DE19859115A1 - Use of delayed tumor cells in combination with intact antibodies for immunization - Google Patents
Use of delayed tumor cells in combination with intact antibodies for immunizationInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Tumorzel len zeitversetzt in Kombination mit intakten, bevorzugt hetero logen Antikörpern zur Immunisierung von Mensch und Tier.The present invention relates to the use of tumor cells len delayed in combination with intact, preferably hetero antibodies to immunize humans and animals.
Die Immuntherapie durch Antikörper, insbesondere durch bispezi fische oder trispezifische Antikörper, hat in den letzten Jah ren an Bedeutung stetig zugenommen. Ein wesentliches Problem bei der Verwendung derartiger Antikörper in der Immuntherapie ist beispielsweise die Aktivierung der Immunzellen, z. B. der T- Lymphozyten.Immunotherapy with antibodies, especially bispeci fish or trispecific antibodies, has been used in recent years increasing importance. An essential problem when using such antibodies in immunotherapy is, for example, the activation of the immune cells, e.g. B. the T- Lymphocytes.
In der DE 196 49 223 und der DE 197 10 495 sind intakte bispe zifische und trispezifische Antikörper beschrieben, die zur Immuntherapie eingesetzt werden. Diese bispezfischen und tri spezifischen Antikörper sind befähigt, an eine T-Zelle, zumin dest ein Antigen auf einer Zielzelle und durch ihren Fc-Teil oder durch eine dritte Spezifität an Fc-Rezeptor positive Zellen (akzessorische Zellen) zu binden.DE 196 49 223 and DE 197 10 495 are intact bispe specific and trispecific antibodies described which are used for Immunotherapy can be used. These bispec fish and tri specific antibodies are capable of attaching to a T cell, at least one antigen on a target cell and through its Fc part or by a third specificity to Fc receptor positive cells (accessory cells).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Ver wendungsart eines Kombinationspräparates bereitzustellen, das sowohl Tumorzellen enthält, die so behandelt wurden, daß ihr Überleben nach Reinfusion verhindert wird, als auch intakte bispezifische und/trispezifische Antikörper, die gegen die Tu morzellen gerichtet sind.It is an object of the present invention to develop a new ver to provide a combination preparation contains both tumor cells that have been treated so that their Survival after reinfusion is prevented as well as intact bispecific and / or trispecific antibodies against Tu morelles are directed.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß autologe
Tumorzellen oder allogene Tumorzellen desselben Tumortyps, die
je so behandelt wurden, daß ihr Überleben nach Reinfusion ver
hindert wird, zeitversetzt in Kombination mit intakten bispezi
fischen und/oder trispezifischen Antikörpern, die die nachfol
genden Eigenschaften aufweisen:
This object is achieved in that autologous tumor cells or allogeneic tumor cells of the same tumor type, which have been treated in such a way that their survival after reinfusion is prevented, staggered in time in combination with intact bispecific and / or trispecific antibodies which have the following properties :
- 1. α) Binden an eine T-Zelle;1. α) binding to a T cell;
- 2. β) Binden an zumindest ein Antigen auf einer Tumorzelle;2. β) binding to at least one antigen on a tumor cell;
- 3. γ) Binden durch ihren Fc-Teil (bei bispezifischen Antikör pern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifi schen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positiven Zellen,3. γ) binding through their Fc part (with bispecific antibody pern) or by a third specificity (for trispecific antibodies) on Fc receptor positive cells,
an den zu immunisierenden Menschen oder das zu immunisierende Tier verabreicht werden.to the person to be immunized or the person to be immunized Animal.
Die Tumorzellen und die Antikörper bilden erfindungsgemäß eine funktionelle Einheit und werden in Form einer Kombination ver abreicht, um zielgerichtet eine Immunisierung zu erreichen, wobei es für den Erfolg der Verwendung darauf ankommt, daß ihre Anwendung zeitlich abgestuft voneinander erfolgt. Dabei ist es grundsätzlich möglich, zunächst die behandelten Tumorzellen zu verabreichen und, zeitlich abgesetzt hiervon, die Antikörper, oder zunächst die Antikörper an den Patienten zu verabreichen und, zeitlich abgestuft hiervon, die Tumorzellen.According to the invention, the tumor cells and the antibodies form one functional unit and are ver in the form of a combination is enough to achieve a targeted immunization, the success of the use depends on their Application takes place in different stages. It is basically possible to first treat the treated tumor cells administer and, at different times, the antibodies, or first administer the antibodies to the patient and, in terms of time, the tumor cells.
Der Zeitraum, der zwischen der Verabreichung der Tumorzellen und der Antikörper und vice versa liegt, beträgt bevorzugt ca. 1-48 Stunden. Besonders bevorzugt ist ein Zeitraum von 1-24 Stunden, weiterhin bevorzugt 1-12 Stunden. Weiterhin möglich sind Zeiträume von 1-6 Stunden oder 2-4 Stunden. Entschei dend für den Erfolg der vorliegenden Erfindung ist die zeitlich abgestufte Anwendung, wobei der anzuwendende Zeitraum auch von der Art des zu behandelnden Tumors und vom verwendeten Antikör per abhängen kann. Die jeweiligen optimalen Zeiträume können anhand von Versuchen vom Fachmann ermittelt werden.The period of time between the administration of the tumor cells and the antibody and vice versa is preferably approximately 1-48 hours. A period of 1-24 is particularly preferred Hours, further preferably 1-12 hours. Still possible are periods of 1-6 hours or 2-4 hours. Decide The end of the success of the present invention is the temporal graded application, the period to be used also by the type of tumor to be treated and the antibody used can depend on. The respective optimal periods can can be determined on the basis of experiments by a specialist.
Die verwendeten Tumorzellen sollen möglichst intakt verabreicht werden. Es ist jedoch auch notwendig, daß ihr Überleben nach Reinfusion verhindert wird. Hierzu hat es sich als sinnvoll herausgestellt, die Tumorzellen entweder zu bestrahlen oder durch chemische Agentien am Überleben nach Reinfusion zu ver hindern. Durch diese beiden Behandlungsarten bleibt insbesonde re die äußere Struktur der Tumorzellen unverändert, d. h. das Erkennungsmuster für die Antikörper.The tumor cells used should be administered as intact as possible become. However, it is also necessary for them to survive Reinfusion is prevented. For this it has made sense exposed either to irradiate the tumor cells or by chemical agents to survive after reinfusion prevent. In particular, these two types of treatment remain re the outer structure of the tumor cells unchanged, d. H. the Recognition pattern for the antibodies.
Zur Bestrahlung wird bevorzugt eine γ-Bestrahlung eingesetzt, die vorzugsweise mit einer Dosis von 20-200 Gy erfolgt. Bei einer chemischen Behandlung hat sich Mitomycin C besonders be währt. Besonders bevorzugt werden heterologe bispezifische und/oder trispezifische Antikörper eingesetzt.Γ-radiation is preferably used for the radiation, which is preferably done with a dose of 20-200 Gy. At Mitomycin C has especially been a chemical treatment lasts. Heterologous bispecific ones are particularly preferred and / or trispecific antibodies are used.
Der Immunisierungserfolg kann dadurch weiter verbessert werden, daß die Antikörper und die Tumorzellen, je zeitlich getrennt voneinander, mehrfach verabreicht werden. Eine weitere Verbes serung der Immunogenität der Tumorzellen ist dadurch erreich bar, daß diese vor Infusion einer Hitzevorbehandlung unterzogen werden. Der bevorzugte Bereich liegt hier bei 41-42°C, wobei das Optimum durch Versuche ermittelt werden kann. Bevorzugte Ergebnisse werden bei einer Temperatur von ca. 41,8°C erzielt. Der Zeitraum für die Hitzevorbehandlung beträgt im allgemeinen 1 bis 6 Stunden, bevorzugt ca. 3 Stunden. Der Zeitraum als auch die Temperatur, die optimalerweise eingesetzt werden können, hängen von der Art des zu behandelnden Tumors ab. Die jeweili gen Optima können vom Fachmann anhand von Laborversuchen ermit telt werden.The immunization success can be further improved by that the antibodies and the tumor cells, each separated in time from each other, administered multiple times. Another verb This improves the immunogenicity of the tumor cells bar that they had undergone heat pretreatment prior to infusion become. The preferred range here is 41-42 ° C the optimum can be determined by tests. Preferred Results are achieved at a temperature of approx. 41.8 ° C. The period for the heat pretreatment is generally 1 to 6 hours, preferably about 3 hours. The period as well the temperature that can be optimally used depend on the type of tumor to be treated. The respective Gen Optima can be determined by a specialist using laboratory tests be communicated.
Wie im syngenen (autologen) murinen Tumormodell gezeigt werden konnte, spielen für eine besonders erfolgreiche Induktion der Immunität auch noch weitere Faktoren eine nicht unerhebliche Rolle. So ist die räumlich korrekte Präsentation des Tumormate rials wichtig. Die Tumorzellen müssen den für eine Immunisie rung verantwortlichen Immunzellen im richtigen räumlichen Kon text präsentiert werden. Eine intravenöse (i. v.), intraperito neale (i. p.) oder subkutane (s. c.) Applikation hat sich hierbei als besonders günstig herausgestellt, da hierdurch der optimale Kontakt in diesen Kompartimenten mit den entsprechenden Immun zellen unter Anwendung der bispezifischen und/oder trispezifi schen Antikörper gewährleistet wird.As shown in the syngeneic (autologous) murine tumor model could play for a particularly successful induction of the Immunity also other factors a not insignificant Role. So is the spatially correct presentation of the tumor format rials important. The tumor cells need to be immunized responsible immune cells in the right spatial context text are presented. An intravenous (IV), intraperito neal (i. p.) or subcutaneous (s. c.) application has been found turned out to be particularly cheap, as this makes the optimal Contact in these compartments with the appropriate immune system cells using the bispecific and / or trispecific antibody is guaranteed.
Zur erfolgreichen Immunisierung ist es weiterhin vorteilhaft, daß die Menge der verabreichten Tumorzellen in geeigneter Weise ausgewählt wird. So konnte in den Versuchen im murinen Tumormo dell gezeigt werden, daß eine zu geringe Anzahl an Tumorzellen nicht den gewünschten Immunisierungserfolg bringt. Eine zu gro ße Menge an Tumormaterial wiederum kann sich nachteilig auswir ken, da beispielsweise Toleranzphänomene auftreten können. Überträgt man diese Resultate auf die Situation im Patienten, heißt dies, daß es für den Immunisierungserfolg vorteilhaft ist, eine definierte Menge an Tumormaterial im korrekten räum lichen Kontext mit einer ebenfalls definierten Menge an Anti körpern zu verabreichen. Ein Immunisierungserfolg stellt sich zwar auch dann ein, wenn einer dieser Parameter nicht optimiert wurde; besonders gute Ergebnisse werden jedoch erzielt, wenn sowohl die Mengen des Antikörpers als auch die Menge an Tumor material als auch der räumliche Kontext aufeinander abgestimmt und optimiert wurden. For successful immunization, it is also advantageous that the amount of tumor cells administered is appropriate is selected. So in the experiments in the murine tumor dell are shown to have too few tumor cells does not bring the desired immunization success. One too big In turn, excessive amounts of tumor material can have an adverse effect because, for example, tolerance phenomena can occur. If you transfer these results to the situation in the patient, this means that it is beneficial for immunization success is a defined amount of tumor material in the correct space context with a defined amount of anti body to administer. Success in immunization arises even if one of these parameters is not optimized has been; However, particularly good results are achieved if both the amounts of the antibody and the amount of tumor material and the spatial context are coordinated and optimized.
Unter Berücksichtigung der obigen Ausführungen kann bei einer zu geringen Tumorzellzahl beispielsweise nur ein unzureichender Immunschutz etabliert werden. Daher ist es für einen vollstän digen Immunisierungserfolg notwendig, mit einer definierten Anzahl an aktivierten Tumorzellen und einer definierten Menge an bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörpern zu immu nisieren. Die jeweiligen Zahlen können vom Fachmann anhand von Versuchen etabliert werden.Taking into account the above, a an insufficient number of tumor cells, for example Immune protection to be established. Therefore, it is complete for one successful immunization with a defined Number of activated tumor cells and a defined amount to bispecific and / or trispecific antibodies nize. The person skilled in the art can determine the respective numbers using Try to be established.
Die erfindungsgemäß eingesetzten bispezifischen und/oder tri spezifischen Antikörper werden bevorzugt in einer Menge von 5-500 µg, weiterhin bevorzugt 10-300 µg, 10-100 µg oder 10-50 µg, je pro Infusion, verabreicht. Die Menge des eingesetzten Antikörpers hängt von der Art des zu behandelnden Tumors, von der Reaktion des Patienten und weiteren Faktoren ab. Die opti malen Mengen können vom Fachmann anhand von Versuchen ermittelt werden.The bispecific and / or tri used according to the invention specific antibodies are preferred in an amount of 5-500 µg, further preferably 10-300 µg, 10-100 µg or 10-50 µg, each per infusion. The amount of used Antibody depends on the type of tumor being treated the patient's reaction and other factors. The opti Paint quantities can be determined by the expert on the basis of experiments become.
Die Tumorzellen werden bevorzugt in einer Menge von 107-109 Zellen pro Infusion verabreicht, wobei sich eine Zellzahl von ca. 108 als bevorzugt herausgestellt hat. Die Tumorzellen wur den, wie oben ausgeführt, vor der Reinfusion so behandelt, daß ihr Überleben nach Reinfusion verhindert wird, wobei sie wahl weise zusätzlich einer Hitzevorbehandlung unterzogen werden können. Nähere Ausführungen hierzu sind in der vorliegenden Be schreibung enthalten.The tumor cells are preferably administered in an amount of 10 7 -10 9 cells per infusion, a cell count of approximately 10 8 having been found to be preferred. As stated above, the tumor cells were treated before reinfusion in such a way that their survival after reinfusion is prevented, and they can optionally also be subjected to heat pretreatment. Further information on this is contained in the present description.
Unumgänglich ist jedoch die zeitlich versetzte Verabreichung der Tumorzellen und der Antikörper. Dadurch wird gewährleistet, daß durch die Injektion des bispezifischen und/oder trispezifi schen, bevorzugt heterologen Antikörpers in den zu behandeln den Tieren oder Menschen zunächst aufgrund des Überschusses an vorhandenen T-Lymphozyten im peripheren Blut diese über den hochaffinen Bindungsarm gebunden und präaktiviert werden. Zu sätzlich können auch vorhandene Fc-Rezeptor positive akzessori sche Immunzellen über den Fc-Anteil des bispezifischen oder trispezifischen Antikörpers gebunden werden. Wird nun dieser Zellkomplex aus T-Zelle und Fc-Rezeptor positiver Zelle über den zweiten hochaffinen Tumorbindungsarm an die vergleichsweise in geringer Anzahl vorhandenen Tumorzellen herangeführt, werden diese durch T-Lymphozyten bzw. Fc-Rezeptor positiven Zellen zerstört und über die in den Zellkomplex eingebundenen Fc-Re zeptor positiven Zellen, beispielsweise Makrophagen, phagozy tiert. Dies konnte in einem Versuch mit markierten humanen Mo nozyten/Makrophagen und Tumorzellen bereits gezeigt werden. In einem nächsten Schritt wird das aufgenommene Tumormaterial pro zessiert und über MHC Klasse I und insbesondere Klasse II Mole küle dem Immunsystem präsentiert, was eine wichtige Vorausset zung für die beobachtete humorale Immunantwort darstellt.However, the delayed administration is essential of the tumor cells and the antibodies. This ensures that by injection of the bispecific and / or trispecific to treat, preferably heterologous antibody in the to animals or humans initially due to the excess existing T-lymphocytes in the peripheral blood these over the high affinity binding arm can be bound and preactivated. To In addition, existing Fc receptors can also have positive accessories immune cells via the Fc portion of the bispecific or trispecific antibody are bound. Now this one Cell complex from T cell and Fc receptor positive cell via the second high-affinity tumor binding arm to the comparatively are introduced in small numbers of existing tumor cells these positive cells by T lymphocytes or Fc receptor destroyed and via the Fc-Re integrated into the cell complex zeptor positive cells, for example macrophages, phagocytic animals. This could be done in an experiment with labeled human Mo Noocytes / macrophages and tumor cells have already been shown. In A next step is the tumor material taken up per categorized and about MHC class I and especially class II moles küle presented to the immune system, which is an important requirement represents the observed humoral immune response.
Wie das erfindungsgemäße Beispiel zeigt, setzt der Nachweis von tumorreaktiven Antikörpern, die nach einer Therapie gebildet wurden, die Aktivierung von CD4+ tumorspezifischen T-Lymphozy ten voraus, die über die T-B-Zell-Kooperation tumorspezifische B-Zellklone stimulieren können. Durch den Nachweis der humora len Immunantwort konnte somit indirekt ebenfalls eine zelluläre CD4-T-Zellantwort nachgewiesen werden und somit das Überleben der Mäuse als Folge der erfindungsgemäßen zeitlich versetzten Gabe von Tumorzellen und Antikörpern erklärt werden.As the example according to the invention shows, the detection of tumor-reactive antibodies formed after therapy the activation of CD4 + tumor-specific T-lymphozy ten ahead, the tumor-specific via the T-B cell cooperation Can stimulate B cell clones. By demonstrating the humora len immune response could thus indirectly also a cellular CD4-T cell response can be demonstrated and thus survival of the mice as a result of the staggered timing according to the invention Administration of tumor cells and antibodies can be explained.
In einem murinen, autologen Tumormodell wurde der Aufbau eines langanhaltenden Immunschutzes gegen den Tumor mit Hilfe von bsAk untersucht. Hierzu wurde C57BL/6 Mäusen zunächst eine an sich letale Dosis an autologen Melanomzellen verabreicht und zwei Tage später parentale bzw. bispezfische Antikörper nachin jiziert. Um zu testen, ob in den Mäusen hierbei ein langanhal tender Immunschutz aufgebaut worden ist, wurden die überleben den Mäuse nach 100 Tagen einer erneuten Tumorgabe, diesmal je doch ohne Ak, unterzogen. Um ferner der Frage nachzugehen, in wieweit für die Entwicklung des Immunschutzes die Anzahl an verabreichten Tumorzellen eine Rolle spielt, wurden die Versu che mit einer niedrigen Tumordosis von 1500 Tumorzellen (TZ) sowie mit einer hohen Dosis von 5000 Tumorzellen durchgeführt. Neben dem Überleben der Mäuse wurde darüber hinaus eine vorhan dene humorale Immunantwort gegen den Tumor als Kriterium für einen vorliegenden Immunschutz herangezogen. Hierzu wurden die Seren der Mäuse vor und 100 Tage nach der Behandlung (unmittel bar vor der erneuten Tumorgabe) auf das Vorhandensein von anti- Tumorantikörpern miteinander verglichen.In a murine, autologous tumor model, the structure of a long-term immune protection against the tumor with the help of bsAk examined. For this purpose, C57BL / 6 mice were initially treated with one lethal dose of autologous melanoma cells is administered and two days later parental or bispecific antibodies after jokes. To test whether the mice have a long lasting immune protection has been built up, they have survived the mice after 100 days of a new tumor, this time each but without Ak, subjected. To further investigate the question in to what extent the number for the development of immune protection administered tumor plays a role, the Versu che with a low tumor dose of 1500 tumor cells (TZ) as well as with a high dose of 5000 tumor cells. In addition to the survival of the mice, there was also one their humoral immune response against the tumor as a criterion for existing immune protection. For this, the Sera from the mice before and 100 days after treatment (immediately bar before re-tumor) for the presence of anti Tumor antibodies compared with each other.
Die Abb. 1 zeigt die Überlebenskurven der Mäuse nach der primären Tumorgabe von 1500 bzw. 5000 Tumorzellen. Während die Kontrollmäuse ohne Antikörper-Behandlung alle innerhalb von 35 Tagen verstarben, konnten sämtliche mit bsAk behandelten Mäuse geheilt werden. Im Vergleich hierzu überlebten von den Mäusen, die mit einer Kombination aus den beiden parentalen Ak behan delt wurden, nur 84% nach der niedrigen Tumordosis und nur 16% nach der hohen Tumordosis. Fig. 1 shows the survival curves of the mice after the primary tumor administration of 1500 or 5000 tumor cells. While the control mice without antibody treatment all died within 35 days, all mice treated with bsAk could be cured. In comparison, only 84% of the mice treated with a combination of the two parental antibodies survived after the low tumor dose and only 16% after the high tumor dose.
Dieser qualitative Unterschied zwischen den bsAk und den paren talen Ak machte sich auch bei der Ausbildung einer humoralen Immunantwort bemerkbar. Die Abb. 2 zeigt die in der Durch flußzytometrie gemessene humorale Immunantwort gegen die Tumor zellen. Während die Überlebenden aus der "parentalen Gruppe" keine humorale Immunantwort aufwiesen, zeigte sich dies bei den Mäusen aus der "bispezifischen Gruppe". Besonders wichtig hier für war allerdings die Menge an verabreichtem Tumormaterial. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen mit niedrig- und hochdosierter Tumorgabe. Während nach niedriger verabreichter Tumordosis nur 17% der Mäuse einen starken und 33% einen schwachen Titer aufwiesen, konnte nach der höheren Tumordosis bei 66% der Mäuse ein starker Titer nachgewiesen werden.This qualitative difference between the bsAk and the parental tal was also noticeable in the development of a humoral immune response. Fig. 2 shows the humoral immune response against the tumor cells measured by flow cytometry. While the survivors from the "parental group" had no humoral immune response, this was shown in the mice from the "bispecific group". However, the amount of tumor material administered was particularly important for this. There was a significant difference between the low and high dose groups. While only 17% of the mice had a strong titer and 33% a weak titer after a lower dose of the tumor, a strong titer was found in 66% of the mice after the higher tumor dose.
Des weiteren korrelieren die gewonnenen Daten zur humoralen Immunantwort eindeutig mit dem Überleben der Mäuse nach erneu ter Tumorgabe ohne nachfolgende Antikörper-Injektion. Nur die Mäuse, die einen starken Antikörper-Titer gegen den Tumor auf gebaut hatten, überlebten die Tumorgabe oder starben stark ver zögert im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Immunisierung. Hin gegen starben alle Mäuse ohne nachweisbaren Titer zuerst und ohne Verzögerung im Vergleich zur Kontrolle. In Abb. 3 sind die Überlebenskurven der Mäuse dargestellt, die einer er neuten Tumorgabe unterzogen wurden ohne diese Mäuse anschlie ßend wieder mit Antikörper zu behandeln. Die Mäuse, die eine hohe Primärgabe von 5000 TZ erhalten hatten, besaßen einen deutlichen Überlebensvorteil gegenüber den Mäusen mit einer niedrig dosierten Primärtumorgabe von 1500 TZ.Furthermore, the data obtained on the humoral immune response clearly correlate with the survival of the mice after renewed tumor administration without subsequent antibody injection. Only the mice that had built up a strong antibody titer against the tumor survived the tumor administration or died after a delay compared to the control group without immunization. In contrast, all mice with no detectable titer died first and without delay compared to the control. Fig. 3 shows the survival curves of the mice that were given a new tumor dose without subsequently treating these mice again with antibodies. The mice, which had received a high primary dose of 5000 TZ, had a clear survival advantage compared to the mice with a low-dose primary tumor dose of 1500 TZ.
Nachfolgend werden bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung, insbesondere in Bezug auf die zu verwendenden bispezifischen und trispezifischen Antikörper und die Tumorzellen, offenbart.Preferred embodiments of the invention are described below, especially with regard to the bispecific to be used and trispecific antibody and the tumor cells.
Die Tumorzellen werden aus einem Patienten entnommen (autologe Tumorzellen). Um ein Überleben der Tumorzellen nach Reinfusion zu verhindern, werden sie vor dem Inkontaktbringen mit den An tikörpern, was ja erfindungsgemäi3 erst im Körper erfolgt, in an sich bekannter Weise behandelt, beispielsweise durch Bestrah lung. Erfindungsgemäß sind nicht beliebige Antikörper verwend bar, sondern diese müssen intakt sein, d. h. sie müssen eine funktionellen Fc-Teil besitzen. Bevorzugt sind sie heterologer Natur, d. h. die Antikörper sind aus schweren Immunglobulinket ten unterschiedlicher Subklassen (-Kombinationen, auch Fragmen te) und/oder Herkunft (Spezies) zusammengesetzt.The tumor cells are taken from a patient (autologous Tumor cells). To survive the tumor cells after reinfusion to prevent them from contacting the contractor body, which occurs according to the invention only in the body treated in a known manner, for example by irradiation lung. According to the invention, not just any antibodies are used cash, but must be intact, d. H. you must have one own functional Fc part. They are preferably more heterologous Nature, d. H. the antibodies are from a heavy immunoglobulin chain different subclasses (combinations, also fragments te) and / or origin (species).
Diese intakten heterologen bispezifischen und/oder trispezifi
schen Antikörper werden so ausgewählt, daß sie weiterhin die
nachfolgenden Eigenschaften aufweisen:
These intact heterologous bispecific and / or trispecific antibodies are selected so that they continue to have the following properties:
- 1. α) Binden an eine T-Zelle;1. α) binding to a T cell;
- 2. β) Binden an zumindest ein Antigen auf einer Tumorzelle;2. β) binding to at least one antigen on a tumor cell;
- 3. γ) Binden durch ihren Fc-Teil (bei bispezifischen Antikör pern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifi schen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positive Zellen.3. γ) binding through their Fc part (with bispecific antibody pern) or by a third specificity (for trispecific antibodies) on Fc receptor positive cells.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Antikörper sind befähigt, die Fc-Rezeptor positive Zelle zu aktivieren, wodurch die Expres sion von Zytokinen und/oder kostimulatorischen Antigenen initi iert oder erhöht wird.The antibodies which can be used according to the invention are capable of Fc receptor to activate positive cell, causing the express sion of cytokines and / or costimulatory antigens init ized or increased.
Bei den trispezifischen Antikörpern erfolgt die Bindung an die Fc-Rezeptor positiven Zellen bevorzugt beispielsweise über den Fc-Rezeptor von Fc-Rezeptor positiven Zellen oder auch über andere Antigene auf Fc-Rezeptor positiven Zellen (Antigen-prä sentierenden Zellen), wie z. B. den Mannose-Rezeptor.The trispecific antibodies bind to the Fc receptor positive cells are preferred, for example, via the Fc receptor from Fc receptor positive cells or via other antigens on Fc receptor positive cells (antigen pre sending cells), such as. B. the mannose receptor.
Durch die erfindungsgemäße, zeitlich abgestufte Anwendung der intakten, bevorzugt heterologen bispezifischen und/oder trispe zifischen Antikörper wird im Patienten eine Tumorimmunität auf gebaut, bevorzugt eine Langzeit-Tumorimmunität. Die Verabrei chung (Reinfusion) erfolgt bevorzugt in einem Patienten nach der Behandlung des Primärtumors, bevorzugt bei Patienten in einer minimal residual disease (MRD)-Situation. Bei Patienten mit wenig verbliebenen Tumorzellen, bei denen allerdings die Gefahr eines Rezidivs hoch sein kann, ist die erfindungsgemäß beschriebene zeitlich abgestufte Anwendung besonders erfolg reich.Through the use of the intact, preferably heterologous bispecific and / or trispe specific antibodies will have tumor immunity in the patient built, prefers long-term tumor immunity. The disposition chung (reinfusion) is preferably carried out in a patient the treatment of the primary tumor, preferably in patients in a minimal residual disease (MRD) situation. In patients with little remaining tumor cells, in which, however, the According to the invention, the risk of recurrence can be high described graded application particularly successful rich.
Die erfindungsgemäß verwendbaren heterologen bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörper sind zum Teil an sich be kannt, zum Teil werden sie aber auch in der vorstehenden Anmel dung zum ersten Mal beschrieben. Ein Beispiel für einen bsAk ist der Antikörper anti-CD3 X anti-EpCAM (GA-733-2) der bei epithelialen Tumoren wie dem Mammacarcinom eingesetzt wird.The heterologous bispecific that can be used according to the invention and / or trispecific antibodies are in part knows, but in part they are also in the previous application described for the first time. An example of a bsAk is the antibody anti-CD3 X anti-EpCAM (GA-733-2) the at epithelial tumors such as breast cancer are used.
Auf der Tumorzelle erfolgt eine Hochregulation von MHC 1, sowie eine Aktivierung der intrazellulären Prozessierungsmaschinerie (Proteasom-Komplex) aufgrund der Freisetzung von Zytokinen (wie z. B. INF-γ und TNF-α) in unmittelbarer Nachbarschaft der Tumor zelle. Die Zytokine werden aufgrund bispezifischer Antikörper vermittelter Aktivierung von T-Zellen und akzessorischen Zellen freigesetzt. D. h. durch den intakten bsAk werden nicht nur Tu morzellen zerstört oder phagozytiert, sondern indirekt auch deren Tumorimmunogenität erhöht.MHC 1 is upregulated on the tumor cell, as well activation of the intracellular processing machinery (Proteasome complex) due to the release of cytokines (such as e.g. B. INF-γ and TNF-α) in the immediate vicinity of the tumor cell. The cytokines are based on bispecific antibodies mediated activation of T cells and accessory cells released. That is, due to the intact BSA, not only Tu mor cells destroyed or phagocytosed, but indirectly also whose tumor immunogenicity increases.
Die Aktivierung der Fc-Rezeptor positiven Zelle durch den bsAk ist von der Subklasse bzw. der Subklassenkombination des bsAk abhängig. Wie in in vitro-Versuchen nachgewiesen werden konnte, sind beispielsweise bsAk der Subklassenkombination Maus-IgG2a/- Ratte-IgG2b in der Lage, an Fc-Rezeptor positive Zellen zu bin den und diese gleichzeitig zu aktivieren, was zur Hochregula tion bzw. Neuausbildung (Expression) von kostimulatorischen Antigenen, wie z. B. CD40, CD80 oder CD86, auf der Zelloberflä che dieser Zellen führt. Dagegen sind bsAk der Subklassenkom bination Maus-IgG1/IgG2b zwar in der Lage an Fc-Rezeptor posi tive Zellen zu binden (1) Haagen et al., J. Immunology, 1995, 154: 1852-1860, können diese aber offenbar nicht in vergleich barem Maße aktivieren (2) Gast et al., Cancer Immunol. Immun therap., 1995, 40: 390.Activation of the Fc receptor positive cell by the bsAk is of the subclass or the subclass combination of the bsAk dependent. As could be demonstrated in in vitro tests, are, for example, bsAk of the subclass combination mouse-IgG2a / - Rat IgG2b is able to bind positive cells to the Fc receptor to activate this and this at the same time, which leads to high regulations tion or new training (expression) of costimulatory Antigens such as B. CD40, CD80 or CD86, on the cell surface surface of these cells. In contrast, bsAk are the subclass comm combination mouse IgG1 / IgG2b is able to posi Fc receptor to bind active cells (1) Haagen et al., J. Immunology, 1995, 154: 1852-1860, but apparently cannot compare them activated (2) Gast et al., Cancer Immunol. Immune therap., 1995, 40: 390.
Während der intakte bsAk die T-Zelle mit einem Bindungsarm (z. B. an CD3 oder CD2) bindet und gleichzeitig aktiviert, kön nen kostimulatorische Signale von der an den Fc-Teil des bsAk gebundenen Fc-Rezeptor positiven Zelle an die T-Zelle übermit telt werden. D. h. erst die Kombination von Aktivierung der T- Zelle über einen Bindungsarm des bsAk und der gleichzeitigen Übertragung von kostimulatorischen Signalen von der Fc-Rezeptor positiven Zelle auf die T-Zelle, führt zu einer effizienten T- Zellaktivierung (Abb. 4A). Tumorspezifische T-Zellen, die an der Tumorzelle ungenügend aktiviert wurden und anergisch sind, können nach der erfindungsgemäßen ex vivo-Vorbehandlung eben falls reaktiviert werden (Abb. 4B).While the intact bsAk binds the T cell with a binding arm (e.g. to CD3 or CD2) and simultaneously activates it, costimulatory signals can be sent from the Fc receptor positive cell bound to the Fc part of the bsAk to the T cell be conveyed. That is, Only the combination of activation of the T cell via a binding arm of the bsAk and the simultaneous transmission of costimulatory signals from the Fc receptor positive cell to the T cell leads to an efficient T cell activation ( Fig. 4A). Tumor-specific T cells that have been insufficiently activated on the tumor cell and are anergic can also be reactivated after the ex vivo pretreatment according to the invention ( FIG. 4B).
Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Induktion einer Tumorim munität ist die mögliche Phagozytose, Prozessierung und Präsen tation von Tumorbestandteilen durch die vom bsAk herangeführten und aktivierten akzessorischen Zellen (Monozyten/Makrophagen, oder dendritische Zellen). Durch diesen klassischen Mechanismus der Präsentation von Antigenen können sowohl tumorspezifische CD4- wie auch CD8-positive Zellen generiert werden. Tumorspezi fische CD4-Zellen spielen darüberhinaus eine wichtige Rolle für die Induktion einer humoralen Immunantwort im Zusammenhang mit der T-B-Zell Kooperation.Another important aspect in inducing a tumor Munity is the possible phagocytosis, processing and presence tion of tumor components by those introduced by the bsAk and activated accessory cells (monocytes / macrophages, or dendritic cells). Through this classic mechanism The presentation of antigens can be both tumor-specific CD4 and CD8 positive cells are generated. Tumor spec fish CD4 cells also play an important role for the induction of a humoral immune response related to the T-B cell cooperation.
Bispezifische und trispezifische Antikörper können mit einem Bindungsarm an den T-Zellrezeptor-Komplex der T-Zelle, mit dem zweiten Bindungsarm an tumorassoziierte Antigene auf der Tumor zelle binden. Sie aktivieren dabei T-Zellen, die durch Freiset zung von Zytokinen oder Apoptose-vermittelnde Mechanismen die Tumorzellen zerstören. Darüber hinaus besteht offenbar die Mög lichkeit, daß T-Zellen im Rahmen der Aktivierung mit bispezifi schen Antikörpern tumorspezifische Antigene über ihren Rezeptor erkennen und dadurch eine dauerhafte Immunisierung eingeleitet wird (Abb. 4B). Von besonderer Bedeutung ist dabei der intakte Fc-Teil des bispezifischen oder trispezifischen Antikörpers, der die Bindung an akzessorische Zellen wie z. B. Monozyten/Ma krophagen und dendritische Zellen vermittelt und diese veran laßt selbst zytotoxisch zu werden und/oder gleichzeitig wichti ge kostimulatorische Signale an die T-Zelle weiterzugeben. Auf diese Weise kann offensichtlich eine T-Zellantwort u. U. auch gegen bislang unbekannte, tumorspezifische Peptide induziert werden.Bispecific and trispecific antibodies can bind with one binding arm to the T cell receptor complex of the T cell, with the second binding arm to tumor-associated antigens on the tumor cell. They activate T cells that destroy the tumor cells through the release of cytokines or apoptosis-mediating mechanisms. In addition, there is apparently the possibility that T-cells recognize tumor-specific antigens via their receptor as part of the activation with bispecific antibodies, thereby inducing permanent immunization ( Fig. 4B). Of particular importance is the intact Fc part of the bispecific or trispecific antibody, which binds to accessory cells such as. B. monocytes / Ma crophages and dendritic cells and this causes itself to become cytotoxic and / or at the same time to pass on important costimulatory signals to the T cell. In this way, a T cell response can obviously. U. can also be induced against previously unknown, tumor-specific peptides.
Durch Redirektion von u. U. anergisierten, tumorspezifischen T- Zellen an Tumorzellen mittels bispezifischer und/oder trispezi fischer Antikörper bei gleichzeitiger Kostimulation derartiger T-Zellen durch akzessorische Zellen welche an den Fc-Teil des bispezifischen oder trispezifische Antikörpers binden, könnte die Anergie von zytotoxischen T-Zellen (CTLs) aufgehoben wer den. D. h. eine im Patienten gegen den Tumor existierende T- Zell-Toleranz kann mittels intakter heterologer bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper gebrochen und damit eine dauerhafte Tumorimmunität induziert werden.By redirecting u. U. anergized, tumor-specific T- Cells on tumor cells using bispecific and / or trispecific fischer antibodies with simultaneous costimulation of such T cells by accessory cells attached to the Fc part of the could bind bispecific or trispecific antibody the anergy of cytotoxic T cells (CTLs) is lifted the. That is, a T- existing in the patient against the tumor Cell tolerance can be maintained using intact heterologous bispecific and / or trispecific antibody broken and thus a permanent tumor immunity can be induced.
Für den letzten Punkt gibt es erste in vivo-Daten aus Mausver suchen, die auf eine derartige dauerhafte Tumorimmunität nach Behandlung mit einem syngenen Tumor und intakten bsAk hinwei sen. In diesen Versuchen überlebten insgesamt 14 von 14 Tieren, die nach einer ersten Tumorinjektion erfolgreich mit bsAk be handelt werden konnten, eine weitere Tumorinjektion 144 Tage nach der ersten Tumorinjektion - ohne eine erneute Gabe von bsAk.For the last point, there are first in vivo data from Mausver looking for such permanent tumor immunity Treatment with a syngeneic tumor and intact BSA sen. A total of 14 out of 14 animals survived in these experiments, who succeeded with bsAk after a first tumor injection could be treated, another tumor injection 144 days after the first tumor injection - without re-administration of bsAk.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper sind bevorzugt zur Reaktivierung von in Anergie befindlichen, tumorspezifischen T- Zellen befähigt. Weiterhin sind sie zur Induktion von tumorre aktiven Komplement-bindenden Antikörpern und damit zur Induk tion einer humoralen Immunantwort in der Lage.The antibodies used according to the invention are preferred for Reactivation of anergic, tumor-specific T- Cells enabled. Furthermore, they are for the induction of tumorre active complement-binding antibodies and thus to induc tion of a humoral immune response.
Die Bindung erfolgt bevorzugt über CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28 und/oder CD44 an die T-Zelle. Die Fc-Rezeptor positi ven Zellen weisen zumindest einen Fcγ-Rezeptor I, II oder III auf.Binding is preferably via CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28 and / or CD44 to the T cell. The Fc receptor positi ven cells have at least one Fcγ receptor I, II or III on.
Erfindungsgemäß einsetzbare Antikörper sind zur Bindung an Mo nozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, "Natural Killer"- Zellen (NK-Zellen) und/oder aktivierte neutrophile Zellen als Fcγ-Rezeptor 1 und/oder III positive Zellen befähigt.Antibodies which can be used according to the invention are for binding to Mo nocytes, macrophages, dendritic cells, "natural killer" - Cells (NK cells) and / or activated neutrophils as Fcγ receptor 1 and / or III enabled positive cells.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Antikörper bewirken, daß die Expression von CD40, CD80, CD86, ICAM-1 und/oder LFA-3 als ko- stimulatorische Antigene oder/und die Sekretion von Zytokinen durch die Fc-Rezeptor positive Zelle initiiert oder erhöht wird. Die Zytokine sind bevorzugt IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, INF-γ und/oder TNF-α.The antibodies which can be used according to the invention cause the Expression of CD40, CD80, CD86, ICAM-1 and / or LFA-3 as co- stimulatory antigens and / or the secretion of cytokines initiated or increased by the Fc receptor positive cell becomes. The cytokines are preferably IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, INF-γ and / or TNF-α.
Die Bindung an die T-Zelle erfolgt bevorzugt über den T-Zell- Rezeptor-Komplex der T-Zelle.Binding to the T cell is preferably via the T cell T cell receptor complex.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren bispezifischen Antikörper sind
beispielsweise:
The bispecific antibodies which can be used according to the invention are, for example:
- - ein anti-CD3 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD4 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti- CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD8 X anti- Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tu mor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-as soziiertes Antigen-Antikörper ist.- an anti-CD3 X anti-tumor-associated antigen and / or anti-CD4 X anti-tumor associated antigen and / or anti CD5 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD6 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD8 X anti Tumor-associated antigen and / or anti-CD2 X anti-Tu mor-associated antigen and / or anti-CD28 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD44 X anti-tumor as is associated antigen antibody.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren trispezifischen Antikörper
sind bevorzugt:
The trispecific antibodies which can be used according to the invention are preferred:
- - ein anti-CD3 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD4 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti- CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD8 X anti- Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tu mor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-as soziiertes Antigen-Antikörper.- an anti-CD3 X anti-tumor-associated antigen and / or anti-CD4 X anti-tumor associated antigen and / or anti CD5 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD6 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD8 X anti Tumor-associated antigen and / or anti-CD2 X anti-Tu mor-associated antigen and / or anti-CD28 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD44 X anti-tumor as Associated antigen antibody.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren trispezfischen Antikörper wei sen zumindest eine T-Zell-Bindungsarm, einen Tumorzell-Bin dungsarm und einen an Fc-Rezeptor positive Zellen bindenden Bindungsarm auf. Dieser zuletzt genannte Bindungsarm kann ein anti-Fc-Rezeptor-Bindungsarm oder ein Mannose-Rezeptor-Bin dungsarm sein.The trispecific antibodies which can be used according to the invention are white sen at least one T cell binding arm, a tumor cell bin low in binding and a cell that binds to the Fc receptor Low binding. This last-mentioned binding arm can be a anti-Fc receptor binding arm or a mannose receptor bin be low in manure.
Der bispezifische Antikörper ist bevorzugt ein heterologer in takter Ratte/Maus bispezifischer Antikörper.The bispecific antibody is preferably a heterologous in clock rat / mouse bispecific antibody.
Mit den erfindungsgemäß einsetzbaren bispezifischen und trispe
zifischen Antikörpern werden T-Zellen aktiviert und gegen die
Tumorzellen redirigiert. Bevorzugt einsetzbare heterologe in
takte bispezifische Antikörper werden aus einer oder mehreren
der nachfolgenden Isotyp-Kombinationen ausgewählt:
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2a,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2b,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG3,
Ratte-IgG2b/Human-IgG1,
Ratte-IgG2b/Human-IgG2,
Ratte-IgG2b/Human-IgG3[orientaler Allotyp G3m(st) = Bin
dung an Protein A],
Ratte-IgG2b/Human-IgG4,
Ratte-IgG2b/Ratte-IgG2c,
Maus-IgG2a/Human-IgG3[kaukasische Allotypen G3m(b+g) =
keine Bindung an Protein A, im folgenden mit * gekenn
zeichnet]
Maus-IgG2a/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-
Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-
Human-IgG1-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-
IgG4-[Hinge]-Human-IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-
IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Hu
man-IgG3*[CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG3-[Hinge-CH2-CH3,
orientaler Allotyp]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge-CH2-CH3]
Human-IgG1/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-
Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale
Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale
Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale
Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Humän-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale
Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*(CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1; VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG2/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human-
IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale
Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Maus-IgG2b/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human-
IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-
Human-IgG4-[Hinge]-Human-IgG4-[CH2]-Human-IgG3*-[CH3]
HumanIgG1/Ratte[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1 Hinge]-Human-
IgG4-[CH2]-HumanIgG3*[CH3]
HumanIgG1/Maus[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1[Hinge]-Human-IgG4-
[CH2]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG4/Human[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human-
IgG4-[CH2]-HumanIgG3*-[CH3]With the bispecific and trispecific antibodies that can be used according to the invention, T cells are activated and redirected against the tumor cells. Preferred heterologous in tact bispecific antibodies are selected from one or more of the following isotype combinations:
Rat IgG2b / mouse IgG2a,
Rat IgG2b / mouse IgG2b,
Rat IgG2b / mouse IgG3,
Rat IgG2b / human IgG1,
Rat IgG2b / human IgG2,
Rat IgG2b / human IgG3 [oriental allotype G3m (st) = binding to protein A],
Rat IgG2b / human IgG4,
Rat IgG2b / rat IgG2c,
Mouse IgG2a / Human IgG3 [Caucasian allotypes G3m (b + g) = no binding to protein A, marked with * in the following]
Mouse IgG2a / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] - Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse-IgG2a / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2a / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG1 / rat- [VH-CH1, VL-CL] - human-IgG1- [Hinge] -human-IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG4 / rat- [VH-CH1, VL-CL] -human- IgG4- [hinge] -human-IgG4 [N-terminal region of CH2] -human- IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS position 251] -Human-IgG3 * [CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge-CH2-CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG2- [Hinge-CH2-CH3]
Rat IgG2b / Mouse [VH-CH1, VL-CL] Human IgG3 [Hinge CH2-CH3, oriental allotype]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4- [Hinge-CH2-CH3]
Human-IgG1 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] - Human-IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse [VH-CH1, VL-CL] human IgG1 [hinge] human IgG4 [N-terminal region of CH2] human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human-IgG2 [N-terminal region of CH2] -Human-IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse [VH-CH1, VL-CL] human IgG1 [hinge] human IgG2 [N-terminal region of CH2] human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * (CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1; VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG2 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG2- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG4 / Human- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4- [Hinge] Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG4 / Human [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Mouse IgG2b / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2b / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG4 / rat- [VH-CH1, VL-CL] - human-IgG4- [Hinge] -human-IgG4- [CH2] -human-IgG3 * - [ CH3]
HumanIgG1 / Rat [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1 Hinge] -Human- IgG4- [CH2] -HumanIgG3 * [CH3]
HumanIgG1 / Mouse [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1 [Hinge] -Human-IgG4- [CH2] -Human-IgG3 * [CH3]
Human-IgG4 / Human [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG4- [Hinge] -Human- IgG4- [CH2] -HumanIgG3 * - [CH3]
Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um monoklonale, chimäre, rekombinante, syn thetische, halbsynthetische oder chemisch modifizierte intakte Antikörper mit beispielsweise Fv-, Fab-, scFv- oder F(ab)2- Fragmenten.The antibodies which can be used according to the invention are preferably monoclonal, chimeric, recombinant, synthetic, semi-synthetic or chemically modified intact antibodies with, for example, Fv, Fab, scFv or F (ab) 2 fragments.
Bevorzugt werden Antikörper oder Derivate oder Fragmente vom Menschen verwendet oder solche, die derart verändert sind, daß sie sich für die Anwendung beim Menschen eignen (sogenannte "humanized antibodies") (siehe z. B. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).Antibodies or derivatives or fragments of are preferred People used or those who are changed in such a way that they are suitable for use in humans (so-called "humanized antibodies") (see, e.g., Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).
Die Herstellung der verschiedenen oben genannten Antikörperty pen und -fragmente ist dem Fachmann geläufig. Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die ihren Ursprung vorzugsweise in Säugetieren, z. B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen oder Ziege, haben, kann mittels herkömmlicher Methoden erfolgen, wie sie z. B. in Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Harlow und Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) oder in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) oder der DE 195 31 346 beschrieben sind.The production of the various antibodies mentioned above The skilled worker is familiar with pen and fragments. The production monoclonal antibodies, which originate preferably in Mammals, e.g. B. human, rat, mouse, rabbit or goat, have, can be done using conventional methods such as e.g. B. in Koehler and Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor) or in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) or the DE 195 31 346 are described.
Ferner ist es möglich, die beschriebenen Antikörper mittels rekombinanter DNA-Technologie nach dem Fachmann geläufigen Techniken herzustellen (siehe Kurucz et al., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90 (1993), 6444).It is also possible to use the antibodies described recombinant DNA technology familiar to those skilled in the art Techniques (see Kurucz et al., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90 (1993), 6444).
Die Herstellung von Antikörpern mit zwei verschiedenen Spezi fitäten, den sogenannten bispezifischen Antikörpern, ist zum einen durch Anwendung rekombinanter DNA-Technologie möglich, aber auch durch die sogenannte Hybrid-Hybridoma-Fusionstechnik (siehe z. B. Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Hierbei werden Hybridomazellinien, die Antikörper mit jeweils einer der gewünschten Spezifitäten produzieren, fusioniert und rekombi nante Zellinien identifiziert und isoliert, die Antikörper mit beiden Spezifitäten produzieren.The production of antibodies with two different types the so-called bispecific antibodies possible by using recombinant DNA technology, but also through the so-called hybrid hybridoma fusion technology (See, e.g., Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Here are hybridoma cell lines, each with one of the antibodies produce desired specificities, merged and recombined nante cell lines identified and isolated, the antibodies with produce both specificities.
Das der Erfindung zugrunde liegende Problem kann sowohl durch bispezifische als auch trispezifische Antikörper gelöst werden, sofern sie die im Anspruch 1 gekennzeichneten Eigenschaften und Wirkungen aufweisen. Nachfolgend wird die Herstellung von Anti körpern mit Zwei- und Dreispezifitäten näher beschrieben. Die Bereitstellung derartiger bispezifischer und trispezifischer Antikörper gehört zum Stand der Technik, und auf die derartige Herstellungstechniken beschreibende Literatur wird hier voll inhaltlich Bezug genommen.The problem underlying the invention can be solved both by bispecific as well as trispecific antibodies are solved, provided that they have the properties characterized in claim 1 and Have effects. Below is the manufacture of anti bodies with two and three specificities described in more detail. The Provision of such bispecific and trispecific Antibody belongs to the state of the art, and to such Literature describing manufacturing techniques becomes full here referred to in terms of content.
Die Herstellung von Antikörpern mit drei Spezifitäten, soge
nannten trispezifischen Antikörpern, durch die das der Erfin
dung zugrundeliegende Problem ebenfalls lösbar ist, kann bei
spielsweise derart erfolgen, daß an eine der schweren Ig-Ketten
eines bispezifischen Antikörpers eine dritte Antigenbindungs
stelle mit einer weiteren Spezifität, z. B. in Form eines "sing
le chain variable fragments" (scFv), angekoppelt wird. Das scFv
kann beispielsweise über einen
The production of antibodies with three specificities, so-called trispecific antibodies, by means of which the problem on which the invention is based can also be solved, can be done, for example, in such a way that a third antigen binding site with a further specificity is placed on one of the heavy Ig chains of a bispecific antibody , e.g. B. in the form of a "sing le chain variable fragment" (scFv). The scFv can, for example, use a
-S-S(G4S)nD-I-Linker
-SS (G 4 S) n DI linker
an eine der schweren Ketten gebunden sein (S = Serin, G = Gly cin, D = Aspartat, I = Isoleucin).be bound to one of the heavy chains (S = serine, G = Gly cin, D = aspartate, I = isoleucine).
Analog dazu können trispezifische F(ab)2-Konstrukte hergestellt werden, indem die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette einer Spezifität eines bispezifischen Antikörpers ersetzt werden durch ein scFv mit einer dritten Spezifität, während die CH2- CH3-Regionen der schweren Kette der anderen Spezifität bei spielsweise durch Einbau eines Stopcodons (am Ende der "Hinge"- Region) in das codierende Gen, z. B. mittels homologer Rekombi nation, entfernt werden (siehe Abb. 5).Similarly, trispecific F (ab) 2 constructs can be made by replacing the CH2-CH3 regions of the heavy chain of a specificity of a bispecific antibody with an scFv with a third specificity, while the CH2-CH3 regions of the heavy chain of the other specificity in example by incorporating a stop codon (at the end of the "hinge" region) in the coding gene, for. B. by means of a homologous recombination nation (see Fig. 5).
Möglich ist auch die Herstellung trispezifischer scFv-Kon strukte. Hierbei werden drei VH-VL-Regionen, die drei ver schiedene Spezifitäten repräsentieren, hintereinander in Reihe angeordnet (Abb. 6).The production of trispecific scFv constructs is also possible. Here three VH-VL regions, which represent three different specificities, are arranged in a row ( Fig. 6).
Erfindungsgemäß werden z. B. intakte bispezifische Antikörper verwendet. Intakte bispezifische Antikörper sind aus zwei Anti körper-Halbmolekülen (je eine H- und L-Immunglobulinkette), die jeweils eine Spezifität repräsentieren, zusammengesetzt, und besitzen darüber hinaus, wie normale Antikörper auch, einen Fc- Teil mit den bekannten Effektorfunktionen. Sie werden bevorzugt durch die Quadrom-Technologie hergestellt. Dieses Herstellungs verfahren ist beispielhaft in der DE-A-44 19 399 beschrieben. Auf diese Druckschrift, auch bzgl. einer Definition der bispe zifischen Antikörper, wird zur vollständigen Offenbarung voll inhaltlich Bezug genommen. Selbstverständlich sind auch andere Herstellungsverfahren einsetzbar, solange sie zu den erfin dungsgemäß notwendigen intakten bispezifischen Antikörpern der obigen Definition führen.According to the z. B. intact bispecific antibodies used. Intact bispecific antibodies are two anti body half-molecules (one H and one L immunoglobulin chain), the each represent specificity, composed, and also have, like normal antibodies, an Fc- Part with the known effector functions. You are preferred made by Quadrom technology. This manufacturing The process is described by way of example in DE-A-44 19 399. On this document, also with a definition of bispe specific antibody, becomes full for complete disclosure referred to in terms of content. Of course there are others too Manufacturing process can be used as long as they are invented Intact bispecific antibodies of the lead definition above.
Beispielsweise können in einem neu entwickelten Herstellungs verfahren (6) intakte bispezifische Antikörper in ausreichender Menge produziert werden. Die Kombination von 2 bispezifischen Antikörpern gegen 2 unterschiedliche tumorassoziierte Antigene (z. B. c-erb-B2, ep-cam, beispielsweise GA-733-2 = C215) auf den Mammakarzinomzellen minimiert die Gefahr, daß Tumorzellen, die nur ein Antigen exprimieren, unerkannt bleiben.For example, in a newly developed manufacturing procedure (6) intact bispecific antibodies in sufficient Amount produced. The combination of 2 bispecific Antibodies against 2 different tumor-associated antigens (e.g. c-erb-B2, ep-cam, e.g. GA-733-2 = C215) on the Breast cancer cells minimize the risk that tumor cells only express an antigen, remain undetected.
Es wurde auch versucht, durch Behandlung mit bispezifischen F(ab')2-Fragmenten mit den Spezifitäten anti-c-erb-B2 x antiCD64 eine Tumorimmunität zu erreichen. Der Hauptnachteil von bsF(ab')2-Fragmenten liegt darin, daß aufgrund der verwen deten Spezifitäten lediglich FcγRI+ Zellen an den Tumor rediri giert werden. T-Zellen werden durch diesen bispezifischen Anti körper nicht an den Tumor redirigiert. Die FcγRI+ Zellen können zwar indirekt durch Präsentation von tumorspezifischen Peptiden (über MHC I bzw. MHCII) nach z. B. Phagozytose von Tumorzellbe standteilen tumorspezifische T-Zellen aktivieren, die Effizienz der Induktion einer Tumorimmunität ist hier aber niedriger, da T-Zellen durch diesen bsAK nicht gebunden werden und auch nicht zur Kostimulation der Fc-Rezeptor positiven Zellen beitragen können.It has also been tried through treatment with bispecific F (ab ') 2 fragments with the specificities anti-c-erb-B2 x antiCD64 to achieve tumor immunity. The main disadvantage of bsF (ab ') 2 fragments is that due to the use specificities only FcγRI + cells to the tumor rediri be greeded. This bispecific anti body not redirected to the tumor. The FcγRI + cells can indirectly through the presentation of tumor-specific peptides (via MHC I or MHCII) after z. B. Tumor cell phagocytosis components activate tumor-specific T cells, the efficiency the induction of tumor immunity is lower here, however T cells are not bound by this bsAK and neither contribute to the costimulation of the Fc receptor positive cells can.
Weitere Vorteile von intakten bsAk mit der Fähigkeit zur Redi
rektion von T-Zellen gegenüber den o. g. bsF(ab')2 Fragmenten
sind im einzelnen:
Further advantages of intact bsAk with the ability to redirect T cells compared to the above-mentioned bsF (ab ') 2 fragments are:
- 1. An intakte bsAk können Fc-Rezeptor positive Zellen binden und einerseits über ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) direkt zur Tumorzerstörung beitragen sowie andererseits wie oben näher ausgeführt zur T-Zellaktivie rung.1. Fc receptor can bind positive cells to intact bsAk and on the one hand via ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) contribute directly to tumor destruction as well on the other hand, as detailed above for T cell activity tion.
- 2. Durch intakte T-Zell-redirigierende bsAk werden auch aner gisierte tumorspezifische T-Zellen an die Tumorzelle her angeführt, die erfindungsgemäß direkt am Tumor reaktiviert werden können. Dies kann durch ein bsF(ab')2-Fragment mit den Spezifitäten anti-CD64Xanti-tumorassoziiertes Antigen nicht erreicht werden.2. By intact T-cell-redirecting BSAk also others gized tumor-specific T cells to the tumor cell mentioned, which reactivates according to the invention directly on the tumor can be. This can be done with a bsF (ab ') 2 fragment the specificities of anti-CD64X anti-tumor associated antigen cannot be reached.
- 3. Ein bsF(ab')2-Fragment mit den Spezifitäten anti-CD64Xan ti-tumorassoziiertes Antigen kann lediglich eine Tumorim munität in 30% der Patienten erzielen, während erfindungs gemäß in Mausversuchen mit T-Zell-redirigierenden intakten bsAk ein Schutz in 100% der Tiere erzielt werden konnte.3. A bsF (ab ') 2 fragment with the specificities anti-CD64Xan ti-tumor-associated antigen can only be a tumor achieve immunity in 30% of patients while fictional intact in mouse experiments with T cell redirecting bsAk protection could be achieved in 100% of the animals.
Die Bindung des bsAk an Fcγ-RI besitzt zwei wesentliche Vortei
le im Hinblick auf eine optimale anti-Tumorwirksamkeit:
The binding of the bsAk to Fcγ-RI has two essential advantages with regard to optimal anti-tumor activity:
- 1. Fcγ-RI positive Zellen besitzen die Fähigkeit mittels ADCC Tumorzellen zu eliminieren und können insofern synergi stisch zur anti-Tumorwirkung der durch den bsAk an die Tumorzelle herangeführten cytotoxischen T-Zellen beitra gen.1. Fcγ-RI positive cells have the ability by means of ADCC Eliminate tumor cells and can therefore synergi The anti-tumor effect of the BSAK to the Tumor cell induced cytotoxic T cells gene.
- 2. Fcγ-RI positive Zellen (wie z. B. Monozyten/Makrophagen/- Dendriten) sind in der Lage, wichtige kostimulatorische Signale, ähnlich wie bei der Antigen-Präsentation, der T- Zelle zu liefern und damit eine Anergisierung der T-Zelle zu verhindern. Wie in Abb. 4 gezeigt können weiter hin, als erwünschtes Nebenprodukt, aufgrund der durch in takten bsAk vermittelten Interaktion von T-Zelle mit ak zessorischer Zelle und Tumorzelle sogar T-Zellen, deren T- Zellrezeptor tumorspezifische Peptide (über MHC Antigene auf der Tumorzelle präsentiert) erkennt, stimuliert wer den. Die für eine korrekte Aktivierung der T-Zelle notwen digen Kostimuli würden in dieser Konstellation von der akzessorischen Zelle (z. B. Monocyt) geliefert werden. In sofern sollte der erfindungsgemäße Antikörper neben der direkten T-Zellrezeptor-unabhängigen, durch bsAk vermit telten Tumorzerstörung (Abb. 4A) ebenfalls tumorspezifische T-Zellen aktivieren und generieren (Abb. 4B), die nach Ab bau der bsAk weiterhin im Patienten patrouillieren. D. h. mittels intakter bsAk kann ähnlich wie bei gentherapeuti schen Ansätzen (z. B. durch Einbau von kostimulatorischen Antigenen wie B-7 in die Tumorzelle) die Tumortoleranz im Patienten durchbrochen werden.2. Fcγ-RI positive cells (such as, for example, monocytes / macrophages / dendrites) are able to deliver important costimulatory signals, similar to the antigen presentation, to the T cell and thus anergization of the T cell To prevent cell. As shown in Fig. 4, furthermore, as a desired by-product, due to the interaction of T cell with accessory cell and tumor cell mediated by intact bsAk, even T cells whose T cell receptor are tumor-specific peptides (via MHC antigens on the tumor cell presented) recognizes who is stimulated. The costimuli necessary for a correct activation of the T cell would be provided by the accessory cell (e.g. monocyte) in this constellation. In so far, the antibody according to the invention should also activate and generate tumor-specific T cells ( Fig. 4B) which continue to patrol the patient after the bsAk has been broken down, in addition to the direct T cell receptor-independent tumor destruction mediated by bsAk ( Fig. 4A). That is, Similar to gene therapy approaches (e.g. by incorporating costimulatory antigens such as B-7 into the tumor cell), the tumor tolerance in the patient can be broken using intact BSA.
Günstig in diesem Zusammenhang ist weiterhin, daß die Expres sion von Fcγ-RI nach G-CSF-Behandlung auf den entsprechenden Zellen hochreguliert wird.In this context it is also favorable that the express sion of Fcγ-RI after G-CSF treatment on the corresponding Cells is upregulated.
Die erfindungsgemäß eingesetzten intakten, bevorzugt herterolo
gen spezifischen und/oder trispezifischen Antikörper weisen in
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die
nachfolgenden Eigenschaften auf:
In a further preferred embodiment of the invention, the intact, preferably herterological, specific and / or trispecific antibodies used according to the invention have the following properties:
- a) Binden an eine T-Zelle;a) binding to a T cell;
- b) Binden an zumindest ein Antigen auf einer Zielzelle;b) binding to at least one antigen on a target cell;
- c) Binden durch ihren Fc-Teil (bei bispezifischen Antikör pern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifi schen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positive Zellenc) binding by their Fc part (with bispecific antibody pern) or by a third specificity (for trispecific antibodies) on Fc receptor positive cells
und sie induzieren hierdurch eine Immunantwort und/oder zer störte Zielzellen, wobei der Antikörper so ausgewählt ist, daß er an ein Oberflächenantigen als Zielantigen auf der Zielzelle bindet, welches induzierbar ist und im nicht induzierten Zu stand (Normalzustand) auf der Zielzelle nicht vorkommt oder in einer derart geringen Zahl, daß die Anzahl für eine Zerstörung der Zielzelle nicht ausreicht. (and thereby induce an immune response and / or zer disrupted target cells, the antibody being selected so that he thinks of a surface antigen as the target antigen on the target cell binds which is inducible and in the uninduced Zu (normal state) does not occur on the target cell or in such a small number that the number for destruction the target cell is not sufficient. (
Abb.Fig.
7A + B)7A + B)
Es konnte gezeigt werden, daß nach Induktion bereits eine rela tiv geringe Anzahl der Zielantigene auf der Zielzelle ausrei chend ist, um die intakten bispezifischen und trispezifischen Antikörper zu binden und eine Zerstörung der Zielzelle und/oder eine Immunantwort einzuleiten. Unter "geringe Anzahl" wird er findungsgemäß eine Anzahl von Zielantigenen auf der Zielzelle von mehr als 100 Zielantigenen pro Zielzelle, bevorzugt mehr als 300 und weiterhin bevorzugt mehr als 1000 Zielantigenen pro Zelle verstanden. Die induzierbaren Zielantigene können auch in einer Menge von bis zu 500.000 pro Zielzelle vorliegen, wobei auch Mengen bis zu 400.000, bis zu 300.000, bis zu 200.000 oder bis zu 100.000 pro Zielzelle induzierbar sind. Ein weiterer bevorzugter Mengenbereich, in dem die Zielantigene vorliegen können, ist von 50.000 bis 100.000 und von 5000 bis 50.000.It could be shown that a rela tively small number of target antigens on the target cell is the order of the intact bispecific and trispecific Bind antibodies and destroy the target cell and / or initiate an immune response. Under "small number" it will according to the invention a number of target antigens on the target cell of more than 100 target antigens per target cell, preferably more than 300 and furthermore preferably more than 1000 target antigens per Cell understood. The inducible target antigens can also be found in an amount of up to 500,000 per target cell, where also quantities up to 400,000, up to 300,000, up to 200,000 or up to 100,000 can be induced per target cell. Another preferred quantity range in which the target antigens are present is from 50,000 to 100,000 and from 5000 to 50,000.
Beispiele für induzierbare Oberflächenantigene auf Zielzellen (Zielantigene), die für eine Immuntherapie durch intakte bispe zifische und trispezifische Antikörper einsetzbar sind, sind Hitzeschock-Proteine und "MHC-Klasse I-verwandte" MIC-Moleküle. Hitzeschock-Proteine (Hsp) werden von der Zelle als Antwort auf Zellstreß synthetisiert. Unter "Zellstreß" ist erfindungsgemäß beispielsweise eine Entartung der Zelle, das Einwirken von Strahlen, chemischen Substanzen und von erhöhter Temperatur auf die Zelle sowie die Infektion der Zelle durch Mikroorganismen zu subsumieren. Zur Zeit sind vier Familien von Hitzeschock- Proteinen bekannt, die aufgrund ihres unterschiedlichen Moleku largewichts differenziert werden. Diese Familien werden als Hsp25, Hsp60, Hsp70 und Hsp90 bezeichnet, wobei die Zahl das ungefähre Molekulargewicht der Streßproteine in Kilo-Dalton wiedergibt. Die Hitzeschock-Proteine zeichnen sich durch hoch konservierte Aminosäuresequenzen aus, wobei der Grad der Kon servierung bei über 35% Aminosäure-Identität, bevorzugt bei 35-55%, weiterhin bevorzugt 55-75% und am bevorzugtesten zwi schen 75% bis 85% Aminosäure-Identität liegt.Examples of inducible surface antigens on target cells (Target antigens) that are suitable for immunotherapy by intact bispe specific and trispecific antibodies can be used Heat shock proteins and "MHC class I related" MIC molecules. Heat shock proteins (Hsp) are released by the cell in response Cell stress synthesized. Under "cell stress" is according to the invention for example a degeneration of the cell, the action of Rays, chemical substances and from elevated temperature the cell and the infection of the cell by microorganisms to subsume. There are currently four families of heat shock Proteins known because of their different molecule can be differentiated. These families are called Hsp25, Hsp60, Hsp70 and Hsp90, the number being the approximate molecular weight of the stress proteins in kilo-daltons reproduces. The heat shock proteins are characterized by high conserved amino acid sequences, the degree of Kon serving at over 35% amino acid identity, preferably at 35-55%, further preferably 55-75% and most preferably between 75% to 85% amino acid identity.
Auf folgende Übersichtsartikel wird verwiesen: Annu. Rev. Ge net. 27, 437-496 (1993); Biochimie 76, 737-747 (1994); Cell. Mol. Life Sci. 53, 80-129, 168-211 (1997); Experientia 48, 621-656 (1992); Kabakov u. Gabai, Heat Shock Proteins and Cytopro tection, Berlin: Springer 1997.Reference is made to the following overview articles: Annu. Rev. Ge net. 27, 437-496 (1993); Biochimie 76, 737-747 (1994); Cell. Mol. Life Sci. 53: 80-129, 168-211 (1997); Experientia 48, 621-656 (1992); Kabakov et al. Gabai, Heat Shock Proteins and Cytopro tection, Berlin: Springer 1997.
Hitzeschock-Proteine werden im Normalfall auf gesundem Gewebe nicht exprimiert. Es gibt jedoch Untersuchungen, die zeigen, daß Hitzeschock-Proteine beispielsweise auf Tumorzellinien und auf Tumormaterial aus Patienten exprimiert werden können (Mel cher et al., Nature Medicine, 4: 581, 1998). Die Expression der Hitzeschock-Proteine auf den Tumorzellinien ist aber relativ schwach und deshalb für bisher bekannte immuntherapeutische Ansätze mit monoklonalen Antikörpern und unvollständigen (F(ab)2) bispezifischen Antikörpern ungeeignet.Heat shock proteins are usually found on healthy tissue not expressed. However, there are studies that show that heat shock proteins, for example on tumor cell lines and can be expressed on tumor material from patients (Mel cher et al., Nature Medicine, 4: 581, 1998). The expression of the However, heat shock proteins on the tumor cell lines are relative weak and therefore for previously known immunotherapeutic Approaches with monoclonal antibodies and incomplete (F (ab) 2) bispecific antibodies unsuitable.
Beispiele für Hitzeschock-Proteine sind Hsp60 und Hsp70/72.Examples of heat shock proteins are Hsp60 and Hsp70 / 72.
Gleiches gilt für MIC-Moleküle. Auch diese Moleküle sind durch Zellstreß, wie oben näher definiert, induzierbar. MIC-Moleküle sind MHC I-verwandte Moleküle, die unter Kontrolle von Hitze schock-Promoter-Elementen stehen (Groh et al., PNAS 93: 12445, 1996). Beispiele für MIC-Moleküle sind MIC A und MIC B. Auch für MIC-Moleküle konnte gezeigt werden, daß sie auf Normalge webe nicht oder nur in so geringer Menge exprimiert werden, daß sie als Zielstruktur zur Erkennung durch einen Antikörper, um eine Zerstörung der Zielzelle zu erreichen, nicht geeignet sind, während sie auf beispielsweise epithelialen Tumoren in einer solchen Menge exprimiert werden, daß sie durch die erfin dungsgemäß bereitgestellten bispezifischen und trispezifischen Antikörper bei einer Immuntherapie als Zielantigene einsetzbar sind.The same applies to MIC molecules. These molecules are also through Cell stress, as defined in more detail above, inducible. MIC molecules are MHC I-related molecules that are under the control of heat shock promoter elements (Groh et al., PNAS 93: 12445, 1996). Examples of MIC molecules are MIC A and MIC B. Also for MIC molecules it could be shown that they are normal weave not be expressed or only in such a small amount that it as a target structure for detection by an antibody to to destroy the target cell is not suitable while in, for example, epithelial tumors of such an amount that they are expressed by the inventions provided according to bispecific and trispecific Antibodies can be used as target antigens in immunotherapy are.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten intakten bispezifischen oder trispezifischen Antikörper werden so ausgewählt, daß sie gegen zumindest ein Zielantigen auf einer Zielzelle gerichtet sind, welches induzierbar ist und auf der Zielzelle im nicht induzierten Zustand nicht oder im wesentlichen nicht vorkommt. Diese Zahl liegt beispielsweise bei ca. 100 Zielantigenen/Zel le. Dies heißt jedoch nicht, daß derartige Zielantigene auf anderen Zellen, d. h. Nicht-Zielzellen, nicht vorkommen können. Beispielsweise kommen auf sich schnell regenerierendem Gewebe, z. B. den Schleimhautzellen des Magen-Darm-Traktes, auch im phy siologischen Zustand, konstitutiv exprimiert, Hitzeschockpro teine vor. Diese Hitzeschockproteine werden jedoch von der vor liegenden Erfindung nicht mit umfaßt, da sie nicht induzierbar sind, sondern bereits auf Normalgewebe vorkommen. Bei Verwen dung der erfindungsgemäßen Antikörper, die gegen Hitzeschock proteine gerichtet sind, können auch bestimmte Schleimhautzel len des Magen-Darm-Traktes zerstört werden, da diese, wie oben ausgeführt, konstitutiv Hitzeschockproteine auf ihrer Zellober fläche exprimieren. Die mögliche Zerstörung dieser Zellen ist für einen Patienten zwar mit gewissen Nachteilen verbunden, die jedoch im Vergleich zur erzielbaren Tumorzerstörung gering an zusetzen sind.The intact bispecific provided according to the invention or trispecific antibodies are selected so that they directed against at least one target antigen on a target cell which is inducible and not on the target cell induced state does not occur or essentially does not occur. This number is, for example, approximately 100 target antigens / cell le. However, this does not mean that such target antigens occur other cells, i.e. H. Non-target cells, cannot occur. For example, rapidly regenerating tissue e.g. B. the mucosal cells of the gastrointestinal tract, also in the phy siological condition, constitutively expressed, heat shock pro no front. However, these heat shock proteins are from the front lying invention not included since it is not inducible are, but already occur on normal tissue. When used dung of the antibodies according to the invention, against heat shock Proteins can also target certain mucous membranes The gastrointestinal tract can be destroyed, as described above executed, constitutive heat shock proteins on their cell top express area. The possible destruction of these cells is associated with certain disadvantages for a patient that however, in comparison to the achievable tumor destruction are to be added.
Das sich schnell regenerierende Gewebe ist somit nicht primäres Target der erfindungsgemäßen Antikörper, kann jedoch dann von den Antikörpern "getroffen" werden, wenn der erfindungsgemäße Antikörper nicht nur die induzierbaren Zielantigene auf der Zielzelle erkennt, sondern diese Antigene z. B. auch auf sich schnell regenerierendem Gewebe vorkommen. Da sich dieses Gewebe jedoch schnell teilt, kann nach Absetzen der Antikörper-Thera pie der ursprüngliche Zustand dieses Gewebes relativ rasch so wieder hergestellt werden, daß es seine physiologische Aufgabe wieder erfüllen kann. Die Erfindung ist also nicht darauf ge richtet, daß die erfindungsgemäßen bispezifischen und trispezi fischen Antikörper Antigene auf z. B. sich schnell regenerieren dem Gewebe erkennen, welche dort unter Umständen konstitutiv exprimiert werden, sondern die Erfindung umfaßt ausschließlich solche Antikörper, die gegen Zielantigene gerichtet sind, die auf der Zielzelle induzierbar sind und nach Induktion, bei spielsweise auch konstitutiv, exprimierbar sind.The rapidly regenerating tissue is therefore not primary Target of the antibodies of the invention, but can then of the antibodies are "hit" when the invention Antibodies not only the inducible target antigens on the Target cell recognizes, but these antigens z. B. also on itself rapidly regenerating tissue. Because this tissue however, divides quickly after discontinuing the Antibody Thera pie the original condition of this tissue relatively quickly so be restored to its physiological role can meet again. The invention is therefore not based on it judges that the bispecific and trispezi fish antibodies antigens on z. B. regenerate quickly recognize the tissue, which may be constitutive there are expressed, but the invention includes only those antibodies directed against target antigens which are inducible on the target cell and after induction, at are also constitutive, expressible, for example.
Erfindungsgemäß werden unter "induzierbar" solche Zielantigene verstanden, die hier operationell tumorspezifisch sind und im physiologischen Zustand auf der Zelle nicht oder nur in einer solchen Anzahl vorkommen, daß eine Immunantwort gegen sie nicht induzierbar ist oder eine Zerstörung der Zielzellen aufgrund dieser geringen Anzahl nicht oder in einem nicht wesentlichen, therapeutisch nutzbaren Umfang stattfindet.According to the invention, such target antigens are “inducible” understood that are operationally tumor-specific and in the physiological state on the cell not or only in one such numbers occur that an immune response against them does not is inducible or due to destruction of the target cells this small number not or in an insignificant, therapeutically usable scope takes place.
Als induzierbare Zielantigene auf einer Zielzelle sind nicht nur solche auf einer Tumorzelle zu verstehen, sondern auch An tigene, die induziert werden, wenn die Zielzelle beispielsweise durch einen Mikrooganismus infiziert wird. Unter "Mikroorganis mus" wird erfindungsgemäß jeder Organismus verstanden, der die Zielzelle so beeinflußt, daß auf seiner Oberfläche ein vom Mi kroorganismus induziertes Zielantigen im oben beschriebenen Umfang exprimiert wird. Unter Mikroorganismen werden erfin dungsgemäß beispielsweise Bakterien, Viren, Protozoen und Pilze verstanden. Zu den Bakterien gehören beispielsweise Gram-posi tive und und Gram-negative Bakterien, Mycoplasmen und Rickett sien. Von den Protozoen mitumfaßt werden insbesondere Plasmo dien. Von den Viren umfaßt werden beispielsweise Retroviren, Adenoviren, Herpesviren, Hepatitis-Viren, Togaviren, Pockenvi ren usw. Entscheidend ist, daß in Zellen, die von einem oder mehreren dieser Mikroorganismen infiziert wurden, auf der Zell oberfläche Antigene exprimiert werden, die durch die Mikroor ganismen-Infektion induziert werden. Dabei handelt es sich um Antigene, die von den Zielzellen als Antwort auf die Mikroorga nismen-Infektion produziert werden und auf der Zelloberfläche erscheinen (wirtseigene Antigene), nicht dagegen um Zielantige ne, die durch die Mikroorganismen selbst produziert werden. Die Infektion einer Zielzelle durch einen Mikroorganismus führt ebenfalls zu einer Zellstreß-Situation für die Zelle, die als Antwort hierauf die Expression bestimmter Proteine induziert, beispielsweise von Hitzeschock-Proteinen und von MIC-Proteinen.As inducible target antigens on a target cell are not to understand only those on a tumor cell, but also An genes that are induced when the target cell, for example is infected by a micro-organism. Under "Microorganism mus "according to the invention is understood to be any organism which Target cell so influenced that on its surface a Mi target organ antigen induced in the above described Extent is expressed. Microorganisms are invented According to the invention, for example, bacteria, viruses, protozoa and fungi Roger that. The bacteria include, for example, Gram-posi tive and and gram-negative bacteria, mycoplasma and rickett you. The protozoa in particular include plasmo serve. The viruses include, for example, retroviruses, Adenoviruses, herpes viruses, hepatitis viruses, togaviruses, smallpox ren, etc. It is crucial that in cells by one or Several of these microorganisms were infected on the cell surface antigens are expressed by the microor ganism infection can be induced. It refers to Antigens from the target cells in response to the microorganism nism infection are produced and on the cell surface appear (host antigens), but not target antigens ne, which are produced by the microorganisms themselves. The Infection of a target cell by a microorganism also to a cell stress situation for the cell that as Response to that induced expression of certain proteins for example of heat shock proteins and MIC proteins.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten intakten bispezifischen und trispezifischen Antikörper führen nicht nur einen Typ von Immunzellen, sondern T-Zellen und akzessorische Zellen an die Zielzelle heran, und sie sind aus diesem Grund für die Erken nung induzierbarer Oberflächenantigene als operationelle Ziel strukturen besonders geeignet. Es konnte gezeigt werden, daß bereits wenige Zielantigene in einer Menge von 100 bis 5000 pro Zelle auf der Zielzelle ausreichend sind, um diese zu zerstö ren. Die hierzu durchgeführten in vitro-Experimente mit Stamm zellpräparaten (PBSZ) sind im nachfolgenden Beispiel A be schrieben. Somit ist die erfindungsgemäße Klasse intakter bi spezifischer und trispezifischer Antikörper befähigt, auch bei einer sehr geringen Expression der Zielantigene Tumorzellen oder Zielzellen zu zerstören oder nach deren Erkennung eine Immunantwort zu initiieren.The intact bispecific provided according to the invention and trispecific antibodies do not carry only one type of Immune cells, but T cells and accessory cells to the Target cell, and for this reason they are for the oriels inducible surface antigens as an operational goal structures particularly suitable. It could be shown that already a few target antigens in an amount of 100 to 5000 per Cell on the target cell are sufficient to destroy it ren. The in vitro experiments carried out with strain Cell preparations (PBSZ) are A in the following example wrote. Thus, the class of the invention is intact bi specific and trispecific antibody, also with a very low expression of the target antigenic tumor cells or to destroy target cells or, after their detection, a Initiate immune response.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können, da sie gegen induzier bare Antigene gerichtet sind, dazu beitragen, das Problem feh lender zielzellspezifischer, für eine Immuntherapie notwendige Zielantigene auf Tumorzellen und auf durch Mikroorganismen in fizierten Zellen zu lösen. Da derartige induzierbare Antigene nicht nur auf Tumorzellen vorkommen, sondern generell in Streß- situationen produziert werden, können auch Erkrankungen immun therapeutisch angegangen werden, die durch Infektion von bei spielsweise Viren, Einzellern, Bakterien oder Pilzen ausgelöst wurden. Hierbei handelt es sich um die oben bereits näher be schriebenen MIC-Moleküle und Hitzeschock-Proteine.The antibodies according to the invention can, because they induce against bare antigens are directed to help solve the problem lender target cell-specific, necessary for immunotherapy Target antigens on tumor cells and on microorganisms in to loosen infected cells. Because such inducible antigens not only occur on tumor cells, but generally in stress situations are produced, diseases can also be immune to be treated therapeutically by infection by at for example, viruses, unicellular organisms, bacteria or fungi triggered were. These are the ones already described above wrote MIC molecules and heat shock proteins.
Nachdem in präklinischen Tiermodellen die herausrangende Wirk samkeit von intakten bsAk nicht nur in vitro, sondern auch in vivo belegt werden konnte (Lindhofer et al., Blood, 88: 4651, 1996), wurde die Reinigung von Stammzellpräparaten von kontami nierenden Tumorzellen als weitere Anwendungsmöglichkeit entwickelt (Lindhofer et al., Exp. Hematol. 25: 879, 1997).After the outstanding effect in preclinical animal models intact BSA not only in vitro, but also in was demonstrated in vivo (Lindhofer et al., Blood, 88: 4651, 1996), the cleaning of stem cell preparations by kontami Nating tumor cells developed as a further application (Lindhofer et al., Exp. Hematol. 25: 879, 1997).
Auf diesen Versuchen aufbauend, konnte in Folgeversuchen mit kompletten Stammzellpräparaten (ca. 2 × 10e10 Zellen), insbe sondere die Wirksamkeit im untergesättigten Bereich der Zielan tigene nachgewiesen werden. D. h. es wurde, in Titrationsversu chen, so wenig intakter bsAk verabreicht, daß in einem PBSZ (Periphere Blut-Stammzellen)-Präparat mit ca. 6,5 × 10e9 T-Zel len, bei einer Gabe von 5 µg Antiköper/Präparat, lediglich 3000 CD3 Moleküle von ca. 30.000 CD3 Molekülen/T-Zelle mit dem bsAk gebunden vorlagen (siehe Berechnung). Trotzdem waren die intak ten bsAk in der Lage, auch unter diesen Bedingungen, die Ziel zellen (hier Tumorzelle: HCT-8) zu zerstören.Based on these experiments, we were able to use complete stem cell preparations (approx. 2 × 10e10 cells), esp especially the effectiveness in the undersaturated area of the target tigen be proven. That is, it was, in titration verse Chen, so little intact bsAk administered that in a PBSZ (Peripheral blood stem cells) preparation with approx. 6.5 × 10e9 T cell len, with a dose of 5 µg antibody / preparation, only 3000 CD3 molecules of approx. 30,000 CD3 molecules / T cell with the bsAk bound templates (see calculation). Still, they were intact ten bsAk was able to target even under these conditions cells (here tumor cell: HCT-8).
Die Versuche waren so aufgebaut, daß von derartig behandelten PBSZ-Präparaten Aliquots entnommen und mit einer definierten Menge von Tumorzellen kontaminiert wurden. Es konnte gezeigt werden, daß die Tumorzellen selbst bei dieser geringen Konzen tration von intakten bsAk, bei der nur ein Teil der Zielanti gene besetzt vorliegen, zerstört werden.The experiments were set up in such a way that treated PBSZ preparations taken from aliquots and with a defined Amount of tumor cells were contaminated. It could be shown be that the tumor cells even at this low concentration tration of intact BSA in which only a part of the target ant genes are occupied, destroyed.
Die Auswertung des oben beschriebenen Experiments führte zu
folgenden Ergebnissen:
The evaluation of the experiment described above led to the following results:
Ein intakter bsAk hat ein Molekulargewicht von 150 KDa. D. h. 1 Mol sind 150 Kg und entsprechen definitionsgemäß 6 × 1023 Molekü len. Damit entsprechen 5 µg ca. 2 × 1013 Molekülen.An intact bsAk has a molecular weight of 150 KDa. That is, 1 mole is 150 kg and by definition correspond to 6 × 10 23 molecules. 5 µg corresponds to approx. 2 × 10 13 molecules.
Nachdem in einem Stammzellpräparat 6,5 × 109 T-Zellen bestimmt wurden und eine T-Zelle ca. 30.000 CD3 Moleküle trägt, kommt man auf eine Gesamtzahl von 19,5 × 1013 CD3 Molekülen im Stamm zellpräparat.After 6.5 × 10 9 T cells have been determined in a stem cell preparation and one T cell carries approx. 30,000 CD3 molecules, a total of 19.5 × 10 13 CD3 molecules are found in the stem cell preparation.
Da jeder bsAk einen anti-CD3 Bindungsarm besitzt, kann gefol gert werden, daß theoretisch, setzt man die beiden oben berech neten Molekülmengen in Bezug, in diesem konkreten Beispiel nicht mehr als ca. 3000 CD3 Moleküle von den bsAk besetzt wer den können. Since every bsAk has an anti-CD3 binding arm, it can be done theoretically, if you calculate the two above neten Molecular amounts in relation, in this concrete example no more than approx. 3000 CD3 molecules occupied by the bsAk that can.
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with rat IgG2b, J. Immunolog., 1995, 154: 1852-1860
2. Gast G. C., Haagen I.-A., von Houten A. A., Klein S., Duits
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von Dijk A. J. G., de Lau W. B. M., Bast B. J. E. G. CD5 T-cell
activation after intravenous administration of CD3 X CD19
bispecific antibody in patients with non-Hodgkin lymphoma.
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3. Tenny, C., Jacobs, S., Stoller, R., Earle, M., and Kirk
wood, J. Adoptive cellualr immunotherapy with high-dose
chemotherapy and autologous bone marrow rescue (ABMR) for
recurrent breast cancer (meeting abstract).
Proc. Annu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol; 11: A88, 1992 ISSN:
0736-7589. CO: PMAODO - 7589 CO, 1993.
4. Early Hreast Cancer Trialists' Collaborative Group,
Systemic treatment of early breast cancer by hormonal,
cytotoxic, or immune therapy - 133 randomised trials in
volving 31.000 recurrences and 24.000 deaths among 75.000
women. Part II Lancet 339: 71-85, 1992
5. Guo et al., Effective tumor vaccines generated by in vitro
modification ot tumor cells with cytokines and bispecific
monoclonal antibodies. Nature Medicine 3: 451, 1997
6. Lindhofer et al., Preferential species-restricted heavy
light chain pairing in rat-mouse quadromas: Implications
for a single step purification of bispecific antibodies,
J. Immunology 1995, 155: 2191. Haagen et al., Interaction of human moncyte Fcy receptors with rat IgG2b, J. Immunolog., 1995, 154: 1852-1860
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Claims (23)
- 1. α) Binden an eine T-Zelle;
- 2. β) Binden an zumindest ein Antigen auf einer Tumorzelle;
- 3. γ) Binden durch ihren Fc-Teil (bei bispezifischen Anti körpern) oder durch eine dritte Spezifität (bei tri spezifischen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positiven Zellen,
- 1. α) binding to a T cell;
- 2. β) binding to at least one antigen on a tumor cell;
- 3. γ) binding to Fc receptor positive cells by their Fc part (in the case of bispecific antibodies) or by a third specificity (in the case of tri-specific antibodies),
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2a,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2b,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG3,
Ratte-IgG2b/Human-IgG1,
Ratte-IgG2b/Human-IgG2,
Ratte-IgG2b/Human-IgG3[orientaler Allotyp G3m(st) = Bin dung an Protein A],
Ratte-IgG2b/Human-IgG4,
Ratte-IgG2b/Ratte-IgG2c,
Maus-IgG2a/Human-IgG3[kaukasische Allotypen G3m(b+g) = keine Bindung an Protein A, im folgenden mit * gekenn zeichnet]
Maus-IgG2a/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]- Human-IgG1-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human- IgG4-[Hinge]-Human-IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human- IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Hu man-IgG3*[CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG3-[Hinge-CH2-CH3, orientaler Allotyp]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge-CH2-CH3]
Human-IgG1/Human-(VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Numan-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG2/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-(Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Maus-IgG2b/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge)-Human- IgG3*-[CH2-CH3)
Maus-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]- Human-IgG4-[Hinge]-Human-IgG4-[CH2]-Human-IgG3*-[CH3]
HumanIgG1/Ratte[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1 [Hinge]-Human-
IgG4-[CH2]-HumanIgG3*[CH3] HumanIgG1/Maus[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1[Hinge]-Human-IgG4- [CH2]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG4/Human[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4-[CH2]-HumanIgG3*-[CH3]12. Use according to one or more of the preceding claims, characterized in that the bispecific antibody is selected from one or more of the following combinations of isotics:
Rat IgG2b / mouse IgG2a,
Rat IgG2b / mouse IgG2b,
Rat IgG2b / mouse IgG3,
Rat IgG2b / human IgG1,
Rat IgG2b / human IgG2,
Rat IgG2b / human IgG3 [oriental allotype G3m (st) = binding to protein A],
Rat IgG2b / human IgG4,
Rat IgG2b / rat IgG2c,
Mouse IgG2a / Human IgG3 [Caucasian allotypes G3m (b + g) = no binding to protein A, marked with * in the following]
Mouse IgG2a / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] - Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse-IgG2a / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2a / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG1 / rat- [VH-CH1, VL-CL] - human-IgG1- [Hinge] -human-IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG4 / rat- [VH-CH1, VL-CL] -human- IgG4- [hinge] -human-IgG4 [N-terminal region of CH2] -human- IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS position 251] -Human-IgG3 * [CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge-CH2-CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG2- [Hinge-CH2-CH3]
Rat IgG2b / Mouse [VH-CH1, VL-CL] Human IgG3 [Hinge CH2-CH3, oriental allotype]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4- [Hinge-CH2-CH3]
Human-IgG1 / Human- (VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] - Human-IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse [VH-CH1, VL-CL] human IgG1 [hinge] human IgG4 [N-terminal region of CH2] human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1 [Hinge] Human IgG2 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG1- [hinge] -human IgG2 [N-terminal region of CH2] -human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge] Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG2 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG2- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human-IgG4 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG4- (Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG4 / Human [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Mouse IgG2b / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2b / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge) -Human- IgG3 * - [CH2-CH3)
Mouse IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG4 / rat- [VH-CH1, VL-CL] - human-IgG4- [Hinge] -human-IgG4- [CH2] -human-IgG3 * - [ CH3]
Human IgG1 / Rat [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1 [Hinge] Human
IgG4- [CH2] -HumanIgG3 * [CH3] HumanIgG1 / Mouse [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1 [Hinge] -Human-IgG4- [CH2] -Human-IgG3 * [CH3]
Human-IgG4 / Human [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG4- [Hinge] -Human- IgG4- [CH2] -HumanIgG3 * - [CH3]
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