DE10219545A1

DE10219545A1 - Regulation of apoptosis

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Publication number: DE10219545A1
Application number: DE10219545A
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2002-04-26
Publication date: 2003-11-06
Also published as: EP1530473A2; WO2003090665A2; WO2003090665A3; AU2003232212A1; AU2003232212A8

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zum Nachweis von Kationenkanälen sowie die Verwendung eines Wirkstoffes zur Beeinflussung von Kationenkanälen zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen.The present invention relates to the use of a substance for the detection of cation channels and the use of an active substance to influence cation channels for the prevention or treatment of diseases which are associated with a disturbed regulation of apoptosis.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zum Nachweis von Kationenkanälen sowie die Verwendung eines Wirkstoffes zur Beeinflussung von Kationenkanälen zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen. The present invention relates to the use of a substance for Detection of cation channels and the use of an active ingredient for influencing cation channels for prevention or Treatment of diseases with impaired regulation of apoptosis being related.

Unter Apoptose wird der sogenannte programmierte Zelltod verstanden. Im weiteren Sinne faßt man darunter auch den Zelluntergang zusammen, der durch genetische Informationen der betroffenen Zelle selbst reguliert wird. Die Apoptose ist die Grundlage einer geregelten Embryogenese (Absterben überflüssiger Organanlagen), Gewebehomöostase (Schutz vor Neubildungen) und Funktion des Immunsystems (Auslösung von Apoptose bei Zielzellen durch zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen) und wird durch verschiedene Faktoren (z. B. Rezeptorbindungen, Proteasenwirkung) ausgelöst. Ferner spielt die Apoptose auch eine Rolle bei der Zytostastikawirkung, Strahlentherapie und anderen therapeutischen Prinzipien. Apoptosis is the so-called programmed cell death. In a broader sense, this also includes cell death together, through genetic information of the affected cell itself is regulated. Apoptosis is the basis of a regulated one Embryogenesis (death of superfluous organ systems), tissue homeostasis (Protection against new growth) and function of the immune system (triggering of apoptosis in target cells by cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells) and is affected by various factors (e.g. Receptor binding, protease effect) triggered. Apoptosis also plays a role also a role in cytostatic effects, radiation therapy and other therapeutic principles.

Wissenschaftliche Untersuchungen zeigen, daß oxidativer und osmotischer Streß, wohlbekannte Auslöser von apoptotischem Tod kernhaltiger Zellen [Gulbins et al. 2000, Michea et al. 2000, Rosette and Karin 1996] auch erythrozytäre Apoptose hervorrufen. Obgleich Erythrozyten weder Kerne noch Mitochondrien enthalten, sind sie doch fähig, morphologische Änderungen zu durchlaufen, wie sie für apoptotische kernhaltige Zellen typisch sind [Daugas et al. 2001], obwohl die Erythrozyten gegenüber manchen apoptotischen Stimuli resistent sind, wie z. B. gegen Serum-Entzug oder den Proteinkinase C-Hemmer Staurosporin [Daugas et al. 2001]. Scientific studies show that oxidative and osmotic stress, well-known triggers of apoptotic death nucleated cells [Gulbins et al. 2000, Michea et al. 2000, Rosette and Karin 1996] also cause erythrocytic apoptosis. Although erythrocytes contain neither nuclei nor mitochondria, they are able to undergo morphological changes such as those for apoptotic nucleated cells are typical [Daugas et al. 2001], although the erythrocytes are resistant to some apoptotic stimuli, e.g. B. against Serum withdrawal or the protein kinase C inhibitor staurosporin [Daugas et al. 2001].

Obwohl Apoptose eine wichtige Rolle in vielen Krankheitsverläufen spielt, sind die molekularen Mechanismen, welche die Apoptose vermitteln, und deren Bedeutung für den Krankheitslauf freilich bisher weitgehend unklar. Although apoptosis plays an important role in many disease courses plays are the molecular mechanisms that affect apoptosis mediate, and their importance for the course of the disease so far largely unclear.

Dementsprechend stellt sich die Erfindung die Aufgabe, unter Aufklärung der molekularen Mechanismen neue Diagnose- und Behandlungsansätze aufzufinden sowie Wirkstoffe bereitzustellen, die für die therapeutische und die diagnostische Anwendung bei Störungen der Apoptoseregulation genutzt werden können. Accordingly, the invention has the task of Clarification of molecular mechanisms new diagnostic and Find treatment approaches and provide active ingredients that are suitable for the therapeutic and diagnostic use for disorders of the Apoptosis regulation can be used.

Überraschenderweise konnte am Beispiel von Erythrozyten ein Mechanismus aufgezeigt werden, über den diese kernlosen Zelten in den programmierten Zelltod getrieben bzw. gegen wohlbekannte Auslöser von apoptotischem Tod resistent gemacht werden können. Surprisingly, using the example of erythrocytes Mechanism through which these coreless tents in the programmed cell death or against well-known triggers of apoptotic death can be made resistant.

Demzufolge wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 bis 4, 16, 22 und 26 gelöst. Bevorzugte Ausführungen sind in den abhängigen Ansprüchen 5 bis 15, 17 bis 21, 23 bis 25 und 27 genannt. Der Inhalt aller dieser Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht. Accordingly, the object of the invention is through the subject of independent claims 1 to 4, 16, 22 and 26 solved. preferred Executions are in the dependent claims 5 to 15, 17 to 21, 23 to 25 and 27 called. The content of all these claims is hereby made by reference to the content of the description.

Erfindungsgemäß kann mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen verwendet werden. Dabei wird diese Substanz zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose im Zusammenhang stehen, genutzt. Hierbei kann es sich z. B. um die Erkennung von genetischen Dispositionen für bestimmte Erkrankungen infolge von Mutationen, z. B. am Kationenkanal, handeln. Es kann so unter Umständen eine Anfälligkeit gegenüber bestimmten Erkrankungen diagnostiziert werden, so daß bei entsprechenden Symptomen schnell auf eine gestörte Regulation der Apoptose, mit den damit einhergehenden klinischen Symptomen, geschlossen werden kann. Bei der Substanz, die zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen eingesetzt wird, kann es sich z. B. um einen Antikörper handeln, der gegen den Kationenkanal gerichtet ist, und in einem dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, wie z. B. ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) eingesetzt wird. Weiterhin kann z. B. mit Hilfe der sogenannten PCR-Technik (polymerase chain reaction) dieser Nachweis erbracht werden. Bei diesem molekulargenetischen Verfahren werden selektiv bestimmte DNA- Abschnitte amplifiziert. Dabei erfolgt eine Neusynthese von DNA- Sequenzen, die von zwei synthetischen Oligonukleotiden eingerahmt werden, mittels DNA-Polymerasen. Durch die exponentielle Anreicherung, ausgehend von geringen Mengen DNA (10^-9-10^-15 g) können nach mehrmaliger Wiederholung des Vorgangs (20-40 Zyklen) die DNA-Abschnitte nachweisbar gemacht werden. Zum Nachweis von RNA-Abschnitten muß die RNA mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in eine DNA umkopiert werden. Durch Auswahl von geeigneten DNA- Abschnitten am Zielprotein, dem Kationenkanal, kann so der erfindungsgemäße Nachweis erfolgen. Weitere Verfahren, wie ein bekanntes Zielprotein bzw. Domänen eines aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzten Zielproteins quantitativ und/oder qualitativ nachgewiesen werden kann, sind dem Fachmann bekannt, und in diesem Zusammenhang wird auf die umfangreiche dementsprechende Fachliteratur verwiesen. According to the invention, at least one substance can be used to detect the expression and / or function of cation channels in cells. This substance is used to diagnose diseases related to impaired regulation of apoptosis. This can be e.g. B. to the detection of genetic dispositions for certain diseases due to mutations, z. B. act on the cation channel. Under certain circumstances, a susceptibility to certain diseases can be diagnosed, so that, with the corresponding symptoms, it can quickly be concluded that the regulation of apoptosis, with the clinical symptoms associated therewith, is disturbed. The substance used for the detection of expression and / or function of cation channels can, for. B. is an antibody that is directed against the cation channel, and in a detection method known to those skilled in the art, such as. B. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) is used. Furthermore, e.g. B. with the help of the so-called PCR technique (polymerase chain reaction) this proof can be provided. In this molecular genetic method, certain DNA sections are selectively amplified. DNA sequences framed by two synthetic oligonucleotides are re-synthesized using DNA polymerases. Due to the exponential enrichment, starting from small amounts of DNA (10 ^-9 -10 ^-15 g), the DNA sections can be made detectable after repeating the process several times (20-40 cycles). To detect RNA sections, the RNA must be copied into DNA using an RNA-dependent DNA polymerase. The detection according to the invention can thus be carried out by selecting suitable DNA sections on the target protein, the cation channel. Further methods of how a known target protein or domains of a target protein composed of several subunits can be quantitatively and / or qualitatively detected are known to the person skilled in the art, and in this connection reference is made to the extensive corresponding specialist literature.

Weiterhin kann erfindungsgemäß mindestens ein Wirkstoff zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen in Zellen verwendet werden. Dieser Wirkstoff beeinflußt nach Applikation die Expression und/oder die Funktion von Kationenkanälen, wobei es insbesondere zu einer Stimulierung oder Inhibierung des Kationenkanals kommt. Dies resultiert in einer Induktion, alternativ dazu einer zumindest partiellen Hemmung, der Apoptose, d. h. generell in einer Regulation der Apoptose in den betroffenen Zellen. Es kann sich bei diesem Wirkstoff zum einen um die schon beschriebenen Substanzen handeln, zum anderen kann der Wirkstoff z. B. eine gentechnisch veränderte Mutante des Kationenkanals, bzw. ein up-/downstream liegendes Mitglied der Signaltransduktionskaskade dieses Kationenkanals, sein. So ist es z. B. möglich, mit Hilfe der Gentechnologie Wirkstoffe herzustellen, die entweder a) eine höhere Aktivität als ihre physiologischen Äquivalente haben, oder b) keine Wechselwirkungen mit ihren physiologischen Inhibitoren eingehen können. Eine weitere Möglichkeit ist die Bereitstellung der natürlich vorkommenden Signalelemente. Auch könnten Inhibitoren der Signaltransduktionskaskade ihrerseits inhibiert werden, um so eine Aktivierung der entsprechenden Signaltransduktionskaskade des Kationkanales zu ermöglichen. Dieser Wirkstoff kann dann zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden, was in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beansprucht wird. Furthermore, at least one active ingredient can be used according to the invention Prevention or treatment of diseases in cells can be used. After application, this active ingredient influences expression and / or Function of cation channels, with it becoming a particular Stimulation or inhibition of the cation channel comes. This results in an induction, alternatively an at least partial inhibition, the Apoptosis, i.e. H. generally in a regulation of apoptosis in the affected cells. On the one hand, this active ingredient can already be act substances described, on the other hand, the active ingredient z. B. a genetically modified mutation of the cation channel, or an up- / downstream member of the signal transduction cascade this cation channel. So it is z. B. possible with the help of Genetic engineering to produce active ingredients that are either a) a higher Have activity as their physiological equivalents, or b) none Can interact with their physiological inhibitors. A Another possibility is to provide the naturally occurring Signal elements. Inhibitors of the Signal transduction cascade are inhibited in turn, so as to activate the corresponding signal transduction cascade of the cation channel enable. This ingredient can then be used to make a drug or a pharmaceutical composition are provided, which is claimed in a further preferred embodiment.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Regulation der Apoptose beansprucht. Bei diesem Verfahren werden Zellen mit einem Wirkstoff in Kontakt gebracht, wobei der Wirkstoff die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und dadurch die Apoptose in diesen Zellen induziert (bei Stimulierung) bzw. inhibiert (bei Hemmung). Abhängig von der Erkrankung, die mit der Apoptose assoziiert ist, kann dabei durch gezielte Beeinflussung der Apoptose der Krankheitsverlauf positiv beeinflußt werden. In a further preferred embodiment, a method for Regulation of apoptosis claimed. In this procedure Cells brought into contact with an active ingredient, the active ingredient being the Influences expression and / or function of cation channels, in particular stimulates or inhibits, and thereby apoptosis in them Cells induced (when stimulated) or inhibited (when inhibited). Depending on the disease that is associated with apoptosis, you may do so by specifically influencing apoptosis, the course of the disease is positive to be influenced.

Erfindungsgemäß hat die Beeinflussung, insbesondere die Stimulierung oder Inhibierung, von Kationenkanälen eine Beeinflussung und/oder Kontrolle der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, d. h. des Einstroms von Ca²⁺-Ionen in die Zelle, zur Folge. Der Kationenkanal ist dabei Ca²⁺ durchlässig, wodurch ein Eintritt von Ca²⁺ in die Zelle gewährt wird. Bei dem Kanal selbst handelt es sich um einen unspezifischen Kationenkanal. Durch Steigerung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration wird die zelluläre Apoptose unter geeigneten Bedingungen stimuliert, durch Herabsetzung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration dementsprechend die zelluläre Apoptose inhibiert. According to the invention, the influence, in particular the stimulation or inhibition, of cation channels has an influence and / or control of the intracellular Ca ²⁺ concentration, ie the influx of Ca ²⁺ ions into the cell. The cation channel is permeable to Ca ²⁺ , which allows Ca ^{2+ to} enter the cell. The channel itself is an unspecific cation channel. By increasing the intracellular Ca ²⁺ concentration, cellular apoptosis is stimulated under suitable conditions, and accordingly, by reducing the intracellular Ca ²⁺ concentration, cellular apoptosis is inhibited.

Generell sind erfindungsgemäß alle Zellen, d. h. sowohl kernhaltige als auch kernlose Zellen, beeinflußbar, wobei mittels Beeinflussung eines Kationenkanals die Apoptose reguliert werden kann. Unter Zellen werden erfindungsgemäß auch die Zellen umfaßt, die zwar kernlos sind, aber aus kernhaltigen Vorstufen hervorgegangen sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesen Zellen um Blutzellen, d. h. vom Knochenmark abstammenden Zellen, insbesondere um Erythrozyten. Diese kernlosen Zellen sind aus den kernhaltigen Vorstufen, den Erythroblasten, hervorgegangen. Während ihrer Entwicklung durch Reifung und Teilung (Erythropoese) wird der Kern aus der Zelle ausgestoßen, und im Zytoplasma findet gleichzeitig die Hämoglobinbildung statt. Die Zellvolumen-regulatorischen Kationeinkanäle werden, aber nicht nur in Erythrozyten, sondern auch in mehreren kernhaltigen Zellen exprimiert [Cabado et al. 1994, Chan & Nelson 1992, Gamper et al. 2000, Koch & Korbmacher 1999, Volk et al. 1995, Wehner et al. 1995, 2040]. Nachdem eine Zunahme von intrazellulärem Calcium auch in kernhaltigen Zellen Zelltod auslösen kann [Green & Reed 1998], kann die Aktivierung der Zellvolumen-empfindlichen Kationenkanäle gleichermaßen bei der Auslösung des apoptotischen Todes kernhaltiger Zellen eine Rolle spielen. In general, according to the invention, all cells, i.e. H. both nucleated as also coreless cells, which can be influenced by influencing one Cation channel the apoptosis can be regulated. Under cells according to the invention, the cells are also included which are seedless, but have arisen from nucleated preliminary stages. In a In a particularly preferred embodiment, these cells are Blood cells, d. H. cells derived from bone marrow, in particular around erythrocytes. These nucleated cells are from the nucleated Precursors, the erythroblasts. During their development through maturation and division (erythropoiesis) the nucleus becomes the cell ejected, and in the cytoplasm finds the Hemoglobin formation takes place. The cell volume regulatory cation channels are but not only in erythrocytes, but also in several nucleated Cells expressed [Cabado et al. 1994, Chan & Nelson 1992, Gamper et al. 2000, Koch & Korbmacher 1999, Volk et al. 1995, Wehner et al. 1995, 2040]. After an increase in intracellular calcium too can induce cell death in nucleated cells [Green & Reed 1998] the activation of the cell volume-sensitive cation channels equally nucleated in triggering apoptotic death Cells play a role.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Substanz gegen die Kationenkanäle selbst gerichtet. Bei dem Wirkstoff oder der Substanz kann es sich, neben den schon beschriebenen, auch unter anderem um Antisensesequenzen, gentechnisch veränderte Mutanten der Mitglieder der Signaltransduktionskaskade des Kationenkanals, oder um sogenannte "small molecular compounds" handeln. Weiter zu nennen sind Polynukleotide, welche für ein Peptid kodieren, welches die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, oder Polypeptide, welche vorzugsweise die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflussen, insbesondere stimulieren oder inhibieren. Weiterhin kann der Wirkstoff oder die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von Kationenkanälen gerichtet sein. Diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer können z. B. Transkriptionsfaktoren, die für den Expressionslevel des entsprechenden Kationenkanals verantwortlich sind, und andere bekannte Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von Kationenkanälen sein. Auch gegen diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer kann als Wirkstoff oder als Substanz z. B. ein Polynukleotid, welches ein Peptid kodiert, oder ein Polypeptid sowie ein "small molecular compound" eingesetzt werden. Auch der Einsatz mindestens einer oxidierenden Agens als Wirkstoff oder Substanz ist gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt. In a preferred embodiment, the active ingredient is or Substance directed against the cation channels themselves. For the active ingredient or the substance, in addition to those already described, can also be found under other about antisense sequences, genetically modified mutants the members of the signaling cascade of the cation channel, or are so-called "small molecular compounds". Further to are polynucleotides that code for a peptide that the Influences expression and / or function of cation channels, in particular stimulates or inhibits, or polypeptides, which preferably influence the expression and / or function of cation channels, in particular stimulate or inhibit. Furthermore, the active ingredient or the substance against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels. This Activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors can z. B. transcription factors relevant for the expression level of corresponding cation channel are responsible, and other known Activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors to Be cation channels. Against these activators, inhibitors, Regulators and / or biological precursors can be used as an active ingredient or as Substance z. B. a polynucleotide encoding a peptide, or a Polypeptide and a "small molecular compound" can be used. Also the use of at least one oxidizing agent as an active ingredient or Substance is according to a further preferred embodiment includes.

Bei der vorliegenden Erfindung ist es möglich, bekannte sowie noch unbekannte Wirkstoffe oder Substanzen zu verwenden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Substanz ein sogenannter "small molecular compound", insbesondere ein solcher mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000. Bei diesem "small molecular compound" handelt es sich vorzugsweise um Amilorid (MG 229,65), Ionomycin und/oder deren Analoga. Ein Beispiel für ein Analogon von Amilorid ist z. B. Ethylisopropylamilorid. Amilorid ist die internationale Kurzbezeichnung für das Kalium-retinierende Diuretikum N-Amidino-3,5- diamino-6-chlorpyrazin-2-carbamid. Diuretika sind allgemein Arzneimittel, die durch Hemmung der renalen Rückresorption vor allem von Na⁺- Ionen eine erhöhte Ausscheidung von Na⁺, Cl^- und HCO₃ ^--Ionen sowie (indirekt) von Wasser bewirken und dadurch das Plasmavolumen senken und Stauungssymptome verbessern. Kalium-retinierende bzw. kaliumsparende Diuretika wie Amilorid oder Triamteren hemmen die Natriumresorption im distalen Tubulus. Sie haben eine schwache diuretische Wirkung bei gleichzeitiger Kaliumretention. Ionomycin zählt zu den sogenannten Ionophoren. Diese von Pressmann 1967 eingeführte und aus "Ionen" und "phor" zusammengesetzte Bezeichnung faßt die meist makrozyklischen Verbindungen mit einem Molekulargewicht (MG) im allgemeinen < 2.000 zusammen, die reversibel Chelate oder auch Komplexe mit Ionen bilden. Aufgrund ihrer relativ hydrophoben Oberfläche können sie diese Ionen als Carrier durch sonst für Ionen undurchlässige biologische Membranen transportieren. Durch diese Carrierfunktion wird der Einstrom von Ca²⁺ ermöglicht, wodurch es zu einer Induzierung der Apoptose in den entsprechenden Zellen kommt. In the present invention, it is possible to use known or as yet unknown active substances or substances. In a particularly preferred embodiment, the active substance or the substance is a so-called "small molecular compound", in particular one with a molecular weight (MW) <2,000. This "small molecular compound" is preferably amiloride (MW 229.65), ionomycin and / or their analogs. An example of an analog of amiloride is e.g. B. Ethylisopropylamiloride. Amiloride is the international short name for the potassium-retaining diuretic N-amidino-3,5-diamino-6-chloropyrazine-2-carbamide. Diuretics are generally drugs that, by inhibiting renal reabsorption, especially of Na ⁺ ions, increase the excretion of Na ⁺ , Cl ^- and HCO ₃ ^- ions and (indirectly) water, thereby reducing the plasma volume and improving congestion symptoms. Potassium-retaining or potassium-saving diuretics such as amiloride or triamterene inhibit sodium absorption in the distal tubule. They have a weak diuretic effect combined with potassium retention. Ionomycin is one of the so-called ionophores. This name, introduced by Pressmann in 1967 and composed of "ions" and "phor", summarizes the mostly macrocyclic compounds with a molecular weight (MW) generally <2,000, which reversibly form chelates or complexes with ions. Due to their relatively hydrophobic surface, they can transport these ions as carriers through biological membranes that are otherwise impermeable to ions. This carrier function enables the influx of Ca ²⁺ , which leads to an induction of apoptosis in the corresponding cells.

Die Erfindung kann benutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation, insbesondere einer gestörten Inhibierung oder Induzierung, der Apoptose im Zusammenhang stehen, zu erkennen oder zu behandeln. Bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Inhibierung im Zusammenhang stehen, handelt es sich dabei z. B. um neurodegenerative Erkrankungen, akutes Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie und/oder Immundefizienz. Eine längere Verweildauer von Erythrozyten im hochosmolaren Nierenmark während eines akuten Nierenversagens [Mason et al. 1986] kann über Aktivierung des Kanals Apoptose auslösen, eine Wirkung, welche zur Störung der Mikrozirkulation beiträgt. Darüber hinaus wird der Kationen-Kanal bei Störungen aktiviert, welche zur Schrumpfung von Erythrozyten führen, wie Sichelzellanämie [Joiner 1993, Lang et al. 1998], Thalassämie [Mach-Pascual et al. 1996] oder Eisenmangelanämie [Jolobe 2000, Mach-Pascual et al. 1996]. Das beschleunigte Absterben der Erythrozyten bei diesen Erkrankungen kann demnach durch Hemmung des Kationenkanals zumindest partiell abgeschwächt werden. Alternativ dazu handelt es sich bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Induzierung der Apoptose in Zusammenhang stehen, um Tumorerkrankungen und/oder Infektionen, wohlbekannte Erkrankungen, bei denen eine gestörte Inhibierung der Apoptose vorliegt. Durch die Erfindung sind auch alle anderen Erkrankungen, die durch Induktion bzw. Inhibierung der Apoptose über einen Kationenkanal behandelbar sind, erfaßt. The invention can be used to treat all forms of diseases, those with a disturbed regulation, especially a disturbed one Inhibition or induction related to apoptosis recognize or treat. For diseases with a disturbed inhibition related, it is z. B. about neurodegenerative diseases, acute kidney failure, Thalassemia, sickle cell anemia, Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, iron deficiency anemia and / or immunodeficiency. A longer one Residence time of erythrocytes in the high osmolar renal medulla during acute kidney failure [Mason et al. 1986] can about activation of the channel trigger apoptosis, an effect which leads to the disruption of the Contributes to microcirculation. In addition, the cation channel at Disorders activated which lead to shrinkage of erythrocytes, such as sickle cell anemia [Joiner 1993, Lang et al. 1998], thalassemia [Mach-Pascual et al. 1996] or iron deficiency anemia [Jolobe 2000, Mach-Pascual et al. 1996]. The accelerated death of the Erythrocytes in these diseases can therefore be inhibited by Cation channel are at least partially weakened. Alternatively are the diseases with a disturbed Induction of apoptosis is related to tumor diseases and / or infections, well-known diseases in which one impaired inhibition of apoptosis is present. The invention also all other diseases caused by induction or inhibition of the Apoptosis can be treated via a cation channel.

Erfindungsgemäß kann der Wirkstoff oder die Substanz vor allem oral, intravenös, topisch und/oder durch Inhalation verabreicht werden. Die Verabreichungsform sowie die Dosis kann frei gewählt werden. Dabei spielen bekanntermaßen insbesondere Alter, Geschlecht, sowie andere Faktoren des Patienten eine Rolle. Auch das Krankheitsbild, sowie Art und Grad der Erkrankung müssen bei der Auswahl der Applikationsart sowie der Dosis des Wirkstoffes oder Substanz berücksichtigt werden. According to the invention, the active ingredient or substance can be administered orally, administered intravenously, topically and / or by inhalation. The The form of administration and the dose can be chosen freely. there are known to play especially age, gender, as well as others Factors of the patient matter. The clinical picture, as well as Art and degree of disease must be selected when choosing the type of application and the dose of the active ingredient or substance are taken into account.

Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen Wirkstoff enthält, der die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger. Dabei kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Polynukleotid handeln, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert. Alternativ dazu kann der Wirkstoff ein Peptid sein, vorzugsweise ein Polypeptid, wobei dieses Peptid bzw. Polypeptid vorzugsweise die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt. Der Wirkstoff kann ferner ein "small molecular compound", vorzugsweise ein "small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000, sein. So kann es sich z. B. bei dem Wirkstoff um eine sogenannte Antisensesequenz handeln, d. h. eine Sequenz, die in der Lage ist, mit der mRNA eine Doppelstrangduplex auszubilden, und dadurch die Translation in ein Polypeptid zu verhindern. Auch kann z. B. die Gensequenz selbst genutzt werden, um eine Über-/Unterexpression des Kationenkanals zu erzielen, z. B. durch Einbau in geeignete Vektoren mit starken Promotoren oder durch Konstruktion von geeigneten Mutanten. Weiterhin kann es sich bei dem Wirkstoff um die schon beschriebenen Stoffe Amilorid, Ionomycin und/oder deren Analoga, so z. B. Ethylisopropylamilorid, sowie einer oxidierenden Agens handeln. Zu weiteren Merkmalen einer solchen Zusammensetzung wird auf den entsprechenden bisherigen Text der Beschreibung Bezug genommen. The invention further comprises a pharmaceutical composition, which contains at least one active ingredient which expression and / or Function of cation channels influenced, in particular stimulated or inhibited, and optionally a pharmaceutical carrier. there the active substance can be a polynucleotide which encodes a peptide, in particular a polypeptide, preferably this peptide has the expression and / or function of cation channels influenced, especially stimulated or inhibited. Alternatively, you can the active ingredient may be a peptide, preferably a polypeptide, and this Peptide or polypeptide preferably the expression and / or function influenced by cation channels, in particular stimulated or inhibited. The active ingredient may also be a "small molecular compound", preferably a "small molecular compound" with a molecular weight (MG) < 2,000. So it can be z. B. in the active ingredient by a so-called Act antisense sequence, d. H. a sequence that is able to the mRNA to form a double-strand duplex, and thereby the Prevent translation into a polypeptide. Also, e.g. B. the Gene sequence itself can be used to over- / under-express the To achieve cation channel, e.g. B. by incorporation into suitable vectors strong promoters or by constructing suitable mutants. Furthermore, the active ingredient can be the one already described Amiloride, ionomycin and / or their analogs, such as. B. Ethylisopropylamilorid act as well as an oxidizing agent. To further Characteristics of such a composition is based on the corresponding previous text of the description.

Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes aufweist, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationkanälen beeinflußt, vorzugsweise stimuliert oder inhibiert. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch einen pharmazeutischen Träger enthalten. Die Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufer von Kationenkanälen können z. B. die weiter oben schon erwähnten Transkriptionsfaktoren, sowie weitere bekannte oder bis jetzt unbekannte Mitglieder der Signaltransduktionskaskade des Kationenkanals sein. Auch Polynukleotide, die ein Polypeptid kodieren, welches die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflussen, vorzugsweise stimulieren oder inhibieren, können in solchen Zusammensetzungen enthalten sein. Weiterhin sind sogenannte "small molecular compounds", die vorzugsweise ein Molekulargewicht (MG) von < 2.000 haben, und die gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen gerichtet sind, und dabei die Expression bzw. Funktion dieses Kanals stimulieren oder inhibieren, erfindungsgemäß einsetzbar. Schließlich kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Peptid handeln, vorzugsweise ein Polypeptid, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt. Zu den weiteren Merkmalen einer solchen Zusammensetzung wird auf den bisherigen entsprechenden Text der Beschreibung Bezug genommen. The invention further comprises a pharmaceutical composition, which has an effective amount of at least one active ingredient which Expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors influenced by cation channels, preferably stimulated or inhibited. This pharmaceutical The composition can optionally also be a pharmaceutical carrier contain. The activators, inhibitors, regulators and / or biological Precursors of cation channels can e.g. B. the above already mentioned transcription factors, as well as other known or so far unknown members of the signal transduction cascade of the Be cation channel. Also polynucleotides that encode a polypeptide that the Expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or influence biological precursors of cation channels, preferably stimulate or inhibit in such Compositions may be included. Furthermore, so-called "small molecular compounds ", which preferably have a molecular weight (MG) of <2,000 and against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels, and stimulate the expression or function of this channel or inhibit, can be used according to the invention. After all, it can the active ingredient is a peptide, preferably a polypeptide, preferably this peptide expresses and / or functions of Activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors influenced by cation channels, in particular stimulated or inhibited. To The further features of such a composition are based on the previous corresponding text of the description referred.

Schließlich umfaßt die Erfindung ein Diagnosekit. In diesem Kit ist mindestens eine Substanz enthalten, die zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen genutzt wird. Das Diagnosekit dient vorzugsweise zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen. Gezielt können solche Diagnosekits in einem Diagnoseverfahren eingesetzt werden, welches zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber neurodegenerativen Erkrankungen, akutem Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie, Immundefizienz, Tumorerkrankung und/oder Infektionen benutzt wird. Finally, the invention includes a diagnostic kit. In this kit is contain at least one substance for the detection of expression and / or function of cation channels is used. The diagnostic kit is used to identify vulnerabilities to Diseases associated with impaired regulation of apoptosis in Related. Such diagnostic kits can be targeted in one Diagnostic procedures are used, which for the detection of vulnerabilities against neurodegenerative diseases, acute kidney failure, Thalassemia, sickle cell anemia, Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, iron deficiency anemia, immunodeficiency, tumor disease and / or infections are used.

Die genannten Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und Figuren. Hierbei können die Einzelmerkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. The features mentioned and other features of the invention result preferred from the description below Embodiments in connection with the subclaims and figures. The individual features can be used individually or in groups Combination with each other.

In den Abbildungen zeigen: The pictures show:

Abb. 1 Ionomycin-induzierte Erythrozyten-Apoptose; Fig. 1 Ionomycin-induced erythrocyte apoptosis;

Abb. 2 Osmotisch ausgelöste erythrozytäre Apoptose; Fig. 2 Osmotically triggered erythrocytic apoptosis;

Abb. 3 Oxidativ ausgelöste erythrozytäre Apoptose; Fig. 3 Oxidatively induced erythrocytic apoptosis;

Abb. 4 Durch Glucosemangel ausgelöste erythrozytäre Apoptose. Fig. 4 Erythrocytic apoptosis caused by a lack of glucose.

methods

Erythrozyten wurden gesunden Freiwilligen entnommen. Die Experimente wurden bei 37°C in Ringer-Lösung folgender Zusammensetzung vorgenommen: 125 mM NaCl, 5mM KCl, 1 mM MgSO₄, 32 mM N-2- Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES), 5 mM Glucose, 1 mM CaCl₂, pH = 7.4. Für die nominal Calcium-freie Lösung wurde CaCl₂ durch 1mM Ethylenglycol-bis(β-aminoethyläther)-N,N,N',N'-tetra-Essigsäure (EGTA) ersetzt. Die Osmolarität wurde durch Zugabe von Sucrose auf 850 mosmol/l gesteigert. Ionomycin wurde in einer Konzentration von 1 µM, Amilorid in einer Konzentration von 1 mM eingesetzt. Die Konzentration des Lösungsmittels Dimethylsulfoxid DMSO war jeweils 0.1%. Erythrocytes were taken from healthy volunteers. The experiments were carried out at 37 ° C. in Ringer's solution of the following composition: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO ₄ , 32 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES), 5 mM glucose, 1 mM CaCl ₂ , pH = 7.4. For the nominal calcium-free solution, CaCl _{2 was} replaced by 1 mM ethylene glycol bis (β-aminoethyl ether) -N, N, N ', N'-tetra-acetic acid (EGTA). The osmolarity was increased to 850 mosmol / l by adding sucrose. Ionomycin was used in a concentration of 1 μM, amiloride in a concentration of 1 mM. The concentration of the solvent dimethyl sulfoxide DMSO was 0.1% in each case.

Die FACS-Analyse (flow cytometric analysis) wurde nach Standardmethoden durchgeführt [Andree et al., 1990]. Nach Inkubation wurden die Zellen in Annexin-bindendem Puffer gewaschen, der 125 mM NaCl, 10 mM HEPES; pH = 7.4) und 5 mM CaCl₂ enthielt. Die Erythrozyten wurden mit Annexin-Flous (Böhringer Mannheim, Germany) 1 : 100 verdünnt. Nach 15 min. wurden die Proben 1 : 5 verdünnt und durch FACS analysiert (FACS-Calibur from Becton Dickinson). Von den Zellen wurden Vorwärtsstreuung (forward scatter), Seitwärtsstreuung (sideward scatter) und Annexin-Fluoreszenz (FL-1) gemessen. The FACS analysis (flow cytometric analysis) was carried out according to standard methods [Andree et al., 1990]. After incubation, the cells were washed in annexin binding buffer containing 125 mM NaCl, 10 mM HEPES; pH = 7.4) and 5 mM CaCl ₂ contained. The erythrocytes were diluted 1: 100 with Annexin-Flous (Böhringer Mannheim, Germany). After 15 min. the samples were diluted 1: 5 and analyzed by FACS (FACS-Calibur from Becton Dickinson). Forward scatter, sideward scatter, and annexin fluorescence (FL-1) were measured from the cells.

Die Werte werden als arithmetische Mittelwerte ± SEM angegeben, die statistische Analyse wurde mit Hilfe des gepaarten oder ungepaarten t- Tests durchgeführt. The values are given as arithmetic mean ± SEM, the statistical analysis was performed using the paired or unpaired t Tests performed.

Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um der Frage nachzugehen, ob osmotischer Schock oder oxidativer Streß, gut bekannte Auslöser von apoptotischem Zelltod in kernhaltigen Zellen [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998, Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &, Karin 1996] auch Erythrozyten in die Apoptose treiben. Es konnte gezeigt werden, daß beide Maßnahmen sowie Glucosemangel Apoptose auslösen. Überraschenderweise wurde die Apoptose durch Entfernen des extrazellulären Ca²⁺ unterbunden. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß der Kationenkanal- Hemmstoff Amilorid die osmotisch, oxidativ oder metabolisch induzierte Apoptose unterbinden kann. Amilorid hemmt einen Kationenkanal, der durch osmotischen Schock [Huber et al. 2001] und oxidativen Streß [Duranton et al. 2001] aktiviert wird und Ca²⁺ in die Zelle einströmen läßt [Duranton et al. 2001]. Die Hemmung der erythrozytären Apoptose durch Amilorid zeigt daher, daß die Apoptose durch Aktivierung dieses Kanals zustande kommt. Befunde in kernhaltigen Zellen zeigen, daß auch diese Zellen durch Aktivierung des Amilorid-sensitiven Kationenkanales getötet werden können. Studies have been conducted to investigate whether osmotic shock or oxidative stress are well-known triggers of apoptotic cell death in nucleated cells [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998, Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &, Karin 1996] also drive erythrocytes into apoptosis. It could be shown that both measures and glucose deficiency trigger apoptosis. Surprisingly, apoptosis was prevented by removing the extracellular Ca ²⁺ . In further experiments it could be shown that the cation channel inhibitor amiloride can suppress the osmotic, oxidative or metabolically induced apoptosis. Amiloride inhibits a cation channel that is caused by osmotic shock [Huber et al. 2001] and oxidative stress [Duranton et al. 2001] is activated and Ca ^{2+ flows} into the cell [Duranton et al. 2001]. The inhibition of erythrocytic apoptosis by amiloride therefore shows that apoptosis is caused by activation of this channel. Findings in nucleated cells show that these cells can also be killed by activating the amiloride-sensitive cation channel.

Experiment 1 Increase in the cytosolic calcium concentration by the ionophore Ionomycin triggers erythrocytic apoptosis

Änderungen des Zellvolumens (gemessen als forward scatter) nach einer 3-stündigen Inkubation von Erythrozyten mit 1 µM Ionomycin in Abwesenheit von Ca²⁺ (A) oder in Anwesenheit von Ca²⁺ (B). Phosphatidylserin-Assymmetrie (gemessen als Annexinbindung) nach 3-stündiger Inkubation mit Ionomycin in Abwesenheit von Ca²⁺ (C) oder Anwesenheit von Ca²⁺ (D). Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexinbindenden Zellen nach 3 Stunden Vorbehandlung mit 1 µM Ionomycin mit oder ohne Ca²⁺ in der extrazellulären Flüssigkeit (E). Changes in cell volume (measured as forward scatter) after a 3-hour incubation of erythrocytes with 1 µM ionomycin in the absence of Ca ²⁺ (A) or in the presence of Ca ²⁺ (B). Phosphatidylserine asymmetry (measured as annexin binding) after 3 hours of incubation with ionomycin in the absence of Ca ²⁺ (C) or presence of Ca ²⁺ (D). Arithmetic mean (± SEM) of annexin-binding cells after 3 hours pretreatment with 1 µM ionomycin with or without Ca ²⁺ in the extracellular fluid (E).

Um die Bedeutung von Ca²⁺ für die erythrozytäre Apoptose zu überprüfen, wurde das Calciumionophor Ionomycin eingesetzt. Wie in Abb. 1 B gezeigt wird, führt die Verabreichung von 1 µM Ionomycin binnen 3 Stunden zu massiver, Ca²⁺-abhängiger Zeltschrumpfung, wie anhand der "Vorwärtsstreuung" (forward scatter FC) der Fluoreszenz-aktivierten Zell Sortierung (FACS) gezeigt werden kann. Die FC nimmt von einem Wert von 428 ± 13 (n = 3) auf einen Wert von 121 ± 2 (n = 4) ab. Darüber hinaus steigert 1 µM Ionomycin die Bindung von Annexin von 4.1 ± 0.4% (n = 3) auf 71.3 ± 3.2% (n = 4) (Fig. 1 D). Ionomycin induzierte Zellschrumpfung und Annexinbindung werden beide in Abwesenheit von extrazellulärem Ca²⁺ gehemmt. Die entsprechenden Werte betragen 337 ± 16 (n = 4) für die FC und 12.9 ± 3.1% (n = 4) für die Annexinbindung (Fig. 1 E). Die Behandlung von Erythrozyten mit Ionomycin löst somit zwei typische Merkmale der Apoptose aus, d. h. das Zusammenbrechen der Phosphatidylserin-Asymmetrie (welche zur Annexinbindung führt) und die Zellschrumpfung. The calcium ionophore ionomycin was used to check the importance of Ca ²⁺ for erythrocytic apoptosis. As shown in Fig. 1B, the administration of 1 µM ionomycin leads to massive, Ca ²⁺ -dependent cell shrinkage within 3 hours, as shown by the "forward scatter FC" of the fluorescence-activated cell sorting (FACS) can be. The FC decreases from a value of 428 ± 13 (n = 3) to a value of 121 ± 2 (n = 4). In addition, 1 µM ionomycin increases the binding of annexin from 4.1 ± 0.4% (n = 3) to 71.3 ± 3.2% (n = 4) ( Fig. 1 D). Ionomycin-induced cell shrinkage and annexin binding are both inhibited in the absence of extracellular Ca ²⁺ . The corresponding values are 337 ± 16 (n = 4) for the FC and 12.9 ± 3.1% (n = 4) for the annexin binding ( Fig. 1 E). Treatment of erythrocytes with ionomycin thus triggers two typical features of apoptosis, ie the breakdown of phosphatidylserine asymmetry (which leads to annexin binding) and cell shrinkage.

Experiment 2 Osmotic shock leads to erythrocyte annexin binding

Annexin-Bindung von Erythrozyten in isotonischem Medium (A) und in 850 mosmolarem Medium nach Zugabe von Sucrose für 24 Stunden (B). Die Zellen wurden der hyperosmolaren Lösung ferner in Abwesenheit von Ca²⁺ (C) oder in Anwesenheit von 1 mM Ca²⁺ aber Anwesenheit von 1 mM Amilorid (D) ausgesetzt. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen bei verschiedenen Osmolaritäten nach 24 und 48 Stunden (E). Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin- bindenden Zellen, die für 24 Stunden in 850 mosmol/l mit oder ohne Ca²⁺ bzw. mit oder ohne 1 mM Amilorid inkubiert wurden (F). Annexin binding of erythrocytes in isotonic medium (A) and in 850 mosmolar medium after addition of sucrose for 24 hours (B). The cells were further exposed to the hyperosmolar solution in the absence of Ca ²⁺ (C) or in the presence of 1 mM Ca ²⁺ but in the presence of 1 mM amiloride (D). Arithmetic mean (± SEM) of annexin-binding cells at various osmolarities after 24 and 48 hours (E). Arithmetic mean (± SEM) of annexin-binding cells that were incubated for 24 hours in 850 mosmol / l with or without Ca ²⁺ or with or without 1 mM amiloride (F).

Osmotischer Schock ist als Auslöser von Apoptose in kernhaltigen Zellen bekannt [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998, Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &, Karin 1996]. Wie überraschenderweise beobachtet wurde, steigert osmotischer Schock die Annexinbindung auch von kernlosen Erythrozyten (Abb. 2B, E). Werden Erythrozyten einer Osmolarität von 850 mosmol/l ausgesetzt (Zugabe von Sucrose), dann steigt die Zahl Annexin-bindender Zellen binnen 24 Stunden von 3.9 ± 0.3% (n = 4) auf 51.4 ± 3.8% (n = 9). Ein typisches Experiment ist in Abb. 2B dargestellt. Nominale Abwesenheit von Calcium mindert die Zahl Annexin-bindender Zellen nach osmotischem Schock signifikant auf 21.1 ± 7.2% (n = 4, siehe Abb. 2C für ein typisches Experiment und Abb. 2F für arithmetische Mittelwerte ± SEM). Darüber hinaus senkt der Kationenkanalblocker Amilorid (1 mM) die Zahl Annexin-bindender Zellen signifikant auf 29.8 ± 4.0% (n = 5, siehe Abb. 2D für ein typisches Experiment und Abb. 2F für arithmetische Mittelwerte ± SEM). Osmotic shock is known to trigger apoptosis in nucleated cells [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998, Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &, Karin 1996]. As was surprisingly observed, osmotic shock also increases the annexin binding of coreless erythrocytes ( Fig. 2B, E). If erythrocytes are exposed to an osmolarity of 850 mosmol / l (addition of sucrose), the number of annexin-binding cells increases from 3.9 ± 0.3% (n = 4) to 51.4 ± 3.8% (n = 9) within 24 hours. A typical experiment is shown in Fig. 2B. Nominal absence of calcium significantly reduces the number of annexin-binding cells after osmotic shock to 21.1 ± 7.2% (n = 4, see Fig. 2C for a typical experiment and Fig. 2F for arithmetic mean ± SEM). In addition, the cation channel blocker amiloride (1 mM) significantly reduces the number of annexin-binding cells to 29.8 ± 4.0% (n = 5, see Fig. 2D for a typical experiment and Fig. 2F for arithmetic mean values ± SEM).

Experiment 3 Oxidative stress triggers erythrocytic apoptosis

Annexinbindung vor (A) und nach (B, C, D) 15-minütiger Oxidation von Erythrozyten mit 0.66 tert-butyl-hydroperoxid (tBOOH). Nach der Oxidation wurden die Zellen für 24 Stunden in Ringerlösung mit 1 mM Ca²⁺ (B) oder ohne Ca²⁺ (C) bzw. mit 1 mM Ca²⁺ und 1 mM Amilorid (D) inkubiert. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen 24 Stunden nach einer 15-minütigen Behandlung mit 1 mM tBOOH oder 0.66 mM tBOOH, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM Ca²⁺ oder in der Anwesenheit von 1 mM Ca²⁺ und 1 mM Amilorid (E). Annexin binding before (A) and after (B, C, D) oxidation of erythrocytes with 0.66 tert-butyl hydroperoxide (tBOOH) for 15 minutes. After the oxidation, the cells were incubated for 24 hours in Ringer's solution with 1 mM Ca ²⁺ (B) or without Ca ²⁺ (C) or with 1 mM Ca ²⁺ and 1 mM amiloride (D). Arithmetic mean (± SEM) of annexin binding cells 24 hours after 15 minutes of treatment with 1mM tBOOH or 0.66mM tBOOH, in the presence or absence of 1mM Ca ²⁺ or in the presence of 1mM Ca ²⁺ and 1mM amiloride (E).

Oxidativer Streß, hervorgerufen durch die Verabreichung von 0.66 mM oder 1 mM tert-butyl-hydroperoxide (tBOOH) führte zu massiver Schrumpfung von Erythrozyten, wie durch die Änderung der Vorwärtsstreuung (forward scatter) in der FACS-Analyse von 370 ± 13 (n = 4) auf 314 ± 51 (n = 4) bzw. 167 ± 14 (n = 4) erkennbar wird. In einer ersten Serie von Experimenten konnte beobachtet werden, daß eine Behandlung der Zellen für 15 min mit 0.66 mM tBOOH signifikante Annexin-Bindung auslöst (Fig. 3B). Die Annexinbindung konnte durch Weglassen des extrazellulären Calciums (Abb. 3C) oder durch Verabreichung von 1 mM Amilorid (Abb. 3D) signifikant reduziert werden. Wie in Abb. 3E gezeigt wird, steigern 0.66 mM und 1 mM tBOOH die Zahl Annexin-bindender Zellen von 3.2 ± 0.5% (n = 4) auf 26 ± 7.5% (n = 4) und 68.5 ± 5.3 (n = 4). In der nominalen Abwesenheit extrazellulären Calciums sind sowohl die Oxidationsinduzierte Zellschrumpfung, als auch die Annexin- Bindung beide herabgesetzt. Die Werte für die Vorwärtsstreuung (forward scatter) in Calciumfreiem Incubationsmedium erreichten 339 ± 22 (n = 4) (0.66 mM tBOOH) und 307 ± 15 (n = 4) (1 mM tBOOH), im Vergleich zu 314 ± 51 (n = 4) und 167 ± 14 (n = 4) in der Anwesenheit von Calcium. Die Zahlen für Annexin-positive Zellen erreichten nur 11.0 ± 1.4% (n = 4) (0.66 mM tBOOH) und 34.1 ± 2.6% (n = 4) (1 mM tBOOH) in der Abwesenheit von Calcium (Fig. 3E). Entsprechend hemmte das Weglassen von extrazellulärem Calcium die tBOOH-induzierte Phosphatidylserin-Umlagerung um 66% bzw. 53%. Gleichermaßen minderte die Anwesenheit von 1 mM Amilorid die Wirkung von tBOOH selbst in der Anwesenheit von 1 mM Ca²⁺. Die jeweiligen Werte für die Vorwärtsstreuung (forward scatter) erreichten 356 ± 24.0 (n = 4) (0.66 mM tBOOH) und 291 ± 27 (n = 4) (1 mM tBOOH). In der Anwesenheit von 1 mM Amilorid wurde die Zahl Annexin-positiver Zellen auf 7.9 ± 3.2% (0.66 mM tBOOH) bzw. 37.7 ± 4.4% (1 mM tBOOH) herabgesetzt, ein Befund, welcher die Hemmung der t-BOOH-induzierten Annexin-Bindung um 80 bzw. 48% reflektiert (Abb. 3E). Oxidative stress caused by the administration of 0.66 mM or 1 mM tert-butyl hydroperoxide (tBOOH) led to massive shrinkage of erythrocytes, as by the change in the forward scatter in the FACS analysis of 370 ± 13 (n = 4) on 314 ± 51 (n = 4) or 167 ± 14 (n = 4). In a first series of experiments it was observed that treatment of the cells for 15 min with 0.66 mM tBOOH triggers significant annexin binding ( FIG. 3B). Annexin binding could be significantly reduced by omitting the extracellular calcium ( Fig. 3C) or by administering 1 mM amiloride ( Fig. 3D). As shown in Fig. 3E, 0.66 mM and 1 mM tBOOH increase the number of annexin-binding cells from 3.2 ± 0.5% (n = 4) to 26 ± 7.5% (n = 4) and 68.5 ± 5.3 (n = 4) , In the nominal absence of extracellular calcium, both oxidation-induced cell shrinkage and annexin binding are both reduced. The values for forward scatter in calcium-free incubation medium reached 339 ± 22 (n = 4) (0.66 mM tBOOH) and 307 ± 15 (n = 4) (1 mM tBOOH), compared to 314 ± 51 (n = 4) and 167 ± 14 (n = 4) in the presence of calcium. The numbers for annexin positive cells only reached 11.0 ± 1.4% (n = 4) (0.66 mM tBOOH) and 34.1 ± 2.6% (n = 4) (1 mM tBOOH) in the absence of calcium ( Fig. 3E). Accordingly, the omission of extracellular calcium inhibited the tBOOH-induced phosphatidylserine rearrangement by 66% and 53%, respectively. Likewise, the presence of 1mM amiloride diminished the effect of tBOOH even in the presence of 1mM Ca ²⁺ . The respective values for the forward scatter reached 356 ± 24.0 (n = 4) (0.66 mM tBOOH) and 291 ± 27 (n = 4) (1 mM tBOOH). In the presence of 1 mM amiloride, the number of annexin-positive cells was reduced to 7.9 ± 3.2% (0.66 mM tBOOH) and 37.7 ± 4.4% (1 mM tBOOH), respectively, a finding which showed the inhibition of the t-BOOH-induced annexin -Binding reflected by 80 or 48% ( Fig. 3E).

Experiment 4

Glucosemangel induziert ErythrozytenapoptoseA lack of glucose induces erythrocyte apoptosis

Annexin-Bindung von Erythrozyten nach 48-stündiger Inkubation in der Anwesenheit (A) oder der Abwesenheit von Glucose (B). Die Zellen wurden ferner einer Glucose-freien Lösung ohne Ca²⁺ (C) oder mit 1 mM Ca²⁺ und 1 mM Amilorid (D) ausgesetzt. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen, welche einem Glucoseentzug für 24 oder 48 Stunden mit oder ohne Anwesenheit von Ca²⁺ oder 1 mM Amilorid (E) ausgesetzt wurden. Annexin binding of erythrocytes after 48 hours incubation in the presence (A) or in the absence of glucose (B). The cells were further exposed to a glucose-free solution without Ca ²⁺ (C) or with 1 mM Ca ²⁺ and 1 mM amiloride (D). Arithmetic mean (± SEM) of annexin-binding cells that were exposed to glucose deprivation for 24 or 48 hours with or without the presence of Ca ²⁺ or 1 mM amiloride (E).

Es wurde früher gezeigt, daß Glucosemangel die antioxidativen Mechanismen von Erythrozyten schwächt. Daher wurde die Wirkung von Glucosemangel untersucht (Abb. 4A-E). In der Anwesenheit von Glucose banden 3.1 ± 0.6% (n = 4) der Erythrozyten Annexin. Die Entfernung von Glucose aus dem extrazellulären Medium steigerte die Zahl Annexinbindender Zellen auf 11.2 ± 2.2% (n = 4) nach 24 Stunden und auf 49.4 ± 5.7% (n = 4) nach 48 Stunden. Die Zunahme Annexin-bindender Zellen war in der nominalen Abwesenheit von Calcium signifikant herabgesetzt. Die entsprechenden Werte waren 10.4 ± 2.5% (n = 4) nach 24 Stunden und 10.0 ± 1.9% (n = 4) nach 48 Stunden. In gleicher Weise wurde die Wirkung von Glucose-Entzug durch Amilorid (1 mM) abgeschwächt. Die jeweiligen Werte waren 5.7 ± 1.8% (n = 4) nach 24 Stunden und 11.7 ± 1.9% (n = 4) nach 48 Stunden (Abb. 4E). Glucose deficiency has previously been shown to weaken the antioxidant mechanisms of erythrocytes. The effect of glucose deficiency was therefore investigated ( Fig. 4A-E). In the presence of glucose, 3.1 ± 0.6% (n = 4) of the erythrocytes bound annexin. Removal of glucose from the extracellular medium increased the number of annexin-binding cells to 11.2 ± 2.2% (n = 4) after 24 hours and to 49.4 ± 5.7% (n = 4) after 48 hours. The increase in annexin-binding cells was significantly reduced in the nominal absence of calcium. The corresponding values were 10.4 ± 2.5% (n = 4) after 24 hours and 10.0 ± 1.9% (n = 4) after 48 hours. In the same way, the effect of glucose withdrawal was weakened by amiloride (1 mM). The respective values were 5.7 ± 1.8% (n = 4) after 24 hours and 11.7 ± 1.9% (n = 4) after 48 hours ( Fig. 4E).

Jüngste Befunde zeigten, daß der Ca²⁺-Ionophor Ionomycin erythrozytäre Zellschrumpfung und Annexinbindung von Erythrozyten auslöst, beides typische Hinweise auf Apoptose in kernhaltigen Zellen [Bratosin et al. 2001, Berg et al. 2001, Daugas et al. 2001]. Wie und unter welchen Bedingungen die Ca²⁺-Konzentration in Erythrozyten gesteigert wird, blieb bisher unklar. Mit den vorliegenden Ergebnissen ist zum ersten Mal die Bedeutung eines Amilorid-sensitiven, Zellvolumen-regulierten Kationenkanales für die Auslösung von apoptotischem Zelltod gezeigt worden. Die Kanäle wurden früher charakterisiert, ihre Hemmbarken durch Amilorid [Huber et al. 2001, Duranton et al. 2002], sowie ihre Empfindlichkeit gegenüber osmotischem [Huber et al. 2001] und oxidativem [Duranton et al. 2002] Streß gezeigt. Recent findings have shown that the Ca ²⁺ ionophore ionomycin triggers erythrocytic cell shrinkage and annexin binding of erythrocytes, both typical indications of apoptosis in nucleated cells [Bratosin et al. 2001, Berg et al. 2001, Daugas et al. 2001]. How and under what conditions the Ca ²⁺ concentration is increased in erythrocytes has so far remained unclear. With the present results, the importance of an amiloride-sensitive, cell volume-regulated cation channel for the triggering of apoptotic cell death was shown for the first time. The channels were characterized earlier, their inhibitory bark by amiloride [Huber et al. 2001, Duranton et al. 2002] and their sensitivity to osmotic [Huber et al. 2001] and oxidative [Duranton et al. 2002] shown stress.

Die durch oxidativen Streß induzierte erythrozytäre Zellschrumpfung resultiert aus einer Aktivierung von Ca²⁺-sensitiven K⁺-Kanälen in der erythrozytären Zellmembran, die über eine Hyperpolarisation der Zellmembran zu erythrozytärem Verlust von KCl führt [Bookchin et al. 1987, Brugnara et al. 1993]. The erythrocytic cell shrinkage induced by oxidative stress results from an activation of Ca ²⁺ sensitive K ⁺ channels in the erythrocytic cell membrane, which leads to erythrocyte loss of KCl via hyperpolarization of the cell membrane [Bookchin et al. 1987, Brugnara et al. 1993].

Die gezeigten Mechanismen spielen eine Rolle in der Begrenzung der Erythrozytenlebensdauer. Die Präsentation von Phosphatidylserin auf der Zelloberfläche stimuliert die Aufnahme der Erythrozyten durch Makrophagen [Boas et al. 1998, Romero & Romero 1999]. Daher fördert eine Zunahme der intrazellulären Calcium-Konzentration, wie sie in alternden Erythrozyten auftritt [Kiefer & Snyder 2000, Romero & Romero 1999], die Entfernung der betroffenen Erythrozyten aus der Blutbahn. The mechanisms shown play a role in limiting the Erythrocyte life. The presentation of phosphatidylserine on the cell surface stimulates the uptake of erythrocytes Macrophages [Boas et al. 1998, Romero & Romero 1999]. Therefore encourages an increase in intracellular calcium concentration as seen in aging erythrocytes occurs [Kiefer & Snyder 2000, Romero & Romero 1999], the removal of the affected erythrocytes from the bloodstream.

Oxidativer Streß oder herabgesetzte Wirksamkeit von antioxidativen Mechanismen [Damonte et al. 1992] beschleunigt zumindest z. T. über Aktivierung des Kationenkanales die Entfernung von Erythrozyten. Durch Hemmung der Kationenkanäle wird dieses Absterben verzögert. Ähnliche Befunde lassen sich auch in kernhaltigen Zellen nachweisen. Literatur Andree HA, Reutelingsperger CP, Hauptmann R, Hemker HC, Hermens WT and Willems GM (1990) Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers. J Biol Chem. 265: 4923-8
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Claims

1. Use at least one substance for the detection of Expression and / or function of cation channels in cells, for Diagnosis of diseases with a disturbed regulation related to apoptosis.

2. Use of at least one active ingredient for influencing, in particular to stimulate or inhibit expression and / or function of cation channels in cells, for prevention or treatment of disorders associated with a disorder Regulation of apoptosis related.

3. Use of at least one active ingredient for influencing, in particular to stimulate or inhibit expression and / or function of cation channels in cells, for the production a drug or a pharmaceutical Composition for the prevention or treatment of diseases associated with an impaired regulation of apoptosis stand.

4. A method for regulating apoptosis, characterized in that that cells are brought into contact with an active ingredient which influences the expression and / or function of cation channels, in particular stimulates or inhibits, and thereby apoptosis induced or inhibited in these cells.

5. Use or method according to one of claims 2 to 4, characterized in that the influence, in particular stimulation or inhibition, of cation channels has an influence and / or control of the Ca ²⁺ influx into the cells.

6. Use or method according to one of the preceding Claims, characterized in that the cells are Blood cells, especially erythrocytes.

7. Use or method according to one of the preceding Claims, characterized in that the active ingredient or the Substance is directed against cation channels.

8. Use or method according to one of the preceding Claims, characterized in that the active ingredient or the Substance against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursor is directed by cation channels.

9. Use or method according to one of the preceding Claims, characterized in that the active ingredient or the Substance is a polynucleotide, which is a peptide, in particular a Polypeptide, encoded, preferably this peptide Influences expression and / or function of cation channels, especially stimulated or inhibited.

10. Use or method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the active ingredient or substance Is peptide, preferably a polypeptide, preferably this peptide has the expression and / or function of cation channels influenced, especially stimulated or inhibited.

11. Use or method according to one of the preceding Claims, characterized in that the active ingredient or the Substance a "small molecular compound", preferably a "small molecular compound "with a molecular weight (MG) <2,000 is.

12. Use or method according to claim 11, characterized characterized in that the active ingredient or the substance amiloride or a Is analog.

13. Use or method according to one of claims 1 to 11, characterized in that the active substance or the substance is an oxidizing agent.

14. Use or method according to one of the preceding Claims, characterized in that it is in the Diseases with a disturbed regulation, especially one impaired inhibition related to apoptosis about neurodegenerative diseases, acute kidney failure, Thalassemia, sickle cell anemia, Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, iron deficiency anemia and / or immunodeficiency is.

15. Use or method according to one of claims 1 to 13, characterized in that the diseases that with a disturbed regulation, especially a disturbed one Inducing apoptosis related to tumors and / or infections.

16. Pharmaceutical composition comprising an effective Amount of at least one active ingredient, the expression and / or Function of cation channels influenced, in particular stimulated or inhibited, and optionally a pharmaceutical Carrier.

17. Pharmaceutical composition according to claim 16, characterized characterized in that the active ingredient is a polynucleotide which encodes a peptide, in particular a polypeptide, where preferably this peptide expresses and / or functions of Cation channels influenced, in particular stimulated or inhibited.

18. Pharmaceutical composition according to claim 16, characterized characterized in that the active ingredient is a peptide, preferably a Polypeptide, preferably this peptide is the expression and / or function of cation channels influenced, in particular stimulates or inhibits.

19. Pharmaceutical composition according to one of the claims 16 to 18, characterized in that the active ingredient is a "small molecular compound ", preferably a" small molecular compound "with a molecular weight (MW) <2,000.

20. Pharmaceutical composition according to claim 19, characterized characterized in that the active ingredient is amiloride or an analog.

21. Pharmaceutical composition according to one of the claims 16 to 19, characterized in that the active ingredient is a is oxidizing agent.

22. Pharmaceutical composition comprising an effective Amount of at least one active ingredient, the expression and / or Function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors influenced by cation channels, in particular stimulates or inhibits, and optionally one pharmaceutical carrier.

23. Pharmaceutical composition according to claim 22, characterized characterized in that the active ingredient is a polynucleotide which encodes a peptide, in particular a polypeptide, where preferably this peptide expresses and / or functions of Activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors influenced by cation channels, in particular stimulated or inhibited.

24. Pharmaceutical composition according to claim 22, characterized characterized in that the active ingredient is a peptide, preferably a Polypeptide, preferably this peptide is the expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels, especially stimulates or inhibits.

25. Pharmaceutical composition according to one of the claims 22 to 24, characterized in that the active ingredient is a "small molecular compound ", preferably a" small molecular compound "with a molecular weight (MW) <2,000.

26. Diagnostic kit comprising at least one substance for detection of expression and / or function of cation channels for Detection of susceptibility to diseases associated with a disturbed regulation of apoptosis.

27. Diagnostic kit according to claim 26 for the detection of vulnerabilities against neurodegenerative diseases, acute Kidney failure, thalassemia, sickle cell anemia, glucose-6-phosphate Dehydrogenase deficiency, iron deficiency anemia, immunodeficiency, Tumor diseases and / or infections.