CN1440296B - 抗口蹄疫疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗口蹄疫疫苗,用有效量口蹄疫病毒空衣壳作为抗原,所述空衣壳通过在真核细胞中表达编码衣壳的口蹄疫病毒基因组P1区域cDNA及编码3C蛋白酶的口蹄疫病毒基因组区域的cDNA而获得,疫苗进一步包括兽医学中药学可接受的载体或赋形剂。本发明也涉及在序列VP2中突变插入(引入半胱氨酸),由此稳定了空衣壳和由此得到的病毒。

Description

抗口蹄疫疫苗
发明领域
本发明涉及抗口蹄疫疫苗,特别是改进它们的热稳定性。本发明也涉及制备这些疫苗的方法,抗原产生这些疫苗的用途,及用它们接种的方法。
特别地,本发明也涉及同病毒天然序列比较,修饰的核苷酸序列(特别是cDNA)和氨基酸序列。本发明也涉及修饰的核苷酸序列的表达产物,及引入这些修饰的口蹄疫抗原和病毒。
背景技术
口蹄疫是影响农畜最具毒性及传染性的疾病。在世界上许多国家,尤其是在非洲、亚洲和南美洲,这种疾病是地方性流行病。此外,不时出现流行性爆发。
出现这种疾病的国家在感染牧群生产率损失,体重损失及奶产量损失方面可能有非常严重的经济后果,而且强加这些国家在贸易上禁运。
抗这种疾病采取的措施在于严格实行进口限制、卫生控制及检疫,屠宰患病动物,及用灭活疫苗进行接种,该接种或是作为国家或地区范围内预防性措施,或是当流行性爆发出现时在发病区周围进行。
这种疾病特征是短潜伏期、高传染特性及在口和蹄中形成溃疡,有时引起年幼动物死亡。口蹄疫影响大量动物物种,特别是牛、猪、绵羊及山羊。
引起这种疾病的因子是核糖核酸(RNA)病毒,它属于口疮病毒属(Aphthovirus)和小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(Cooper等,Intervirology,1978,10,165-180)。口蹄疫病毒英文缩写是FMDV(口蹄疫病毒)。目前,已知7种类型口蹄疫病毒,欧洲型(A,O和C),非洲型(SAT1,SAT2和SAT3)及亚洲型(亚洲型1)。已鉴定出许多亚型(Kleid等,Science,1981,214,1125-1129)。
它是裸露二十面体病毒,直径25nm,含有由约8500核苷酸组成的正极性的单链RNA分子。这种RNA分子由编码单个多蛋白的单一开放阅读框架(ORF)组成,这个多蛋白尤其包括衣壳前体,也称作蛋白质P1或P88。蛋白质P1氨基末端被十四烷基化。
在成熟过程中,蛋白质P1被蛋白酶3C剪切成称作VPO,VP1和VP3(或分别是1AB,1D和1C)的三个蛋白质(Bel sham G.J.,Progress inBiophysics and Molecular Biology,1993,60,241-261)。随后在病毒粒体中,蛋白质VPO被剪切成两个蛋白质VP4和VP2(或分别是1A和1B)。蛋白质VPO转换成VP1和VP3的机理及成熟病毒粒体的形成是未知的。
蛋白质VP1,VP2和VP3分子量约26000道尔顿,而蛋白质VP4分子量小一些,约8000道尔顿。
衣壳蛋白的简单结合形成了原聚体或5S分子,它是口蹄疫病毒衣壳的基本组成成分。然后这个原聚体与五邻体复合形成12S分子。
通过12个12S五邻体装配,基因组RNA分子衣壳化产生病毒粒体,由此构成146S颗粒。
在RNA分子不出现在病毒衣壳内部时,也可以形成病毒衣壳。这样病毒衣壳是空的。空衣壳也被命名为颗粒70S。空衣壳形成可以在病毒复制过程中天然出现,或通过化学处理人工产生。
通常,抗口蹄疫疫苗若要起作用,它应该是多价的。只要在这个区域的主导类型改变,就应更新它的组成。而且,为了预防疾病在动物群中快速发展,提供具有早期免疫和高效保护的疫苗是可行的。
已提出试图研制有效抗口蹄疫疫苗的大量假说,研究路线和建议。目前在市场上仅有的疫苗是灭活病毒。
化学灭活处理可能涉及降低病毒免疫原性及中和抗体产生。所用剂量常常必须与佐剂一起使用以刺激免疫反应,但是取决于它们的组成,这些佐剂也可以引起炎症反应。灭活疫苗不能赋予长期免疫,这就是每年不得不进行加强注射的原因,或如果发生问题时,尤其当流行性爆发出现时,加强注射更频繁。
此外,在灭活疫苗产生期间,存在与不完全灭活和/或病毒逃离相联系的风险(例如,King等,1981,Nature,293,479-480)。
基因工程技术的发展使得设想亚单位疫苗和重组载体的产生成为可能。然而,尽管进行了大量尝试,到目前为止,在市场上没有一个这样疫苗出现。
在本研究工作以前,对天然空衣壳已进行了大量研究。特别是,Rowlands等(Rowlands等,J.Gen.Virol.,1975,26,227-238)已表明A10口蹄疫病毒粒体主要包括VP1,VP2,VP3和VP4四个蛋白质。比较而言,天然空衣壳(不是通过重组获得,而是从A10口蹄疫病毒培养物纯化获得)基本上包含未剪切蛋白质VPO;Rweyemanu(Rweyemamu等Archives of Virology,1979,59,69-79)就A-Pando口蹄疫病毒描述了相同的结果。在Tris-EDTA存在情况下透析后,离心得到的人工空衣壳不包含蛋白质VP4。根据Rowlands等,这些人工衣壳是轻微免疫原性的,而且天然空衣壳仅在用使其稳定的甲醛处理后是免疫原性的,然而,天然空衣壳在豚鼠中诱导的抗体反应是不持续的,如作者所注释。而且,Rowlands等和Rweyemamu等对需要稳定天然空衣壳持不同意见。对于Rweyemamu等而言,缺乏甲醛处理对于天然空衣壳抗原性水平没有不利影响。在豚鼠中,仅通过中和抗体的诱导检测免疫原性。
有些作者不同意关于空衣壳的想法,或甚至反对它。Doel T.R.和Chong W.K.T.(Doel等,Archiyes of Virology,1982,73,185-191)就是如此,他们从他们的实验结果中得出结论,即空衣壳免疫原性较弱,因为它们比亚型A24口蹄疫病毒粒体更不稳定。
在昆虫细胞中通过重组杆状病毒,编码衣壳蛋白前体P1的基因的表达与在大肠杆菌(E.coli)中编码P1的基因和蛋白酶3C一起表达比较(Grubman等,Vaccine,1993,11,825-829;Lewis等,J.Virol.,1991,65,6572-6580)。P1和3C在大肠杆菌(E.coli)中共表达引起空衣壳70S装配。这两个构建物的表达产物在豚鼠和猪中产生了中和抗体。用P1/杆状病毒构建物获得的效价低。这些相同表达产物在猪中诱导部分保护。然而,有些被保护抗口蹄疫的猪没有被保护抗攻击病毒的复制。
作者也发现大肠杆菌(E.coli)表达系统不能十四烷基化蛋白质且蛋白酶3C对细胞有毒。Lewis等断定,关于在动物中获得最大保护所需要的病毒组成和衣壳结构的基本问题还没有被解答。而且,Grubman等认为在形成疫苗前稳定空衣壳是必要的;在这点上,他们对从病毒培养物提取获得的空衣壳所遇到的问题(见上文)想法一致。
已利用由痘苗病毒组成的表达系统获得空口蹄疫病毒衣壳A10,A24和01K(Abrams等,J.Gen.Virol.,1995,76,3089-3098)。每个亚型产生两个主要构建物,包含或在早期/晚期痘苗病毒p7.5K启动子,或在细菌噬菌体T7启动子控制下编码前体P1和蛋白酶3C的核苷酸序列的片段。在人细胞培养物上仅进行重组和体外表达实验。用包含p7.5K启动子的构建物转化的细胞培养物不能分离重组痘苗病毒。原因未知。用包含T7启动子的构建物转化的细胞培养物已使获得重组痘苗病毒载体,表达病毒蛋白质VP0,VP1和VP3及获得空衣壳成为可能。这些实验目的是研究口蹄疫病毒形态发生学,不涉及疫苗产生和任何它们有效性的评估。
Chinsangaram等(Chinsangaram等,J.Virol.,1998,72(5)4454-4457)已实验了含有依赖hCMV-IE启动子,编码P1-2A和3C的盒子的质粒。给猪注射这些质粒,可诱导中和抗体,取决于动物组,2次注射后无保护作用,或4次注射后取得保护。作者推论通过细胞因子共表达改善诱导的免疫反应是可行的。
与这些还不能引起疫苗产生的方法比较,其它作者对口蹄疫病毒蛋白质VP 1本身、联合或合成肽的用途感兴趣。
用大肠杆菌(E.coli)色氨酸操纵子蛋白质LE与A24口蹄疫病毒蛋白质VP1片段(氨基酸131-157,单体形式)组成的融合蛋白在猪中进行研究工作(Morgan等,Am.J.Vet.Res.,1990,51,40-45),结果与用从A12蹄疫病毒(氨基酸137-168串连)构建类似融合蛋白质获得结果比较。Giavedoni等(Giavedoni等,J.Gen.Vior.,1991,72,967-971)描述了具有口蹄疫病毒01蛋白质VP1C末端区域的片断的融合蛋白质TrpE。Huang等描述了包含β-半乳糖苷酶和口蹄疫病毒0VP1序列的两个串连重复的重组融合蛋白质(Huang等,ViralImmunol.,1999,12(1),1-8)。
通过用病毒载体,即疱疹病毒或痘苗病毒(Vaccinia virus)也已获得包含部分或全部蛋白质VP1的融合蛋白质。特别地,CA-A-2,047,585用牛疱疹病毒产生含有口蹄疫病毒肽序列(VP1的第141至158位氨基酸与VP1的第200-213位氨基酸结合)的融合蛋白质,这个口蹄疫病毒肽序列与牛疱疹病毒糖蛋白gpIII融合。
已研制和实验含有以蛋白质VP1免疫原性区域为基础(关于这些区域,参见Strohmaier等,J.Gen.Virol.,1982,59,295-306)的合成肽的疫苗。
Agteberg等(Vaccine,1990,8,438-440)在转化大肠杆菌(E.coli)中产生了含有口蹄疫病毒A10蛋白质VP1两个免疫原决定簇(区域141-153和200-207)和大肠杆菌(E.coli)K-12膜蛋白PhoE的融合蛋白。随后,通过肌内途径给药豚鼠100μg这种融合蛋白,随后证实了可检测水平的中和抗体及攻击后的同源保护。
WO-A-99/66954描述了与A,O或亚洲型口蹄疫病毒VP1抗原位点共有序列(与口蹄疫病毒A12VP1区域134-168对应)对应的合成肽。
WO-A-98/12333描述了含有与口蹄疫病毒蛋白质部分序列对应的至少8个氨基酸的合成肽。
发明内容
本发明目的是提供有效和安全的抗口蹄疫疫苗。
本发明也试图提供稳定的抗口蹄疫疫苗。
本发明也试图提供低剂量有效的这种抗口蹄疫疫苗。
因此,本发明涉及抗口蹄疫疫苗,应用有效量口蹄疫病毒空衣壳作为抗原,这些空衣壳通过在真核细胞中表达编码衣壳的口蹄疫病毒基因组P1区域的互补DNA(cDNA)及编码蛋白酶3C的口蹄疫病毒基因组区域的cDNA获得,该疫苗进一步包括对兽医应用而言药学可接受的载体或赋形剂。通过定义,没有功能L蛋白质被表达,因而,该构建物不含有编码L的cDNA,优选地,不含有任何编码部分或全部L的cDNA。
优选地,表达P1和至少部分2A,优选全部2A。表达也可包括2A以外区域,可包括,例如部分2B,例如如实施例所示。
优选表达3C和至少部分3B蛋白质,例如两个相邻的3B蛋白质和3D的非功能部分,例如如实施例所示。
图3(SEQ ID NO.38)给出了与口蹄疫病毒A10株的P1(氨基酸2到737),2A(氨基酸738到753),3C(氨基酸913到1126)对应的核苷酸和氨基酸序列。可得到其它株的各种型和亚型序列,尤其是在实施例提到的Genbank中。
根据本发明第一个实施方式,空衣壳以有效量作为亚单位在疫苗中存在。优选地,通过表达依赖启动子,优选相同启动子的区域P1和3C的cDNA获得这些亚单位。优选地,它是诱导型启动子或病毒来源的晚期启动子。
尤其是,可用的表达载体包括例如病毒载体,优选痘病毒,尤其是痘苗病毒,或腺病毒,疱疹病毒和质粒载体。这些表达载体用于确保在原代真核细胞或细胞系中空衣壳的体外表达。一个替代实施方式在于用整合载体整合表达盒进入真核细胞。可用的真核细胞优选源于细胞系的细胞,例如细胞BHK-21,CHO,COS,RK13,Vero,MDBK,PK15。
特别地,诱导型启动子可以是噬菌体T7启动子,热休克启动子,金属硫蛋白启动子及能被蜕皮激素或类固醇诱导的启动子。当应用噬菌体T7启动子时,共表达噬菌体T7的聚合酶和空衣壳。
特别地,当用痘病毒作为载体时,病毒起源的晚期启动子可以是痘苗病毒P11K启动子,痘苗病毒P28K启动子,牛痘病毒P160K ATI。
优选地,亚单位通过冷冻或冷冻干燥保存和保藏。
尤其是,给药剂量的单位剂量可在0.3到30μg,尤其是,在0.5到20μg,优选地,1到10μg,更优选地,在1到5μg。
优选地,剂量体积可在0.2到5ml,更优选地在1到3ml。
亚单位疫苗吸收介质(赋形剂,载体)优选允许空衣壳保存的介质,例如DMEM型的。
尤其是,亚单位疫苗可通过肠胃外途径,优选通过皮下或肌内途径,或通过真皮途径,尤其是用无针装置(压力喷射器)给药。
本领域技术人员有精确定义用于每次接种计划的每个疫苗注射次数和剂量的必要能力。
优选地,这些疫苗包含一种和多种佐剂。
特别地,用于本发明亚单位疫苗的佐剂可以是(1)氢氧化铝,皂苷(Saponine)(例如QuilA),阿夫立定,DDA,(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物,或(3)疫苗可以以水包油,油包水或水包油包水乳剂形式制成。
尤其是,乳剂可以基于轻液体石蜡油(欧洲药典型)、类异戊二烯油,例如角鲨烷或角鲨烯;烯烃,特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油,带直链烷基的酸或醇形成的酯,更特别是植物油,油酸乙基酯,丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯),甘油三(辛酸酯/癸酸酯),丙二醇二油酸酯;分支脂肪酸酯或醇的酯,特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂,特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸),脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯,脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚,聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物,特别是尤其是L121(参照Hunter等,1995,“The Theory and Practical Application ofAdjuvants”(Steward-Tull,D.E.S主编)John Wiley andSons,NY,51-94;Todd等,Vaccine,1997,15,564-570)。
特别地,丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆(Carbomer)(Pharmeuropa8卷,2期,1996,6月)。本领域技术人员也可参考US-A-2 909 462(并入参考文献),这篇文献描述了通过至少有3个羟基,优选不多于8个羟基的多羟基化合物交联的这种丙烯酸聚合物,至少3个羟基的氢原子被至少有两个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选含有2-4个碳原子的基团,例如乙烯基,烯丙基,及其它烯键式不饱和基团。不饱和基团本身可含有其它取代基,例如甲基。以名字
Figure S01812070919960326D000081
(BFGoodrich,0hio,USA)出售的产品特别适合。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。其中可提到
Figure S01812070919960326D000082
974P,934P和971P。在顺丁烯二酸酐和链烯衍生物的共聚物中,优选是
Figure S01812070919960326D000083
(Monsanto)共聚物,这种共聚物是顺丁烯二酸酐和乙烯的直链或交联共聚物,例如通过二乙烯基醚交联。可参看J.Fields等,Nature,186:778-780,1960年6月4日(引入作为参考)。
在它们结构上,优选从下面通式的基本单位形成丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物及
Figure S01812070919960326D000084
其中:
-R1和R2,可以相同和不同,代表H或CH3
-x=0或1,优选x=1
-y=1或2,同时x+y=2
对于
Figure S01812070919960326D000086
x=0,y=2。对于卡波姆,x=y=1。
在最终疫苗组合物中,聚合物浓度范围是从0.01%到1.5%P/V,更优选从0.05%到1%P/V,优选0.1%到0.4%P/V。
根据本发明第二个实施方式,疫苗含有表达载体,此表达载体含有cDNA以便在体内产生空衣壳。优选地,通过插入质粒表达载体或病毒表达载体中依赖于启动子,优选相同启动子的P1和3C区域cDNA的表达,在体内获得这些空衣壳。优选启动子是强早期启动子或病毒起源的晚期启动子。
如果是病毒载体,优选使用病毒起源的晚期启动子。优选病毒载体是痘病毒,尤其是痘苗病毒,禽痘(例如,鸡痘(fowlpox),金丝雀痘)、浣熊痘、猪痘、山羊痘、或可复制腺病毒,特别是猪腺病毒,和疱疹病毒。对于痘病毒,病毒起源的晚期启动子尤其可以是痘苗病毒P11K启动子,痘苗病毒P28K,牛痘病毒P160K ATI。
通过定义,质粒表达载体(或质粒)包括含多核苷酸序列的DNA转录单元,此多核苷酸序列含有被表达的cDNA和体内表达必需元件。优选环形,超螺旋或非螺旋(uncoiled)质粒形式。线性形式也包括在本发明范围内。
如果是质粒,优选使用病毒来源或细胞来源的强早期启动子,特别是人或鼠来源的巨细胞病毒CMV-IE早期启动子,或可能是一些其它来源如鼠或豚鼠来源的早期启动子。也可用SV40病毒早期或晚期启动子或劳斯肉瘤病毒LTR启动子。细胞启动子可以是细胞骨架基因启动子,例如肌纤维蛋白(desmine)启动子或肌动蛋白启动子。
优选通过冷冻或冷冻干燥或以液体形式保存和贮藏该重组疫苗。
吸收介质(赋形剂,载体)优选0.9%NaCl盐水溶液或磷酸缓冲液。
本发明疫苗中每个剂量所用病毒载体的量至少是均103pfu,优选约104pfu到约1010pfu,例如,约105pfu到约109pfu,更优选地,约106pfu到约108pfu。
本发明疫苗单位剂量中所用质粒载体的量是约1μg到约2mg,优选是约50μg到约1mg。
优选地,剂量体积可在0.2ml到5ml,优选1ml到3ml。
本发明重组疫苗可通过常规给药途径用已知方法给药。根据本发明优选实施方式,通过肌内或皮下途径或用无针注射器通过真皮内途径给药。特别是对于病毒载体,优选肌内或皮下途径。对于病毒或质粒载体,也可用粘膜途径(例如,口,鼻)。
优选地,这些疫苗包含一个或多个佐剂。对于病毒载体,用丙稀酸或甲基丙稀酸聚合物,或顺丁烯二酸酐和链烯衍生物的聚合物,特别是卡波姆,尤其是
Figure S01812070919960326D000101
(这些佐剂在此前被描述过)是有益的。
对于质粒载体,通过加入化学式为:
的含有季铵盐的阳离子脂作为佐剂形成它们是有益的。其中,R1是有12到18个碳原子的直链饱和或不饱和脂肪族基团,R2是有2或3个碳原子的脂肪族基团,X是羟基或氨基。
优选它是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙铵);WO-A-9634109),优选与中性脂,尤其是DOPE(二油酰-磷脂酰基-乙醇胺;Behr J.P.1994,Bioconjugate Chemistry,5,382-389)结合形成DMRIE-DOPE。优选地,质粒提前与该佐剂混合,而且在给予动物前,这样形成的混合物需要时间复合,例如10-60分钟的时间,特别是大约30分钟。
当存在DOPE时,DMRIE:DOPE摩尔比优选范围是95∶5到5∶95,而且更优选是1∶1。
质粒:佐剂,尤其是DMRIE或DMRIE-DOPE的重量比范围尤其可以是50∶1到1∶10,特别是10∶1到1∶5,而且更优选是1∶1到1∶2。
如上所述本发明有或无佐剂的疫苗也可含有一种或多种细胞因子作为佐剂,这些细胞因子被加入或在体内表达。优选地,使用GM-CSF(英语:Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Fator(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子):Clark S.C等,Science1987.230.1229;Grant S.M.等,Drugs 1992.53.516),这可通过直接将GM-CSF蛋白质掺入疫苗组合物中,或优选地,在允许其在体内表达的情况下,在表达载体中常规插入编码GM-CSF的核苷酸序列而实现,所述表达载体例如包含编码FMDV抗原的核苷酸序列的载体或其它载体。优选用质粒作为表达载体。优选地,根据待接种的动物物种选择GM-CSF;因此,对于牛,用牛的GM-CSF(参照,例如Maliszewski等,Molec.Immunol.1988.25.843-850);对于猪,用猪的GM-CSF(参照,例如Inumaru S.和Takamatsu H.,Immunol.Cell.Biol.1995.75.474-476)。
对于表达GM-CSF载体的产生,在Genbank中可得到GM-CSF序列,猪是D21074,牛是U22385,绵羊是X55991。
本发明也涉及制备亚单位抗口蹄疫疫苗的方法,其中通过区域P1的cDNA的表达和区域3C的cDNA的表达产生这个病毒的空衣壳,而且它在对兽医应用适合的载体或赋形剂中,优选在至少一种佐剂存在情况下配制。
本发明也涉及本发明体外产生的空衣壳用于亚单位抗口蹄疫疫苗的制备,该疫苗进一步包括对兽医应用适合的载体或赋形剂,优选至少一种佐剂存在。
本发明也涉及抗口蹄疫的接种方法,包括施用本发明亚单位疫苗给动物,特别是农畜,特别是牛、绵羊、猪、山羊物种。上文定义了给药方法和剂量。
关于本发明亚单位疫苗的上述各种特征应用于这些不同对象。
本发明也涉及制备重组抗口蹄疫疫苗的方法,其中在导致空衣壳形成的条件下,产生在体内表达蛋白质P1和蛋白质3C的病毒或质粒载体,这些载体在对兽医应用适合的载体或赋形剂中,优选在至少一种佐剂存在情况下配制。
本发明也涉及本发明病毒或质粒载体在重组抗口蹄疫疫苗的制备中的用途,所述疫苗进一步包含对兽医应用适合的载体或赋形剂,优选至少一种佐剂存在。
本发明也涉及抗口蹄疫的接种方法,包括施用本发明重组疫苗给动物,特别是农畜,特别是牛、绵羊、猪、山羊物种。上文定义了给药方法和剂量。
关于使用病毒或质粒载体的本发明疫苗的上述各种特征也应用于这些不同对象。
本发明也涉及多价疫苗或疫苗的联合物(Combination),其在兽医应用适合的载体或赋形剂中含有本发明疫苗及至少一种抗其它型(例如O,A,C,SATl,SAT2,SAT3,亚洲型)、其它亚型(例如,A10,A12,A24,01)或其它变种口蹄疫病毒的其它疫苗,优选根据本发明的那些,而且优选有佐剂,尤其是上述那些佐剂。
本发明也涉及在兽医应用适合的载体或赋形剂中含有本发明疫苗及至少一种抗其它病原体,尤其是狂犬病病毒的疫苗的多价疫苗或疫苗联合物,而且优选有佐剂,尤其是上述那些佐剂。
本发明也涉及改进空口蹄疫病毒衣壳及所得疫苗的温度稳定性。
通过形成二硫桥,有利地确保了空衣壳的温度稳定性。
特别是,通过在衣壳的结构蛋白蛋白质VP2多肽序列中用半胱氨酸置换原始序列氨基酸获得这种改进,这个氨基酸位于氨基酶序列SEQID NO 38的第179位(图3)。通常,这个氨基酸位置在其它口蹄疫病毒中是相同的(特别是实施例中所述株系就是这种情况)。在其它病毒的序列中,该位置可能有极细微的不同,例如,可以是178或180。含有这个氨基酸的区域与α螺旋对应。为了识别或确认要突变的氨基酸,考虑到这个区域序列在不同口蹄疫病毒中结构非常保守的事实,将这个区域的氨基酸序列与序列SEQ ID NO 38中对应区域(例如,大约10个,或略微多一些,如10-20个氨基酸)排列对比。特别是通过比较株系01,A10,A24,A22,C1,C3,SAT2的序列,发现这个区域可写成如下所示:
X1 Gly X3 X4 Gly X6 Leu X8 X9 Ser X11 X12 Tyr Met
其中,
X4和X11是Tyr,His或Phe(疏水氨基酸)
X3,X8和X12是Val,Met,Ile,Thr或Ala
X6是His,Gln,Arg,Lys,Ser或Gly;这是要突变成Cys的氨基酸
X1是His或Lys(碱性氨基酸)
X9是Asp,Glu或Lys(酸性和碱性氨基酸)。
待突变的氨基酸是位于口蹄疫病毒A10 P1前体位置179的组氨酸。
这是口蹄疫病毒01 P1前体位置179的丝氨酸。
这是口蹄疫病毒C1 P1前体位置179的甘氨酸。
这是口蹄疫病毒A24 P1前体位置179的组氨酸。
通过转换,对应于起始密码子(它不出现在天然序列中,因此是被加上的)的甲硫氨酸序号是1。
在核苷酸水平上,这相当于用编码半胱氨酸的密码子置换原来的密码子,半胱氨酸密码子对cDNA是TGT或TGC密码子,或对RNA是UGU或UGC密码子。
因此,本发明也涉及引入这种修饰的核苷酸序列,尤其是cDNA。特别是,本发明涉及序列cDNA及含有它们的载体,该cDNA包含带有这种修饰的编码VP2(或VP0),更特别是P1的序列,例如编码P1-2A或P1-2A-部分2B的cDNA序列及含有它们的序列,例如含有它们及有允许它们表达的序列(启动子,ATG密码子)的序列。
本发明也涉及从这些核苷酸序列获得的氨基酸序列,及空衣壳和热稳定口蹄疫病毒(即有改进的热稳定性)。优选地,它们包含在天然衣壳和病毒中不存在的二硫桥。特别地,它们包含含有半胱氨酸而不是天然氨基酸的VP2蛋白质,如上所述。
根据本发明优选实施方式,上述疫苗是以这种修饰的应用为基础的,因此cDNA序列被修饰,结果,在体外或体内获得的空衣壳有二硫桥。
相似地,上述本发明所有的其它对象(方法,用途,过程)可以且优选有这些特征。
现在通过实施方式作为非限制实例并参考附图将更加详细地描述本发明。
附图及序列表说明
图1:牛中测定的抗口蹄疫A24中和抗体的效价图(表示为log)。
图2:得到的凝胶照片。
图3:与口蹄疫病毒A10株系P1(氨基酸2到737),2A(氨基酸738到753),3C(氨基酸913到1126)对应的核苷酸序列与氨基酸序列。
本发明构建的序列序列标识列表:
SEQ ID NO 1:寡核苷酸JCA305
SEQ ID NO 2:寡核苷酸JCA306
SEQ ID NO 3:寡核苷酸JCA307
SEQ ID NO 4:寡核苷酸JCA308
SEQ ID NO 5:寡核苷酸JCA309
SEQ ID NO 6:寡核苷酸JCA310
SEQ ID NO 7:寡核苷酸JCA311
SEQ ID NO 8:寡核苷酸JCA312
SEQ ID NO 9:寡核苷酸JCA313
SEQ ID NO 10:寡核苷酸JCA314
SEQ ID NO 11:寡核苷酸JCA315
SEQ ID NO 12:寡核苷酸JCA316
SEQ ID NO 13:寡核苷酸JCA317
SEQ ID NO 14:寡核苷酸JCA318
SEQ ID NO 15:寡核苷酸JCA319
SEQ ID NO 16:寡核苷酸JCA320
SEQ ID NO 17:寡核苷酸JCA321
SEQ ID NO 18:寡核苷酸JCA322
SEQ ID NO 19:寡核苷酸JCA323
SEQ ID NO 20:寡核苷酸JCA324
SEQ ID NO 21:寡核苷酸JCA325
SEQ ID NO 22:寡核苷酸JCA326
SEQ ID NO 23:寡核苷酸JCA327
SEQ ID NO 24:寡核苷酸JCA328
SEQ ID NO 25:寡核苷酸JCA329
SEQ ID NO 26:寡核苷酸JCA330
SEQ ID NO 27:寡核苷酸JCA331
SEQ ID NO 28:寡核苷酸JCA332
SEQ ID NO 29:寡核苷酸JCA333
SEQ ID NO 30:寡核苷酸JCA334
SEQ ID NO 31:寡核苷酸JCA335
SEQ ID NO 32:寡核苷酸JCA336
SEQ ID NO 33:寡核苷酸JCA337
SEQ ID NO 34:寡核苷酸JCA338
SEQ ID NO 35:寡核苷酸JCA339
SEQ ID NO 36:寡核苷酸JCA340
SEQ ID NO 37:寡核苷酸JCA341
SEQ ID NO 38:与口蹄疫病毒A10P1(氨基酸2到737),2A(氨基酸738到753),3C(氨基酸913到1126)对应的氨基酸序列。
SEQ ID NO 39:与口蹄疫病毒A10P1,2A,3C对应的核苷酸序列。
SEQ ID NO 40:寡核苷酸JCA342
SEQ ID NO 41:寡核苷酸JCA343
实施例
用Sambrook J.等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版.Cold Spring Harbor Laboratory.Cold Spring Harbor.NewYork.1989)所述标准分子生物学技术(克隆,用限制性酶消化,单链互补DNA合成,聚合酶链式反应,用DNA聚合酶进行寡核苷酸延伸......)产生所有构建物。用试剂盒(BIO101Inc.La Jolla,CA)分离和纯化用于本发明的所有限制性片段及聚合酶链式反应(PCR)的各种片段。
可从GenBank数据库获得口蹄疫病毒的核苷酸与多肽序列,尤其是序号X00429(对于A10),X00871(对于O1K),AJ251476(对于A24),AJ133357(对于C Spain Olot)。
实施例1:口蹄疫病毒株系培养
为了扩增它们,将名为O1K(Forss等,1984,Nucleic AcidsRes.,12(16),6587-6601),A24(Weddell等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,2618-2622),A10(Carroll等,1984,Nucleic Acids Res.,12(5),2461-2472),C Spain Olot(Toja等,1999,Virus Res.,64(2),161-171)的口蹄疫病毒株系在BHK-21细胞(幼仓鼠肾,可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号为CCL-10得到)上培养。
细胞BHK-21培养在含补加了1%酵母提取物和5%小牛血清的MEM伊格尔培养基(Eagle Medium)的Falcon 25cm2上,每ml中含有大约100,000细胞。细胞在37℃下培养。
3天后,细胞层达到铺满,然后用无血清但是补加0.4%乳清蛋白水解产物和0.3%蛋白胨(pH7.4)的MEM伊格尔培养基(Eagle Medium)置换培养基,以1pfu对约20个细胞的量加口蹄疫病毒。
当完成致细胞病变效应(CPE)时(通常培养开始后24小时),收集病毒悬浮液,然后通过离心澄清病毒悬浮液,-70℃冷冻。为了产生一批病毒,通常需要3到4次连续过程。这批病毒贮藏在-70℃。
对于每株系口蹄疫病毒重复这些操作。
实施例2:从口蹄疫病毒株系提取病毒RNA
冷冻后,用“High PureTM Viral RNA Kit”(Cat#1858 882,Roche Molecular Biochemicals)溶液,按照制造商提取步骤说明提取包含在100ml实施例1得到的口蹄疫病毒株系A24病毒悬浮液中的病毒RNA。用10ml无RNase的无菌蒸馏水重悬浮提取最后得到的RNA残渣。
在同样条件下,提取每个口蹄疫病毒株系的病毒RNA。
实施例3:口蹄疫病毒A10空衣壳表达质粒的构建
用“Gene Amp RNA PCR Kit”(Cat# N 8080017,PerkinElmer,Norwalk,CT 06859,USA)在供应商说明的条件下,合成口蹄疫病毒A10的互补DNA(cDNA)。对于第一个片断,用50μl口蹄疫病毒A10病毒RNA悬浮液(实施例2)及下面寡核苷酸
JCA305(37mer)(SEQ ID NO 1)
5′TTTTGATATCATGGGTGCTGGGCAGTCCAGCCCAGCA 3′
和JCA306(21mer)(SEQ ID NO 2)
5′TTCACGACGAAAGTACTATCC 3′
进行反转录-扩增链式反应(“TI-ACP”或“RT-PCR”反应)。
这对寡核苷酸能使EcoRV限制性位点及ATG起始密码子被引入编码P1的核苷酸序列中。
在寡核苷酸JCA306与RNA模板杂交后,通过延伸寡核苷酸JCA306合成cDNA第一链。
第一链cDNA合成条件是:42℃,15分钟,然后99℃,5分钟,最后4℃,5分钟。在寡核苷酸对JCA305和JCA306存在条件下,PCR反应条件是95℃,2分钟,然后35个循环(95℃,1分钟,然后62℃,1分钟,72℃,2分钟),最后72℃,7分钟以产生2583bp片段。
用EcoRV,然后用XhoI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后分离约2550bp片段EcoRV-XhoI。这个片段命名为片段A。
对于第二个片段,用50μl口蹄疫病毒A10病毒RNA悬浮液(实施例2)及下面寡核苷酸
JCA307(21mer)(SEQ ID NO 3)
5’CTGAAGGACCCTACTCCGGGC 3’
and JCA308(37mer)(SEQ ID NO 4)
5′TTTTAGATCTTCAAAGCTTTGTTTTGCGCATCACGTG 3′
进行PCR反应。
这对寡核苷酸允许BglII限制性位点及终止密码子被引入编码蛋白酶3C的核苷酸序列中。
在寡核苷酸JCA308与RNA模板杂交后,通过延伸寡核苷酸JCA308合成cDNA第一链。
第一链cDNA合成条件是:42℃,15分钟,然后99℃,5分钟,最后4℃,5分钟。在寡核苷酸对JCA307和JCA308存在条件下,PCR反应条件是95℃,2分钟,然后35个循环(95℃,1分钟,然后62℃,1分钟,72℃,2分钟),最后72℃,7分钟以产生936bp片段。
用BglII,然后用XhoI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离约900bp片段BglII-XhoI。这个片段命名为片段B。
用预先用BglII和EcoRV消化过的表达质粒pVR1012(Hartikka J.等,1997,Human Gene Therapy,7.1205-1217)连接片段A和片段B得到质粒pJCA161(8327bp)。这个质粒包含在人巨细胞病毒或hCMV-IE(即早期人巨细胞病毒)早期启动子控制下的编码部分多蛋白的插入片段,这个部分多蛋白足以产生具有自我装配能力的衣壳蛋白。
实施例4:口蹄疫病毒亚型O1K,C Spain Olot及A24空衣壳表达质粒的构建
如实施例3所述合成口蹄疫病毒亚型O1K,C Spain Olot及A24的cDNA。
对于O1K,寡核苷酸对:
JCA309(37mer)(SEQ ID NO 5)
5′TTTTGATATCATGGGGGCTGGACAATCCAGTCCAGCG 3′
和JCA310(21mer)(SEQ ID NO 6)
5′TTCACGACGAAGGTGCTGTCC 3′
被用于第一个PCR反应,产生2583bp片段,在消化和分离后,产生约2550bp的EcoRV-XhoI片段。这个片段称为片段C。
在第二个PCR反应中,寡核苷酸对:
JCA311(18mer)(SEQ ID NO 7)
5′AAGGACCCTACGCCGGAC 3′
和JCA312(34mer)(SEQ ID NO 8)
5′TTTTAGATCTTCAAAGCTTGGTTTTGCGCATCAC 3′
被用于产生930bp片段,在消化和分离后,产生约900bp的BglII-XhoI片段。这个片段称为片段D。
用预先用BglII和EcoRV消化过的表达质粒pVR1012连接片段C和片段D得到质粒pJCA162(8327bp)。
对于C Spain Olot,寡核苷酸对:
JCA313(37mer)(SEQ ID NO 9)
5′TTTTGATATCATGGGAGCTGGGCAATCCAGCCCAGCG 3′
和JCA314(23mer)(SEQ ID NO 10)
5′TTCACGACAAACGTGCTGTCCAG 3′,
被用于第一个PCR反应,产生2568bp片段,在消化和分离后,产生约2540bp的EcoRV-XhoI片段。这个片段称为片段E。
在第二个PCR反应中,寡核苷酸对:
JCA315(21mer)(SEQ ID NO 11)
5’AGAGCAACCGCAAGCTGAAGG 3’
和JCA316(34mer)(SEQ ID NO 12)
5′TTTTAGATCTTCAAAGCTTGGTTTTGCGCATTAC 3′,
被用于产生947bp片段,在消化和分离后,产生约900bp的BglII-XhoI片段。这个片段称为片段F。
用预先用BglII和EcoRV消化过的表达质粒pVR1012连接片段E和片段F得到质粒pJCA163(8312bp)。
对于A24,寡核苷酸对:
JCA317(37mer)(SEQ ID NO 13)
5′TTTTGATATCATGGGGGCCGGGCAATCCAGTCCGGCG 3′
和JCA318(31mer)(SEQ ID NO 14)
5′TTTTCTCGAGGGGGGCCGGCACGTGAAAGAG 3′,
被用于第一个PCR反应,产生约2630bp片段,在消化和分离后,产生约2580bp的EcoRV-XhoI片段。这个片段称为片段G。
在第二个PCR反应中,寡核苷酸对:
JCA319(31mer)(SEQ ID NO 15)
5’TTTTCTCGAGGGACCGGTGAAGAAGCCTGTC 3’
和JCA320(37mer)(SEQ ID NO 16)
5′TTTTAGATCTTCAGCGGCGGAACAGCGCTTTGTCCTC 3′
被用于产生约950bp片段,在消化和分离后,产生约940bp的BglII-XhoI片段。这个片段称为片段H。
用预先用BglII和EcoRV消化过的表达质粒pVR1012连接片段G和片段H得到质粒pJCA164(大小约8400bp)。
实施例5:A24/A10的表达质粒的构建
如实施例3所述合成口蹄疫病毒A24的cDNA。
用50μl口蹄疫病毒A24RNA悬浮液(实施例2)及下面寡核苷酸:
JCA317(37mer)(SEQ ID NO 13)
和JCA321(24mer)(SEQ ID NO 17)
5′TTTGACCTAACGTCGGAGAAGAAG 3′
进行PCR反应。
产生约2300bp的片段。
然后,用EcoRV消化,然后用HindIII消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离约1710bp的EcoRV-HindIII片段。这个片段称为片段I。
用HindIII消化,然后用ApaI消化2300bp片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离约550bp的HindIII-ApaI片段。这个片段称为片段J。
用ApaI消化质粒pJCA161(实施例3),然后用EcoRV消化,琼脂糖凝胶电泳后,分离约5960bp的ApaI-EcoRV片段。这个片段称为片段K。
片段I,J和K被连接在一起产生质粒pJCA165(8333bp)。该质粒含有编码多蛋白A24的结构部分和A10的酶性部分的插入片段,这些部分足以产生具有自我装配能力的衣壳蛋白。
实施例6:重组痘苗病毒vV100(A10)的构建
用质粒pJCA161(实施例3)作为模板和下面寡核苷酸:
JCA322(37mer)(SEQ ID NO 18):
5’TTTTGAATTCATGCAGTCCAGCCCAGCAACCGGCTCG 3’
和JCA323(44mer)(SEQ ID NO 19):
5’TTTTGAATTCATAAAAATCAAAGCTTTGTTTTGCGCATCACGTG 3’
进行PCR反应扩增约3462b的片段。
这对寡核苷酸能在扩增片段每个末端引入限制性位点EcoRI。
在这对寡核苷酸存在的条件下,PCR反应条件是95℃,2分钟,然后35个循环(95℃,1分钟,然后62℃,1分钟,72℃,2分钟),最后72℃,7分钟。
用EcoRI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离约3448bp片段EcoRI-EcoRI。
用下面寡核苷酸对在痘苗病毒(株系WR)基因组上进行PCR反应:
JCA342(28mer)SEQ ID NO 40
5’TTTTATCGATTCATTGATAGTACCAAAT 3’
JCA343(20mer)SEQ ID NO 41
5’ATTCTACAGTTCTAACATCG 3’.
PCR反应条件同前面一样。产生488bp片段。用ClaI和EcoRI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离367bp片段。然后将这个最后片段插入预先用ClaI和EcoRI消化过的质粒pGS20(Mackett等,J;Virol.,1984,49,857-864)中。用EcoRI使由此获得的质粒线性化,在此插入3448bp片段EcoRI-EcoRI,得到载体pJCA166。
有利地,本领域技术人员也能用含有痘苗病毒P11K启动子及痘苗病毒TK基因的两个分支(一个位于这个启动子上游,另一个位于EcoRI位点下游)的质粒pvFOHC(Newton等,在:Vaccines 87,1987,Chanock等编辑,Cold Spring Harbor Laboratory,12-21)。
除了TK基因外,也可用痘苗病毒中其它的插入位点,例如,尤其是基因HA,M2L。
将质粒pJCA166转染进入用痘苗病毒(株系WR,ATCC号VR-119)感染的COS细胞(源于非洲绿猴的肾细胞,保藏在美国典型培养物中心(ATCC),保藏号:ATCC CRL-1651)。
在含用10%胎牛血清,2mM谷氨酰胺,500Ul/μg/ml青霉素/链霉素,12.5μg/ml两性霉素(所有都是最终浓度)补料的DMEM培养基(Dulbecco’s修改的伊格尔培养基(Eagles Medium))的培养皿中培养COS细胞,每ml约含有100,000细胞,+37℃,含有5%CO2的空气中,16小时。当细胞达到75%铺满时,除去培养基。然后,以3DICC50/细胞的感染复数(moi),用痘苗病毒(株系WR)感染COS细胞,然后温育培养皿1小时。随后,用无血清的DMEM培养基洗培养物。然后每个培养皿中加入400μl质粒/脂质转染试剂/Optimen混合物(8μl脂质转染试剂,192μl Optimen及200μl蒸馏水,含有8μg质粒),质粒是pJCA166。培养皿在+37℃,含有5%CO2的空气中温育4到6小时,每30分钟搅拌。然后每个培养皿中加入补加10%胎牛血清的DMEM培养基,培养皿在+37℃,含有5%CO2的空气中温育16小时。
然后收集细胞,冷冻,贮藏在-20℃。
在含有5mlDMEM培养基的6cm培养皿中在143TK-人细胞培养物(可从美国典型培养物保藏中心,保藏号CRL-8303获得)上进行重组痘苗病毒的筛选,在+37℃,含有5%CO2的空气中温育16小时。
加入先前获得的转染悬浮液。在+37℃温育1小时后,每ml加25μg 5-溴脱氧尿苷(BUdR)以筛选重组痘苗病毒TK-。延长温育48小时以允许重组细胞发育。进行3次重组痘苗病毒筛选/纯化的连续循环。
用143TK-细胞接种有DMEM培养基的24孔板,每ml DMEM培养基含有25μg 5-溴脱氧尿苷(BUdR)。+37℃温育2小时后,每个吸取到2μl PBS缓冲液中的约10个斑点被转移进10个孔中。然后温育斑点48-72小时。
温育后,用“Gene Releaser”方法(Cambio),利用寡核苷酸JCA305和JCA308在每个孔的培养上清液上进行PCR反应。
对于发现是阳性的孔,重组病毒进行新一轮纯化。扩增称作vV100的重组病毒,贮藏在-70℃或-20℃。
实施例7:O,C和A型疫苗重组病毒的构建
如实施例6所述进行O,C,A型口蹄疫病毒重组痘苗病毒的构建。
对于O型:
用质粒pJCA162(实施例4)作为模板和下面寡核苷酸:
JCA324(37mer)(SEQ ID NO 20):
5’TTTTGAATTCATGGGGGCTGGACAATCCAGTCCAGCG 3’
和JCA325(41mer)(SEQ ID NO 21):
5’TTTTGAATTCATAAAAATCAAAGCTTGGTTTTGCGCATCAC 3’
进行PCR反应,以扩增约3470bp片段。
消化和分离后,3448bp的片段EcoRI-EcoRI插入预先用EcoRI消化过的质粒pvFOHC,产生供体质粒pJCA167。
根据实施例6所述技术完成重组。用寡核苷酸JCA309和JCA312通过PCR反应筛选阳性区域。扩增一个区域,获得的重组病毒株被命名为vV101。
对于C型:
用质粒pJCA163(实施例4)作为模板和下面寡核苷酸:
JCA326(37mer)(SEQ ID NO 22):
5’TTTTGAATTCATGGGAGCTGGGCAATCCAGCCCAGCG 3’
和JCA327(41mer)(SEQ ID NO 23):
5’TTTTGAATTCATAAAAATCAAAGCTTGGTTTTGCGCATTAC 3’
进行PCR反应,以扩增约3460bp片段。
消化和分离后,3439bp的片段EcoRI-EcoRI插入预先用EcoRI消化过的质粒pvFOHC,产生供体质粒pJCA168。
根据实施例6所述技术进行重组。用寡核苷酸JCA313和JCA316通过PCR反应筛选阳性斑。扩增斑,获得的重组病毒株被命名为vV102。
对于A型:
用质粒pJCA164(实施例4)作为模板和下面寡核苷酸:
JCA328(37mer)(SEQ ID NO 24):
5’TTTTGAATTCATGGGGGCCGGGCAATCCAGTCCGGCG 3’
和JCA329(44mer)(SEQ ID NO 25):
5’TTTTGAATTCATAAAAATCAGCGGCGGAACAGCGCTTTGTCCTC 3’
进行PCR反应,以扩增约3550bp片段。
消化和分离后,约3530bp的片段EcoRI-EcoRI插入预先用EcoRI消化过的质粒pvFOHC,产生供体质粒pJCA169。
根据实施例6所述技术进行重组。用寡核苷酸JCA317和JCA320通过PCR反应筛选阳性斑。扩增斑,获得的重组病毒株被命名为vV103。
A型变种:
用质粒pJCA165(实施例5)作为基质和下面寡核苷酸:
JCA328(SEQ ID NO 24)(37mer)
和JCA325(SEQ ID NO 21)(37mer)
进行PCR反应,以扩增约3480bp片段。
消化和分离后,约3463bp的片段EcoRI-EcoRI插入预先用EcoRI消化过的质粒pvFOHC,产生供体质粒pJCA170。
根据实施例6所述技术进行重组。用寡核苷酸JCA317和JCA312通过PCR反应筛选阳性斑。扩增斑,获得的重组病毒原种被命名为vV104。
实施例8:用于体外表达的疫苗重组病毒的构建(A10)
用限制性酶EcoRV和BglII消化质粒pJCA161(实施例3)。琼脂糖凝胶电泳后,分离约3450bp大小的片段EcoRV-BglII。这个片段通过用Klenow聚合酶处理制成“平末端”,然后连接到质粒pBG200(Abrams,等1995,J.Gen.Virol.,76,3089-3098)中(这个质粒预先用BamHI消化,而且通过用Klenow聚合酶处理制成平末端)产生供体质粒pJCA171。
质粒pBG200含有T7噬菌体启动子,T7转录终止子和痘苗病毒TK基因的两个分支,一个位于这个启动子上游,另一个位于终止子的下游(本领域技术人员可以参考Fuerst等,Molecular and CellularBiology,1987,7,2538-2544来构建pBG200)。在质粒pBG200上BamHI插入位点位于T7启动子和终止子之间。
用实施例6所述技术进行重组。用寡核苷酸JCA305和JCA308通过PCR反应筛选阳性斑。扩增斑,获得的重组病毒原种被命名为vV105。
在-20℃或-70℃保藏重组病毒原种。
实施例9:体外表达O,C,和A型的重组痘苗病毒的构建
如实施例8所述进行O,C,A型口蹄疫病毒用于体外表达的重组痘苗病毒的构建。
对于O型:
用限制性酶EcoRV和BglII消化质粒pJCA162(实施例4)。分离后,通过用Klenow聚合酶处理,把约3450bp大小的EcoRV-BglII片段制成平末端,然后连接到质粒pBG200上(质粒pBG200预先用BamHI消化,而且通过用Klenow聚合酶处理制成平末端)产生供体质粒pJCA172。
用寡核苷酸JCA309和JCA312通过PCR反应筛选斑,扩增斑,获得的重组病毒原种被命名为vV106。
对于C型:
用限制性酶EcoRV和BglII消化质粒pJCA163(实施例4)。分离后,通过用Klenow聚合酶处理,把约3440bp大小的EcoRV-BglII片段制成平末端,然后连接到质粒pBG200上(质粒pBG200预先用BamHI消化,而且通过用Klenow聚合酶处理制成平末端),产生供体质粒pJCA173。
用寡核苷酸JCA313和JCA316通过PCR反应筛选斑,扩增斑,获得的重组病毒原种被命名为vV107。
对于A型:
用限制性酶EcoRV和BglII消化质粒pJCA164(实施例4)。分离后,通过用Klenow聚合酶处理,把约3520bp大小的EcoRV-BglII片段制成平末端,然后连接到质粒pBG200上(质粒pBG200预先用BamHI消化,而且通过用Klenow聚合酶处理制成平末端),产生供体质粒pJCA174。
用寡核苷酸JCA317和JCA320通过PCR反应筛选斑,扩增斑,获得的重组病毒株被命名为vV108。
A型变种:
用限制性酶EcoRV和BglII消化质粒pJCA165(实施例5)。分离后,通过用Klenow聚合酶处理,把约3450bp大小的EcoRV-BglII片段制成平末端,然后连接到质粒pBG200上(质粒pBG200预先用BamHI消化,而且通过用Klenow聚合酶处理制成平末端),产生供体质粒pJCA175。
用寡核苷酸JCA317和JCA312通过PCR反应筛选斑,扩增斑,获得的重组病毒原种被命名为vV109。
实施例10:空病毒衣壳的产生和纯化
在37℃,在有10%胎牛血清,2mM谷氨酰胺,500UI/μg/ml青霉素/链霉素,12.5μg/ml两性霉素补料的20ml DMEM培养基的12个175cm2Falcons中培养兔肾细胞RK13(可从美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏号CCL-37得到)。在铺满时,每个Falcon含有约2×107个细胞。
然后,在每个Falcon中以10DICC50/细胞的感染复数(moi)加入每个重组痘苗病毒vTF7-3和vV108(实施例9)。
在37℃维持病毒培养物约24小时,直到获得100%致细胞病变效应。
重组痘苗病毒vTF7-3(可从美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏号VR-2153得到)含有痘苗病毒(Fuerst等,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,8122-8126)p7.5K启动子控制下的噬菌体T7RNA聚合酶。
T7RNA聚合酶的产生诱导T7启动子控制下插入物的表达。因此,产生口蹄疫病毒P1前体和3C蛋白酶,同时空衣壳自我装配。
然后,收集病毒悬浮液,通过离心澄清(每分钟4,000转(rpm),4℃下,30分钟)。
在0℃,30ml含有0.5%乙基苯基聚乙二醇(NP40)(Roche,Cat.No.1754599)的磷酸缓冲液(40mM磷酸钠,100mM氯化钠,pH7.6)中重悬浮残渣。在0℃,在冰上进行细胞溶解20分钟。
在4℃,10000rpm离心20分钟后,收集细胞碎屑。在0℃,冰上保存上清液。在6ml磷酸缓冲液中重悬浮细胞碎屑。用氯仿(等体积)进行提取。从这个提取获得的水相与先前获得上清液混合,堆放在15%蔗糖垫(2ml)上,用Beckman SW28转子(28000rpm,5小时,4℃)离心。吸取残渣在1ml磷酸缓冲液中,贮藏在4℃。
重悬浮得到的残渣,然后用20μl RNase(10mg/ml)在冰上处理10分钟。然后加10μl 10%乙基苯基聚乙二醇(NP40),该混合物在冰上放置10分钟。然后,用等体积氯仿提取悬浮液。回收水相(1ml),放在15-45%蔗糖梯度(约12ml)上,用Beckman SW40转子(40000rpm,5小时,12℃或18000rpm,16小时,12℃)离心。
然后,分级梯度成14个0.8ml级分。在波长220nm下,测量吸收值。收集与吸收峰对应的级分。这些级分含有空病毒衣壳A24。通过蛋白质印迹(Western Blot)检验收集的蛋白特异性。
通过这个实施例所述完全相同方法,通过分别用vV106(实施例9),vV105(实施例8),vV107(实施例9)和vV109(实施例9)替代重组痘苗病毒vV108得到亚型O1K,A10,C Spain Olot及A24/A10的空病毒衣壳。
应用在疫苗中之前,在4℃保藏由此获得的蛋白质级分。
实施例11:亚单位疫苗的产生
用14.01ml DMEM配制实施例10获得的13.2ml含有总计165g空口蹄疫病毒衣壳的蔗糖梯度级分,所述DMEM还含有27.5ml 1.5%氢氧化铝(Al(OH)3)和0.29ml皂苷。
由此得到55ml在两个烧瓶间分配,第一个烧瓶30ml,第二个烧瓶25ml。5ml剂量含有15μg空病毒衣壳,同时含有360溶血单位的皂苷。
用牛血清白蛋白溶液(BSA)做对照,通过分光光度测定法测定220nm吸收测定空颗粒量。
实施例12:重组疫苗的产生
为了制备疫苗,重组痘苗病毒vV100到vV105(实施例6和7)可与卡波姆溶液混合。优选卡波姆是BF Goodrich,Ohio,USA的CarbopolTM 974P(分子量约为3000000)。
首先,在含有1g/L氯化钠的蒸馏水中制备1.5%CarbopolTM 974P母液。然后,用这个母液在生理盐水中制备4mg/ml的CarbopolTM 974P溶液。用适量生理盐水一步或连续多步混合该母液,每步用1N(或更浓的)氢氧化钠溶液调pH以获得最终pH7.3-7.4。
由此获得的备用CarbopolTM 974P溶液可用于吸收冻干重组病毒或稀释重组病毒浓缩母液。例如,为了获得每1ml剂量含有108pfu病毒悬浮液,稀释病毒母液获得108,3pfu/ml效价,然后用等份所述备用4mg/ml CarbopolTM 974P溶液稀释它。
实施例13:DNA疫苗的产生
如Sambrook等(1989)所述,通过乙醇沉淀浓缩含有一个或多个质粒pJCA161到pJCA165(实施例3到4)的DNA溶液。溶解DNA残渣到0.9%NaCl溶液中以获得1mg/ml浓度。通过溶解DMRIE-DOPE冻干物在适量无菌水(DMRIE或N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙铵)(WO-A-9634109);DOPE或二油酰-磷脂酰基-乙醇胺(Behr J.P.,1994,Bioconjugate Chemistry,5,382-389))中制备0.75mM DMRIE-DOPE溶液。
通过用0.9%NaCl中的1mg/ml DNA溶液稀释等部分0.75mMDMRIE-DOPE溶液形成质粒DNA-脂质复合物。用弯形26G针沿含阳离离脂溶液的烧瓶壁逐步加DNA溶液,防止起泡沫。两种溶液一混合就轻轻摇动烧瓶。最后,获得含有0.375mM DMRIE-DOPE和500μg/ml质粒的组合物。
对此前所述所有程序,所用所有溶液应该处于周围环境温度中。在免疫动物前,DNA/DMRIE-DOPE复合在环境温度下进行30分钟。
实施例14:对牛的实验
给一组6头牛施用抗口蹄疫病毒A24疫苗,所述疫苗是在实施例11中从由vV109表达的空病毒衣壳获得的。
通过皮下途径,在颈部每一侧,对着肩部进行注射。前5头动物给5ml剂量(2×2.5ml),第6头牲畜给4ml(2×2.0ml)。在第6头动物耳上刺标记“UC10”。
在第一次接种后31天,通过皮下途径,在每头动物颈部每一侧进行二次注射。(前5头牲畜4ml(2×2.0ml),第6头牲畜0.5ml(2×0.25ml))。
在第0(第一次接种当天),6,13,20,31,38,42,52天及临屠宰前,从接种牲畜采集血样。
用A24口蹄疫病毒以104,4感染剂量/ml的效价(在牛甲状腺细胞上的效价),通过舌皮内途径(intradermolingual route)(每个舌头10×0.10ml)攻击所有接种动物和2头非接种对照动物。
每天检查每头动物温度(表2)及舌,口和蹄上的口蹄疫症状(表1)。检验抗口蹄疫病毒A24中和抗体的水平。
表1:病毒攻击后,牛中口蹄疫临床症状的检验
  动物/攻击后的天数   0   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
接种的UC6   T04F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   ND   T14F0   T04F0   ND   T04F0
  接种的UC7   T04F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   ND   T14F0   T04F0   ND   T04F0
  接种的UC8   T04F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   ND   T14F0   T04F0   ND   T04F0
  接种的UC9   T04F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   ND   T14F0   T04F0   ND   T04F0
  接种的UC10   T04F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   ND   T14F0   T04F0   ND   T04F0
  接种的UC11   T04F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   T14F0   ND   T14F0   T04F0   ND   T04F0
  对照UC79   T04F0   T14F0   T24F0   T24F0   T24F0   T24F+   T24F+   T24F+   T24F+   T24F+   T24F+
  对照UC80   T04F0   T14F0   T24F0   T24F0   T24F0   T24F+   T24F+   T24F+   T24F+   T24F+   T24F+
代码说明:
T0:健康舌头,无病毒复制症状,在注射位点无痕迹。
T1:健康舌头,无病毒复制症状,在注射位点仅有外伤。
T2:在舌头上出现原发损害。
T3:在舌头上或口其它部分出现原发和继发性损害。
4F0:在所有四个蹄上无口蹄疫症状。
4F+:在所有四个蹄上出现水疱。
ND:没进行临床试验。
这些结果表明接种的动物都被保护抗口蹄疫病毒A24感染,即使在注射位点局部。给较弱加强注射的动物UC10与其它动物相比也是被保护的。相反,对照动物易受病毒感染,在攻击后第2天在口部及攻击后第5天在蹄部产生可见口蹄疫。
表2:病毒攻击后,检测牛的温度(℃)
 动物/攻击后天数   0   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
 接种的UC6   38,6   38,6   38,2   37,9   38,2   38,6   38,5   38,7   38,5   39,1   39,1
 接种的UC7   38,7   38,5   38,4   38,2   38,3   38,2   38,3   38,5   38,6   38,4   38,0
 接种的UC8   38,3   39,0   38,3   38,5   38,6   38,6   38,5   38,3   38,2   38,0   38,6
 接种的UC9   38,8   38,7   39,0   38,6   38,4   38,5   38,3   38,4   38,6   38,8   39,0
 接种的UC10   39,3   38,8   38,9   38,6   38,6   38,7   38,8   39,0   38,7   39,2   39,1
 接种的UC11   38,6   38,8   38,4   38,3   38,3   38,0   38,2   38,0   38,3   38,7   38,8
 对照UC79   39,0   40,7   41,0   39,5   39,6   38,8   38,4   38,6   38,4   38,6   38,8
 对照UC80   39,1   39,8   40,6   39,9   39,4   38,9   38,6   38,5   38,9   38,8   38,6
这些结果表明接种的牛不存在任何高热,即使给予比其它动物较弱加强注射的动物UC10也不存在任何高热。相反,对照牛有高热,攻击后两天达到高峰,接着返回正常体温。
图1表示接种的牛产生中和性抗口蹄疫病毒A24抗体的强应答,初次接种后大约13天出现第一个高峰。加强注射后,观察到中和抗体的强应答。在给予与其它动物相比较弱的加强注射的动物UC10中也观察到这种应答。攻击后,抗体水平不增加,表明FDMV A24病毒没有进行足以刺激抗体应答的复制。
总之,从重组痘苗病毒表达载体获得的空病毒衣壳产生的抗口蹄疫A24疫苗在牛中诱导初次免疫应答和二次免疫应答。攻击后,这些牛完全被保护抗口蹄疫和病毒复制。
实施例15:A10构建物的诱变
用寡核苷酸和PCR反应进行针对A10构建物的诱变,目的是用编码半胱氨酸的密码子置换编码组氨酸179(质粒pJCA161编码的多蛋白中的位置,实施例3;甲硫氨酸起始密码子序号是1)的密码子。
用质粒pJCA161作为模板和下面寡核苷酸:
JCA309(37mer)(SEQ ID NO 5)
和JCA330(27mer)(SEQ ID NO 26):
5’TGAGTCCACCAGGCACCCGAAGACACC 3’
进行PCR反应,扩增559bp片段,这个片段称为片段L。
PCR反应第一循环条件是:95℃,2分钟,然后62℃,2分钟,然后72℃,3分钟。
后面35个循环PCR反应条件与实施例6所述是同样的。
用质粒pJCA161作为模板和下面寡核苷酸:
JCA331(27mer)(SEQ ID NO 27):
5’GGTGTCTTCGGGTGCCTGGTGGACTCA 3’
和JCA332(36mer)(SEQ ID NO 28):
5’AAAGTCTTTGCCGGCGCTAGCCGACACTAACAAGGT 3’
进行二次PCR反应,扩增1020bp片段,这个片段称为片段M。
PCR反应条件同实施例6所述。
用片段L和M作为模板,与寡核苷酸JCA309(SEQ ID NO 5)和JCA332(SEQ ID NO 28)进行第三次PCR反应,扩增1552bp片段。PCR反应条件同实施例6所述。
然后,用EcoRV和NheI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离1527bp片段EcoRV-NheI。这个片段称为片段N。
用NheI,然后是EcoRV消化质粒pJCA161,琼脂糖凝胶电泳后,分离约6800bp片段NheI-EcoRV。将这个片段和片段N连接在一起产生质粒pJCA176(8327bp)。这个质粒含有编码部分多蛋白A10的插入物,该部分多蛋白足以产生具有自我装配能力的热稳定突变衣壳蛋白。
根据实施例8,用质粒pJCA176构建重组痘苗病毒,在这种情况下,从质粒pJCA176,而不是从质粒pJCA161获得片段EcoRV-BglII。由此获得的重组病毒称为vV110。
实施例16:O1K构建物的诱变
如实施例15所述,用寡核苷酸和PCR反应进行针对O1K构建物的诱变,目的是用编码半胱氨酸的密码子置换编码丝氨酸179(质粒pJCA162编码的多蛋白中的位置,实施例4;甲硫氨酸起始密码子序号是1)的密码子。
用质粒pJCA162作为模板和下面寡核苷酸:
JCA305(37mer)(SEQ ID NO 1)
和JCA333(27mer)(SEQ ID NO 29):
5’CGAGTCAGTCAGGCAGCCGTAGACACC 3’
进行PCR反应,扩增559bp片段,这个片段称为片段O。
用质粒pJCA162作为模板和下面寡核苷酸:
JCA334(27mer)(SEQ ID NO 30):
5’GGTGTCTACGGCTGCCTGACTGACTCG 3’
和JCA335(36mer)(SEQ ID NO 31):
5’AGACGTCCGTGTGTTGGCGCCTCTGGATCTGTGTTT 3’
进行二次PCR反应,扩增1147bp片段,这个片段称为片段P。
用片段O和P作为模板,与寡核苷酸JCA305(SEQ ID NO 1)和JCA335(SEQ ID NO 31)进行第三次PCR反应,扩增1679bp片段。
然后,用EcoRV和NarI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离1654bp片段EcoRV-NarI。这个片段称为片段Q。
用NarI,然后是EcoRV消化质粒pJCA162,琼脂糖凝胶电泳后,分离约6670bp片段NarI-EcoRV。将这个片段和片段Q连接在一起产生质粒pJCA177(8327bp)。这个质粒含有编码部分多蛋白O1K的插入物,该部分多蛋白足以产生具有自我装配能力的热稳定突变衣壳蛋白。
根据实施例9,用质粒pJCA177构建重组痘苗病毒,在这种情况下,从质粒pJCA177,而不是从质粒pJCA162获得的片段EcoRV-BglII。因此获得的重组病毒称为vV111。
实施例17:C Spain Olot构建物的诱变
如实施例15所述,用寡核苷酸和PCR反应进行针对C Spain Olot构建物的诱变,目的是用编码半胱氨酸的密码子置换编码甘氨酸179(质粒pJCA163编码的多蛋白中的位置,实施例4;甲硫氨酸起始密码子序号是1)的密码子。
用质粒pJCA163作为模板和下面寡核苷酸:
JCA313(37mer)(SEQ ID NO 9)
和JCA336(27mer)(SEQ ID NO 32):
5’TGACTTGACGAGGCACCCGTAAACACC 3’
进行PCR反应,扩增559bp片段,这个片段称为片段R。
用质粒pJCA163作为模板和下面寡核苷酸:
JCA337(27mer)(SEQ ID NO 33):
5’GGTGTTTACGGGTGCCTCGTCAAGTCA 3’
和JCA338(36mer)(SEQ ID NO 34):
5’GTAGTACTGGGCCAAGCCGGCCAAGTAGGTGTTTGA 3’
进行二次PCR反应,扩增681bp片段,这个片段称为片段S。
用片段R和S作为模板,与寡核苷酸JCA313(SEQ ID NO 9)和JCA338(SEQ ID NO 34)进行第三次PCR反应,扩增1213bp片段。
然后,用EcoRV和NaeI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离约1190bp片段EcoRV-NaeI。这个片段称为片段T。
用NaeI,然后是EcoRV消化质粒pJCA163,琼脂糖凝胶电泳后,分离约7120bp片段NaeI-EcoRV。将这个片段和片段T连接在一起产生质粒pJCA178(8312bp)。质粒pJCA178含有编码多蛋白C Spain Olot一部分的插入物,这个多蛋白质部分足以产生具有自我装配能力的热稳定突变衣壳蛋白。
根据实施例9,用质粒pJCA178构建重组痘苗病毒,在这种情况下,从质粒pJCA178,而不是从质粒pJCA163获得片段EcoRV-BglII。因此获得的重组病毒称为vV112。
实施例18:A24构建物的诱变
如实施例15所述,用寡核苷酸和PCR反应进行针对A24构建物的诱变,目的是用编码半胱氨酸的密码子置换编码组氨酸179(质粒pJCA164编码的多蛋白中的位置,实施例4;甲硫氨酸起始密码子序号是1)的密码子。
用质粒pJCA164作为模板和下面寡核苷酸:
JCA317(37mer)(SEQ ID NO 13)
和JCA339(27mer)(SEQ ID NO 35):
5’CGAGTCCACCAAGCATCCAAAGACACC 3’
进行PCR反应,扩增559bp片段,这个片段称为片段U。
用质粒pJCA164作为模板和下面寡核苷酸:
JCA340(27mer)(SEQ ID NO 36):
5’GGTGTCTTTGGATGCTTGGTGGACTCG 3’
和JCA341(36mer)(SEQ ID NO 37):
5’CCCAGGGTAGTTAGTCCTAGGCGGGTTGTACACCTT 3’
进行二次PCR反应,扩增507bp片段,这个片段称为片段V。
用片段U和V作为基质,与寡核苷酸JCA317(SEQ ID NO 13)和JCA341(SEQ ID NO 37)进行第三次PCR反应,扩增1039bp片段。
然后,用EcoRV和BlnI消化这个片段,琼脂糖凝胶电泳后,分离约1014bp片段EcoRV-BlnI。这个片段称为片段W。
用BlnI,然后是EcoRV消化质粒pJCA164,琼脂糖凝胶电泳后,分离约7360bp片段BlnI-EcoRV。将这个片段和片段W连接在一起产生质粒pJCA179(大小约8400bp)。这个质粒含有编码多蛋白A24一部分的插入物,这个多蛋白部分足以产生具有自我装配能力的热稳定突变衣壳蛋白。
根据实施例9,用质粒pJCA179构建重组痘苗病毒,在这种情况下,从质粒pJCA179,而不是从质粒pJCA164获得片段EcoRV-BglII。因此获得的重组病毒称为vV113。
实施例19:热稳定空病毒衣壳的产生和纯化
通过实施例10所述完全相同的方法,通过分别用vV110(实施例15),vV111(实施例16),vV112(实施例17)和vV113(实施例18)替代重组痘苗病毒Vv108得到亚型A10,O1K,C Spain Olot及A24的修饰空病毒衣壳。
实施例20:检验热稳定性
制备和定量10个含有口蹄疫病毒A10的修饰空病毒衣壳(实施例19)的试管。每管含有0.5ml磷酸缓冲液,pH7.6中的0.8μg衣壳。
放置这10支试管在50℃水浴中1小时。然后冷却它们。放每个衣壳样品在蔗糖梯度上(15-35%),12℃离心2.5小时(Beckman SW40转头,40000rpm)。得到的每个梯度分级为1ml的12个级分。0.5ml每个级分在1ml纯乙醇中-20℃沉淀16小时。
收集沉淀,干燥,在加样缓冲液(Maniatis等,1982,《Molecularcloning:a Laboratory manual》,Cold  Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY,USA)中重悬浮,在SDS-PAGE 10%丙烯酰胺凝胶电泳上电泳。转移后,用本质上与蛋白质VP1反应的抗-140S A10多克隆豚鼠抗体显示蛋白质带。
空衣壳迁移在梯度中级分7和8内,而降解的空衣壳靠近梯度水平上部位于级分11内。
蛋白质印迹(Western)(图2)表明与突变体对应的空衣壳总是在50℃1小时后(凝胶A)被装配,而非突变空衣壳如期望一样被降解,不能抵抗热处理(凝胶B)。
实施例21:生产含有口蹄疫病毒热稳定空衣壳的亚单位疫苗
通过进行与实施例11类似的方法,用修饰的空病毒衣壳(实施例19)替代末修饰空病毒衣壳,获得含有口蹄疫病毒亚型O1K,A10,CSpain Olot和A24的修饰空病毒衣壳的疫苗。
应当认识到,如所附权利要求所限定的本发明不限于前述说明书所述特定实施方式,而包括本发明范围和本质中的所有变形。
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Claims (40)

1.抗口蹄疫疫苗,包含有效量的抗原或含有编码所述抗原的cDNA的表达载体和适于兽医用的载体或赋形剂,其中所述抗原是通过在真核细胞中表达编码口蹄疫病毒经修饰的P1区及3C蛋白酶的cDNA而获得的口蹄疫病毒空衣壳,其中所述经修饰的P1的氨基酸序列是SEQ IDNO:38第2-737位氨基酸的序列,但SEQ ID NO:38第179位氨基酸用半胱氨酸替代,这形成使所述空衣壳热稳定的非天然存在的S-S键,其中所述3C蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:38第913至1126位氨基酸的序列。
2.权利要求1的疫苗,其中编码P1的cDNA还编码口蹄疫病毒A10亚型2A的全部或部分。
3.权利要求1的疫苗,其中编码3C的cDNA还编码口蹄疫病毒A10亚型蛋白质3B的全部或部分。
4.权利要求1的疫苗,其中空衣壳在疫苗中以有效量作为亚单位存在。
5.权利要求4的疫苗,其中在诱导型启动子或病毒来源的晚期启动子控制下,由表达载体在真核细胞中体外表达所述cDNA而获得亚单位形式的空衣壳。
6.权利要求5的疫苗,其中该启动子选自T7噬菌体启动子,热休克启动子或病毒来源的晚期启动子。
7.权利要求6的疫苗,其中该启动子是T7噬菌体启动子,而且在存在T7聚合酶表达的情况下,通过所述cDNA的表达获得所述亚单位形式的空衣壳。
8.权利要求5的疫苗,其中表达载体选自病毒载体和质粒载体,或所述cDNA整合进真核细胞中。
9.权利要求8的疫苗,其中病毒载体是痘病毒载体,而且病毒来源的晚期启动子选自痘苗病毒的P11K,痘苗病毒的P28K及牛痘病毒的P160K ATI。
10.权利要求1的疫苗,其中真核细胞来自选自BHK-21,CHO,COS,RK13,Vero,MDBK和PK15细胞的细胞系。
11.权利要求1的疫苗,其中它是用保存空衣壳的介质配制的。
12.权利要求1的疫苗,其还含有佐剂。
13.权利要求12的疫苗,其中佐剂选自氢氧化铝,皂苷,阿夫立定,DDA,丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物,GM-CSF,水包油乳剂、油包水乳剂和水包油包水乳剂。
14.权利要求1的疫苗,其中:该疫苗包括含有cDNA的表达载体,以在体内产生衣壳。
15.权利要求14的疫苗,其中:载体是病毒载体或质粒载体。
16.权利要求15的疫苗,其中:载体是病毒载体。
17.权利要求14的疫苗,其中:所述cDNA在病毒来源的晚期启动子控制下由病毒载体表达。
18.权利要求17的疫苗,其中:载体是痘病毒,病毒来源的晚期启动子选自痘苗病毒的P11K,痘苗病毒的P28K及牛痘病毒的P160KATI。
19.权利要求17的疫苗,其中:所述cDNA在病毒来源或细胞来源的强早期启动子的控制下,由质粒载体表达。
20.权利要求19的疫苗,其中:所述cDNA在选自SV40病毒早期启动子,劳斯肉瘤病毒LTR启动子,和细胞骨架基因启动子的启动子的控制下,由质粒载体表达。
21.权利要求1的疫苗,其中:用9/1000NaCl盐水溶液或磷酸缓冲液配制疫苗。
22.权利要求14的疫苗,其还含有佐剂。
23.权利要求22的疫苗,其中:疫苗含有质粒载体,佐剂包含下式的含季铵盐的阳离子脂:
其中,R1是有12到18个碳原子的直链饱和或不饱和脂肪族基团,R2是含有2或3个碳原子的另一脂肪族基团,X表示羟基或氨基。
24.权利要求23的疫苗,其中所述佐剂含有DMRIE。
25.权利要求22的疫苗,其中疫苗含有质粒载体,佐剂包含丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,或者顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物。
26.权利要求22的疫苗,其中佐剂含有GM-CSF。
27.权利要求22的疫苗,其中它含有可体内表达GM-CSF的载体。
28.权利要求8的疫苗,其中病毒载体是痘苗病毒。
29.权利要求9的疫苗,其中痘病毒载体是痘苗病毒载体。
30.权利要求16的疫苗,其中:病毒载体是选自痘苗病毒,禽痘,金丝雀痘,浣熊痘,猪痘和山羊痘的痘病毒。
31.权利要求30的疫苗,其中:痘病毒是禽痘。
32.权利要求30的疫苗,其中:痘病毒是金丝雀痘。
33.权利要求30的疫苗,其中:痘病毒是浣熊痘。
34.权利要求30的疫苗,其中:痘病毒是猪痘。
35.权利要求30的疫苗,其中:痘病毒是山羊痘。
36.权利要求16的疫苗,其中:病毒载体选自腺病毒和疱疹病毒。
37.权利要求19的疫苗,其中所述序列的表达处在CMV-IE的早期启动子的控制之下。
38.权利要求20的疫苗,其中所述细胞骨架基因启动子是肌纤维蛋白启动子或肌动蛋白启动子。
39.权利要求24的疫苗,其中DMRIE与中性脂结合。
40.权利要求39的疫苗,其中DMRIE与DOPE结合形成DMRIE-DOPE。
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