CN1938048B - 脂质体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脂质体制剂，所述脂质体制剂不破坏用亲水性高分子进行膜修饰获得的血中稳定性等效果，在可稳定地载带酸性条件下稳定性受损的药物的保存稳定性方面效果良好，所述脂质体制剂包含由以磷脂作为主膜材的脂质双层膜形成的单层囊泡和存在于该囊泡内的pH为5以下的内水相，并且载带药物，上述囊泡仅外表面被亲水性高分子修饰。

Description

脂质体制剂
技术领域
本发明涉及用于给药系统的脂质体制剂。
背景技术
近年，正在积极研究将药物安全且有效率地送达·分布到目标病灶部位的给药系统(DDS)。作为上述方法之一，研究将脂质体、乳剂、脂质微球、纳米微粒等封闭囊泡用作药物的搬运体(载体)。但是，使用封闭囊泡的DDS的实用化时存在需要克服的各种问题，其中，回避生物体内的异物识别机构及控制体内动态是重要的。总之，为了将封闭囊泡高选择性地送达目标部位，必须避免被肝脏、脾脏等的网状内皮组织(RES)捕获，防止血液中的调理素蛋白质或血浆蛋白质等的相互作用(吸附)导致的凝集，提高血中稳定性。
作为解决该课题的方法，已知用亲水性高分子进行膜修饰的方法。被亲水性高分子修饰的封闭囊泡、特别是脂质体能够取得较高的血中滞留性，因而能够被动蓄积在肿瘤组织或炎症部位等血管透过性亢进的组织内，该方法已经开始实用化(参见专利文献1～3及非专利文献3～5等)。作为用亲水性高分子进行膜修饰时使用的修饰剂，通常优选使用在聚乙二醇(PEG)上键合有磷脂或胆固醇等脂质的聚乙二醇衍生物。可从商业渠道购入的常用修饰剂为键合了二酰基磷脂酰乙醇胺等磷脂的聚乙二醇衍生物。
实施了上述修饰的脂质体为由脂质双层膜形成的封闭囊泡，在上述囊泡空间内包含水相(内水相)。脂质体已知有由脂质双层膜层的单层膜构成的单层囊泡(Small Unilamellar Vesicle，SUV、LargeUnilamella Vesicle，LUV)及由多层膜构成的多层囊泡(MultilamellarVesicle，MLV)等膜结构。为了抑制内包在脂质体内的药物泄漏，还提出了将脂质体的膜结构制成MLV膜的方案(参见专利文献4)。
另外，将药物封入上述脂质体内的方法各种各样，但是已知只要采用pH梯度法等离子梯度法(参见专利文献5～7、非专利文献6等)即可高浓度地封入药物。
专利文献1：特表平5-505173号公报
专利文献2：特公平7-20857号公报
专利文献3：专利第2667051号公报
专利文献4：国际公开01/000173号说明书
专利文献5：美国专利第5077056号说明书
专利文献6：专利第2847065号公报
专利文献7：专利第2659136号公报
非专利文献1：Cancer Lett.，1997，118(2)，p.153
非专利文献2：Br.J.Cancer.，1997，76(1)，p.83
非专利文献3：D.D.Lasic著《LIPOSOMES from Physics toApplications》，Elsevier，1993
非专利文献4：Martin C.Woodle，Gerrit Storm编《Long CirculatingLiposomes：Old Drugs，New Therapeutics》，Springer，1997
非专利文献5：D.D.Lasic、D.Papahadjopoulos编《MedicalApplications of LIPOSOMES》，Elsevier，1998
非专利文献6：G.Gregoriadis编《Liposome Technology LiposomePreparation and Related Techniques》2nd edition，Vol.I-III，CRC Press
发明内容
上述脂质体载带的药物中，有在高于中性条件的pH范围中稳定性差的药物，这种情况下，为了将药物导入脂质双层膜中、进入内水相，必须将脂质体的内水相保持为酸性。另外，利用pH梯度将弱碱性的药物封入(载带)到脂质体内时，使用柠檬酸缓冲液将内水相调节成pH为4左右的酸性条件，加热到脂质体主膜材的相转移点以上的温度(例如60℃左右)。但是，如上所述地操作使脂质体内为酸性条件，根据需要将其暴露在高温中，在制造时及保存期间，可能因膜劣化导致稳定性降低。着眼于上述问题，针对将必须在酸性中保持的药物载带在特别是经亲水性高分子进行了膜修饰的脂质体中得到的脂质体制剂的保存性进行研究时，发现与未修饰的脂质体相比，几种经亲水性高分子修饰的脂质体在制造时或保存期间所载带的药剂容易发生分解，结果容易破坏作为脂质体制剂的保存稳定性。本发明的目的在于基于上述认知提供一种脂质体制剂，该脂质体制剂在将必须在酸性中保持的药物或因用于封入药物的方法导致被保持在酸性条件下的药物载带在特别是经亲水性高分子进行了膜修饰的脂质体中的情况下，能够在保持亲水性高分子本来的膜修饰效果的同时，具有优异的膜稳定性和优异的保存稳定性。
本发明人鉴于上述情况，进一步研究了在以普通的磷脂为主膜材、经亲水性高分子进行了膜修饰的脂质体中、将必须在酸性环境下保持的药物保持在内水相中的脂质体制剂，发现脂质在内水相的酸性环境中水解，结果容易破坏作为脂质体制剂的保存稳定性。基于上述发现进行了进一步研究，发现保存稳定性容易被破坏的脂质体制剂是膜内外表面均被亲水性高分子修饰的脂质体制剂。由此想到仅将脂质体的外表面用亲水性高分子修饰即可。进而确认上述结构的脂质体制剂即使内水相为酸性环境也能够确保保存稳定性。而且，发现用含有氨基、脒基、胍基等的碱性化合物(阳离子化剂)进行膜修饰时，即使内水相为酸性环境也具有稳定脂质体膜的效果，因此含有上述碱性化合物作为膜成分的脂质体制剂的保存稳定性优异，从而完成了下述的本发明。
(1)一种脂质体制剂，该脂质体具有由含有磷脂作为主膜材的脂质双层膜形成的单层囊泡和存在于该囊泡内的pH为5以下的内水相，并且载带有药物，其中，上述囊泡仅外表面被亲水性高分子修饰。
(2)上述(1)所述的脂质体制剂，其中，上述药物是在pH大于5的pH范围内不稳定的药物。
(3)上述(1)或(2)所述的脂质体制剂，其中，该脂质体制剂至少以0.05mol药物/mol脂质的浓度载带上述药物。
(4)上述(1)或(2)所述的脂质体制剂，其中，该脂质体制剂至少以0.1mol药物/mol脂质的浓度载带上述药物。
(5)上述(1)～(4)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述主膜材是相转移点为50℃以上的磷脂。
(6)上述(1)～(5)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述磷脂为被氢化的磷脂。
(7)上述(1)～(5)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述磷脂为鞘磷脂。
(8)上述(1)～(7)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，作为上述脂质双层膜的膜成分，还含有上述磷脂以外的其他脂质类。
(9)上述(6)或(7)所述的脂质体制剂，其中，作为上述脂质双层膜的膜成分，还含有胆固醇。
(10)上述(1)～(9)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，作为上述脂质双层膜的膜成分，还含有具有选自氨基、脒基及胍基的基团的碱性化合物。
(11)上述(10)所述的脂质体制剂，其中，上述碱性化合物为3，5-二(十五烷氧基)苄脒盐酸盐。
(12)上述(1)～(11)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述亲水性高分子为分子量500～10000道尔顿的聚乙二醇。
(13)上述(1)～(12)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述亲水性高分子以亲水性高分子的磷脂或胆固醇衍生物的形式导入。
(14)上述(1)～(13)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述脂质体制剂的平均粒径为40～140nm左右。
(15)上述(1)～(13)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述脂质体制剂的平均粒径为50～130nm。
(16)上述(1)～(13)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，上述脂质体制剂的平均粒径为60～120nm。
(17)上述(1)～(16)中的任一项所述的脂质体制剂，其中，内水相的pH为2～5。
(18)上述(1)所述的脂质体制剂的制造方法，上述脂质体制剂的制造方法为调制含有磷脂的脂质双层膜的单层结构的囊泡，使内水相的pH为5以下，然后，添加亲水性高分子脂质衍生物仅修饰上述囊泡的外表面，在调制囊泡时在内水相中预先添加药物、或在调制囊泡后使药物从囊泡外通过上述脂质双层膜进入囊泡内，封入药物，从而使其载带药物。
(19)上述(18)所述的脂质体制剂的制造方法，其中，在调制囊泡后，利用离子梯度法使药物从囊泡外通过上述脂质双层膜进入囊泡内而封入药物。
如果采用上述特定结构的脂质体，则与膜内外双方均添加亲水性高分子进行膜修饰时相比，能够以整体相对较低的修饰率表现出亲水性高分子的效果。即，由于不含有无用的修饰，因此脂质体膜的稳定性优异，另外，能够抑制酸性环境下的内水相中脂质不必要的水解。特别是本发明的脂质体制剂受上述制约使保持在酸性环境下的内水相在制剂的构造方面确实地排除了不必要的结构，随之抑制不必要的脂质水解，因而能够抑制制造时及保存时的分解、高浓度地稳定载带内封的药物，且能够在保持亲水性高分子本来具有的高血中滞留性等膜修饰效果的同时、具有优异的保存稳定性。由上述特征可知，本发明的脂质体制剂具有治疗及/或诊断疾病的效果。
附图说明
图1表示亲水性高分子脂质衍生物(PEG5000-DSPE)的稳定试验后的TLC照片。
图2表示亲水性高分子脂质衍生物(PEG5000-DSPE)的稳定试验后的TLC照片。
图3表示保存试验中的PEG5000-DSPE的残留率。
图4表示保存试验中的HSPC分解物的比例(％)。
图5表示保存试验中的HSPC分解物的比例(％)。
具体实施方式
下面更详细地说明本发明。
脂质体为由磷脂双层膜构成的封闭囊泡，在该囊泡空间内含有水相(内水相)。脂质体制剂是以该脂质体为载体、在其中载带药物的制剂。如上所述，脂质体已知有由单层脂质双层膜构成的单层(单张膜)囊泡(SUV、LUV)及由多层脂质双层膜构成的多层囊泡(MLV)等，本发明的脂质体为单层膜。其中，特别是LUV(large unilamellarvesicle)脂质体。也优选SUV(small unilamellar vesicle)。
需要说明的是，本发明中，构成脂质体制剂的整个囊泡中，单层囊泡所占的比例用存在比表示为整体的50％以上，优选为80％以上。
另外，本发明中载带药剂的脂质体含有pH5以下的内水相，且单层脂质双层膜如下所述具有仅其外膜表面被亲水性高分子选择性地进行了表面修饰的特定膜修饰结构。
上述脂质双层膜至少含有磷脂作为其主膜材。
一般而言，磷脂是分子内具有由长链烷基构成的疏水性基团和由磷酸基构成的亲水性基团的两亲性物质。作为本发明中使用的磷脂，可以举出磷脂酰胆碱(＝卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等甘油磷脂；鞘磷脂(Sphingomyelin)等鞘磷脂类；心磷脂等天然或合成的双磷脂酰基类磷脂及上述物质的衍生物；按常规方法对上述物质进行氢化处理得到的物质(例如氢化大豆磷脂酰胆碱)等。以下也将上述磷脂称为“磷脂类”。
其中，优选氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)等氢化磷脂、鞘磷脂(SM)等。
脂质体可以含有一种磷脂或多种磷脂作为主膜材。
另外，脂质体优选使用相转移温度高于生物体内温度(35～37℃)的磷脂作为主膜材。原因在于通过使用上述磷脂，在保存时或在血液等生物体中，能够使封入脂质体内的药物不易由脂质体漏出到外部。上述脂质体优选在主膜材的相转移温度以上的温度下进行制造。原因在于在低于主膜材的相转移温度的温度下难以控制粒径。例如，主膜材的相转移温度为50℃左右时，优选在50～80℃左右、更具体而言在60～70℃左右下进行制造。
只要是能够稳定地形成本发明的特定形态的脂质体的物质，也可以与上述主膜材一同，含有其他膜成分。例如，优选含有磷脂以外的脂质或其衍生物(以下也称为其他脂质类)、与上述磷脂一同形成由混合脂质构成的膜。
作为其他脂质类，可以举出不含磷酸的脂质，没有特别限定，可以举出甘油糖脂、鞘糖脂及作为稳定化剂的后述胆固醇等甾醇等及上述物质的氢化物等衍生物。脂质体优选由含有作为主膜材的磷脂和其他脂质类的混合脂质形成的膜构成。
构成脂质双层膜的膜脂质整体中，作为主膜材的磷脂的比例通常为20～100mol％，优选为40～100mol％.
另外，上述其他脂质类在膜脂质整体中的比例通常为0～80mol％，优选为0～60mol％。
本发明中，上述脂质双层膜的外膜侧被亲水性高分子选择性地修饰。作为亲水性高分子，没有特别限定，可以举出聚乙二醇、聚甘油、聚丙二醇、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯基甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟丙基酯、聚丙烯酸羟乙基酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚天冬酰胺、合成聚氨基酸等。
需要说明的是上述亲水性高分子未与脂质键合一侧的末端被烷氧基化(例如甲氧基化、乙氧基化、丙氧基化)的物质具有优异的保存稳定性，故而优选。
其中，从具有使制剂具有优异的血中滞留性的效果方面考虑，优选聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)、聚丙二醇(PPG)。
PEG的分子量没有特别限定。PEG的分子量通常为500～10,000道尔顿、优选为1,000～7,000道尔顿、更优选为2,000～5,000道尔顿。
PG的分子量没有特别限定。PG的分子量通常为100～10000道尔顿、优选为200～7000道尔顿、更优选为400～5000道尔顿。
PPG的分子量没有特别限定。PPG的分子量通常为100～10,000道尔顿、优选为200～7,000道尔顿、更优选为1,000～5,000道尔顿。
其中，聚乙二醇是最常用的物质，具有提高血中滞留性的效果，优选使用。
聚乙二醇是具有-(CH2CH2O)n-重复结构的直链状高分子。聚乙二醇是具有在水中、有机溶剂中均可溶的两亲性(amphipathicproperty)的高分子，且毒性低，因此广泛用于稳定医药品、改善体内动态。在被已知毒性低的聚乙二醇修饰的载体(例如脂质体)中载带药物得到的药物载体(例如脂质体制剂)的安全性高。
需要说明的是，本发明中的“血中滞留性”是指在给予了例如药物载体的宿主中，药物以内封在载体内的状态存在于血液中的性质。
药物一旦从载体中释放出来，将迅速从血中消失、暴露。如果血中滞留性良好，则可以更少量地给予药物。
另外，本发明中的“暴露”是指释放到载体外部的药物作用于外部环境。具体而言，被释放出的药物靠近、接触目标部位，从而发挥其作用(例如抗肿瘤效果)。药物作用于目标部位，显示出局部作用于目标部位的处于进行DNA合成的细胞周期的细胞等所期待的效果。
上述脂质体如下所述在形成脂质双层膜的单层囊泡的未修饰脂质体后，只要利用亲水性高分子从外部修饰膜表面，就可以仅对脂质双层膜的外膜进行选择性的表面修饰。此时，如果使用亲水性高分子脂质衍生物作为用于导入亲水性高分子的修饰剂，则由于亲水性高分子部分处于向外方突出的状态，作为疏水性部分的脂质部分进入脂质体的脂质双层膜中，被稳定地保持，因此能够使与脂质键合的亲水性高分子存在、分布于脂质体的脂质双层膜的外膜表面。
上述亲水性高分子脂质衍生物的脂质(疏水性部分)没有特别限定.例如可以举出具有疏水性区域的化合物(疏水性化合物).作为疏水性化合物，可以举出下述构成混合脂质的磷脂、甾醇等其他脂质类、或直链脂肪醇、直链脂肪胺、甘油脂肪酸酯等.其中，磷脂为优选方案之一.
上述磷脂中包含的酰基链优选为饱和脂肪酸。酰基链的链长优选为C14-C20，进一步优选为C16-C18。作为酰基链，例如可以举出二棕榈酰基、二硬脂酰基、棕榈酰基硬脂酰基。
磷脂没有特别限定。作为磷脂，例如可以使用具有能够与上述亲水性高分子反应的官能团的磷脂。作为具有能够与上述亲水性高分子反应的官能团的磷脂的具体例，可以举出具有氨基的磷脂酰乙醇胺、具有羟基的磷脂酰甘油、具有羧基的磷脂酰丝氨酸。使用上述磷脂酰乙醇胺为优选方案之一。
亲水性高分子的脂质衍生物由上述亲水性高分子和上述脂质衍生而成。亲水性高分子与脂质的组合没有特别限定，可以使用根据目的适当组合的亲水性高分子与脂质。例如可以举出从磷脂、甾醇等其他脂质类、直链脂肪醇、直链脂肪胺、甘油脂肪酸酯中选出的至少1种物质与从PEG、PG、PPG中选出的至少1种物质结合而成的亲水性高分子的衍生物。亲水性高分子为PEG时，作为脂质，选择磷脂、胆固醇是优选方案之一。作为上述组合得到的PEG的脂质衍生物，例如可以举出PEG的磷脂衍生物或PEG的胆固醇衍生物。
亲水性高分子的脂质衍生物可以根据脂质的选择而选择为正电荷、负电荷或中性。例如，作为脂质选择DSPE时，得到受磷酸基的影响而显示负电荷的脂质衍生物，作为脂质选择胆固醇时，得到中性的脂质衍生物。脂质可以根据目的进行选择。
本发明中，上述列举的亲水性高分子的脂质衍生物中，可以举出PEG的磷脂衍生物作为优选方案之一。作为PEG的磷脂衍生物的具体例，可以举出聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)。PEG-DSPE是常用的化合物，容易购入，故而优选。
上述亲水性高分子的脂质衍生物可以按照现有的公知方法进行制备。合成作为亲水性高分子的脂质衍生物之一例的PEG的磷脂衍生物的方法例如可以举出使用催化剂使具有能够与PEG反应的官能团的磷脂与PEG反应的方法。作为该催化剂，例如可以举出氰尿酰氯、碳二亚胺、酸酐、戊二醛。通过上述反应，使上述官能团与PEG共价键合，可以得到PEG的磷脂衍生物。
本发明中，脂质体可以含有一种上述亲水性高分子或亲水性高分子的脂质衍生物，也可以含有上述物质中的2种以上的组合。
上述亲水性高分子脂质衍生物对膜脂质(总脂质)的修饰率以相对于膜脂质的比率表示，通常为0.1～20mol％、优选为0.1～5mol％、更优选为0.5～5mol％。需要说明的是，内封有在肝脏内发挥作用的药剂等血中滞留性并非特别必要的情况下，以脂质体制剂保存时的稳定性为主要目的，优选将修饰率设定为0.25～5mol％。
此处的总脂质是指亲水性高分子脂质衍生物以外的构成膜的全部脂质的总量，具体而言包括磷脂类及其他脂质类，还含有其他表面修饰剂时也包括该表面修饰剂。
使用上述亲水性高分子的脂质衍生物进行了表面修饰的脂质体能够防止血浆中的调理素蛋白质等吸附在该脂质体的表面，提高该脂质体的血中稳定性，避免被RES捕捉，能够提高对作为药物的送达目标的组织或细胞的送达率。
特别是在本发明中，脂质体是在亲水性高分子仅分布在脂质体外表面的条件下形成的，脂质双层膜的外膜被上述亲水性高分子选择性地修饰.上述脂质体中，其外膜表面的亲水性高分子链朝向脂质体外部地分布，而脂质双层膜的内水相侧内膜未被表面修饰，因此亲水性高分子链实质上未分布在内水相中.如果采用上述分布结构，则即使内水相为酸性条件，与双层膜的内外膜两侧均分布有亲水性高分子相比，也能够确保膜的稳定性.另外，与双层膜的内外膜两侧均分布有亲水性高分子的脂质体相比，以总量较少的亲水性高分子即可获得血中稳定性的效果.
本发明的脂质体除上述磷脂、其他脂质、亲水性高分子及其脂质衍生物外，还可以在不影响本发明目的的范围内含有能够保持上述膜结构、可以包含在脂质体内的其他膜成分。
作为其他膜成分，可以举出用于改变脂质的物性、赋予载体的膜成分所希望的特性的上述亲水性高分子以外的表面修饰剂。对其他表面修饰剂没有特别限定，可以举出在脂质上键合上述亲水性高分子以外的化合物得到的物质。
对亲水性高分子以外的化合物没有特别限定，例如可以举出葡糖醛酸、唾液酸、葡聚糖、茁霉多糖(pullulan)、直链淀粉、支链淀粉、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、角叉菜胶等水溶性多糖类；具有酸性官能团的化合物；具有氨基、脒基、胍基等碱性官能团的碱性化合物等。
特别是在本发明中可以含有上述化合物中的碱性化合物作为抑制脂质水解的物质。已知脂质通常因温度、pH而发生水解。特别是Sn-1和Sn-2位的脂肪酸酯容易水解，分解成溶血脂质及脂肪酸(Grit等，Chem.Phys.Lipids 64，3-18，1993)。上述分解物使现有的脂质膜组成混乱，导致脂质膜的透过性增加，破坏脂质体的稳定性。
因此，特别是为了将必须在酸性环境中保持的药剂保持在内水相中，必须提高脂质在酸性环境中的稳定性，本发明中通过使膜中含有碱性化合物，使脂质体表面带正电，从而能够抑制脂质的水解。
对碱性化合物没有特别限定，可以举出十八胺(ODA)、N-甲基-正十八胺(MODA)、N，N-二甲基-正十八胺(DMODA)、溴化硬脂酰三甲基铵(TMODA)等胺(也包括铵盐)化合物。含有TMODA等季铵盐的脂质衍生物在低浓度下即可使脂质膜表面带正电，故优选。
另外，作为碱性化合物，还可以举出特开昭61-161246号中公开的DOTMA、特表平5-508626号中公开的DOTAP、特开平2-292246号中公开的阳离子脂质体(TranSfectam)、特开平4-108391号中公开的TMAG、国际公开第97/42166号中公开的3，5-二(十五烷氧基)苄脒盐酸盐、DOSPA、TfxTM-50、DDAB、DC-CHOL、DMRIE等化合物。
上述其他表面修饰剂是在脂质上键合了具有碱性官能团的化合物的物质时，被称为阳离子化脂质。阳离子化脂质的脂质部分在脂质体的脂质双层膜中被稳定化，碱性官能团部分可以存在于载体的脂质双层的膜表面上(外膜表面上及/或内膜表面上)。通过用阳离子化脂质对膜进行修饰，可以提高脂质体膜与细胞的结合性等。
本发明中，上述脂质体的内水相为pH5以下、优选为pH2～pH5、更优选为pH3～pH5、特别优选为约pH4。由此可以稳定地载带pH超过5时不稳定的药物。内水相的pH可以在调制脂质体时用生物体内能够接受的生理性pH缓冲液进行调节。
可以使上述脂质体载带各种药物.例如作为用于治疗的药物，具体可以举出核酸、多核苷酸、基因及其类似物、抗癌剂、抗生素、酶制剂、抗氧化剂、脂质摄入抑制剂、激素制剂、抗炎剂、甾族化合物制剂、血管扩张剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、平滑肌细胞的增殖·游走抑制剂、血小板凝集抑制剂、抗凝固剂、化学介质的游离抑制剂、血管内皮细胞的增殖促进或抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、肾小球膜细胞增殖抑制剂、脂氧合酶抑制剂、免疫抑制剂、免疫激活剂、抗病毒剂、美拉德反应抑制剂、淀粉样变性病抑制剂、一氧化氮合成抑制剂、AGEs(Advanced glycation endproducts)抑制剂、自由基捕获基、蛋白质、肽、葡糖胺基葡聚糖及其衍生物、寡糖及多糖及其衍生物等。
本发明的脂质体制剂可以特别稳定地载带在pH大于5的pH条件下变得不稳定的药物。作为上述药物，具体可以举出盐酸多巴胺、甲磺酸加贝酯、去甲肾上腺素、盐酸溴己新、甲氧氯普胺、肾上腺素、维生素B1、维生素B6、卡铂、盐酸吉西他宾、酒石酸长春瑞宾、硫酸长春新碱、盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素、盐酸柔红霉素等。
作为用于诊断的药物，可以举出X射线造影剂、超声波诊断剂、放射性同位素标记核医学诊断药、核磁共振诊断用诊断药等体内诊断药。除此之外，只要是不破坏本发明的脂质体的膜形态、即使包含在或接触pH5以下的液体成分也不受影响的药物、以及适于封入pH5以下的内水相的药物即可，不特别限定于治疗用药物或诊断用药物，均可载带。
药物因其种类不同理想的载带量各异，通常优选为高载带率。本发明中，通过使内水相的pH为5以下，可以利用离子梯度法高浓度地载带药物。
在本发明的脂质体制剂中，优选的载药量用相对于脂质体膜的总脂质的浓度表示至少为0.05mol药物/mol脂质、更优选为至少0.1mol药物/mol脂质。此处的总脂质是指亲水性高分子脂质衍生物以外构成膜的全部脂质的总量，具体而言包括磷脂类及其他脂质类，在还含有其他表面修饰剂的情况下也包括该表面修饰剂。
需要说明的是，本发明中的“载带”是指将药物实质上封入脂质体(载体)的封闭空间内的状态，也包括部分药物包含在膜内的状态或附着在脂质体的外表面的状态。
本发明的脂质体制剂根据给药途径还可以含有药学上允许的稳定化剂及/或抗氧化剂。
对稳定化剂没有特别限定，例如可以举出甘油、甘露醇、山梨醇、乳糖或蔗糖等糖类。作为膜构成成分中的其他脂质的上述胆固醇(Cholesterol)等甾醇发挥稳定化剂的作用。
对抗氧化剂没有特别限定，例如可以举出抗坏血酸、尿酸、生育酚同系物(例如维生素E)。需要说明的是，生育酚存在α、β、γ、δ这样4个异构体，本发明中可以使用任一个。使用的稳定化剂及/或抗氧化剂根据剂型从上述物质中适当选择，但是并不限定于此。上述稳定化剂及抗氧化剂可以分别单独使用，也可以将2种以上组合使用。另外，从抗氧化方面考虑，优选将上述分散体制成充氮包装。
本发明的脂质体制剂可以根据给药途径进一步含有药学上允许的添加物。作为上述添加物的例子，可以举出水、生理盐水、药学上允许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原酸胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、PBS、生物体内分解性聚合物、无血清培养基、可用作医药添加物的表面活性剂、上述可被生物体内接受的生理性pH缓冲液等。
添加物可以从上述物质中适当选择或将上述物质组合使用，但是并不限定于上述物质。
对本发明的脂质体制剂的大小没有特别限定，制成球状或近似球状的形态时，粒子外径的直径在LUV的情况下为70nm～140nm、优选为80nm～130nm、更优选为90nm～120nm。SUV的情况下为40nm～140nm、优选为50～130nm、更优选为60～120nm。
粒子外径的直径是指利用动态光散射法测定的脂质体制剂全部粒子直径的平均值，在本发明中，具体而言，采用Zetasizer(MalvernInstruments.3000HS或S ZEM 5002)进行测定。
脂质体制剂的制造中，作为最终灭菌法，使用过滤灭菌法。过滤灭菌法中，由于要求脂质体能够通过、作为指标菌使用的缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta，尺寸约0.3×0.8μm)不能通过，因此必须为与缺陷短波单胞菌相比足够小的粒子。即使从更确实地进行该过滤灭菌工序方面考虑，粒径为100nm左右也是重要的。
本发明中，可以将含有上述添加物的脂质体制剂用作医药组合物。本发明的医药组合物可以按通常的方法、例如在0～8℃下冷藏或在1～30℃的室温下保存。
下面列举本发明的特定结构的脂质体的优选制造方法，但是并不限定于此。
例如在烧瓶内，将磷脂等膜构成成分用氯仿等有机溶剂混合，蒸馏除去有机溶剂后，进行真空干燥，由此在烧瓶内壁上形成薄膜。然后，在该烧瓶内加入内水溶液，剧烈搅拌，得到脂质体分散液。可以通过将添加的内水相溶液根据需要用pH调节剂等调节至所希望的pH来调节脂质体内水相的pH。接下来，对得到的脂质体分散液进行离心分离，倾析上清液，进行提纯，可以得到脂质体分散液。作为用亲水性高分子修饰脂质体表面的方法，优选使用聚乙二醇(PEG)与磷脂或胆固醇等的衍生物，在使用上述方法等得到的脂质体分散液中直接添加聚乙二醇衍生物，或将其制成水溶液后进行添加，制备仅在外表面分布有PEG链的脂质体。
与上述方法不同，还可以在采用常规方法制备含有具有反应活性的官能团的磷脂等膜构成脂质的脂质体后，在脂质体外液中添加一侧末端活化的PEG，使其与具有官能团的磷脂等膜构成脂质结合，制备脂质体。
除了上述方法以外，脂质体还可以通过混合上述各构成成分，用高压喷出型乳化机使其高压喷出而制得。该方法具体记载在《生命科学中的脂质体》(寺田、吉村等；Springer-Verlag东京(1992))，引用该记载作为本说明书中记载的内容。
上述方法中，为了使脂质体具有理想的尺寸，可能利用几种技术(G.Gregoriadis编《Liposome Technology Liposome Preparation andRelated Techniques》2nd edtion，Vol.I-III、CRC Press)。引用该记载作为本说明书中记载的内容。
脂质体分散液可以使用挤出机，使其强制通过过滤器数次而进行单层化。通常，过滤器使用2种以上具有大于所希望粒径的孔径的过滤器、能够最终得到所希望粒径的过滤器这样孔径不同的过滤器。使用孔径不同的过滤器，挤出的次数越多，单层化率越高，可以实质上形成单层膜脂质体。实质上的单层囊泡具体是指构成脂质体制剂的全部载体(囊泡)中、单层囊泡所占的比例用存在比表示为整体的50％以上，优选为80％以上。
为了将药物载带在上述脂质体中，有下述方法：在含有药物的水溶液中使构成脂质体的脂质膜水合，将药物载带在脂质体中的方法(被动载药，Passive loading)；或在脂质体膜的内侧/外侧形成离子梯度使药物顺着该离子梯度透过脂质体膜而被载带的方法(主动载药，Remote loading)(参见记载有上述筛分技术的文献及美国专利第5192549号、美国专利第5316771号等).本发明的脂质体制剂的优选制造方法为主动载药法.采用该方法能够实现高药物/脂质，可以得到临床有效的高载带率脂质体制剂.
主动载药法可以通过在内水相和外水相间形成pH梯度来实现。作为形成pH梯度的方法，可以首先在低pH条件下利用上述方法调制脂质体，然后置换外水相，形成pH梯度。
有使用Na+/K+浓度梯度作为间隔脂质体膜形成的梯度的方法。在利用相对于Na+/K+浓度梯度的主动载药法向预先形成的脂质体中添加药剂的技术记载在美国专利第5077056号说明书中，可以参照该说明书进行操作。需要说明的是，引用该记载作为本说明书中记载的内容。
在脂质体的内侧和外侧间形成pH梯度的方法可以使用具有内侧高/外侧低的铵离子浓度梯度及/或具有能够质子化的氨基的有机化合物浓度梯度。具有能够质子化的氨基的有机化合物优选低分子量的化合物，可以举出甲基胺、乙基胺、丙基胺、二乙基胺、乙二胺、氨基乙醇等，但是并不限定于此。
需要说明的是，在采用相对于铵离子浓度梯度的主动载药法向预先形成的脂质体中添加药剂的技术记载在美国专利5192549号说明书中，可以参照该说明书进行操作。另外，可以引用该记载作为本说明书中记载的内容。具体而言，在含有0.1～0.3M的铵盐(例如硫酸铵)的水性缓冲液中预先形成脂质体，将外部介质与不含有铵离子的介质、例如蔗糖溶液交换，形成铵离子梯度。内部铵离子用氨及质子平衡，氨透过脂质膜进行扩散，从脂质体内部消失。伴随氨的消失，脂质体内的平衡连续向质子生成的方向移动。结果质子蓄积在脂质体内，在脂质体的内侧/外侧形成pH梯度。通过在具有该pH梯度的脂质体分散液中添加药剂，将药剂内封在脂质体中。
对形成铵离子梯度的铵盐没有特别限定，包括硫酸铵、氢氧化铵、乙酸铵、氯化铵、磷酸铵、柠檬酸铵、琥珀酸铵、乳糖酸铵、碳酸铵、酒石酸铵、及草酸铵。
在脂质体的内侧和外侧间形成pH梯度的方法还有使用离子载体(Ionophore)的方法。使用离子载体在脂质体的内侧和外侧间形成pH梯度，利用主动载药法在脂质体中导入药剂的技术记载在美国专利第5837282号说明书中，可以参照该说明书进行操作。另外，可以引用该记载作为本说明书中记载的内容。
在脂质体的内侧和外侧间形成pH梯度，作为主动载药法的具体例有以下的方法。
在烧瓶内，将磷脂等膜构成成分用氯仿等有机溶剂混合，蒸馏除去有机溶剂后，进行真空干燥，在烧瓶内壁上形成薄膜。接下来，加入酸性缓冲液(例如pH4的缓冲液)，振荡，得到脂质体分散液。再根据需要对脂质体粒径进行筛分，通过采用凝胶过滤等方法将脂质体外液置换为pH在中性附近的外水相的方法或用适当的pH调节剂将脂质体外水相的pH调节为中性附近(例如pH7～7.5附近)的方法等形成pH梯度，在该脂质体分散液中加入含有药物的水溶液，将该溶液加热一段时间，使其载带药物。需要说明的是，本发明中，亲水性高分子的修饰只要如上所述在形成脂质双层膜的单层囊泡之后进行即可，也可以在药物载带操作之前或之后的任一阶段进行。
作为脂质体制剂的非口服给药途径，例如可以选择点滴等静脉内注射(静注)、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法.作为脂质体制剂的具体给药方法，可以通过注射器或点滴给予医药组合物.另外，也可以将导管插入患者或宿主体内、例如管腔内、例如血管内，将其前端导入目标部位附近，通过该导管，在所希望的目标部位或其近傍或可期待血液流向目标部位的部位进行给药.
为了治愈或至少部分抑制受疾病困扰的患者的疾病症状，给予足够量的本发明的脂质体制剂。例如封入脂质体制剂内的药物的有效给药量通常在0.01mg～100mg/1kg体重/日的范围内选择。但是，本发明的脂质体制剂并不限定于上述给药量。对于给药时期，可以在患病后开始给药，或在推测发病时为了缓解发病时的症状而进行预防性给药。另外，给药期间可以根据患者的年龄、症状进行适当选择。
实施例
下面，列举实施例、试验例更详细地说明本发明，但是本发明并不限定于下述实施例、试验例。
需要说明的是，各例中使用的成分的分子量如下所示。
氢化大豆卵磷脂(简记为HSPC、分子量790、Lipoid公司制SPC3)
胆固醇(简记为Chol、分子量386.65、Solvay公司制)
鞘磷脂(Sphingomyelin；简记为SM、分子量703.3、Avanti PolarLipidos公司制)
聚乙二醇5000-磷脂酰乙醇胺(简记为PEG5000-DSPE、分子量6075、日本油脂公司制)
3，5-二(十五烷氧基)苄脒盐酸盐(分子量609.41)
十八胺(Octadecylamine；简记为ODA)(东京化成：分子量269.51)
N-甲基-正十八胺(N-Methyl-n-octadecylamine；简记为MODA)(东京化成：分子量283.54)
N，N-二甲基-正十八胺(N，N-Dimethyl-n-octadecylamine；简记为DMODA)(东京化成：分子量297.56)
溴化硬脂酰三甲基铵(Stearyltrimethylammonium Bromide；简记为TMODA)(东京化成：分子量392.5)
阿霉素(盐酸阿霉素：Doxorubicin Hydrochloride USP23(BORYUNG)：分子量579.99)
(实施例1)内封有阿霉素的脂质体的制造例
实施例1给出本发明的脂质体制剂例。如下所述，向在低pH条件下(pH4)制造的脂质体中添加亲水性高分子脂质衍生物(PEG5000-DSPE：分子量5000道尔顿的聚乙二醇的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺衍生物)，使亲水性高分子(PEG链)分布在脂质体的外膜表面，再利用离子梯度法导入药物，制成LUV脂质体。
以氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)∶胆固醇(Chol)＝54∶46的摩尔比溶解在叔丁醇中，使其冻干，调制膜成分的混合脂质。
混合300mM的柠檬酸溶液和300mM的柠檬酸三钠溶液，调制调节成pH4.0的内水相溶液和调节成pH7.5的外水相溶液。
称量0.37g上述调制的混合脂质后，加入内水相溶液10mL，在68℃的恒温槽中膨润15分钟后，进行涡流搅拌，调制脂质体粗分散液。使用加热到68℃的挤出机(Lipex Biomembranes公司制)，通过孔径200nm的过滤器5次，更换为孔径100nm的过滤器后，再进行2次同样的操作(
Figure G2005800097595D00191
200nm×5、
Figure G2005800097595D00192
100nm×5、
Figure G2005800097595D00193
100nm×5)，调制LUV脂质体分散液。将挤出后的样品冰冷却。
将上述调制的脂质体分散液用以外水相进行了充分置换的凝胶柱(Sepharose 4Fast Flow)进行凝胶过滤，形成pH梯度。将凝胶过滤后的样品冰冷却。
对凝胶过滤后的脂质体进行脂质定量(HSPC定量)，基于通过HSPC定量算出的HSPC浓度，加入PEG5000-DSPE(日本油脂公司制)使其达到1.0mol％，60℃下搅拌30分钟，导入PEG5000-DSPE。
再基于通过HSPC定量算出的HSPC浓度，按盐酸阿霉素/HSPC＝0.2(w/w)计算盐酸阿霉素量，基于计算结果称量必要量的盐酸阿霉素，使用10％蔗糖(pH9.0)溶液，调制10mg/mL的溶液。在脂质体分散液中加入规定量的盐酸阿霉素溶液(10mg/mL)，在60℃下搅拌60分钟，导入盐酸阿霉素。将导入盐酸阿霉素后的样品冰冷却。使用经10％蔗糖(pH6.5)充分置换后的柱(Sepharose 4Fast Flow，2.8cm×20cm)进行凝胶过滤，除去未封入脂质体内的盐酸阿霉素。
实施例1中，脂质体磷脂使用磷脂C Test Wako(和光纯药公司制)进行定量。
另外，封入脂质体内的阿霉素浓度用在阿霉素脂质体40μL中加入甲醇2mL得到的溶液，用分光光度计测定480nm处的吸光度而求出。
粒径是将脂质体分散液20μL用生理盐水稀释至3mL，用Zetasizer3000HS(Malvern Instruments.)测定得到的平均粒径。得到的脂质体示于表1。
(比较例1)内封有阿霉素的脂质体的制造例
比较例1给出本发明范围外的脂质体制剂例。通过在脂质体形成时共存亲水性高分子脂质衍生物(PEG5000-DSPE)，使亲水性高分子(PEG链)分布在脂质体的双层膜的内外膜两侧，除此之外，使用与实施例1同样的脂质体成分，制造脂质体制剂。
即、称量0.37g与实施例1相同的混合脂质(HSPC∶Chol＝54∶46)，然后基于HSPC浓度，秤量0.073g PEG5000-DSPE，使PEG5000-DSPE达到2.0mol％，加入乙醇1mL，在65℃的恒温槽内溶解30分钟。确认完全溶解后，加入内水相10mL，再在65℃下加热搅拌60分钟，调制脂质体粗分散液。使用挤出机，进行与实施例1相同的操作，将挤出后的样品冰冷却。
将调制成的脂质体用经外水相充分置换后的凝胶柱(Sepharose 4Fast Flow)进行凝胶过滤，与实施例1同样地形成pH梯度，将凝胶过滤后的样品冰冷却。
基于通过凝胶过滤后的脂质体的脂质定量(HSPC定量)算出的HSPC浓度，按盐酸阿霉素/HSPC＝0.2(w/w)计算盐酸阿霉素量，基于计算结果称量必要量的盐酸阿霉素，使用10％蔗糖(pH9.0)溶液调制10mg/mL的溶液。
在脂质体分散液中加入规定量的盐酸阿霉素溶液(10mg/mL)，与实施例1同样地进行导入盐酸阿霉素的操作，除去未封入脂质体内的盐酸阿霉素。
与实施例1同样地进行脂质体磷脂的定量、测定封入脂质体内的阿霉素量、粒径。得到的脂质体示于表1。
(实施例2)本发明的内封有阿霉素的脂质体的制造例
在膜成分中使用鞘磷脂(SM)∶Chol＝55∶45的混合脂质，制造本发明的脂质体制剂.将SM∶Chol按55∶45的摩尔比溶解在氯仿/甲醇混合液中，减压蒸馏除去溶剂，形成薄膜.混合300mM的柠檬酸溶液和300mM的柠檬酸三钠溶液，调节成pH4.0，制成内水相溶液.称量混合脂质0.30g，加入内水相溶液5mL，70℃下进行10分钟水合.不时地使用保温在55℃的槽式超声波破碎仪施加超声波，使脂质均匀分散.
用保温在65℃的挤出机(Lipex Biomembranes公司制)，使得到的脂质分散液通过孔径400nm的过滤器3次，换成孔径200nm的过滤器后再通过3次，换成孔径100nm的过滤器后再进行同样的操作2次(400nm×3、
Figure G2005800097595D00212
200nm×3、100nm×5、100nm×5)。将挤出后的样品冰冷却。
将调制成的脂质体用经生理盐水充分置换后的凝胶柱(Sepharose4Fast Flow)进行凝胶过滤。将凝胶过滤后的样品冰冷却。
对凝胶过滤后的脂质体进行脂质定量(SM定量)，基于通过SM定量算出的SM浓度加入PEG5000-DSPE使其达到0.75mol％，60℃下搅拌30分钟，导入PEG5000-DSPE。
再基于通过SM定量算出的SM浓度，计算相对于脂质体的总脂质量为20mol％的盐酸阿霉素量，基于计算结果称量必要量的盐酸阿霉素，使用生理盐水调制10mg/mL的溶液。在脂质体分散液中加入规定量的盐酸阿霉素溶液(10mg/mL)，用1N NaOH或饱和碳酸氢钠水溶液调节成pH7.4后，在65℃下搅拌30分钟，导入盐酸阿霉素。将导入盐酸阿霉素后的样品冰冷却。用经生理盐水充分置换后的柱(Sepharose 4Fast Flow)进行凝胶过滤，除去未封入脂质体内的盐酸阿霉素。
与实施例1同样地进行脂质体磷脂的定量、测定封入脂质体内的阿霉素量、粒径。得到的脂质体示于表1。
表1
  膜构成(mol比)   粒径nm   载药量mol药物/mol脂质
 实施例1   HSPC∶Chol∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝54∶46∶1   118.8   0.11
 比较例1   HSPC∶Chol∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝54∶46∶2   112.9   0.13
 实施例2   SM∶Chol∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝54∶46∶0.75   107.4   0.12
(实施例3)
将HSPC∶Chol∶3，5-二(十五烷氧基)苄脒盐酸盐按50/42/8的摩尔比溶解在叔丁醇中，使其冻干得到混合脂质。
混合300mM的柠檬酸溶液和300mM的柠檬酸三钠溶液，调节成pH4，制成内水相溶液。
称量0.30g混合脂质，加入调节成pH4的内水相溶液5ml，在70℃下水合10分钟。不时地使用保温在55℃的槽式超声波破碎仪施加超声波，使脂质均匀分散。用保温在73℃的挤出机(Lipex Biomembranes公司制)，使得到的脂质分散液通过
Figure G2005800097595D00221
0.4μm的膜过滤器3次、0.2μm的膜过滤器3次、0.1μm的膜过滤器10次，得到LUV的分散液。得到的脂质体的粒径为111.3nm。
将上述调制成的脂质体分散液添加到柱(Sepharose 4Fast Flow，1.5cm×25cm)中，用生理盐水洗脱，进行凝胶过滤，将外水相用生理盐水置换。
将PEG5000-DSPE溶解在生理盐水中，使浓度为10mg/mL，将其加入到外水相中，使相对于脂质体的总脂质量含有0.75mol％的PEG5000-DSPE，边搅拌，边在60℃下培养30分钟。
将阿霉素溶解在生理盐水中，使浓度为10mg/mL，加入该溶液使相对于脂质体的总脂质量含有20mol％的阿霉素，用1N NaOH或饱和碳酸氢钠水溶液调节成pH7.4后，在65℃下培养30分钟。
上述方法中，与实施例1同样地定量脂质体磷脂。
粒径是将脂质体分散液100μL用生理盐水稀释至3mL，使用Zetasizer SZEM 5002(Malvern Instruments.)测定的。封入脂质体内的阿霉素量(载药量＝药剂/脂质)是用分光光度计测定在阿霉素脂质体0.1mL中混合1N HCl 0.3mL和异丙醇3.6mL得到的混合液在480nm处的吸光度而求出的。阿霉素量为0.12mol/mol。
(试验例1)
在以下的4种缓冲液中溶解PEG5000-DSPE(日本油脂公司制)，使浓度为5mg/mL，在65℃下加热90分钟。另外，将PEG5000-DSPE溶解在同样的缓冲液中，使浓度为10mg/mL，在40℃下保存1周。
缓冲液(1)：硫酸铵(250mM)
缓冲液(2)：L-组氨酸(10mM)，10％蔗糖pH6.5
缓冲液(3)：柠檬酸(300mM)pH4.0
缓冲液(4)：柠檬酸(300mM)pH7.5
取10μL保存后的溶液，在距离20cm×20cm的硅胶薄层板的下部1cm处点样。将硅胶薄层板放置在预先用氯仿/甲醇/氨水(28)混合液(85∶14∶1)的展开溶剂进行了平衡化的玻璃容器中，用展开溶剂展开约15cm，用碘显色法检测分解物。该薄层色谱(TLC)示于图1～2。图1是将PEG5000-DSPE溶液在65℃下加热90分钟后的TLC结果，图2是将PEG5000-DSPE溶液在40℃下加热1周后的TLC结果。结果未确认溶解在pH5以上的缓冲液中的样品加温前后在分解物(溶血物)的位置(参见Lyso-PEG Std的点)的点增大，而明确确认溶解在pH4的缓冲液中的样品的分解物(溶血物)的点增大。
试验例1给出酸性条件下的亲水性高分子脂质衍生物(PEG5000-DSPE)的稳定性数据。PEG5000-DSPE如果在酸性条件(缓冲液(3)柠檬酸pH4.0)下加热则发生分解。即，推测用比较例1列举的在酸性缓冲液条件下存在PEG5000-DSPE的方法制造的脂质体在制造时及保存时PEG5000-DSPE发生分解。另外，推测用比较例1的方法制造的脂质体的内水相为酸性，分布在内水相侧的PEG5000-DSPE也发生分解。结果示于试验例2。
(试验例2)实施例1与比较例1的脂质体的PEG分解行为比较
将实施例1和比较例1中调制的2种脂质体在40℃下保存1周·2周后，使用HPLC法进行PEG5000-DSPE定量。结果用相对于4℃下保存的PEG脂质体的PEG5000-DSPE残留率表示，示于图3。
试验例2的结果为比较例1的脂质体的PEG5000-DSPE残留率降低，表示PEG5000-DSPE发生分解。而实施例1的本发明脂质体的PEG5000-DSPE残留率未发生变化，表示PEG5000-DSPE未发生分解。
即，通过防止PEG5000-DSPE分解，能够克服伴随PEG5000-DSPE分解的脂质双层膜不稳定化、脂质体载带的药剂泄漏、脂质体凝集、防止脂质体与血浆蛋白或调理素蛋白发生吸附的效果降低、破坏脂质体在血中的稳定性等问题.
(实施例4)
按HSPC∶Chol∶碱性脂质((1)ODA、(2)MODA、(3)DMODA或(4)TMODA)＝50∶42∶8(mol比)称量各脂质，使其溶于乙醇。确认完全溶解后，加入硫酸铵溶液(250mM)9mL，在68℃下进行加热搅拌。加热搅拌结束后，使用加热到68℃的挤出机，在1.0MPa下用孔径为200nm的过滤器在2.0MPa下通过5次，换成孔径为100nm的过滤器后再通过5次。再换成孔径为100nm的过滤器，在2.0MPa下再通过5次。在挤出后的样品中加入2mL PEG5000-DSPE溶液(36.74mg/mL(RO水))，使PEG5000-DSPE导入率达到0.75mol％，60℃下加热搅拌30分钟，导入PEG5000-DSPE。将导入后的样品冰冷却。上述使用的各碱性脂质的结构如下所示。
将上述调制的脂质体分散液用经10％蔗糖(pH9.0)溶液充分置换后的凝胶柱(Sepharose 4Fast Flow)进行凝胶过滤，形成pH梯度。将凝胶过滤后的样品冰冷却。
再基于通过HSPC定量算出的HSPC浓度，按盐酸阿霉素(Dox)/总脂质(Total Lipid)(mol/mol)＝0.16(Dox/Total Lipid(w/w)＝0.18)计算盐酸阿霉素量。基于计算结果称量必要量的盐酸阿霉素，使用10％蔗糖(pH9.0)溶液调制10mg/mL的溶液。在脂质体分散液中加入规定量的盐酸阿霉素溶液(10mg/mL)，在60℃下搅拌60分钟，导入盐酸阿霉素。将导入盐酸阿霉素后的样品冰冷却。使用经10％蔗糖(pH6.5)溶液充分置换后的柱(Sepharose 4Fast Flow，
Figure G2005800097595D00251
2.8cm×20cm)进行凝胶过滤，除去未封入脂质体内的盐酸阿霉素。
定量对应于上述各碱性脂质得到的脂质体制剂(1)～(4)的磷脂、测定粒径及Zeta电位。
在本实施例中，脂质体磷脂使用磷脂C Test Wako(和光纯药公司制)进行定量。
粒径是将脂质体分散液20μL用生理盐水稀释至3mL，用Zetasizer3000HS(Malvern Instruments.)测定的平均粒径。
Zeta(Zeta)电位如下所述地测定。
在2.5mL的注射器中量取约2.5mL RO水。边拉推杆，边从注射器前端部加入20μL脂质体分散液及20μL杜比克氏(Dulbecco’s)PBS，然后，挤压推杆，推出空气。颠倒混和，使其均匀分散后，用Zetasizer3000HS进行Zeta电位测定。
实施例4的脂质体制剂(1)～(4)的测定结果与实施例1的脂质体制剂的测定结果一同示于表2。
(实施例5)
按HSPC∶Chol∶碱性脂质(TMODA)＝((1)53.5∶45.5∶1)、(2)(53∶45∶2)、(3)(52∶44∶4)、(4)(45.4∶38.6∶16)(mol比)秤量各脂质，使其溶于乙醇。之后的操作按与(实施例4)同样的操作顺序进行调制。
与实施例4同样地对对应于上述各碱性脂质比得到的脂质体制剂(1)～(4)的磷脂进行定量、测定粒径及Zeta电位。结果示于表2。
表2
  膜构成(mol比)   粒径nm   Zeta电位mV
  实施例1   HSPC∶Chol∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝54∶46∶0.75   110.9   -6.1
  实施例4(1)   HSPC∶Chol∶ODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝50∶42∶8∶0.75   119.7   2.2
  实施例4(2)   HSPC∶Chol∶MODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝50∶42∶8∶0.75   118.2   1.9
  实施例4(3)   HSPC∶Chol∶DMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝50∶42∶8∶0.75   120.3   2.7
  实施例4(4)   HSPC∶Chol∶TMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝50∶42∶8∶0.75   113.1   4.6
  实施例5(1)   HSPC∶Chol∶TMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝53.5∶45.5∶1∶0.75   119.0   -3.3
  实施例5(2)   HSPC∶Chol∶TMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝53∶45∶2∶0.75   120.6   -3.0
  实施例5(3)   HSPC∶Chol∶TMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝52∶45∶4∶0.75   124.3   -1.6
  膜构成(mol比)   粒径nm   Zeta电位mV
  实施例5(4)   HSPC∶Chol∶TMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝45.4∶38.6∶16∶0.75   110.3   5.1
(试验例3)脂质体制剂中的PEG的分解行为
将实施例4及实施例5中调制的脂质体制剂(各实施例的脂质体制剂(4))在40℃下保存2周后，采用HPLC法进行PEG5000-DSPE定量。与实施例1(无碱性化合物)的脂质体制剂的结果(试验例2)一同以相对于4℃下保存的PEG脂质体的PEG5000-DSPE的残留率表示，示于表3中。通过含有碱性化合物，能够依赖于碱性化合物的含量地进一步抑制PEG5000-DSPE的含量降低。
表3
  膜构成(mol比)   PEG<sub>5000</sub>-DSPE的残留率(％)
  实施例1   HSPC∶Chol∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝54∶46∶0.75   97.6
  实施例4(4)   HSPC∶Chol∶TMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝50∶42∶8∶0.75   99.0
  实施例5(4)   HSPC∶Chol∶TMODA∶PEG<sub>5000</sub>-DSPE＝45.4∶38.6∶16∶0.75   101.7
(试验例4)脂质体制剂中的HSPC的分解行为
将实施例4及实施例1中调制的脂质体制剂在40℃下保存1周/2周后，使用HPLC法定量HSPC的分解物比例(％)。HSPC分解物的比例(％)的计算方法如下所示。
HSPC的分解物比例(％)＝HSPC分解物的总峰面积/(HSPC的总峰面积+HSPC分解物的总峰面积)×100
试验例4的结果示于图4及图5。
如图4所示，实施例4的脂质体制剂与实施例1的脂质体相比，HSPC分解物的比例(％)少，表示HSPC的水解被抑制。可知HSPC分解物的比例(％)并非在较大程度上依赖于碱性化合物的构成。
图5表示实施例4的脂质体制剂在0周、1周、2周(图中的0W、1W、2W)的各试验期间相对于碱性化合物(TMODA)的含有率(mol％)的HSPC分解物的比例(％)的结果。如图5所示，随碱性化合物的含有率(mol％)提高，HSPC分解物的比例(％)得到抑制。
如上所述，通过将PEG脂质(PEG5000-DSPE)载带在脂质体的脂质双层膜的外侧，可以防止PEG5000-DSPE分解。而且，通过将碱性化合物导入脂质膜内，可以进一步抑制PEG5000-DSPE分解、也可以抑制HSPC水解、即使将必须在酸性环境下保持的药物包含在内水相的情况下也能够稳定脂质体制剂.根据本发明，能够克服脂质体制剂中的脂质双层膜的不稳定化、脂质体载带的药剂泄漏、脂质体凝集、防止脂质体与血浆蛋白或调理素蛋白发生吸附的效果降低、破坏脂质体在血中稳定性等问题.

Claims (18)

1.一种脂质体制剂，该脂质体具备由含有磷脂作为主膜材的脂质双层膜形成的单层囊泡和存在于该囊泡内的pH为5以下的内水相，并且载带有药物，其中，所述囊泡仅外表面被亲水性高分子修饰。
2.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述药物是在pH大于5的pH范围内不稳定的药物。
3.权利要求1或2所述的脂质体制剂，其中，该脂质体制剂以至少为0.05mol药物/mol脂质的浓度载带所述药物。
4.权利要求1或2所述的脂质体制剂，其中，该脂质体制剂以至少为0.1mol药物/mol脂质的浓度载带所述药物。
5.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述主膜材为相转移点为50℃以上的磷脂。
6.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述磷脂为被氢化的磷脂。
7.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述磷脂为鞘磷脂。
8.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，作为所述脂质双层膜的膜成分，还含有所述磷脂以外的其他脂质类。
9.权利要求6或7所述的脂质体制剂，其中，作为所述脂质双层膜的膜成分，还含有胆固醇。
10.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，作为所述脂质双层膜的膜成分，进一步含有包含选自氨基、脒基及胍基的基团的碱性化合物。
11.权利要求10所述的脂质体制剂，其中，所述碱性化合物为3，5-二(十五烷氧基)苄脒盐酸盐。
12.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述亲水性高分子为分子量500～10,000道尔顿的聚乙二醇。
13.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述亲水性高分子以亲水性高分子的磷脂或胆固醇衍生物的形式被导入。
14.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述脂质体制剂的平均粒径为40～140nm。
15.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述脂质体制剂的平均粒径为50～130nm。
16.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述脂质体制剂的平均粒径为60～120nm。
17.权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述内水相的pH为2～5。
18.权利要求1所述的脂质体制剂的制造方法，该方法为调制由含磷脂的脂质双层膜的单层结构的囊泡，使内水相的pH为5以下，然后，添加亲水性高分子脂质衍生物，仅修饰所述囊泡的外表面，在调制囊泡时将药物预先添加到内水相中、或在调制囊泡后使药物由囊泡外通过所述脂质双层膜而将药物封入，从而使药物被载带。
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