杀虫活性

DIG-152蛋白的杀虫活性在鳞翅目物种上验证，包括欧洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis(Hübner))，cry1F-抗性ECB(rECB)，棉铃虫(CEW；Helicoverpa zea(Boddie))，小地老虎(BCW；Agrotis ipsilon(Hufnagel))，秋粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda(J.E.Smith))，Cry1F-抗性FAW(rFAW)，和西南玉米螟(SWCB，Diatraea grandiosella)。

样品制备与生物分析。包涵体制备物(自身全长蛋白或胰蛋白酶活化的蛋白)通过交换方法例如透析或PD-10柱转入10mM CAPS pH10缓冲液中。然后样品适当地稀释于10mM CAPS pH10中，所有的生物分析包含一个该缓冲液组成的对照处理，其作为死亡率或生长抑制的背景对照。

生物分析缓冲液的蛋白浓度通过凝胶电泳用BSA制作对凝胶密度的标准曲线来评估，用上文所述的BioRad成像系统来测量。凝胶基体中的蛋白质用基于考马斯蓝的染料染色并在读取前脱色。

纯化的蛋白在生物测量中测试杀虫活性，通过初生鳞翅目幼虫在人工昆虫食物上进行。ECB，CEW，BCW，FAW，和SWCB的幼虫由商业昆虫饲养所(Benzon Research Inc.，Carlisle，PA)保持的克隆得到的卵所孵化。rECB和rFAW的幼虫由个人拥有的克隆(Dow AgroSciences，Indianapolis，IN)收获的卵所孵化。

生物分析在特别设计为昆虫生物分析的128孔塑料盘(C-D International，Pitman，NJ)上进行。每个孔含1.0mL的多物种鳞翅目食物(SouthlandProducts，Lake Village，AR)。40μL分量的蛋白样品用移液器递送至每孔的1.5cm²食物表面(即，26.7μL/cm²)。食物浓度计算为孔中每平方厘米表面面积的DIG-152蛋白的量(ng)。处理过的盘保持在通风橱中直到食物表面的液体蒸发或被吸收进入食物。

羽化数小时之后，用湿润的驼毛刷捡起单个的幼虫并堆放在处理过的食物上，每孔一只幼虫。侵染的孔用干净塑料的粘性薄膜密封，并开通风口以允许气体交换(C-D International)。生物分析盘保持在控制的环境条件下[28°，约40%相对湿度(RH)，16小时:8小时(光：暗)]保持5天，到时间后所有昆虫暴露于每种蛋白样品，记录死亡昆虫数量，和存活昆虫的重量。计算每个处理的百分比死亡率和百分比生长抑制。百分比生长抑制(GI)用下式计算：

%GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]x100

其中TWIT是该处理中昆虫总重量(Total Weight of Insects inthe Treatment)；

TNIT是该处理中昆虫总数(Total Number of Insects in theTreatment)；

TWIBC是背景检测(缓冲液对照)中昆虫总重量(Total Weight ofInsects in the Background Check)，而TNIBC是背景检测(缓冲液对照)中昆虫总数(Total Number of Insects in the Background Check)。

GI₅₀确定为%GI值为50时食物中嵌合DIG-152蛋白的浓度。LC₅₀(50%死亡浓度)记录为50%的测试昆虫被杀死时食物中DIG-152蛋白的浓度。统计学分析(One-way ANOVA)用JMP软件(SAS，Cary，NC)进行。

表3展示了DIG-152蛋白对7中类型的测试昆虫幼虫的摄取生物分析。

表3.GI₅₀和LC₅₀值(ng/cm²)，从顶部加载DIG-152蛋白的昆虫食物计算。

本发明的DIG-152蛋白具有该特征，即秋粘虫(Spodoptera frugiperda)和西南玉米螟(Diatraea grandiosella)初生幼虫的生长在摄取DIG-152蛋白之后被抑制。进一步，对Cry1F毒性有抗性的秋粘虫幼虫与野生型秋粘虫幼虫一样对DIG-152敏感。

实施例4

由荧光假单胞菌生产的DIG-152蛋白的进一步的杀虫活性

DIG-152蛋白(不是胰蛋白酶活化的)的鳞翅目杀虫活性进一步在甘蔗螟(SCB；Diatraea saccharalis)和Cry1Ab-抗性SCB(rSCB)的初生幼虫上以剂量响应实验用食物整合方法来确定。DIG-152包涵体轻柔摇晃4小时4°下溶于7.5mL的100mMCAPS pH11，1mMEDTA，其中已经加入200μL的细菌蛋白酶抑制剂(Sigma P4865；根据供应商的说明制备)。离心使不溶材料形成小块之后，储存的蛋白浓度在100mM CAPS，pH11中调节至4.0mg/mL。对于昆虫生物分析，DIG-152蛋白在0.030μg-102μg/gm食物范围内的浓度通过合适的体积与部分化学的食物(Bio-Serv，Frenchtown，NJ)混合而制备，之后立即分配至128孔盘(Bio-Ba-128，C-D International)的单个细胞的食物中。

胰蛋白酶活化的Cry1Ab蛋白(用作杀虫活性的阳性对照)在0.03125μg-32μg/gm食物的范围内测试(通过在食物制备之前混合冻干粉与合适量的蒸馏水来制备)。

用蒸馏水制备的食物(空白对照，对于Cry1Ab测试)或仅仅缓冲液(100mM CAPS pH11，对于DIG-152测试)用作对照处理。甘蔗螟的一个初生幼虫(孵化后<24小时)释放在每孔的食物表面上。幼虫接种后，细胞用通风盖(C-DInternational)覆盖，生物分析盘置于环境箱中保持28°，50%RH，和16小时:8小时(光:暗)光照周期。在接种后的第7天记录幼虫死亡率，幼虫重量，和未证明重量增长(每只幼虫<0.1mg)的存活幼虫的数量。昆虫株/Cry蛋白浓度的每个组合重复4次，每次重复用16-32只幼虫。

幼虫死亡率标准被测量为“实际”死亡率，其考虑死亡的(病态的)幼虫和存活的(矮小的，不进食的)幼虫，其不显示显著的体重增长(即每只幼虫<0.1mg)。在一个处理中幼虫的实际死亡率用该公式来计算：

实际死亡率(%)=[TDS/TNIT]x100

其中TDS是死亡幼虫数加矮小幼虫数的总数(Total number ofDead larvae plus the number of Stunted larvae)，

而TNIT是该处理中的昆虫总数(Total Number of Insects in theTreatment)。

对每种甘蔗螟株的“实际”死亡率(下文简称为死亡率)进行校正，分析Cry1Ab处理的结果用水空白对照食物上观察到的幼虫死亡率进行校正，而DIG-152处理则用仅缓冲液处理的食物。

进一步分析剂量响应实验的结果以建立GI₅₀值，[即，幼虫生长抑制(%GI)值是50时食物中B.t.蛋白的浓度]。包含Cry1Ab蛋白的食物上幼虫的%GI值用下式计算：

%GI=[TWC-TWT]/TWCx100

其中TWC是水对照食物喂养的幼虫的总体重(Total body Weightof larvae feeding on water Control diet)，而

TWT是Cry1Ab处理的食物喂养的幼虫的总体重(Total bodyWeight of larvae feeding on Cry1Ab Treated diet)

其中，为了计算作为DIG-152蛋白摄入的结果的幼虫%GI，用下式计算：

%GI=[TWB-TWT]/TWBx100

其中TWB是仅缓冲液对照处理的食物喂养的幼虫的总体重(Totalbody Weight of larvae feeding on Buffer-Only control treated diet)，而

TWT是DIG-152处理的食物喂养的幼虫的总体重(Total bodyWeight of larvae feeding on DIG-152 Treated diet)

如果没有幼虫具有显著的重量增长(每只幼虫<0.1)，则指定为100%的幼虫生长抑制。用双向ANOVA以昆虫株和Cry浓度作为两个主要因子分析生长抑制数据。LSMEANS检验用于确定在α=0.05的水平下处理的差异。

甘蔗螟幼虫上的食物结合生物分析的结果显示于表4。

表4.用含Cry1Ab或DIG-152蛋白的食物喂养的Cry1Ab-敏感(SCB)和Cry1Ab-抗性(rSCB)的玉米螟剂量响应的幼虫死亡率和生长抑制(%平均值±标准误差)^a

^a一列中贯穿所有处理后面均跟随一个相同字母的平均值不是显著差异的(P<0.05；LSMEANS检验)。sem=平均值的标准误差。

^bμg蛋白/gm食物

^c幼虫死亡率的测量如文中所定义。

^d这些百分比数值用文中所述的公式计算。

^e这些百分比数值用文中所述的公式计算。

^fNT=未检测

数据分析校正过的剂量/死亡率数据然后用于概率值分析以确定引起50%死亡率(LC₅₀)值和相应的95%置信区间(CI)的处理蛋白浓度。概率值分析中所用的处理包括产生零死亡率的最高浓度，导致100%死亡率的最低浓度，和这些极值之间的所有结果。抗性比率通过rSCB株的LC₅₀值除以SCB昆虫的值来计算。致死剂量比率测试用于确定抗性比率在α=0.05水平上是否显著。用双向ANOVA分析死亡率数据，然后用LSMEANS检验在α=0.05的水平下确定处理的差异。分析结果展示于表5。

表5.结合了DIG-152蛋白或Cry1Ab蛋白的昆虫食物中SCB和rSCB幼虫的生物分析检验的总结。

^a幼虫死亡率的测量如文中所述的定义。

^b字母“S”的抗性比率是显著的，而字母“NS”的是不显著的，在5%水平上和基于致死剂量检验。

本发明的DIG-152蛋白具有如下特征，即在DIG-152蛋白以与活化的Cry1Ab蛋白以相似水平被摄取后，初生的甘蔗螟(Diatraea saccharalis)幼虫的生长被抑制，或者幼虫被杀死，其中活化的Cry1Ab蛋白引起同样的生物学反应。DIG-152的进一步的特征是对Cry1Ab蛋白的毒性影响有抗性的甘蔗螟幼虫仍然对DIG-152蛋白的毒性敏感。

实施例5

对嵌合Cry1Ca蛋白免疫反应的兔多克隆和小鼠多克隆抗体的产生

开发了抗体以检测和定量化Cry1Ca嵌合蛋白和Cry1Ca嵌合蛋白的变体，例如，在由生产本发明的蛋白的转基因植物制备的提取物中。标准免疫印迹制备/分析方法和ELISA方法用于表征抗体和B.t.蛋白检测(例如，在Coligan etal.，2007中教导的及其更新)。

多克隆抗体的产生。用于多克隆免疫的蛋白质抗原是实施例2中描述的荧光假单胞菌中生产的DIG-152蛋白经胰蛋白酶截短的核心毒素。另外，对Cry1Ca核心毒素片段特异性的两个肽缀合在血蓝蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin)上并用作免疫原。所述肽对应于SEQ ID NO:1的436-445氨基酸(VQRSGTPFLT；Cry1Ca436；SEQ ID NO:6)和591-600氨基酸(SEQPLFGAGS；Cry1Ca591；SEQ ID NO:7)。当Cry1Ca的蛋白序列与其它几类的Cry1 B.t.蛋白对比时这些肽序列被鉴定为对Cry1Ca是独特的。进一步，期望这些肽暴露在自身Cry1Ca蛋白的表面。

通过订约卖主的标准流程进行免疫和血清收集。通过Covance(Princeton，NJ)获得多克隆抗体。新西兰白兔用于产生针对胰蛋白酶活化的DIG-152蛋白的多克隆抗体。免疫和血清收集之间有14天的循环时间。剂量以包含0.5mg的蛋白或缀合肽的弗氏完全佐剂开始。随后的注射用不完全弗氏佐剂制备。

合并来自这两只兔的血清以产生一批蛋白A纯化的抗体(称为DIG152RPC1)，其能与Cry1Ca核心毒素蛋白反应。如抗体表征领域技术人员所公知的，由完整蛋白产生的多克隆抗体通常不是非常特异的并经常会检测到用来免疫的蛋白以及其它相关蛋白的很多表位。因此，免疫分析显示DIG152RPC1能检测到其它Cry1-类的B.t.毒素，尤其是，胰蛋白酶活化的Cry1Ab，Cry1Da，和Cry1Fa，和胰凝乳蛋白酶活化的Cry1Be和Cry1Ea。注意到在商业设置中，作物植物可以产生其它Cry1-类蛋白，因此DIG152RPC1显示出用于检测这些蛋白的有用试剂，包括这些蛋白的截短和其它形式。

开发了针对Cry1Ca的两个缀合肽特异性批次的兔多克隆抗体。两只新西兰白兔分别用于每种肽，对每种肽合并血清；获得两种肽各自的一份肽抗体。免疫和血清收集通过标准流程来进行，在免疫和血清收集之间间隔14天的循环时间。血清的最终批次用对应的肽亲和力纯化。两种肽特异性抗体的直接ELISA评估显示针对肽Cry1Ca591的抗体显示出特异性检测Cry1Ca，相比于与其它Cry1类蛋白的反应，而针对肽Cry1Ca436的抗体不是特异性的(表6)。

表6.两种Cyr1Ca肽特异性抗体以1g/mL与各种Cry1 B.t.蛋白质抗原反应后获得的直接ELISA光密度读数。

	Cry1Ca	Cry1Ad	Cry1Fa	Cry1Be	Cry1Da	Cry2Aa	Cry1Ab	Cry1Ea
									抗-Cry1Ca591	1.36	0.32	0.27	0.27	0.3	0.2	0.51	0.23
抗-Cry1Ca436	0.39	0.32	0.41	0.42	0.54	0.32	0.81	0.38

单克隆抗体的制备。单克隆抗体通过Open BioSystems/Thermo FisherScientific(Huntsville，AL)来制备。小鼠抗-Cry1Ca单克隆抗体的开发采用实施例2中描述的荧光假单胞菌中生产的DIG-152蛋白制备的经胰蛋白酶截短的核心毒素。免疫和细胞系的发展通过标准抗体开发方法在细胞培养基中进行，而不是通过腹水生产方法。单克隆细胞系通过标准流程融合免疫过的小鼠脾细胞与相容性ND4小鼠骨髓瘤细胞系来获得。

直接结合ELISA筛选鉴别出小鼠M4血清具有对Cry1Ca蛋白的显著特异性(表7)。

表7.小鼠M4血清(用胰蛋白酶活化的Cry1Ca免疫)与几种Cry1类的蛋白的直接结合ELISA反应的终点滴度。

抗原

Cry1Ca

Cry1Da

Cry1Ac

Cry1F

Cry1Be

Cry1Ab

结束点滴度

312500

62500

500

12500

<100

500

所有源自M4的单克隆细胞系通过结合至Cry1Ca，Cry1Da，Cry1Ac，Cry1Fa，Cry1Be，和Cry1Ab的直接结合ELISA来测试。细胞系M4-34和M4-23，其被证明具有检测Cry1Ca的能力[即，具有高的光密度(OD)读数]，并且不检测其它Cry1类蛋白[即，具有零或非常低的OD读数]，是特别关心的(表8)。来自优选细胞系M4-34的单克隆抗体被称为抗体DIG152MabM4-34。

表8.源自M4的单克隆细胞系与目标的胰蛋白酶活化的Cry1Ca蛋白和非目标的Cry1类蛋白反应的直接结合ELISA的光密度读数。

抗原	Cry1Ca	Cry1Be	Cry1Ac	Cry1F	Cry1Ab	Cry1Da
							细胞系M4-34	2.024	0.029	0.105	-0.013	-0.008	0.03
细胞系M4-23	1.799	0.07	0.095	0.061	0.043	0.064

因此本发明的一个目的是提供特异性识别截短的Cry1Ca B.t.蛋白的单克隆抗体。

实施例6

设计编码DIG-109蛋白的玉米密码子优化的序列

植物分子生物学领域技术人员能理解多个DNA序列可以设计为编码一种氨基酸序列。增加感兴趣的蛋白的编码区域的表达的通常含义是将编码区域改变为这样的方式，即其密码子组成类似宿主的总体密码子组成，在其中基因一定会表达。关于设计和产生合成性基因的教导参见例如WO1997/13402和US专利号5380831。

设计并合成了具有玉米偏好密码子的DNA序列以在转基因单子叶植物中产生DIG-109嵌合杀虫蛋白。根据从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)存放的序列获得的706个蛋白编码序列计算了对玉米(Zea mays L.)的密码子使用表。忽略任何使用少于用于该氨基酸的密码子总共的约10%的多余密码子之后，计算出玉米密码子设置的加权平均值。代表每个密码子的加权平均值用下式计算：

C1的加权平均值%=1/(%C1+%C2+%C3+etc.)x%C1x100

其中C1是所讨论的密码子，而%C2，%C3，etc.表示其余同义密码子的平均%使用值。

为了获得编码SEQ ID NO:5的1164个氨基酸的DIG-109蛋白的玉米密码子优化的DNA序列，进行了编码Cry1Ca核心毒素片段的自身cry1CaDNA序列的密码子取代，以获得具有玉米优化的偏好密码子表的全部密码子组成。以类似的形式，进行了编码SEQ ID NO:4的Cry1Ab原毒素片段的自身cry1Ab DNA序列的密码子取代，以获得具有玉米优化的偏好密码子表的全部密码子组成。对序列的进行了进一步精致化以消除不希望的限制性酶识别位点，潜在的植物内含子剪接位点，长段的A/T或C/G残基，和其它可能干扰植物细胞中RNA稳定性、转录或翻译编码区域的基序。进行了其它改变以引入需要的限制性酶识别位点，并消除长的内在开放阅读框(不同于+1的阅读框)。这些改变均在保留大致的玉米偏好密码子组合的约束下进行。编码DIG-109蛋白的完整的玉米密码子优化序列作为SEQ ID NO:8公开。根据SEQ ID NO:8的DNA片段的合成通过商业供应商(DNA2.0，Menlo Park，CA)来进行。

实施例7

构建包含编码DIG-109蛋白的植物-可表达基因的植物转化载体

农杆菌超级双元系统(Japan Tobacco，Tokyo，JP)被便利地用于单子叶植物宿主的转化。该超级双元系统使用pSB11穿梭载体质粒，其含有由多克隆位点分离出的T-DNA右边界重复(RB)和T-DNA左边界重复(LB)。通过标准DNA克隆方法制备了pSB11的一个衍生物(称为pDAB7691)。质粒pDAB7691包含玉米优化的DIG-109编码序列(CDS；即，SEQ ID NO:8)在玉米泛素1启动子的转录控制之下并连接内含子1(US专利号5510474)和玉米Per5 3’不翻译区域(3'UTR)(US专利号7179902)。进一步，pDAB7691含有植物选择标记基因，包含Dow AgroSciences DSM2 CDS(WO 2008/070845 A2)在水稻肌动蛋白1启动子的转录控制之下并连接内含子1(US专利号5641876)和玉米脂肪酶3’UTR(US专利号7179902)。pDAB7691的T-区域的组分的物理排列简要示意如下：

RB>玉米 Ubi1 启动子:DIG-109 CDS:玉米 Per5 3′UTR>水稻Act1 启动子:DSM2 CDS:玉米 Lip 3'UTR>LB

通过标准DNA克隆方法制备了pSB11的第二个衍生物(称为pDAB100276)。质粒pDAB100276包含玉米优化的DIG-109编码序列(CDS；即，SEQ ID NO:8)在玉米泛素1启动子的转录控制之下并连接内含子1和玉米Per5 3’UTR。进一步，pDAB100276含有植物选择标记基因，包含Dow AgroSciences AAD1 CDS(US专利申请号20090093366)，在玉米泛素1启动子的转录控制之下并连接内含子1和玉米脂肪酶3’UTR。pDAB100276的T-区域的组分的物理排列简要示意如下：

RB>玉米 Ubi1 启动子:DIG-109 CDS:玉米 Per5 3'UTR>玉米 Ubi1启动子:AAD-1 CDS:玉米 Lip 3'UTR>LB

为了准备农杆菌的转化，具有质粒pDAB7691或质粒pDAB100276的大肠杆菌细胞克隆株DH5α在37°下在含壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基(g/L：细菌用胰蛋白胨，10；细菌用酵母提取物，5；NaCl，10；琼脂，15)中生长过夜。含有结合转移质粒pRK2013的菌株DH5α细胞在含卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂上生长。平板在4°下孵育以等候含质粒pSB1的根瘤农杆菌菌株LBA4404可以使用。

实施例8

转化农杆菌以产生超级双元载体

农杆菌超级双元体系，其使用含质粒pSB1的根瘤农杆菌菌株LBA4404，能便利地用于转化单子叶植物宿主。构建和确认超级双元载体的方法学已经被很好地建立，参见pSB1的操作手册(Japan Tobacco)。标准微生物学和分子生物学方法用于产生和确认超级双元质粒pDAS5162，这是包含质粒pSB1和pDAB7691的共合体，以及超级双元质粒pDAS5848，这是包含质粒pSB1和pDAB100276的共合体。

实施例9

在玉米植物中生产DIG-109

农杆菌介导的玉米的转化来自Hi-II F1杂交(Armstrong et al.，1991)的种子平铺在含有95%的Metro-Mix 360无土培养基(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)和5%的粘壤土的混合物的5加仑罐中。植物在温室中生长，使用高压钠和金属氯化物灯以16小时光照:8小时黑暗的光周期的组合。进行控制下的近亲授粉以获得不成熟的F2胚用于转化。授粉后约10天后当不成熟的胚为1.0mm-2.0mm之间的大小时收获玉米穗。

感染和共培养。玉米穗脱壳并通过肥皂液擦洗来表面灭菌，浸没在20%商业漂白剂(含5%次氯酸钠)保持20分钟，然后用无菌水漂洗3次。包含pDAS5162的根瘤农杆菌细胞的悬浮液，具有编码DIG-109蛋白的基因和含有DSM2植物选择标记基因的超级双元质粒，通过转移1或2个循环的细菌[在含100mg/L壮观霉素，10mg/L四环素，和150mg/L链霉素的YEP固体培养基(g/L：细菌用酵母提取物，10；细菌用蛋白胨，10；NaCl，5；琼脂，15)上28°下生长2-3天]至5mL的含100μM乙酰丁香酮的液体感染培养基[LS Basal培养基(Linsmaier and Skoog，1965)，N6维生素(Chu et al.，1975)，1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，68.5g/L蔗糖，36.0g/L葡萄糖，6mM L-脯氨酸，pH 5.2]来准备。

可选地，包含pDAS5848的根瘤农杆菌细胞的悬浮液，具有编码DIG-109蛋白的基因和含有AAD-1植物选择标记基因的超级双元质粒，通过转移1或2个循环的如上所述生长的细菌至5mL的含100-200μM乙酰丁香酮的液体感染培养基来准备。

在两种情况下，溶液涡旋振荡直到形成均一的悬浮液，用Klett-Summerson色度计以紫色过滤器调节浓度至终浓度为200 Klett单位(对pDAS5162转化)，或光学浓度550nm处为1.2(对pDAS5848)转化。未成熟胚直接分离至含2mL感染培养基的微离心管中。移除培养基并用1mL的农杆菌溶液替换，农杆菌/胚溶液室温孵育5-10分钟。然后胚被转入含100μM乙酰丁香酮(对pDAS5162转化)或含100-200μM的乙酰丁香酮(对pDAS5848转化)的共培养基[LS Basal培养基，N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，30.0g/L蔗糖，6mML-脯氨酸，0.85mg/L AgNO₃，2.8g/L结冷胶(PhytoTechnology Laboratories，Lenexa，KS)，pH 5.8]，20°下黑暗中培养3-4天。

共培养之后，胚转移至含MS盐和维生素，6mM L-脯氨酸，100mg/L肌醇，500mg/L MES，30g/L蔗糖，1.5mg/L 2,4-D，0.85mg/LAgNO₃，250mg/L头孢噻肟(Cefotaxime)，2.8g/L结冷胶，pH 5.8的休眠培养基中。约7天后，胚转移至补充了3mg/L双丙氨膦(对pDAS5162转化)或补充了100nM吡氟氯禾灵(haloxyfop)(对pDAS5848转化)的相同培养基中(选择培养基)。约8周后转化的个体被鉴别出来并通过转移至新鲜筛选培养基2周时间来胀大从而再生和分析。

再生和种子产生。对于再生，培养物转移至补充了3mg/L双丙氨膦(对pDAS5162转化)或补充了100nM吡氟氯禾灵(对pDAS5848转化)的“28”诱导培养基(MS盐和维生素，30g/L蔗糖，5mg/L苄基氨基嘌呤，0.25mg/L 2，4-D，250mg/L头孢噻肟，2.5g/L结冷胶，pH 5.7)。低光照条件下(14μEm^-2s^-1)孵育1周，然后高光照条件下(约89μEm^-2s^-1)1周。组织随后转移至“36”重生培养基(与诱导培养基相同，除了缺乏植物生长调节因子)。当植物苗为3-5cm长时，将其转移至含SHGA培养基[(Schenk and Hildebrandt(1972)盐和维生素；PhytoTechnologies Labr.)，1.0g/L肌醇，10g/L蔗糖and 2.0g/L结冷胶，pH 5.8]的玻璃培养试管中以允许进一步的生长和芽和根的发育。植物被移植至于前文所述相同的土壤混合物中并在温室中生长至开花。进行控制的授粉以获得种子。

玉米转化领域的技术人员将理解其它方法对玉米转化和筛选转化植物也是可以的，当使用其它植物可表达的选择性标记基因(例如除草剂耐受基因)时。

实施例10

生产DIG-109蛋白的玉米植物的生物化学分析和昆虫生物分析

DIG-109蛋白在转基因玉米植物中的生产从植物幼苗(T0代)的叶提取的蛋白中检测。两片6mm直径的玉米叶圆片放置在深孔96集群试管箱(CostarCat#3957)的一个样品试管里，冷冻在-80°直到分析那天。这时候，两份4.5mm锌包被的Daisy^TM BB’s加入每个(冷冻)试管，连同200μL的提取缓冲液一起，所述缓冲液包含PBS(磷酸盐缓冲液；Fisher Cat#BP665-1)加0.05%吐温20。盖上每个试管，试管箱置于玻珠研磨机(Kleco^TM 4-96 Pulverizer；GarciaManufacturing，Visalia，CA)在最大设置下3分钟。研磨成粉的样品在2500xg下离心5分钟，含有可溶蛋白的上清液用于免疫分析。

提取的玉米叶蛋白的免疫印迹分析显示DIG152RPC1多克隆抗体不与从非转基因植物叶中提取的蛋白发生交叉反应。在pDAS5162转化的植物的提取物中，通过DIG152PRC1抗体检测到了几种蛋白种类。至少有4条主要的免疫反应条带被常规地检测到。很多情况下，能看到一个最大量的蛋白种类，其与对应于约70kDa蛋白的迁移率来移动。其它主要的蛋白种类具有估计为65kDa的分子大小(与实施例2中的Dpf108制备的DIG-152的胰蛋白酶限制肽相同)，60kDa和55kDa。当pDAS5162转基因玉米叶提取物用DIG-152多克隆抗体的免疫印迹检测时，一些植物中60kDa和55kDa的种类是最大量的。对于任何一种抗体，都只有少数植物具有全长DIG-109(130kDa)蛋白，并且，即使发现了，它也以非常次要的种类出现。

显然，尽管通过pDAS5162转化而引入玉米的转基因编码全长DIG-109蛋白，玉米细胞内的蛋白水解活性将初生的蛋白质加工为充足的稳定的小分子量种类。

从独立分离的用pDAS5162构建体转化的转基因玉米植物中收获的叶的昆虫毒性通过秋粘虫(FAW，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(J.E.Smith))的初生幼虫和Cry1F-抗性FAW(rFAW)的幼虫来进行体外检测。FAW卵从商业供应商(Benzon)获得，而rFAW卵来自专利权人的种群(Dow AgroSciences)。来自温室生长的T0植物在从实验室移植至温室约2周后的叶片段样品用于昆虫生物分析。每株植物的两片叶片(每片约1平方英寸)置于32孔盘(CDInternational)的分离的孔中，在约3mL的固体化2%琼脂上。卵在多种类鳞翅目食物(Southland Products)上孵化出，选择小于24小时的初生幼虫。每叶片段约10只幼虫被用驼毛刷小心放置在每孔中，侵染的盘用盘提供的带孔盖封闭，保持在28°，40%RH，16小时光照:8小时黑暗3天。测试结束时记录每个叶片的百分比伤害(%DAM)。平均伤害比率用于确定对每种类型的测试昆虫哪些植物具有最少的伤害。所有昆虫的测试重复数次。

数据用JMP统计软件(SAS，Cary，NC)分析，对每种昆虫类型，平均每种植物的%DAM分数。“Fit Y by X”模型用于单项ANOVA分析。需要分析每种处理的平均%DAM分数之间的显著差异时使用Tukey-Kramer均值分离。与从类似年龄的对照植物获得的%DAM分数进行了对比。阳性对照植物由商业上Herculex I^TM杂合体种子生长，其生产Cry1Fa B.t.毒素。阴性对照(即非转化植物)由Hi II和B104系以及一个Herculex I^TM变异系(所述Herculex I^TM杂合体的不含Cry的母本)代表。

图1总结了这些昆虫生物分析测试获得的结果。这是一个令人惊异的发现，即转基因叶中DIG-109的生产与%DAM比率之间的正相关性。对于FAW，F=35.3；d.f.=1，33；P<0.0001；r²=0.52，而对于rFAW，F=25.3；d.f.=1，33；P<0.0001；r²=0.43。进一步的惊人的和新颖的发现是，所有对Cry1FaB.t.毒素抗性的秋粘虫幼虫仍然被DIG-109B.t.毒素的进食所抑制。

应当理解玉米的其它昆虫害虫也可以以类似的方式进行测试。这些害虫包括，但不限于：Agromyza parvicornis(玉米杂交斑潜蝇)，Agrotis ipsilon(小地老虎)，Anticarsia gemmatalis(绒毛豆毛虫)，Diatraea grandiosella(西南玉米螟)，Diatraea saccharalis(甘蔗螟)，Elasmopalpus lignosellus(小玉米茎蛀虫)，Helicoverpa zea(玉米夜蛾)，Heliothis virescens(烟草夜蛾)，Ostrinianubilalis(欧洲玉米螟)，Cry1F-抗性O.nubilalis，Plutella xylostella(小菜蛾)，Cry1-抗性P.xylostella，Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)，和Trichoplusia ni(甘蓝银纹夜蛾)。

pDAS5848转化的转基因玉米植物(T0代)也通过昆虫生物分析和免疫分析进行检测。叶提取物中的DIG-109蛋白的量通过商业上可获得的Cry1CELISA检测试剂盒(Envirologix^TM，Portland，MA；Cat#AP007)来定量，检测的DIG-109蛋白的水平以百万分之几(ppm；1ppm表示提取物中每mg的总共可溶蛋白1ng的DIG-109蛋白)来表示。FAW和rFAW的食用伤害编码如下：0=无伤害或小孔的食用标记，1=25%-50%的叶片被吃，而2=几乎所有叶片被消耗或没有叶片剩余。被保护的植物是伤害值为0.67或更低的那些。

表9中的数据显示出T0植物中ELISA检测到的DIG-109蛋白的存在与体外生物分析中秋粘虫幼虫造成的食用伤害的控制之间有正相关性。具有最高检测水平的DIG-109蛋白的植物(植物5848-005.4)具有最低的叶进食伤害得分。来自具有190-230ppm范围的低水平的可检测DIG-109蛋白的叶片也受到更少的食用(feeding)伤害，相比于阴性对照植物(即，未转化对照B104和Hi II)的叶片锁观察到的，后者具有1.7或1.8的平均伤害得分。在所有检测的pDAS5848叶片中，检测到的主要DIG-109蛋白种类包含成对出现的大约60kDa和55kDa大小的肽。

表9.pDAS5848转化的转基因玉米叶中DIG-109蛋白的水平和秋粘虫食用伤害的降低。

^aNA=不适用；^bSD=平均值的标准偏差。

因此本发明具有这样的特点，玉米植物中生产的DIG-109蛋白使得植物对秋粘虫幼虫和Cry1F抗性秋粘虫幼虫的进食伤害有抗性。

实施例11

产生DIG-109蛋白的玉米植物的分子分析

组织提取。Tissue extraction.从pDAS5162和pDAS5848转化的T0转基因玉米植物的叶片中分离基因组DNA。组织样品收集在96孔收集板(Qiagen，Cat.#19560)中并冻干2天。用实施例10描述的Klecko^TM组织粉碎器和钨珠破碎组织。对于水解探针(HP)分析，用DNeasy^TM 96 Plant kit(Qiagen)根据生产商建议的流程以高通量形式分离基因组DNA。对于DNA印迹分析，用Murrayand Thompson(1980)的CTAB DNA提取流程的改变方法的高通量形式分离基因组DNA。Murray，M.G.，Thompson，W.F.(1980)Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA，Nucl.Acids Res.8:4321-4325。

从任何一个流程提取的DNA用Quant-IT Pico Green DNA分析试剂盒(Molecular Probes，Invitrogen Catalog#P7589)定量化。在该步骤中，未知的88个样品置于96孔板中，其中第一列包含2倍连续稀释的标准液，从20ng/μL至1.25ng/μL范围，加缓冲液空白，水空白和空孔。测试DNA样品，5μL的1:5和1:40稀释液(取决于期望的初始浓度)，随后与合适的稀释的、缓冲液的染料混合，在105μL反应中黑暗下孵育10分钟。孵育之后，荧光用Synergy2平板计数器(BioTek，Winooski，VT)记录。根据标准曲线校正背景荧光后评估基因组DNA浓度。

DNA印迹制备来自pDAS5848转化的玉米系的10μg基因组DNA用限制性酶Bsm I在37°下消化过夜。消化过的DNA样品片段通过凝胶电泳以(SAS，Cary，NC)1%琼脂糖凝胶分离，并转移至尼龙膜(INYC000I0IMMOBILON-NY+，Millipore)。DNA印迹与地高辛标记(DIG PCR ProbeSynthesis Kit；Roche Applied Science，Indianapolis，IN)的对应于SEQ ID NO:8的251-630碱基的PCR扩增的探针杂交。杂交和检测根据供应商的流程来进行。通过DNA印迹分析确认具有单一拷贝的DIG-109编码基因的来自pDAS5848转化系的DNA用作定量化PCR拷贝数分析的参考对照。

水解探针分析由水解探针(HP)分析测定的转基因拷贝数通过实时PCR来确认，使用

系统(Roche Applied Science)。

探针设计软件v 2.0用于设计检测下列基因的分析：DSM2和AAD-1选择标签基因，GLP1(玉米萌发样蛋白；GenBank Accession AY394010)和INV(玉米转化酶；GenBank Accession U16123)参考基因，以及DIG-109编码基因。对于扩增，在含0.4μM的每种引物和0.2μM的每种探针的10μL体积混合反应液中以1x终浓度制备

Probes Master Mix(寡核苷酸和荧光标签的序列列于表10)。进行2步扩增反应，56°延伸40秒以获得荧光。所有样品以三份进行，平均Ct值用于分类每种样品。

表10.用于水解探针(HP)PCR分析的寡核苷酸。

^aAAD1探针是由ABI(Invitrogen)提供的

MGB探针

DSM2的HP分析在36份pDAS5162转化系上完成。在样品的95%(34个事件)上检测到简单整合事件，定义为基因的1-2个拷贝。

AAD-1和DIG-109的HP分析在13份pDAS5848转化系上完成。在AAD-1样品的93%(12个事件)和DIG-109的54%(7个系)上检测到简单整合事件。这些系(7个系)的54%包含两个基因的简单整合事件。

实施例12

玉米DIG-109截短种类的生物化学表征

对从pDAS5162转化的T0玉米植物的叶中提取的蛋白进行了更详细的分析。用DIG152RPC1多克隆抗体作为探针进行的蛋白提取物的免疫印迹显示出5种DIG-109蛋白种类。基于这些肽的相对移动速率，指示出以下区别：种类1对应于SEQ ID NO:5所示的全长的DIG-109(130kDa)蛋白；种类2对应于一个70kDa DIG-109产物。在表达编码全长DIG-152蛋白的基因的细菌细胞的提取物中发现了同样移动速率的肽。这些大约70kDa片段的产生指示出暴露于玉米和细菌中均发现的蛋白酶的全长蛋白的主要切断位点。种类3大小上对应于DIG-152的胰蛋白酶限制的肽，如实施例2所制备的，并具有约65kDa的大小；种类4对应于约60kDa的截短的DIG-109产物；种类5对应于大约55kDa的截短的DIG-109产物。大约70kDa，60kDa和55kDa的肽在实施例14中进一步表征。

实施例13

设计编码DIG-109变体的基因和结构域Iα-螺旋的缺失

为了促进DIG-109蛋白的杀虫特性，进行了连续的、逐步的缺失，每次移除SEQ ID NO:5公开的DIG-109蛋白的N-端的部分。这些缺失移除了结构域I中部分或全部的α-螺旋1和部分或全部的α-螺旋2，同时保留α-螺旋3至α-螺旋7的结构完整性。通过比较Cry1Ca核心毒素氨基酸序列与Cry1Aa蛋白的氨基酸序列(GenBank Accession No.AAA22353)，我们已经推论出Cry1Ca核心毒素的结构域I中α-螺旋1，α-螺旋2A，α-螺旋2B，α-螺旋3和α-螺旋4的起始和终止位点，以及它们之间的空隙区域的位置，使用该对比对象是因为其结构是已知的[RCBS Protein Structure Database Number:CRYIA(A)；Grochulski et al.，(1995)]。这些位点描述于表1。

在设计N-端缺失突变体的编码序列时，将一个编码蛋氨酸的ATG起始密码子插入设计为表达所述缺失突变体的核苷酸序列的5’端。对于设计为用于转基因植物中的序列，最好根据Varshavsky(1997)的“N-端法则”来粘合。其教导某些氨基酸当其作为蛋白质的N-端残基时可以为蛋白在真核细胞中的不稳定性和降解做出贡献。例如，由酵母和哺乳动物细胞收集的数据显示N-端不稳定氨基酸残基是F，L，W，Y，R，K，H，I，N，Q，D，E和可能的P。尽管特定蛋白的降解机制可以在物种之间有所不同，上文所述的N-端不稳定氨基酸的同一性的保守性暗示了类似的机制可能在植物细胞中起作用。例如，Worley et al.，(1998)发现在植物中，N-端法则包括碱性和芳香残基。很可能在B.t.杀虫蛋白对象的α-螺旋3的起始点附近植物蛋白酶的蛋白水解切断可以暴露不稳定N-端氨基酸。这样的过程可以导致切断的蛋白质的快速衰变并限制B.t.杀虫蛋白积累至足以有效控制昆虫的水平。从而，对于由一个不稳定氨基酸起始的N-端缺失突变体，申请人优选在翻译起始的蛋氨酸和不稳定氨基酸之间增加指定一个G(甘氨酸)氨基酸的密码子。

如下所述来设计缺失。该实例利用编码全长1164个氨基酸的嵌合DIG-109蛋白(即，SEQ ID NO:5)的玉米密码子优化的全长3492 bp DNA序列(即，SEQ ID NO:8)以示意65个特定变体的设计原则。本领域技术人员将认识到编码Cry1Ca核心毒素片段的全部或N-端部分的其它DNA序列可以类似地处理以达到预期的结果。为了设计第一缺失变体编码序列，所有编码α-螺旋1的碱基，包括α-螺旋2A起始点附近的缬氨酸(即，SEQ ID NO:5的全长DIG-109蛋白的V51)的密码子，均被移除。从而，SEQ ID NO:8的1到153位的碱基的删除移除了SEQ ID NO:5的1至51位氨基酸的编码序列。在起始点(即，在对应于全长蛋白的52位氨基酸的密码子的前面)重新引入一个翻译起始ATG(蛋氨酸)，这为缺失变体编码序列提供了编码序列，包含一个3342个碱基的开放阅读框，其编码一个包含1114个氨基酸的DIG-109蛋白的缺失变体(即，蛋氨酸加全长DIG-109蛋白的52-1164位氨基酸)。连续的、逐步的缺失，其移除对应于SEQ ID NO:5的全长DIG-105蛋白的残基52-91的单个氨基酸的额外密码子，提供了缺少部分或全部的α-螺旋2A和α-螺旋2B的变体。这样，第二个设计的缺失变体编码序列要求消除SEQ ID NO:8的碱基1-156，从而移除氨基酸1-52的编码序列。功能性开放阅读框的恢复再次通过在保留的编码序列的起始处重新引入翻译起始蛋氨酸密码子来实现，因而提供了第二个缺失突变体编码序列，其具有3339个碱基的开放阅读框并编码包含1113个氨基酸的DIG-109蛋白的缺失变体(即，蛋氨酸加全长DIG-109蛋白的53-1164位氨基酸)。最后设计的缺失变体编码序列需要移除SEQ ID NO:8的碱基1-273，这样消除了氨基酸1-91的编码序列，并且，在重新引入翻译起始蛋氨酸密码子之后，提供了具有3222个碱基的开放阅读框的缺失变体编码序列，其编码1074个氨基酸的DIG-109蛋白缺失变体(即，蛋氨酸加全长DIG-109蛋白的92-1164位氨基酸)。如示例所示，消除缺失序列之后，在保留的编码序列的起始点添加一个起始蛋氨酸密码子以恢复功能性开放阅读框。如前所述，一个额外的甘氨酸密码子将被添加在蛋氨酸密码子和不稳定性确定的氨基酸的密码子之间，以防止缺失序列的全长蛋白的保留部分的N-端暴露的是一个前文所提供的不稳定性确定的氨基酸。

表11描述了依照上文描述的策略设计的特定变体。

表11.SEQ ID NO:5的全长DIG-109蛋白的缺失变体蛋白序列。

编码表11中描述的DIG-109蛋白变体的其它核酸依照倾向于植物中表达的合成性基因的常规原理来设计，如实施例6所教导。

实施例14

设计其它的DIG-109变体

如实施例12所公开，包含全长DIG-109蛋白的初始翻译产物在植物中被处理至各种程度，其中一个产物对应于65kDa的胰蛋白酶截短的核心毒素肽。该核心毒素被认为是结合昆虫中肠的受体并导致中毒的毒素的活性形式。胰蛋白酶是内肽酶，其在精氨酸(R)或赖氨酸(K)残基的C-端侧切割蛋白。因此，玉米中观察到的65kDa DIG-109肽可能对应于由玉米的胰蛋白酶类似蛋白酶在SEQ ID NO:5的残基R28和R628之后切割所产生的65kDa片段。注意到这个65kDa核心毒素肽可能包含SEQ ID NO:1的Cry1Ca核心毒素片段的氨基酸28-619和SEQ ID NO:4的Cry1Ab原毒素片段的氨基酸1-9。但是，应当理解，65kDa的截短产物，或在转基因玉米中观察到并在下文讨论的其它截短产物的精确C-端，并未经试验验证。因此，本文讨论的DIG-109变体蛋白的设计试图是示意性的，保留杀虫活性的其它DIG-109截短变体蛋白也在本发明的范围内。

大多数转基因玉米植物中显示的DIG-109肽产物的浓度被确定为大约200ppm。因此，能够从植物组织手工纯化并确定这些DIG-109肽的氨基酸序列的材料是不充足的。通过使用不同蛋白酶切断全长DIG-152蛋白而产生了与玉米中探测到的截短蛋白在大小上类似的替代肽。

70kDa肽的身份。荧光假单胞菌(Pf)中作为包涵体产生的全长DIG-152的SDS-PAGE图解显示大量蛋白具有看起来70kDa的分子量，并对胰蛋白酶是相对稳定的。通过阴离子交换和大小排阻色谱的结合从溶解的全长DIG-152包涵体中纯化之后，该肽在SDS-PAGE上具有与从转基因玉米植物提取物中检测到的约70kDa的DIG-109肽相同的迁移率。两种肽均被针对DIG-152的多克隆抗体识别，而且Pf-生产的肽的氨基酸分析鉴定出MDNNP作为其N-端序列(DIG-109，SEQ ID NO:5的残基1-5)。因此该70kDa肽含有全长DIG-109蛋白的自身N-端。胰蛋白酶在推定核心毒素C-端切割位点(R628)的切断，同时留下完整的最先28个残基，后者被通过胰蛋白酶在R28位的切断特征性地从DIG-109蛋白上移除从而产生核心毒素，产生了具有计算的大小为70.5kDa的肽(包含DIG-109的残基1-628)，与从Pf包涵体分离的和在转基因玉米植物中检测到的DIG-152肽几乎不能区别。因而，这个70kDa蛋白的身份被认为对应于包含氨基酸1-628的截短的DIG-109肽。

60dDa和55kDa肽的身份。发现pDAS5162和pDAS5848转化的玉米植物也产生对应于60kDa和55kDa的迁移率的DIG-109衍生蛋白。这些大小的肽在实验上通过首先用胰蛋白酶切断全长DIG-152蛋白然后用胰凝乳蛋白酶处理胰蛋白酶切断的产物而产生。[全长DIG-152蛋白用胰凝乳蛋白酶单独处理导致稍微大于60kDa的多种截短产物。]大量制备胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶切断产物然后通过阴离子交换色谱然后Superose 200大小排阻色谱来纯化。在大小排阻色谱步骤中观察到3个主要的峰，在12.5mL，18.3mL，和20mL收集体积处洗脱。第一个主要峰(12.5mL)包含高分子量(700kDa至1000kDa)的DIG-152蛋白集合，而第三个主要峰(20mL)包含过量的胰凝乳蛋白酶。12.5mL部分也含有这样的条带，其具有对应于DIG-152的65kDa和60kDa产物的迁移率；因此显示出DIG-152衍生肽的寡聚和聚集是可逆的。

18.3mL峰的蛋白，与仅胰蛋白酶切断的DIG-152蛋白一起，通过SDS-PAGE在还原和变性条件下进行分析。这些蛋白包含两种主要种类，具有对应于60kDa和55kDa的迁移率。也观察到更小的14kDa和9kDa的蛋白并鉴别为胰凝乳蛋白酶，其似乎在纯化期间结合至DIG-152肽上。另外，观察到具有对应于240kDa的迁移率的高分子量条带。该条带的蛋白被DIG152RPC1抗体识别，证明其最可能是DIG-152切断产物的寡聚体(四聚体)。

通过SDS-PAGE分离DIG-109生产植物的提取物中的蛋白，然后电印迹至硝化纤维上，与纯化样品一起，胰蛋白酶切断的DIG-152和用胰蛋白酶然后胰凝乳蛋白酶切断的DIG-152蛋白。通过初级DIG152RPC1兔抗体和次级抗-兔辣根过氧化物酶标记的抗体引发的增强化学发光显示出对应于DIG-109或DIG-152肽的条带。胰蛋白酶处理的DIG-152样品在约65kDa迁移率处展现出单一的条带。来自DIG-109肽生产植物的提取物展现出4个条带：一个对应于130kDa的迁移率，(代表全长DIG-109蛋白)，对应于60kDa和55kDa的迁移率的条带，和一个对应于约20kDa的迁移率的条带。没有进一步表征DIG-109的20kDa的切断产物。用胰蛋白酶然后胰凝乳蛋白酶处理的DIG-152蛋白展现出2个条带，具有对应于约60kDa和55kDa的迁移率，与植物提取物中观察到的60kDa和55kDa一起移动。在胰蛋白酶然后胰凝乳蛋白酶处理的DIG-152蛋白样品中也有一个大分子量的条带，具有对应于约240kDa的迁移率。

因此，玉米中生产的DIG-109的主要切断产物在大小上对应于全长DIG-152蛋白首先用胰蛋白酶切断、然后进一步用胰凝乳蛋白酶切断后获得的2个产物。酶处理产生的60kDa和55kDa肽的最先5个N-端残基均被确定为DAFLV(对应于SEQ ID NO:5的DIG-109蛋白的残基74-78)。注意到全长DIG-109蛋白在W73之后的切断导致移除了α-螺旋1，α-螺旋2A和部分的α-螺旋2B(表1)。

进一步注意到，由于60kDa和55kDa肽两者均具有同样的N-端序列，在较小(55kDa)肽的产生中被移除的5kDa片段一定代表着60kDa肽的C-末端的进一步移除。

由pDAS5162和pDAS5848转化的玉米植物产生的5种主要的DIG-109肽的推定氨基酸坐标总结在表12。这些种类的精确C-端并未确定。注意到60kDa的种类4在R568之后经胰蛋白酶切断将产生56kDa的肽，(即，与种类5接近)。

表12.由DIG-109和DIG-152蛋白衍生的加工肽的推定身份。根据凝胶的大致分子量推断了大致的C-端位置。氨基酸数是包含在内的。

DIG-109或DIG-152肽	SEQ ID NO:5的残基
		种类1(130kDa)	1-1164(计算的MW 131.7)
种类2(70kDa)	1-628(计算的MW 70.59)
		种类3(胰蛋白酶产生的核心；65kDa)	28-628(600个残基，计算的MW 67.4)
种类4(60kDa)	74-628(555个残基，计算的MW 62.7)
		种类5(55kDa)	74-568(495个残基，计算的MW 56.1)

设计DIG-109截短变体。如表1中所展示，DIG-109核心毒素的α-螺旋1至α-螺旋4存在于DIG-109蛋白的最先145个氨基酸残基内。DIG-109核心毒素的N-末端的第一个潜在位点的切断(DIG-109的R87；核心毒素的R39)将从DIG-109核心中移除59个氨基酸，并产生具有61.02kDa分子量的蛋白，具有α-螺旋1，α-螺旋2A，和α-螺旋2B的移除。Cry1Ab的α-螺旋1的移除已经牵连于允许蛋白初始结合于钙粘蛋白受体的旁路，导致形成寡聚前-核心结构，之后插入昆虫中肠细胞膜并最终导致孔的形成。根据类似的研究，预测移除胰蛋白酶截短的DIG-109核心的N-端部分，导致失去α-螺旋1，是允许寡聚体形成和结合至次级氨肽酶N受体并导致功能性孔的形成所需要的。因此，植物中DIG-109蛋白以这种方式切断可以导致被昆虫摄取的DIG-109毒素肽提供结合至钙粘蛋白受体的需求的旁路。这样的效果已经显示导致具有变异的钙粘蛋白受体蛋白的昆虫中对Bt蛋白中毒的克服性抗性。

pDAS5162和pDAS5848转基因玉米植物中发现的较小的肽(60kDa和55kDa)可能代表胰蛋白酶类似蛋白酶的进一步切断的产物。由于这些肽仅比65kDa的核心肽小5kDa至10kDa，这样的进一步切断可以从核心毒素的任意一段移除少于总共约80个残基。在DIG-109蛋白的N-端的最先130个残基之内，潜在的胰蛋白酶切断位点位于R28(核心毒素的R-1)，R87(核心毒素的R59)，R93(核心毒素的R65)，K115(核心毒素的K87)，K122(核心毒素的K94)，R127(核心毒素的R99)，和R129(核心毒素的R101)。在核心毒素的C-端的最后100个残基之内，潜在的胰蛋白酶切断位点位于R530(核心毒素的R502)，R533(核心毒素的R505)，K557(核心毒素的K529)，R568(核心毒素的R540)，R571(核心毒素的R543)，R582(核心毒素的R554)，和K610(核心毒素的K582)。

利用上述鉴定的潜在蛋白酶切割位点的位置作为引导，SEQ ID NO:8公开的玉米优化的DIG-109编码序列衍生的DNA序列设计为遗传编码截短的DIG-109蛋白变体。实施例13所公开的在截短的编码序列之前添加5’端蛋氨酸和甘氨酸密码子的指导方针在这些构建提中仍然使用。第一个这样的实施方式，DIG-110，如SEQ ID NO:27所公开，包含DIG-109蛋白的氨基酸88-1164，和N-端添加的蛋氨酸和甘氨酸。编码DIG-110的玉米优化的DNA序列作为SEQ ID NO:28公开。第二个实施方式，DIG-111，如SEQ ID NO:29所公开，包含DIG-109蛋白的氨基酸88-628，和N-端添加的蛋氨酸和甘氨酸。编码DIG-111的玉米优化的DNA序列作为SEQ ID NO:30公开。第三个实施方式，DIG-112，如SEQ ID NO:31所公开，包含DIG-109蛋白的氨基酸123-1164，和N-端添加的蛋氨酸和甘氨酸。编码DIG-112的玉米优化的DNA序列作为SEQID NO:32公开。第四个实施方式，DIG-113，如SEQ ID NO:33所公开，包含DIG-109蛋白的氨基酸123-628，和N-端添加的蛋氨酸和甘氨酸。编码DIG-113的玉米优化的DNA序列作为SEQ ID NO:34公开。第五个实施方式，DIG-114，如SEQ ID NO:35所公开，包含DIG-109蛋白的氨基酸1-582。编码DIG-114的玉米优化的DNA序列作为SEQ ID NO:36公开。

应当注意DIG-110和DIG-112蛋白包括SEQ ID NO:4公开的Cry1Ab原毒素片段。据认为这个C-端原毒素片段可能在一些情况下起着使蛋白质在植物中稳定或使其可溶的功能。DIG-110的R543胰蛋白酶位点的切断，从而移除原毒素片段的大部分，将产生计算大小为61.2kDa的肽，该大小与pDAS5162和pDAS5848转化的玉米植物中观察到的60kDa DIG-109截短肽非常接近。DIG-111蛋白(其缺少所有Cry1Ab原毒素片段除了最先的9个氨基酸)包含DIG-110的能通过这样的切断而产生的片段(即，DIG-110的氨基酸1-543，计算大小为61.2kDa)。

类似地，DIG-112的相似的R508位点的切断将产生计算大小为57.2kDa的肽，该大小与pDAS5162和pDAS5848转化的玉米植物中观察到的55kDaDIG-109截短肽非常接近。DIG-113蛋白(其缺少所有Cry1Ab原毒素片段除了最先的9个氨基酸)包含DIG-112的能通过这样的切断而产生的片段(即，DIG-112的氨基酸1-508，计算大小为57.2kDa)。

DIG-114蛋白保留了DIG-109蛋白的氨基酸1-28(这些残基可以在植物中或在昆虫中肠中酶移除)和并终止于DIG-109蛋白的R582处的潜在胰蛋白酶切断位点。从而该DIG-109变体可以以65.7kDa蛋白或62.2肽存在，取决于N-端28个氨基酸是否被体内移除。

通过本文公开的原则而设计了额外的玉米优化的编码序列以编码进一步的DIG-109蛋白变体。

实施例15

构建编码DIG-109和DIG-109变体蛋白的表达质粒并在假单胞菌中表达

标准克隆方法[描述于例如Sambrook et al.，(1989)和Ausubel et al.，(1995)，及其更新]被用于构建荧光假单胞菌(Pf)表达构建体，后者被加工为产生DIG-109蛋白或DIG-110，DIG-111，DIG-112，DIG-113，或DIG-114蛋白(统称为DIG-109变体蛋白)。蛋白表达在荧光假单胞菌MB214(菌株MB101的衍生物；荧光假单胞菌的生物变型I)中进行，该菌株具有插入的修饰的lac操纵子，如US专利号5169760所描述。基本的克隆策略包括亚克隆编码DIG-109或DIG-109变体蛋白的DNA片段至质粒pDOW1169中，并置于来自质粒pKK223-3(PL Pharmacia，Milwaukee，WI)的Ptac启动子和rrnBT1T2终止子的表达控制之下。pDOW1169是中等拷贝质粒，具有RSF1010复制起始点，pyrF基因，和核糖体结合位点，之后是限制性酶识别位点，含有蛋白编码区域的DNA片段可以被引入其中(US专利申请号20080193974)。这个表达治理被通过电穿孔转化进入DC454(接近野生型的荧光假单胞菌菌株，具有突变ΔpyrF和lsc::lacI^QI)，或其衍生物，在SOC-大豆水解物培养基中复苏，平铺于选择培养基(M9葡萄糖琼脂缺少尿嘧啶，Sambrook et al.，supra)。微生物学操作的细节参见Squires et al.，(2004)，US专利申请号20060008877，US专利申请号20080193974，和US专利申请号20080058262，并入本文作为参考。克隆首先通过PCR来筛选，阳性克隆随后通过限制性消化小量质粒DNA来分析。所选包含插入物的克隆的质粒DNA通过联系商业测序供应商例如MWGBiotech (Huntsville，AL)来测序。用Sequencher^TM软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)组装并分析序列。

摇瓶中的生长和表达分析用于表征和昆虫生物分析的DIG-109蛋白或DIG-109变体蛋白的生产通过摇瓶生长的包含合适的表达质粒的荧光假单胞菌菌株来完成。DIG-109蛋白或DIG-109变体蛋白的生产由Ptac启动子驱动，并如先前的US专利号5527883描述的那样来操作。摇瓶30℃起始培养24小时后通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。培养物在诱导时和诱导后不同的时间取样。通过在600nm的光密度(OD600)来测量细胞密度。在每个时间点，样品的细胞密度调节至OD₆₀₀=20，1mL分量在14000xg下离心5分钟。细胞小块在-80°下冷冻。

实施例16

生产DIG-109和DIG-109变体蛋白的假单胞菌的摇瓶培养样品的细胞分部与SDS-PAGE分析

来自冷冻的摇瓶培养细胞小块样品的可溶和不溶部分用EasyLyse^TM细菌蛋白提取溶液(

Biotechnologies，Madison，WI)来产生。使用实施例2公开的方法和指导方针。

实施例17

荧光假单胞菌中生产的DIG-109变体蛋白的杀虫活性

DIG-109变体蛋白的杀虫活性在鳞翅目物种上验证，包括欧洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis(Hübner))，cry1F-抗性ECB(rECB)，棉铃虫(CEW；Helicoverpa zea(Boddie))，小地老虎(BCW；Agrotis ipsilon(Hufnagel))，秋粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda(J.E.Smith))，Cry1F-抗性FAW(rFAW)，西南玉米螟(SWCB，Diatraea grandiosella)，蔗糖螟(SCB；Diatraeasaccharalis)和Cry1Ab-抗性SCB(rSCB)。

遵从实施例3和实施例4公开的方法、指导方针和数据处理来进行。

实施例18

包含编码DIG-109变体蛋白的植物可表达基因的植物转化载体的构建

农杆菌超级双元系统(Japan Tobacco，Tokyo，JP)被便利地用于单子叶植物宿主的转化。植物表达载体的构建，以及超级双元质粒的产生和其确认通过实施例7和实施例8公开的方法来进行。pSB11衍生质粒的T-DNA组分的物理排列简要示意如下：

RB>玉米 Ubi1 启动子:DIG-109 变体 CDS:玉米 Per5 3'UTR>水稻 Act1 启动子:DSM2 CDS:玉米 Lip 3'UTR>LB，or

RB>玉米 Ubi1 启动子:DIG-109 变体 CDS:玉米 Per5 3'UTR>玉米 Ubi1 启动子:AAD-1 CDS:玉米 Lip 3'UTR>LB

实施例19

玉米植物中生产DIG-109蛋白变体

农杆菌介导的玉米的转化生产DIG109变体蛋白的转基因玉米植物通过实施例9公开的方法来产生。

实施例20

表达编码DIG-109变体蛋白的基因的转基因玉米植物的生物化学和分子分析以及昆虫生物分析

具有和表达编码DIG-109变体蛋白的基因的转基因玉米植物生产的DIG-109变体蛋白的生物化学表征通过实施例10和实施例12的方法和试剂来操作。编码DIG-109变体蛋白的基因的转基因分析根据实施例11公开的方法和试剂来进行。源自具有并表达编码DIG-109变体蛋白的基因的转基因玉米植物的叶片的昆虫生物分析通过实施例10公开的方法来操作。