CN1281371A - 获得用于预防与逆转录病毒感染有关的致病作用的疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于获得对抗与逆转录病毒所致的宿主感染有关的致病作用的疫苗的方法,在本发明中,逆转录病毒的靶细胞具有宿主蛋白的膜受体,这种病毒感染诱导直接对抗病毒的包膜蛋白和宿主蛋白的免疫应答。本方法包括以修饰形式的多肽为基础制备疫苗试剂,因此这种疫苗试剂可诱导直接对抗包膜蛋白、但不对抗宿主蛋白的免疫应答,所述多肽包括逆转录病毒包膜蛋白的优势免疫区和保护区的片段。
Description
本发明涉及获得用于预防人和脊椎动物中与逆转录病毒感染有关的致病作用的疫苗的方法。
与逆转录病毒感染有关的致病作用是有害的，包括可能出现的致癌作用或免疫抑制作用，它是通过逆转录病毒引入宿主(哺乳动物、鸟或者鱼)体内、然后侵入，并且上述逆转录病毒再在作为逆转录病毒的靶细胞的宿主细胞中复制而诱导的，也即是说这种细胞是病毒能够侵入的细胞。
由于逆转录病毒通过叫做逆转录酶的这种酶将RNA转录为DNA，由此而得名，而在生物中，遗传信息通常是通过信使RNA由染色体的DNA传递给蛋白质的。
在逆转录病毒的家族中，可以分为三个亚族：肿瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。
肿瘤病毒是因其与癌症和恶性感染有关而被命名的逆转录病毒。例如，致白血病的病毒(如禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MULV)、也叫做Moloney病毒、猫白血病病毒(FELV)、人白血病病毒如HTLV1和HTLV2、猴白血病病毒或STLV、牛白血病病毒或BLV)，灵长类D型肿瘤病毒、B型肿瘤病毒，它们是哺乳动物肿瘤的诱导物，或者导致迅速发展的癌症的肿瘤病毒(如Rous肉瘤病毒或RSV)；参见如STEHELIN等，《分子生物学杂志》101：349-365(1976)。
慢病毒是因其与发展缓慢的疾病有关而命名的，这类病毒频繁参与免疫抑制现象，包括AIDS。
附表1通过举例列出了与某些慢病毒相关的疾病，以及这些慢病毒的主要靶细胞。
泡沫病毒对给出的细胞型或种具有极低的特异性，它们有时与免疫抑制现象有关；对于这种情形，例如有猴泡沫病毒(或SFV)。
本发明的一个目的是开发预防与逆转录病毒所致的宿主生物体感染有关的致病作用的方法和疫苗产品，其中的致病作用包括致癌作用或免疫抑制作用。
对于大多数逆转录病毒而言，已经观察到与感染有关的免疫抑制作用，可以将其视为逆转录病毒感染的致病常数；参见BENDINELLI等，《癌症研究进展》45：125-181(1985)。这种情形尤见于慢病毒感染。在相当多的肿瘤病毒感染时也有这种情况；参见例如P.SONIGO所著的“SIDA和VIH感染”[AIDS和HIV感染]一书、MONTAGNIER等(Medecine Science Flammarion)，113-122页(1989)。
已经对许多人和动物的疫苗进行了预防逆转录病毒感染的致病作用的测试，但一般说来，这些疫苗不是十分有效或者无效。尤其是，在人或动物AIDS领域内观察到，在发现HIV病毒后14年(BARRE-SINOUSSI等，《科学》220：868-871，1983)仍无法找到能够有效地阻止疫苗后HIV或SIV的疫苗；参见例如LINHART等，《AIDS研究和人逆转录病毒》13：593-599(1997)；VOGT等，《疫苗》13：202-208(1995)；和LETVIN等《病毒学杂志》69：4569-4571(1995)。
所用的大多数疫苗制剂包括各种形式的逆转录病毒包膜的蛋白质，如失活的病毒、HIV蛋白的gp120和gp160之类的包膜蛋白(参见特别是GORSE，G.J.,《疫苗》10：383-388，1992)、含包膜蛋白的病毒核心、或与各种载体有关的包膜蛋白(嵌合蛋白、细菌)；参见Levy J.A.,《Trans医学回顾》2：265-271，1988和《微生物学回顾》57：183-289，1993，尤其是第247页。
其它制剂使用了来源于包膜糖蛋白的逆转录病毒的包膜或优势免疫肽的片段，这些肽以各种形式出现(脂肽、与支持蛋白连接的肽)以便使它们具有免疫原性；参见特别是Eriksson等《疫苗》11：859-865(1993)。
通常所述的疫苗方案是，例如在人、猴或猫AIDS领域内，建议不修饰包膜蛋白的保守表位和优势免疫表位，这或许是完全合理的。实际上，一方面，这些保守表位是不同病毒株共有的，这对必须诱导直接对抗大多数毒株的免疫应答的疫苗制剂是有利的。另一方面，这些优势免疫表位很易被疫苗处理和感染过程中的细胞免疫系统或体液免疫系统识别，然而，它们常常代表中和位点；参见如HO等《病毒学杂志》61：2024-2028(1987)；JOHNSON等，《实验医学杂志》175：961-971(1992)；SHAFFERMAN等，P.N.A.S，美国88：7126-7130(1991)；和HAMMOND等，《免疫学杂志》146：1470-1477(1991)。
对比之下，为了获得有效的疫苗，本发明方法包括修饰病毒包膜的某些蛋白质的保守表位和优势免疫表位。
实际上，本发明人已发现逆转录病毒的包膜的保守区域和优势免疫区域可导致有害的自动免疫现象。举例来说，在人AIDS中，他们观察到HIV包膜的某些保守区域和优势免疫区域具有三维结构类似物和/或与人免疫系统的至少一种蛋白质的某些区域的交叉反应，因此，将含上述完整区域的病毒蛋白质作为疫苗给药时，可诱导导致有害的自身免疫反应的免疫应答，从而使得疫苗无效。
在本发明初期，一方面是观察到如上所述，即通常存在于疫苗制剂中的某些逆转录病毒的保守区和优势免疫区在许多情况下是确定的区域，由于这些区域具有三维结构类似物和/或与病毒的宿主的某些蛋白发生交叉反应的特性，因此可引起有害的自身免疫反应。在本发明初期，另一方面是观察到上述宿主的蛋白用同一靶细胞或同种靶细胞作为上述逆转录病毒。本发明人所进行的所有这些观察使他们萌生了如下想法：具有三维结构类似物和/或交叉反应的逆转录包膜蛋白和宿主蛋白在多数情况下可与同种靶细胞结合，且在这些靶细胞中存在共同的膜受体。
一般认为，当通过采用上述一种蛋白进行体内或体外免疫接种可获得直接对抗其它蛋白的免疫应答时，则这些蛋白具有与另一蛋白的交叉反应性，例如，当根据已知的检测T型免疫应答的实验如体外细胞毒性实验，这种免疫接种诱导了一种(叫做B型)体液应答、并且可使之获得和选择至少一种能够识别其它蛋白的单克隆抗体时，或者当体外一种蛋白诱导的同样的细胞免疫应答(也即是T型)可识别两种蛋白时。已知的是，“免疫接种”一词是指通过将宿主的免疫活性细胞与抗原在体内或体外进行接触、经此刺激后免疫应答的诱导过程，给予疫苗试剂的目的之一是为了准确地获得这种免疫接种。
因此本发明的主题是提供一种获得对抗与逆转录病毒所致的动物或人宿主感染有关的致病作用的疫苗的方法，这种逆转录病毒能侵入上述宿主的靶细胞，该靶细胞具有上述宿主蛋白的膜受体，在此方法中，以多肽为基础制备疫苗试剂，该多肽包括上述逆转录病毒的致病株的至少部分包膜蛋白，其中将上述多肽制备成修饰形式，可以理解为：
-上述部分包膜蛋白是选自那些包括上述包膜蛋白的优势免疫区的至少一个片段者，所述片段含有至少一种氨基酸，它是上述优势免疫区的一种保守氨基酸，并且存在于上述致病株中；
-上述多肽，呈非修饰形式，诱导直接对抗上述优势免疫区和宿主蛋白两者的免疫应答；
-上述修饰多肽选自[原文如此]那些诱导直接对抗上述包膜蛋白的优势免疫区、但不对抗宿主蛋白的免疫应答的多肽。
在刚才所给出的本发明方法的定义中，认为疫苗试剂是“基于”修饰多肽。这意味着疫苗试剂包括这种修饰多肽，但并不意味疫苗试剂必需一类专有的多肽性质。事实上，在这种疫苗试剂中，上述多肽可以任意与任何生物可溶性分子、按本身已知的方式结合(尤其是共价键合)或缔合，其中生物可溶性分子可选自，例如聚合物、脂类、肽(包括脂肽、糖肽、蛋白质)、核酸、寡糖等等。上述生物可溶性分子尤其可用作多肽免疫原性试剂的载体。它也可用于修饰多肽的构象，在后一种情况中，所述的分子应被视为修饰其所连接的氨基酸残基的取代基，上述取代基由此而发生了修饰，最后分析中，氨基酸残基的多肽的抗原性只是一部分。
在初期研究时，本发明方法至少可包括选择多肽(未修饰的)的步骤，如上所述，这种多肽包含逆转录病毒的致病株的至少部分病毒包膜蛋白。这种包括优势免疫区的至少一个免疫原性片段的蛋白部分，即是指能诱导直接对抗病毒蛋白(更准确地是指对抗包含在上述部分中的优势免疫区的片段)和宿主蛋白两者的免疫应答的多肽(未修饰的)，正是这种直接对抗病毒包膜蛋白和宿主蛋白的免疫应答的存在，决定了本申请中的病毒株的致病特性。因此可选择含这种片段的多肽(未修饰的)。
如果用与适当载体(如蛋白质、类脂或多肽)任意结合的上述片段对宿主进行了体内或体外免疫接种，则可认为多肽片段具有免疫原性，这样就能产生免疫反应(B型和/或T型免疫反应，直接对抗上述多肽片段)。
本申请中，体外或体内免疫接种后，如果提及免疫应答，没有任何其它特殊信息，则是指脊椎动物的免疫应答。
本发明方法也包括至少一个以下步骤，该步骤是：按下面将要描述的方式进行的修饰，其中多肽就是由此选择的；以及在这些被修饰的多肽中进行选择，其中至少一种修饰多肽可诱导直接对抗病毒包膜蛋白、而不对抗宿主蛋白的免疫应答。
因此，如上所述，现有技术并没有教导修饰逆转录病毒包膜蛋白的保守表位和优势免疫表位，对比之下，本发明方法的目的在于修饰这种表位的抗原性，以便获得对病毒包膜蛋白和宿主蛋白的不同的免疫应答。
已知的是，为了修饰多肽的免疫原性片段的抗原性，可以用影响至少一种氨基酸的突变来修饰上述多肽。应把后面将要对“突变”所下的定义理解为与此处的一致。突变的氨基酸可存在于免疫原性片段中、或甚至存在于上述片段外的多肽区中。实际上已知位于片段外的氨基酸的修饰可影响上述片段的空间结构，由此影响其抗原性；尤其是，已发现在肽中，位于相对于氨基酸残基的+8至-8位的氨基酸残基的特性可影响氨基酸残基的构象；参见例如GARNIER等，《分子生物学杂志》120：97-120(1978)。除此之外，氨基酸残基的特性仍具有一种影响，但仅从公知的多肽序列的知识来看，这种影响既不是对称的、也不是可定量的。
因此突变的氨基酸可位于修饰多肽中、免疫原性片段的内部或外边。当它位于免疫原性片段外边时，通常不能被8个以上(尤其是7个以上)氨基酸残基从多肽链的上述免疫原性片段的最近端分离出来。特别是，根据本发明突变的、存在于免疫原性片段外边的氨基酸通常不能被8个以上氨基酸残基、尤其是7个以上氨基酸残基从最近的保守氨基酸中分离出来，这种保守氨基酸属于优势免疫区，其中至少一个片段包含在未修饰多肽中。
本发明的修饰多肽可以是例如被上述的至少一种突变所修饰的致病病毒株的整个包膜蛋白。这种修饰多肽也可以是被上述的至少一种突变所修饰的致病病毒株的部分包膜蛋白，所述的部分包括至少一种如上所述的免疫原性片段。修饰多肽也可以是嵌合蛋白，它包括至少部分包膜蛋白，所述的部分包膜蛋白如上所述且包含至少一种突变。
本发明所使用的修饰多肽可以是例如逆转录病毒的跨膜糖蛋白或跨膜糖蛋白的片段，尤其是包括所述跨膜糖蛋白(修饰的)的外部区域的片段，也即是说存在于病毒膜的外表面的区域。当然，这种蛋白片段包括至少部分优势免疫区，如上所示。如果提及蛋白的“外部”区域，更准确地说是指易受溶剂影响的表面，特别可以采用X-plor(见下文)之类的软件、用“Lee和Richards《分子生物学杂志》55：379-400，1971”中所述的公式对上述区域进行定义。上述多肽也可是至少部分上述跨膜糖蛋白的寡聚体形式，该寡聚体呈修饰状态。
上述的对本发明方法的定义提示了所用的多肽包括病毒包膜蛋白的至少部分优势免疫区和保守区。在本申请的说明书中，“保守区”所指的是可任意缩减为单个氨基酸残基的病毒蛋白的区域，对于大多数已给出的病毒株(如10株中约至少6株)而言，有一个或多个相同的或功能类似的氨基酸，这些氨基酸位于上述各种株的蛋白的肽序列的同一排序位置。这种相同或功能类似的氨基酸就叫做保守氨基酸。功能类似的氨基酸的保守概念是已知的，并且其中有许多取代基基体，这样就有可能对此概念进行定量(Dayhoff,M.O.等，《蛋白序列和结构的示图》1978，第5卷，增刊3，第22和23章)。
通过所得到的序列的多种排序方法，对所研究的病毒的各种株的蛋白进行排序后，很容易确定保守区。对此，可使用如Clustal-w程序(Thompson J.D.等，《核酸研究》22：4673-4680，1994)。而且，在数据库中各种病毒株的蛋白序列经常受到影响。例如，Los AlamosHIV数据库的互联网服务器有HIV1、HIV2、SIV和FIV序列，它们常常是最新的。此服务器在国际互联网上的地址是：
http：//hiv-web.lanl.gov/HTML/sequences.html
附表2a、2b、2c和2d是属于HIV跨膜糖蛋白(进入SWISSPROTENV_HV1 BR)即分别为HIV1、HIV2、FIV和SIV的545-682区域的同源包膜糖蛋白区域的序列排序的例子。该表的最后一行用符合表示所观察到的同源性程度以及保守程度。符号“★”表示同一残基存在于所有序列中的排序位置，符号“：”表示存在于各种序列中的氨基酸非常相似时的排序位置，符号“．”表示存在于各种序列中的氨基酸相似时的排序位置，符号空缺表示存在于各种序列中的氨基酸不十分相似时的排序位置。此符号系统是由Clustal W排序程序(版本1.7)所使用。
在本申请说明书中，蛋白质的优势免疫区是指在极大多数情况(例如10种中约至少7种)下，用含上述序列的蛋白或基本包含上述序列的肽进行免疫接种后、可诱导直接对抗上述区域的免疫系统的体液和/或细胞应答的肽序列。
有关本发明方法的定义中提及了病毒的靶细胞，该靶细胞是指病毒可侵入其中的细胞。逆转录病毒的靶细胞一般是已知的。病毒具有与能受感染的细胞结合的特性。因此，使用常规的体外实验可任意检测所研究的病毒的靶细胞。
本发明方法的定义中还提及了具有宿主蛋白的膜受体的宿主细胞。通常具有上述宿主蛋白的受体的宿主细胞是已知的，反之，使用常规实验可以确定所给的蛋白是否与某些细胞型结合。例如，用放射性标记蛋白质可确定是否结合了上述细胞型。也可以通过用表达上述膜受体的基因转染的细胞系来检测该蛋白是否与已知的膜受体结合。
其中某些宿主细胞具有膜受体的宿主蛋白主要是指属于可溶性蛋白介体范畴的蛋白。根据情况，这一范畴包括蛋白质、激素、生长因子或细胞因子，但这些各种类型的介体之间没有明显的分界；参见如CAVAILLON J.M.,《Les细胞因子》(Masson，巴黎，1996)第一章，第1-3页和序言。
本申请中，已知通过用本发明方法制备的修饰多肽进行免疫接种获得的免疫应答如抗体反应，可直接对抗病毒包膜蛋白而不对抗宿主蛋白，当所得到的抗体对实质上不同的宿主蛋白和逆转录病毒的包膜蛋白具有亲和性时，在ELISA实验中可导致非常重要的反应性的不同，例如光密度的比率约为4(或更大)，这意味着上述抗体与病毒蛋白结合后所得到的光密度至少高于上述抗体与宿主蛋白结合所得到的光密度的4倍。同样，当用候补疫苗对宿主的免疫活性细胞在体外进行免疫接种诱导活性细胞的形成时，细胞型免疫应答可直接对抗包膜蛋白但不对抗宿主蛋白，其表达逆转录病毒包膜蛋白的反应细胞(包括转染细胞系)明显多于表达宿主蛋白的反应细胞，例如，在实验所用的最终光学测定或最终放射性计数(尤其是靶细胞释放的51Cr放射性)中，或者在通过任何已知的由诱导细胞毒性细胞所致的细胞裂解方法进行计数时，反应的比例约为4(或更大)。根据刚才所示的标准，至少可以在所研究的修饰肽中进行最先选择，但是在最终分析时，由于对宿主蛋白的免疫应答的抑制或减弱(用任何适当方法证实)，可导致失去致病作用或致病作用降低，它将形成选择能够构成符合要求的疫苗试剂的修饰肽的标准。
根据本发明，对抗原性进行修饰的优势免疫区和保守区可以选自在体外产生B型和/或T型的交叉反应、具有上述宿主蛋白者。
这种优势免疫区和保守区也可选自其中具有上述宿主蛋白区域的三维结构类似物已预先确定者，所述的结构类似物与体外和/或体内的交叉反应有关。两种蛋白质的某些区域之间的三维结构类似物是指特别是其侧链和/或其功能类似的化学基团相似的氨基酸残基在空间上排列相同。用核磁共振(NMR)光谱和/或X线衍射光谱可获得蛋白质的三维结构。例如，用NMR光谱得到了SIV gp41蛋白质的结构(Caffrey M.等，《分子生物学杂志》271，819-826，1997)。另外，某些情况下，采用分子制作模型技术，从已知结构的蛋白质的原子坐标可以得到好的模型。尤其是可以使用分子制作模型软件X-plor(参考：“用于X线晶体学和NMR的系统，版本3.1”，Axel T.Brunger，耶鲁大学出版社，1992)。
为了研究三维结构类似物，可以在生物分子的三维结构的图解屏上使用已知的显色法和迭加法。有一种软件，可用不同表现方式对分子的三维结构进行显色、对几何参数(如距离、角度等)进行计算和对数个分子结构进行客观和定量迭加(特别是RASMOL软件：Sayle,R.A.和Milner-White E.J.,《分子生物学杂志》247，536-540，1995和ANTHEPROT软件：Geourjon C.和Deleage G.,《分子图杂志》(J.Mol.Graph.)13，209-212，1995)，以及对溶剂的易受影响性进行评价(X-plor软件，上面已述，和CCP4软件：协调计算工程4(CollaborativeComputational Project Number 4)，Acta Cyrst.,D50，760-763，1994)。
然而，为了较好地评价这些结构类似物，以每一氨基酸为标准，来考虑被比较的两种蛋白质中以相似方式定位的功能基团是很有用的。对此，为了不仅考虑到全部氨基酸，而且特别要考虑其每一个官能化学基团(例如：酰胺、羧基、羟基、硫氢基和胺官能团等等)，本发明的共同发明人使用了可计算分子表面积的方法，目的是比较两种三维结构间的官能特性。因此，在所比较的结构中，可考虑功能上类似的氨基酸，而不仅是完全相同的氨基酸。
因此，如果使用刚才所述的技术可以证实在所对比的两个区域中，某些完全相同的或功能类似的氨基酸的相似空间结构，则可认为逆转录病毒蛋白的区域具有含宿主蛋白的给出区域的三维结构类似物。
应注意的是，空间上功能类似且以相似方式组合在一起的氨基酸在同一肽链中可以相互具有相对的距离。但是，被比较的两种蛋白质之间的三维结构类似物也可涉及相同或功能类似的氨基酸按相似方式的空间排列，在一种蛋白质被寡聚化的情况中，所包含的氨基酸残基位于寡聚体的不同链上，而包含在这种类似物中的其它蛋白质的氨基酸残基可位于所述的其它蛋白质的相同肽链上。
尤其需要找出三维结构类似物和/或与宿主的蛋白质区域的交叉反应，它们参与了上述蛋白质与其受体的结合。
在本发明方法的定义中已经描述的宿主蛋白质中，尤其要提及的是所述的可溶性介体。考虑到上面的陈述，即免疫抑制作用与逆转录病毒感染有关，找出结构类似物和/或逆转录病毒的外部蛋白质和免疫系统的可溶性蛋白质介体之间的交叉反应是尤其重要的。在这些免疫系统介体中，有细胞因子，尤其是白细胞介素2、白细胞介素10、白细胞介素15和白细胞介素8以及趋化因子。
为了制备构成本发明所获得的疫苗试剂的修饰多肽，可以使用已知的肽合成方法或基因工程技术。可以分离或制备对病毒的至少部分蛋白质进行编码的聚核苷酸序列，如果需要，可在此时期引入核苷酸序列、突变，该突变可使之获得构成修饰多肽的翻译突变产物。也可直接合成包括一种或多种突变且编码修饰多肽的修饰聚核苷酸序列。将由此所得到的突变聚核苷酸序列用已知方法引入到适当的载体，该载体可使之表达上述任意修饰形式的多肽。这种载体例如有大肠杆菌、杆状病毒和哺乳动物细胞。也可以在通过前面所述方法之一所获得的未修饰多肽上进行突变。
在本申请中，“突变”是指对多肽的区域(任意缩减成单氨基酸残基)的任何修饰区域，通过物理方法、化学方法(共价或非共价修饰)和/或生物方法(通过一种或多种氨基酸的取代、缺失和/或插入所致的突变)，导致对上述区域(叫做“突变区域”)所组成的氨基酸的潜在功能的修饰。举例来说，可以进行导致二硫键和氢键的特性的去除、获得和/或调节，静电作用和/或疏水作用的突变，对蛋白质容量的修饰可形成杂络物，或者在寡聚蛋白质中，对寡聚状况或寡聚体的稳定性进行修饰。
对多肽链的氨基酸a的修饰(包括对该多肽的末端氨基酸的修饰)可影响链中的邻近氨基酸的构象，如上所述，包括通过许多氨基酸残基从a中分离的氨基酸b的构象，该氨基酸残基可以是7或8的高度，当氨基酸b是表位的一部分时，对氨基酸a的任何修饰(尤其是取代基的任意加入或取代基的任意修饰)可修饰所考虑的表位的抗原性。
在寻找本发明的修饰多肽的过程中，可以按任意方式或合理方式选择将要突变的氨基酸和/或选择突变方法。特别是可以使用至少一种下列修饰方法：
1)用具有亲水侧链(如：Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、His、Lys)或中性链(如：Gly、Pro)的一种或多种氨基酸置换具有疏水侧链(如：Ala、Leu、Val、Ile、Phe、Trp、Met、Tyr、Cys)的一种或多种氨基酸，反过来亦如此；
2)用具有带负电侧链(如：Asp、Glu)的一种或多种氨基酸或中性链置换具有带正电侧链(如：Arg、Lys、His)的一种或多种氨基酸，反过来亦如此；
3)一种或多种二硫键的获得、抑制和/或修饰；
4)模拟位(mimotopes)产物，尤其是由逆向倒位所获得的；
5)至少一种氨基酸的取代、抑制、加入和/或其它修饰，该氨基酸是氢键的潜在供体或受体；
6)至少一种氨基酸的取代、抑制、加入和/或其它修饰，该氨基酸是离子键的潜在供体或受体；
7)由一种或多种氨基酸的取代、抑制、加入和/或其它修饰产生的空间位阻的改变；
8)使用不是天然存在于蛋白质中的氨基酸；
9)糖基化的修饰(糖基化位点或其相关糖的产生、抑制或修饰)。
当然，为了选择诱导直接对抗包膜蛋白而不对抗宿主蛋白的免疫应答的修饰多肽，如上所述对由此得到的修饰多肽进行实验。
本发明方法可用于获得疫苗，尤其是对抗下列病毒的疫苗：HIV、FIV、SIV、致白血病的肿瘤病毒(禽、鼠、猫、人、猴和牛白血病病毒，也即分别是ALV、MULV、FELV、HTLV、STLV、BLV)、灵长类D型逆转录病毒、哺乳动物肿瘤诱导B型逆转录病毒、Rous肉瘤病毒、Maedi-visna病毒(感染羊)、猫肉瘤病毒、禽髓细胞瘤病病毒和禽成髓细胞过多症病毒。
如上所述，本发明的主题还在于，修饰多肽在制备用于预防与逆转录病毒所致的宿主感染有关的致病作用的疫苗组合物中的应用。
本发明还涉及可通过本发明方法获得的疫苗组合物，该组合物包含上述的修饰多肽这一活性成分。这种组合物可用于预防逆转录病毒感染的致病作用的疫苗接种法中，此方法实质上是对包括人在内的脊椎动物给予足够量的上述修饰多肽，以获得疫苗接种效果。有关疫苗组合物的形成及其给药方法是已知的，在此不再做进一步描述。
本发明的主题还在于提供一种如上所述的编码修饰多肽的修饰逆转录病毒聚核苷酸。这种修饰聚核苷酸可按上面所述获得。本发明提供了一种其中插入了上述修饰聚核苷酸的表达载体，所述的表达载体能表达修饰多肽。
为了通过免疫接种诱导可特别用于治疗逆转录病毒感染的抗体的形成，根据本发明获得的修饰多肽也可用作免疫原性试剂，因此本发明还涉及在用免疫试剂对动物(包括人)进行体内或体外免疫接种的反应中获得的抗体，其中疫苗试剂包含上述修饰多肽。本发明抗体尤其是指具有识别逆转录病毒包膜蛋白而不识别宿主蛋白特性的纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用病毒蛋白和宿主蛋白进行多克隆抗体的纯化和单克隆抗体的选择，以便选择仅仅识别病毒蛋白而不识别宿主蛋白的抗体。本发明的抗体尤其可用于对上述宿主中由被直接对抗的逆转录病毒所致的感染进行早期治疗。剂量为抗体的常用剂量。提供含这种抗体的药学组合物也是本发明的主题之一。
下列实施例是对本发明的举例说明。
实施例l
下面描述了本发明人寻找对于病毒的包膜蛋白质即HIV1的gp41蛋白质、与细胞因子即人白细胞介素2(缩写：IL-2)之间的结构和抗原性类似物的方法。
注意gp41和人IL-2的肽序列不是同源的。实际上，这两种蛋白质之间总的来说仅有16.5％的序列等同，这一同源性阈值并不重要，通过在含同样组合物的序列上进行硅(in silico)刺激很容易发现这一点，但该组合物中的氨基酸的顺序已被随机修饰。
前面的研究(Bost等，《免疫》65：611-615，1988)已报道了gp41蛋白质与IL-2(序列LERILL)之间的序列同源性。应注意此gp41的LERILL序列不构成这种蛋白质的优势免疫区域；参见LEVY J.A.,《微生物学回顾》57：183-289(1993)，尤其是第232页。序列LERILL实际上是位于病毒颗粒的内部；与gp41的C末端部分一致。
已经观察到IL-2和AIDS相关逆转录病毒显示具有相同的靶细胞，本发明人提出如下假说：人白细胞介素2的受体可以与IL-2和HIV的gp41蛋白质是共同的，因此他们找出了对于后两种之间的三维结构类似物。
在本申请中，白细胞介素2和gp41的肽序列的氨基酸残基数是指用于SWISSPROT库(版本34)的那些。
IL-2和gp41蛋白质的肽序列是已知的。本申请中，提及了下列公开序列：
-IL-2：代码为IL2_HUMAN的SWISSPROT条目(版本34)；
-gp41：代码为ENV_HV1BR的SWISSPROT条目(版本34)。
已经使用的公开结构如下：
-IL-2：PDB条目(Brookhaven数据库)1IRL；
-gp41：PDB条目(Brookhaven数据库)。
-1AIK，
-1ENV。
而且，已知通过NMR测定的IL-2的三维结构(Mott,P.C.等，《分子生物学杂志》248：979，1995)以及gp41蛋白质的某些区域的结构，该结构是通过X线衍射光谱得到的(Chan,D.C.等，《细胞》89，263-273，1997；Weissenhorn,W.等《自然》387，426-430，1997)。另外，本发明的共同发明人通过分子造模，在545-671区域中获得了gp41蛋白质的部分外部区域的三维模型(三聚体形式)。这种分子模型是使用X-plor软件、按照类似NMR限制下的分子造模的方案获得的。三聚体形式的分子造模必需的限制是从蛋白质GCN4(PDB密码：IGCM)的“亮氨酸拉链”区域的pⅡ突变体的三维结构推出的，上述结构以“卷曲螺旋”型的三聚体形式结晶。
通过检验所获得的结构，在gp41蛋白质的某些区域与参加与其受体结合的白细胞介素2的某些区域之间发现了三维结构类似物。IL-2与其受体结合的方式以及参与这种结合的IL-2的区域实际上是已知的；参见BAZAN J.F.,P.N.A.S.美国87：6934-6938(1990)；Bamborough P.等《结构》2：839-851(1994)；Gnarra J.,R.等P.N.A.S.美国87：3440-3444(1990)；Takeshita T.等《科学》257：379-382(1992)；和CAVAILLON J.M.,《Les细胞因子》(Masson，巴黎，1996)，第119-125页。
通过对gp41和IL-2的结构的全面比较、和尤其是集中对每一结构的类似功能基团的局部比较所做出的研究已经证实了这些结果，这已经在上面的说明书中描述了。
尤其是观察到：以α螺旋形式组构的IL-2的53-61和88-93区域，与三个gp41的中心三聚体的螺旋中的两个螺旋按符合要求的形式迭加。这提示在两种蛋白质中，不同螺旋带有的基团具有可比的易受影响性和相关构成。
在HIV的gp41糖蛋白的高度保守的优势免疫区域(更准确的是545-682区域)和人IL-2之间还发现了局部三维结构类似物。
在附表3中再现了HIV1(SWISSPROT密码：ENV_HV1BR)的gp41蛋白质的545-682区域的肽序列。
在附表3bis中，已经描述了此gp41区域的四个区(555-577、572-601、590-620和628-663)的肽序列，其中用IL-2注明了结构类似物和/或交叉反应。
刚才所述的结构类似物相关的IL-2区域是指IL-2的27-47、45-69、99-121和131-153区域。这些区域的肽序列示于附表4中。
重点要注意IL-2的27-47区域参与IL-2与其受体的β链结合。实际上，27-47区域中的氨基酸属于A螺旋，该螺旋参与与IL-2(RIL-2)的受体的结合，更准确地说是βRIL-2。
45-69区域中的氨基酸属于IL-2区域，该区域参与与αRIL-2的结合。
99-121区域中的氨基酸属于E螺旋，该螺旋参与与βRIL-2的结合。
IL-2的131-153区域中的氨基酸属于F螺旋，该螺旋参与与γRIL-2的结合。
举例来说，在gp41的572-601区域和人IL-2的27-47区域之间所发现的结构类似物说明在附表4bis中。表4bis中，在这种三维结构类似物中所包含的外部氨基酸在下边划了线。
但是，应指出，gp41的同一区域可具有含几种不同IL-2区域的三维结构类似物。
另外，本发明人观察到在gp41的600-612区域中，在gp41三聚体的三个链上的606位置上的三个赖氨酸(K)可形成构象表位，gp41的这些赖氨酸在空间上可对应于IL-2的赖氨酸52、96和55。
他们还观察到IL-2和gp41蛋白质之间的免疫交叉反应性。尤其是使用ELISA和PEPSCAN技术，通过使用在含固定化的人IL-2的柱上进行免疫纯化、从纯化的HIV+血清获得的抗体，他们观察到这些抗体中有一些可识别IL-2的区域，该区域参与IL-2与其受体的α、β和γ链的结合，尤其是属于A螺旋(KTQLQLEHLLLTLQ)、E螺旋(RPRDLISNINVIVLELK)、F螺旋(TIVEFLNRWITFCQSIISTLT)、AB环和起始的B螺旋(NNYKNPKLTRMLTFKFYMPKK)的区域。
使用滤膜斑点印迹技术和Western印迹型免疫转移技术，还显示从HIV+患者的血清获得、并在人IL-2中进行了免疫纯化的多克隆抗体可识别gp41蛋白质的寡聚体。
所进行的这些研究还表明，直接对抗HIV的gp41蛋白质的优势免疫保守区的鼠和人抗gp41单克隆抗体可识别IL-2区域，该区域参与后者与IL-2受体的α、β和γ链的结合。
因此根据本发明可获得抗HIV病毒的疫苗，尤其是通过制备含至少一种表3bis所述的gp41区域的多肽，所述的多肽呈修饰形式，也即是说包含上面所述的至少一种突变。应清楚地认识到，545-682区域的这些被划分的区域可具有某种专一性，这就是为什么上述一些区域可以重迭的原因。
实施例2=HIV1的gp41中的突变
根据已知方法制备突变的gp41包膜糖蛋白。在列有gp41的有关序列和排列在后边的突变序列的附表5中，对这些突变进行了描述。通过在相关的氨基酸下面划线表示了这些突变的位置。
在无菌和无致热原、含水盐水溶液中制备疫苗组合物，每一组合物包括一种上述所获得的突变gp41蛋白质。
用获得的突变蛋白质对兔或鼠进行免疫接种，例如通过ELISA或PEPSCAN技术，来确定由这些动物产生的抗体是否能识别人白细胞介素2。选择可诱导不能识别IL-2、但能识别gp41蛋白的抗体形成的突变蛋白质。
在《“肽抗原-实验方法”》(G.B.WISDOW Ed.)，牛津大学出版社(1994)中，J.WORTHINGTON和K.MORGAN，“使用合成肽的表位作图”描述了PEPSCAN技术。
实施例3=FIV的gp36中的突变
FIV的gp36蛋白质的序列是已知的(参考ENV-FIVPE)。
附表6中描述了这种蛋白质中的一些序列，它与表3bis所述的gp41的保守区域是同源的，表6中有突变的例子。
表1
| 慢病毒属 | 宿主 | 主要靶细胞 | |
| EIAV | 马 | 巨噬细胞 | 溶血性贫血 |
| VISNA病毒 | 绵羊 | 巨噬细胞 | Maedi-visna-脑炎-间质性肺炎 |
| CAEV | 山羊 | 巨噬细胞 | 免疫缺损-脑病-关节炎 |
| BIV | 牛 | T淋巴细胞 | 免疫缺损-牛淋巴细胞增多症 |
| FIV | 猫+猫科动物 | T淋巴细胞 | 免疫缺损(AIDS) |
| SIV | 脊椎动物(猴) | T淋巴细胞 | 免疫缺损(AIDS) |
| HIV | 人 | T淋巴细胞 | 免疫缺损(AIDS) |
EIAV表示马的贫血感染性病毒
CAEV表示羊的脑炎病毒
FIV：猫免疫缺损病毒
SIV：猴免疫缺损病毒
HIV：人免疫缺损病毒
表2aGP41_HV1Z2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1Z6 QARQLMSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1EL QARQLMSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1ND QARQLMSGIVHQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1MA QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLQDQRLLGMWGCSGP41_HV1Z8 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVESYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1C4 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIKAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGFWGCSGP41_HV1Sl QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1BN QARLLLSGIVQQQNNLLMAIEAQQHMLELTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1JR QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLMGIWGCSGP41_HV1J3 QARLLLSGIVQQQNNLLRAIEGQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1SC QARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1KB QARQLLPGIVQQQNNLLRAIDAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLMGIWGCSGP41_HV1Y2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1MN QARLLLSGIVQQQNNLLKAIEAQQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGFWGCSGP41_HV1A2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGGSGP41_HV1QY QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1RH QARHLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1S3 QARKLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1H2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1H3 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1B1 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1PV QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1B8 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEGQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1MF QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1BR QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1W1 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1W2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIDAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1ZH QARRLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLKLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCS
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表2a(续)GP41_HV1Z2 LLELDKWASLWNWFNITQGP41_HV1Z6 LLELDKWASLWNWFNITQGP41_HV1EL LLELDKWASLWNWFSITQGP41_HV1ND LLELDKWASLWNWFSITKGP41_HV1MA LLELDKWASLWNWFSISKGP41_HV1Z8 LLQLDKWASLWNWFSITKGP41_HV1C4 LLQLDKWASLWTWSDITKGP41_HV1S1 LLELDKWASLWNWFDISKGP41_HV1BN LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1JR LLELDKWASLWNWFGITKGP41_HV1J3 LLGLDKWASLWNWFTITNGP41_HV1SC LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1KB LLALDKWDSLWNWFSITKGP41_HV1Y2 LIALDKWASLWNWFDITKGP41_HV1MN LLELDKWASLWNWFDITNGP41_HV1A2 LLELDKWASLWNWFSITNGP41_HV1OY LLELDKWAGLWSWFSITNGP41_HV1RH LLELDKWANLWNWFDITQGP41_HV1S3 LLELDKWASLWNWFSITNGP41_HV1H2 LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1H3 LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1B1 LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1PV LLELDKWANLWNWLNITNGP41_HV1B8 LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1MF LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1BR LLELDKWASLWNWFNITNGP41_HV1W1 LLELDKWASLWNWFSITNGP41_HV1W2 LLELDKWASLWNWFDITNGP41_HV1ZH LLALDKWANLWNWFDISN** **** ** * *::
表2bGP41_HV2D1 QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP41_HV2G1 QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP4l_HV2BE QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKHQAQLNSWGCAGP41_HV2NZ QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP41_HV2CA QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKILQARVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP41_HV2RO QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAGP41_HV2S2 QSRTSLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP41_HV2ST QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP41_HV2SB QSRTLFRGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLADQARLNSWGCAGP41_MV2D2 QSRTLLAGIVQQQQQPVDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIKKYLKDQAQLNSWGCA
**** : ******** :********:********* ************ .**:*******GP41_HV2D1 FRQVCHTTVPWVNDSLTPDWNNMTWQEWEKRVHYLEANISQSLEQAQIQQFKNMYELQKLGP41_HV2G1 FRQVCHTTVPWVNDSLSPDWNNMTWQEWEKQVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLGP41_HV2BE FRQVCHTTVPWVNDSLSPDWKNMTWQEWEKQVRYLEANISQSLEEAQIQQEKNMYELQKLGP41_HV2NZ FRQVCHTSVPWVNDTLTPDWNNMTWQEWEQKVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLGP41_HV2CA FRQVCHTTVPWANESLTPDWNNMTWQEWEQKVRYLEANISQSLEEAQLQQEKNMYELQKLGP41_HV2RO FRQVCHTTVPWVNDSLAPDWDNMTWQEWEKQVRYLEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLGP41_HV2S2 FRQVCHTTVPWVNDTLTPDWNNITWQEWEQRIRNLEANISESLEQAQIQQEKNMYELQKLGP41_HV2ST FRQVCHTTVPWVNDTLTPDWNNMTWQEWEQRIRNLEANISESLEQAQIQQEKNMYELQKLGP41_HV2SB FRQVCHTTVPWVNDTLTPEWNNMTWQEWEHKIRFLEANISESLEQAQIQQEKNMYELQKLGP41_HV2D2 FRQVCHTTVPWPNETLTPNWNNMTWQQWEKQVHFLDANITALLEEAQIQQEKNMYELQKI
*******:*** *::*:*:*.*:***:**:::: *:***: **:**:***********:GP41_HV2D1 NSWDVFGNWFDLTSGP41_HV2G1 NSWDVEGNWFDLTSGP41_HV2BE NSWDILGNWFDLTSGP41_HV2N2 NSWDVFTNWLDFTSGP41_HV2CA NNWDVFTNWFDLTSGP41_HV2RO NSWDIFGNWFDLTSGP41_HV2S2 NSWDVFSNWFDLTSGP41_HV2ST NSWDVFGNWFDLTSGP41_HV2SB NSWDVFGNWFDLTSGP41_HV2D2 NSWDVFGNWFDLTS*.**:: **:*:**
表2cGP36_FIVPE QYHQVLATHQEAIEKVTGALKINNLRLVTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQELGCNGP36_FIVUl QYHQVLATQQEAIEKVTEALKITNLRLVTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQELGCNGP36_FIVWO QYQQVLATHQEAIEKVTEALKINNLRLVTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQELGCNGP36_FIVU2 QYHQVLATHQETIEKITEALKVNNLRLVTLEHQVLVIGLKVEAIEKFLYTAFAMQELGCNGP36_FIVU8 QYHQVLATHQETIEKVTEALKINNLRLVTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQELGCNGP36_FIVSD QYQQVLATHQEALDKITEALKINNLRLVTLEHQMLVIGLKVEAIEKFLYTAFAMQELGCNGP36_FIVT2 QYHQVLATHQQALEKITEALKINNLRLITLEHQVLVIGLRVEAIEKFLYTAFAMQELGCN
**:*****:*::::*:* ***:.****:*****:*****:***:****************GP36_FIVPE QNQFFCKIPLELWTRYNMTINQTIWNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGGP36_FIVU1 QNQFFCKVPPELWRRYNMTINQTIWNHGNITLGEWYNQTKDLQKKFYGIIMDIEQNNVQGGP36_FIVWO QNQFFCKVPSALWERYNMTINQTIWNHGNITLGEWYNQTKDLQQRFYEIIMDIEQNNVQGGP36_FIVU2 QNQFFCKVPPELWQRYNMTINQTIWNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDMEQNNVQGGP36_FIVU8 QNQFFCKVPPELWKRYNMTINQTIWNHGNITLGEWYNQTKELQQKFYEIIMNIEQNNVQVGP36_FIVSD QNQFFCEIPKELWLRYNMTLNQTIWNHGNITLGEWYNQTKYLQQKFYEIIMDIEQNNVQGGP36_FIYT2 QNQFFCKIPPSLWSMYNMTLNQTIWNHGNISLGNWYNQTRDLQNKFYEIIMDIEQNNVQG
******::* ** ****:**********:**:*****: **::** ***::*******GP36_FIVPE KTGLQQLQKWEDWVRWIGNIPQGP36_FIVU1 KKGLQQLQKWEDWVGWIGNIPQGP36_FIVWO KKGLQQLQEWEDWVGWIGNIPQGP36_FIVU2 RKGLQQLQEWEDWVGWLGNIPRGP36_FIVU8 KKGLQQLQEWEDWVGWIGNIPQGP36_FIVSD KQGLQKLQNWQDWMGWIGKIPQGP36_FIVT2 KTGIQQLQKWENWVGWIGKIPQ: *:*:**:*::*: *:*:**:
表2dGP41_SIVMK QSRTLLAGIVQQQQQLLGVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLEDQAQLNAWGCAGP41_SIVML QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTKVTAIEKYLKDQAQLNAWGCAGP41_SIVM1 QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVSAIEKYLKDQAQLNAWGCAGP41_SIVS4 QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP41_SIVSP QSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGAKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAGP41_SIVAG QSQHLLAGILQQQKNLLAAVEAQQQMLKLTIWGYKNLNARVTALEKYLEDQARLNAWGCAGP41_SIVAT QSRHLLAGILQQQKNLLAAVEAQQQMLKLTIWGVKNLNARVTALEKYLEDQARLNSWGCAGP41_SIVA1 QSQHLLAGILQQQKNLLAAVGAQQQMLKLTIWGVKNLNARVTALEKYLADQARLNAWGCAGP41_SIVAI QSRHLLAGILQQQKNLLAAVEQQQQLLKLTIWGVKNLNARVTALEKYLEDQARLNSWGCAGP41_SIVGB QSQSLVTGIVEQQKQLLKLIEQQSELLKLTIWGVKNLQTRLTSLENYIKDQALLSQWGCSGP41_SIVC2 QARQLLSGIVQQQNNLLKAIEAQQHLLQLSIWGVKQLQARLLAVERYLQDQQILGLWGCS
*:: *::**::**::** : *..:*:*::**.*:*:::: ::*.*: ** *. ***:GP41_SIVMK FRQVCHTTVPWPNASL-----TPDWNNDTWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYGP41_SIVML FRQVCHITVPWPNASL-----TPDWNNDTWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYGP41_SIVM1 FRQVCHTTVPWPNASL-----TPDWNNETWQEWERKVDFLEANITALLEEAQIQQEKNMYGP41_SIVS4 FRQVCHTTVPWPNETL-----VPNWNNMTWQEWERQVDFLEANITQLLEEAQIQQEKNMYGP41_SIVSP FRQVCHTTVPRPNDTL-----TPNWNNMTWQEWEKQVNFLEANITQSLEEAQIQQEKNTYGP41_SIVAG WKQVCHTTVPWQWNNR-----TPDWNNMTWLEWERQISYLEGNITTQLEEARAQEEKNLDGP41_SIVAT WKQVCHTTVEWPWTNR-----TPDWQNMTWLEWERQIADLESNITGQLVKAREQEEKNLDGP41_SIVA1 WKQVCHTTVPWTWNN------TPEWNNMTWLEWEKQIEGLEGNITKQLEQAREQEEKNLDGP41_SIVAI WKQVCHTTVPWKYNN------TPKWDNMTWLEWERQINALEGNITQLLEEAQNQESKNLDGP41_SIVGB WAQVCHTSVEWTNTSI-----TPNWTSETWKEWETRTDYLQQNITEMLKQAYDREQRNTYGP41_SIVCZ GKAVCYTTVPWNNSWPGSNSTDDIWGNLTWQQWDKLVSNYTGKIFGLLEEAQSQQEKNER
**: :* * . ** :*: :* * :* ::.:*GP41_SIVMK ELQKLNSWDVFGNWFDLASGP41_SIVM KLQKLNSWDVFGNWEDLASGP41_SIVM1 ELQKLNSWDVFGNWFDLTSGP41_SIVS4 ELQKLNSWDIFGNWFDLTSGP41_SIVSP ELQKLNSWDIFGNWFDLTSGP41_SIVAG AYQKLSSWSDFWSWFDFSKGP41_SIVAT AYQKLTSWSDFWSWFDFSKGP41_SIVA1 AYQKLSDWSSFWSWFDFSKGP41 SIVAI LYQKLDDWSGFWSWFSLETGP41_SIVGB ELQKLGDLTSWASWFDFTWGP41_SIVCZ DLLELDQWASLWNWFDITK* **.::
表3
gp41(区域545-682)545- QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITN - 682
表3bisgp41的区域区域555-577QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG区域572-601QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW区域590-620RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS区域628-663WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ
表4
| IL-2 |
| 区域27-47TKKTQLQLEHLLLDLQMILNG |
| 区域45-69LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKK |
| 区域99-121HLRPRDLISNINVIVLELKGSET |
| 区域131-153TATIVEFLNRWITFCQSIISTLT |
表4bis
| gp41 | IL-2 |
| 区域572-601QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW | 区域27-47TKKTQLQLEHLLLDLQMILNG |
表5555-577区域中的突变区域555-577
QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG突变1： QQQNNLLAAIEAQQHLLQLTVWG突变2： QQQNNLLRAIERQQHLLQLTVWG突变3： QQQNNLLAAIERQQHLLQLTVWG突变4： QQQNNLLRAIEAQQELLQLTVWG突变5： QQQNNLLRAIEAQQQLLQLTVWG突变6： QQQNNLLRAIEAQQHLLRLTVWG突变7： QQQNNLLRAIEAQQHLLKLTVWG突变8： QQQNNLLRAIEAQQQLLKLTVWG
572-601区域中的突变区域572-601 QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW突变1： QLTVWGIKQLQARILAVERYLKAQQLLGIW突变2： QLTVWGIKQLQARILAVEAYLKDQQLLGIW突变3： QLTVWGIKQLQARILAVEAYLKAQQLLGIW突变4： QLTVWGIKQLQARILAVEDYLKRQQLLGIW突变5： QLTVWGIKQLQARITAVERYLKDQQLLGIW
表5(续)
590-620区域中的突变区域590-620 RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突变1： KYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突变2： RYLKDQALLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突变3： RYLKDQQQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突变4： RYLKDQAQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突变5： RYLKDQARLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突变6： RYLKDQQLLNSWGCSGKLICTTAVPWNASWS突变7： RYLKDQQLLGIWGCSQKLICTTAVPWNASWS突变8： RYLKDQQLLGIWGCSFKLICTTAVPWNASWS突变9： RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSS突变10： RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNADTL突变11： RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNATNR突变12： RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTR突变13： RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTS
628-663区域中的突变区域628-663 WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ突变1： WNNMTWMEWDREINNYESLIHSLIEESQNQQEKNEQ突变2： WNNMTWMEWDREINNYTSNIHSLIEESQNQQEKNEQ
表6区域651-673 EAIEKVTGALKINNLRLVTLEHQ
突变1 EAIEKVTRALKINNLRLVTLEHQ
突变2 EAIEKVTDALKINNLRLVTLEHQ
变突3 EAIEKVTAALKINNLRLVTLEHQ
突变4 EAIEKVTQALKINNLRLVTLEHQ区域668-697 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQEL
突变1 VTLEHQVLVIGLKVEAMEAFLYTAFAMQEL
突变2 VTLEHQVLVIGLKVEAMENFLYTAFAMQEL
突变3 VTLEHQVLVIGLKVEAMEYFLYTAFAMQEL
突变4 VTLEHQVLVIGLKVEAMERFLYTAFAMQEL
突变5 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLKTAFAMQEL
突变6 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLETAFAMQEL
突变7 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLQTAFAMQEL
突变8 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLRTAFAMQEL
突变9 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLATAFAMQEL
突变10 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFQMQEL
突变11 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFKMQEL
突变12 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFRMQEL
突变13 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQIL
突变14 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQAL
突变15 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQSL
突变16 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQFL区域686-718 KFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPLELWTRYNM
突变1 KFLYTAFAMQELGCNQNKFFCKIPLELWTRYNM
突变2 KFLYTAFAMQELGCNQNRFFCKIPLELWTRYNM
突变3 KFLYTAFAMQELGCNQNGFFCKIPLELWTRYNM
突变4 KFLYTAFAMQELGCNQNAFFCKIPLELWTRYNM
突变5 KFLYTAFAMQELGCNQNQLFCKIPLELWTRYNM
突变6 KFLYTAFAMQELGCNQNQHFCKIPLELWTRYNM
突变7 KFLYTAFAMQELGCNQNQIFCKIPLELWTRYNM
突变8 KFLYTAFAMQELGCNQNQAFCKIPLELWTRYNM
突变9 KFLYTAFAMQELGCNQNQQFCKIPLELWTRYNM
突变10 KFLYTAFAMQELGCNQNQRFCKIPLELWTRYNM区域727-762 WNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKT
突变1 WNHGNITLGEWYNQTKDLQNKFYEIIMDIEQNNVQGKT
突变2 WNHGNITLGEWYNQTKDLQHKFYEIIMDIEQNNVQGKT
突变3 WNHGNITLGEWYNQTKDLQSKFYEIIMDIEQNNVQGKT
突变4 WNHGNITLGEWYNQTKDLQAKFYEIIMDIEQNNVQGKT
突变5 WNHGNITLGEWYNQTKDLQGKFYEIIMDIEQNNVQGKT
突变6 WNHGNITLGEWYNQTKDLQEKFYEIIMDIEQNNVQGKT
Claims (9)
1．获得对抗与逆转录病毒所致的动物或人宿主感染有关的致病作用的疫苗的方法，这种逆转录病毒能够侵入所述宿主的靶细胞，所述的靶细胞具有宿主蛋白的膜受体，
其中疫苗试剂是基于包含所述逆转录病毒的致病株的至少部分包膜蛋白的多肽制备的，
其中将所述多肽被制备成修饰形式，
可以理解为：
-所述部分包膜蛋白选自那些包括上述包膜蛋白的优势免疫区的至少一个片段的包膜蛋白，所述片段含有至少一种氨基酸，它是上述优势免疫区的一种保守氨基酸，并且存在于所述致病株中，
-所述多肽，呈非修饰状态，其诱导直接对抗所述优势免疫区和宿主蛋白两者的免疫应答，
-所述修饰多肽选自那些诱导直接对抗所述包膜蛋白的优势免疫区、但不对抗宿主蛋白的免疫应答的多肽。
2．根据权利要求1所述的方法，其中所述的优势免疫区选自：
-那些与所述宿主蛋白产生B型和/或T型交叉反应者，和/或
-那些三维结构类似物，它含有前面已经确定的部分的所述宿主蛋白。
3．根据前述任一项权利要求所述的方法，它具备至少一种下述的特性：
-所上述宿主蛋白是可溶性介体；
-所述可溶性介体选自生长因子、蛋白质激素和细胞因子；
-所述细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-10、白细胞介素-15、白细胞介素-8或趋化因子。
4．根据前述任一项权利要求所述的方法，它具有至少一种下述的特性：
-所述病毒选自以下病毒：HIV、FIV、SIV、ALV、MULV、FELV、HTLV、STLV、BLV、Rous肉瘤病毒、绵羊肺腺瘤病-绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒、猫肉瘤病毒、禽髓细胞瘤病病毒、禽成髓细胞过多症病毒、灵长类D型逆转录病毒、哺乳动物肿瘤诱导B型逆转录病毒；
-所述包膜蛋白是所述逆转录病毒的一种跨膜糖蛋白；
-所述跨膜糖蛋白是HIV、FIV或SIV病毒的跨膜糖蛋白；
-所述糖蛋白为HIV1的gp41蛋白；
-所述疫苗试剂包含修饰形式的多肽，该多肽包括HIV1的gp41蛋白的至少部分545-682区域；
-所述修饰多肽包含选自表5所述的突变；
-所述糖蛋白为FIV的gp36蛋白；
-所述修饰多肽包含选自表6所述的突变。
5．根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述多肽为所述逆转录病毒的至少部分跨膜糖蛋白的寡聚体形式，所述多肽呈修饰状态。
6．疫苗组合物，它包含按照权利要求1-5的任一项权利要求所述的方法得到的疫苗试剂。
7．按照权利要求6所述的疫苗组合物通过免疫接种获得的抗体，以及含这种抗体的药物组合物，所述抗体能识别所述包膜蛋白，而不能识别宿主蛋白。
8．按照权利要求1-5的任一项权利要求所述的方法可获得的修饰多肽在制备疫苗组合物中的应用，这种组合物可预防与逆转录病毒所致的动物或人宿主感染有关的致病作用，该逆转录病毒能够侵入所述宿主的靶细胞，所述的靶细胞具有宿主蛋白的膜受体。
9．编码权利要求1-5的任一项权利要求所述的修饰多肽的聚核苷酸，以及含所述聚核苷酸的表达载体。
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