DE4411223A1 - Verwendung alkalischer Proteasen in gewerblichen Textilwaschverfahren - Google Patents
Verwendung alkalischer Proteasen in gewerblichen TextilwaschverfahrenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung alkalischer Protea
sen in gewerblichen Textilwaschverfahren sowie in diesen Ver
fahren verwendete Zusammensetzungen, welche alkalische Protea
sen enthalten.
Die in gewerblichen Wäschereien eingesetzten Textilwasch
mittel unterscheiden sich in vielfältiger Weise von den üb
licherweise im Haushalt eingesetzten Waschmitteln. So werden in
gewerblichen Wäschereien taktabhängig oder kontinuierlich ar
beitende Großwaschanlagen mit einem sehr hohen Wäschedurchsatz
eingesetzt, wobei bei den unterschiedlichen Waschstufen wie
Benetzen, Vorwaschen, Klarwaschen und Spülen, unterschiedliche
Waschmittelkombinationen je nach Textilart und Grad der Ver
schmutzung in die Flotte eindosiert werden. Auch die rationelle
Ausnutzung von Wasser und Energie hat die Entwicklung besonde
rer teilkonfektionierter Waschmittelkombinationen für die ge
werbliche Textilwäscherei erforderlich gemacht, die je nach Art
und Verschmutzung der zu waschenden Textilien optimal auf die
jeweilige Waschstufe abgestimmt werden können.
Der Einsatz proteasehaltiger Waschmittelzusammensetzungen
in gewerblichen Wäschereien, z. B. zur Reinigung von mit Blut
verunreinigter Krankenhauswäsche oder Schutzbekleidung aus
fleischverarbeitenden Betrieben, ist bereits seit längerem
bekannt. Auf Grund der in gewerblichen Textilwaschverfahren im
Vergleich zu Haushaltswaschmitteln drastischeren Bedingungen
werden an die hierbei verwendeten Proteasen besonders hohe
Anforderungen gestellt. Neben einer guten Beständigkeit und
Aktivität bei hochalkalischen pH-Werten sollten die Proteasen
so über eine hohe Temperaturstabilität verfügen, um bei niedri
ger Konzentration für eine möglichst lange Zeitdauer bei den
in gewerblichen Textilwaschverfahren hohen Temperaturen gute
Waschergebnisse für den jeweiligen Waschgang zu erbringen.
Außerdem sollten die eingesetzten alkalischen Proteasen mög
lichst unempfindlich gegen die in gewerblichen Textilwaschver
fahren üblichen Waschmittelinhaltsstoffen wie z. B. Tenside,
Bleichmittel oder desinfizierend wirksamen Bestandteile sein.
Daher besteht immer noch Bedarf nach weiteren für gewerbliche
Textilwaschverfahren geeigneten alkalischen Proteasen.
Es bestand daher die Aufgabe, neue für die Verwendung in
gewerblichen Textilwaschverfahren geeignete alkalische Protea
sen anzugeben.
Es wurde nun gefunden, daß sich die nachstehend angegebe
nen alkalischen Bacillus-Proteasen mit hoher Waschwirksamkeit
in gewerblichen Textilwaschverfahren einsetzen lassen. Gegen
stand der Erfindung ist daher die Verwendung alkalischer Pro
teasen in Zusammensetzungen für gewerbliche Textilwaschverfah
ren, wobei man mindestens eine alkalische Protease ausgewählt
aus der Gruppe alkalischer Bacillus-Proteasen aus
- a) dem Bacillus-Stamm DSM 6845 und/oder
- b) dem Bacillus-Stamm DSM 5466 mit einer Aminosäurensequenz, welche sich von der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurense quenz durch wenigstens einen der Aminosäurenaustausche Q12R, N42R, N74R, N114R, N115R, Q135R, M216Q, N237P, T249R unterscheidet,
verwendet.
Die genannten alkalischen Bacillus-Proteasen besitzen
Molekulargewichte im Bereich von 26 000 bis 28 000 g/mol, ge
messen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gegenüber
Referenzproteinen mit bekanntem Molekulargewicht. Ihr pH-Opti
mum liegt im Bereich von 8 bis 13,0, wobei unter pH-Optimum
derjenige pH-Bereich verstanden wird, in dem die Proteasen
maximale proteolytische Aktivität aufweisen. Auch weisen die
genannten alkalischen Bacillus-Proteasen eine gute pH-Stabili
tät auf.
Alkalische Bacillus-Proteasen aus dem am 16.12.1991 unter
der Nummer DSM 6845 hinterlegten Bacillus-Stamm sind durch
Kultivierung dieses Stammes aus dem Kulturüberstand erhältlich.
Eine alkalische Bacillus-Protease aus dem am 28.07.1989
unter der DSM-Nr. 5466 hinterlegten Bacillus-Stamm, welche
eine Aminosäurensequenz besitzt, die sich von der in Fig. 1
angegebenen Aminosäurensequenz in den genannten Positionen
unterscheidet, ist auf an sich bekannte Weise durch Punktmuta
tion in der Aminosäurensequenz erhältlich, wie es z. B. in der
EP-A-415 296 beschrieben wird.
In einer bevorzugten Variante verwendet man eine alkali
sche Bacillus-Protease aus dem Stamm DSM 6845, welche die fol
genden Eigenschaften aufweist:
- (1) Wirkung: Abbau von Proteinen und Peptiden;
- (2) pH-Optimum: etwa bei pH-Werten von 9,5-13,0,
- (3) pH-Stabilität: bei pH-Werten von 9,5-11,0 erweist sich die Protease als völlig stabil, wobei unter "völlig sta bil" eine Restaktivität von mindestens 90% verstanden wird;
- (4) Temperatur-Optimum: etwa 64°C;
- (5) Temperatur-Stabilität: durch Inkubation der Protease bei Temperaturen bis 30°C für 15 Minuten wird die Protease nicht wesentlich in ihrer Aktivität beeinträchtigt; nach 15 Minuten Inkubation bei 40°C beträgt die Restaktivität der Protease wenigstens 75%.
In einer weiteren bevorzugten Variante verwendet man eine
alkalische Bacillus-Protease aus dem Stamm DSM 5466 mit einer
Aminosäurensequenz, welche sich von der in Fig. 1 angegebe
nen Aminosäurensequenz durch wenigstens einen der Aminosäu
renaustausche Q12R, N42R, N114R, N115R, Q135R, M216Q, N237P
oder T249R, vorzugsweise durch die Aminosäurenaustausche
N42R/N114R/N115R oder N42R/N114R/M216Q unterscheidet. Die Zah
lenangaben beziehen sich dabei auf die Position in der Amino
säurensequenz. Die Aminosäuren werden durch den Einbuchstaben
code bezeichnet, wobei die ursprüngliche Aminosäure der Posi
tionsangabe vorangestellt und die eingeführte Aminosäure der
Positionsangabe nachgestellt ist. Diese Aminosäurenaustausche
können auf an sich bekannte Weise durch Punktmutation in der
Aminosäurensequenz erhalten werden, wie es z. B. in der
EP-A-415 296 beschrieben ist.
Die genannten alkalischen Bacillus-Proteasen zeigen unge
wöhnlich gute Waschleistung unter den in gewerblichen Wäsche
reien üblichen Bedingungen wie hohen pH-Werten, kurzen Wasch
zeiten und hohen Waschtemperaturen. Auch zeigen die genannten
Proteasen eine überraschend hohe Beständigkeit gegen die in
gewerblichen Textilwaschverfahren gebräuchlichen Waschmittelbe
standteile. Erfindungsgemäß können die genannten alkalischen
Bacillus-Proteasen vorteilhaft in gewerblichen Großraumtrommel
waschmaschinen oder vollkontinuierlich oder taktabhängig arbei
tenden Gegenstrom-Waschstraßen verwendet werden. Besonders vor
teilhaft werden dabei die alkalischen Bacillus-Proteasen bei
sogenannten Mehrlaugenverfahren, z. B. Zweibadverfahren aus
Vorwasch- und Klarwaschgang, der Flotte im Vorwaschgang zugege
ben. Die Vorwäsche kann dabei bei den gewerblichen Textilwasch
verfahren üblichen Bedingungen, z. B. bei Temperaturen von 30
bis 70°C auf an sich bekannte Weise mit den üblicherweise in
diesem Waschgang verwendeten Waschmittelinhaltsstoffen durchge
führt werden. Bei stark proteinhaltigen Verunreinigungen, z. B.
stark blutbefleckter Wäsche aus Krankenhäusern, Großküchen oder
fleischverarbeitenden Betrieben können die genannten Proteasen
gegebenenfalls in einem dem Vorwaschgang vorgeschalteten Vor
spülgang mit klarem kalten oder rückgeführtem warmen Wasser und
den ansonsten hierfür üblichen Waschmittelinhaltsstoffen mit
gutem Erfolg verwendet werden. Natürlich können die genannten
alkalischen Bacillus-Proteasen auch in allen anderen, gewerb
lichen Textilwaschverfahren, z. B. in auf bestimmte Textil- und
Verschmutzungsarten abgestimmten gewerbliche Textilwaschverfah
ren, wie z. B. bei der desinfizierenden Wäsche von Textilien
aus dem Krankenhaus-Sektor, erfindungsgemäß verwendet werden.
Weiterhin umfaßt die Erfindung Zusammensetzungen für ge
werbliche Textilwaschverfahren, welche mindestens eine alkali
sche Bacillus-Protease aus
- a) dem Bacillus-Stamm DSM 6845 und/oder
- b) dem Bacillus-Stamm DSM 5466 mit einer Aminosäurensequenz, welche sich von der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurense quenz in mindestens einer der Positionen Q12R, N42R, N74R, N114R, N115R, Q135R, M216Q, N237P, T249R unterscheidet,
enthalten.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzun
gen eine alkalische Bacillus-Protease aus dem Bacillus-Stamm
DSM 6845, welche durch die bereits weiter oben angegebenen
Eigenschaften charakterisiert ist.
In einer ebenfalls bevorzugten Variante enthalten die er
findungsgemäßen Zusammensetzungen eine alkalische Bacillus-Pro
tease aus dem Stamm DSM 5466 mit einer Aminosäurensequenz, wel
che sich von der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz durch
wenigstens einen der Aminosäurenaustausche Q12R, N42R, N114R,
N115R, Q135R, M216Q, N237P, T249R, insbesondere durch die Ami
nosäurenaustausche N42R/N114R/N115R oder N42R/N114R/M216Q
unterscheidet.
Vorzugsweise sollten in den erfindungsgemäßen Zusammen
setzungen solche alkalischen Bacillus-Proteasen eingesetzt wer
den, welche eine Enzymaktivität von 50 000 bis 1 000 000 DU je
Gramm Enzympräparat aufweisen. Unter "DU" wird dabei die enzy
matische Aktivität in Delft Units verstanden, wobei 1000 DU
der proteolytischen Aktivität entsprechen, die bei einem Volu
men von 1 ml einer 2% (W/W)igen Enzymlösung nach Abbau von
Casein eine Extinktionsdifferenz (1 cm Lichtweg; 275 nm; Be
stimmung gegen Blindprobentest) von 0,4000 ergibt. Die genann
ten alkalischen Bacillus-Proteasen können dabei in den für
gewerbliche Textilwaschverfahren üblichen Formulierungen ein
zeln oder gewünschtenfalls auch in Kombination miteinander,
gegebenenfalls auch in Kombination mit anderen auf den gewerb
lichen Sektor gebräuchlichen Waschmittelproteasen oder anderen
an sich üblichen Waschmittelenzymen, wie z. B. Amylasen, Lipa
sen, Pektinasen, Nukleasen, Oxidoreduktasen etc., eingesetzt
werden. Bezogen auf die Trockensubstanz der Gesamtzubereitung
sollte der Anteil der genannten Bacillus-Proteasen in den er
findungsgemäßen Waschmittelformulierungen bevorzugt bei 0,1 bis
5 Gew.-%, insbesondere bei 0,2 bis 2,0 Gew.-% liegen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Form der
für gewerbliche Textilwaschverfahren gebräuchlichen Vollwasch
mittel, Alleinwaschmittel sowie Vorwasch- oder Vorspülmittel
vorliegen. Je nach Waschmitteltyp können dabei alle an sich im
Stand der Technik üblichen Waschmittelinhaltsstoffe wie Tensi
de, Bleichmittel, Buildersubstanzen (Gerüststoffe), Waschhilfs
chemikalien, optische Aufheller sowie weitere übliche Kompo
nenten wie z. B. Soda, Metasilikat, Orthophosphat oder Natrium-
Triphosphat in an sich üblichen Mengen enthalten. Zu den mögli
chen Waschmittelinhaltsstoffen gehören weiterhin z. B. Verstär
ker, Enzymstabilisatoren, Schmutzträger und/oder Kompatibili
sierungsmittel, Komplex- und Chelatbildner, Seifenschaumregu
latoren und Zusatzstoffe wie Korrosionsinhibitoren, Antielek
trostatika, Duftstoffe, Desinfektionsmittel, Bleichmittelakti
vatoren, Persäurebleichmittelvorstufen und Vergrauungsinhibito
ren.
Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Waschmittelzusammen
setzungen Vorwaschmittel, wie sie bei gewerblichen Textilwasch
verfahren im Temperaturbereich von 30 bis 70°C in sogenannten
Mehrlaugenverfahren, z. B. in Zweibadverfahren aus Vorwasch-
und Klarwaschgang, eingesetzt werden. Neben den genannten alka
lischen Bacillus-Proteasen können die erfindungsgemäßen Vor
waschmittel alle hierfür auf dem gewerblichen Sektor üblichen
Inhaltsstoffe wie z. B. nichtionische Tenside, Phosphate, Car
bonate, Silikate, gegebenenfalls Perborate und/oder Bleichakti
vatoren, Vergrauungsinhibitoren, Polycarboxylate, optische
Aufheller sowie gegebenenfalls weitere Puffer- und Hilfsstoffe
enthalten. Es können auch kommerziell erhältliche Waschmittel
formulierungen eingesetzt werden, denen zusätzlich die genann
ten alkalischen Bacillus-Proteasen in den angegebenen Mengen
zugesetzt wurden. Falls erforderlich, können diese kommerziell
erhältlichen Formulierungen dabei auch Bleichmittel auf Sauer
stoffbasis enthalten. Beispiele für derartige kommerziell er
hältliche Waschmittelformulierungen für den gewerblichen Sektor
sind TEN-COLOR® oder TENAX CONC®.
Die erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzungen können
auf an sich bekannte Weise in Pulverform, z. B. in Form von
Granulaten, Prills oder Pellets, gegebenenfalls auch mit Ober
flächenüberzügen versehen, konfektioniert sein. Auf Grund ihrer
guten Stabilität lassen sich die genannten Bacillus-Proteasen
auch in Flüssigformulierungen einsetzen.
Bei den für gewerbliche Textilwaschverfahren üblichen Be
dingungen wie hochalkalischen pH-Werten, z. B. pH-Werten über
11,0 sowie hohen Waschtemperaturen von bis zu 70°C zeigen die
genannten alkalischen Bacillus-Proteasen überraschend gute
Wascheigenschaften. Dies ist umso überraschender, als im Ver
gleich zur üblichen Haushaltswäsche durch die in gewerblichen
Wäschereien eingesetzten oft vollkontinuierlich arbeitenden Ge
genstromwaschanlagen zumeist nur relativ kurze Waschzeiten zur
Verfügung stehen. Neben einer hohen Temperaturbeständigkeit
zeigen die genannten alkalischen Bacillus-Proteasen dabei eine
hohe Enzymstabilität in Gegenwart der in gewerblichen Wasch
mitteln gebräuchlichen Inhaltsstoffe. Auch gegen die im gewerb
lichen Sektor gebräuchlichen Bleichmittel, wie sie z. B. in
gewerblichen Desinfektions-Waschmitteln für den Krankenhaus-
Sektor eingesetzt werden, insbesondere gegen Sauerstoffbleich
konzentrate z. B. auf der Basis von Perborat oder Wasserstoff
peroxid, sind die genannten alkalischen Bacillus-Proteasen bei
erfindungsgemäßer Verwendung stabil.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern,
ohne sie jedoch in ihrem Umfang zu beschränken.
Fig. 1:
Sequenzprotokoll der Aminosäurensequenz (SEQ ID NO1) der alka lischen Protease aus Bacillus alcalophilus HA1 (DSM 5466).
Fig. 2:
Temperatur-Optimum der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Fig. 3:
Temperatur-Stabilität der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Fig. 4:
pH-Optimum der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Fig. 5:
pH-Stabilität der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Sequenzprotokoll der Aminosäurensequenz (SEQ ID NO1) der alka lischen Protease aus Bacillus alcalophilus HA1 (DSM 5466).
Fig. 2:
Temperatur-Optimum der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Fig. 3:
Temperatur-Stabilität der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Fig. 4:
pH-Optimum der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Fig. 5:
pH-Stabilität der Protease aus Bacillus sp. MF12 (DSM 6845).
Die Sequenzierung der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurense
quenz der alkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus HAI
(DSM 5466) über Ermittlung der entsprechenden Nukleotidsequenz
ist in den Beispielen 1 bis 4 der EP-A 24 15 296 beschrieben.
Unter der Nummer DSM 6845 ist der als Bacillus sp. MF12-
Stamm benannte Stamm bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga
nismen (DSM) am 16.12.1991 hinterlegt worden. Unter der Nummer
DSM 5466 ist der als Bacillus alcalophilus HAI benannte Bacil
lus alcalophilus-Stamm bei der Deutschen Sammlung von Mikroor
ganismen (DSM) am 28.07.1989 hinterlegt worden.
Die Herstellung alkalischer Proteasen, welche sich von der in
Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz der alkalischen Protease
aus Bacillus alcalophilus HA1 (DSM 5466) durch wenigstens einen
der Aminosäurenaustausche Q12R, N42R, N74R, N114R, N115R,
Q135R, M216Q, N237P, T249R unterscheiden, wurden auf an sich
bekannte Weise durch gerichtete Mutagenese in DNA-Teilsequenzen
des entsprechenden Proteasegens durchgeführt. Mit den Zahlen
angaben ist dabei die entsprechende Position in der in Fig. 1
angegebenen Aminosäurensequenz bezeichnet, wobei der Positions
angabe im an sich bekannten Einbuchstabencode die ursprüngliche
Aminosäure vorangestellt und die eingeführte Aminosäure der Po
sitionsangabe nachgestellt ist. Ausführlich wird für die ange
gebenen Mutationen das Verfahren der gerichteten Mutagenese in
den Beispielen 5 bis 18 der EP 415 296 beschrieben. In bezug
auf die Aminosäurenaustausche in den Positionen 42, 114, 216
und 249 sei zusätzlich noch auf die DE 43 04 161 verwiesen.
Prinzipiell umfaßte das Verfahren die folgenden an sich bekann
ten Verfahrensschritte:
Aus dem Naturisolat Bacillus alcalophilus HAI (DSM 5466) wurde nach der Methode von Saito et al (1963, Biochim. Biophys. Acta 72, 619-629) chromosomale DNA isoliert und mit der Restrik tionsendonuklease Sau3A partiell hydrolysiert. Die Restrik tionsfragmente wurden durch Elektrophorese aufgetrennt und die Fragmente mit einer Größe von 3 bis 8 Kilobasen isoliert. Die isolierten und größenselektierten DNA-Fragmente aus Bacillus alcalophilus HA1 wurden mit Vektor-DNA des an sich bekannten Plasmids pUB 110 in vitro auf an sich bekannte Weise neu kom biniert. Mit der erhaltenen in vitro neu kombinierten DNA wur den Protoplasten des Stammes Bacillus subtilis BD224 (Bacillus Genetic Stock Center 1A46) nach der von S. Chang und N. Cohen (1979, Mol. Gen. Genet. 168, 111-115) beschriebenen Methode transformiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit Neomycin selektiert. Aus einem Klon wurde die Plasmid-DNA nach dem Handbuch von Maniatis et al (Maniatis et al = T. Maniatis, E. F. Frisch, J. Sombrock, Molecular Cloning, A Laboratory Menual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) iso liert. Das in diesem Plasmid enthaltende Fragment aus der B. alcalophiliis-DNA hatte eine Größe von 4,1 KB und enthielt die vollständige DNA-Sequenz für die hochalkalische Protease aus Bacillus alcalophilus HAI (DSM 5466) (vgl. Beispiel 1 und 2 der EP 415 296).
Aus dem Naturisolat Bacillus alcalophilus HAI (DSM 5466) wurde nach der Methode von Saito et al (1963, Biochim. Biophys. Acta 72, 619-629) chromosomale DNA isoliert und mit der Restrik tionsendonuklease Sau3A partiell hydrolysiert. Die Restrik tionsfragmente wurden durch Elektrophorese aufgetrennt und die Fragmente mit einer Größe von 3 bis 8 Kilobasen isoliert. Die isolierten und größenselektierten DNA-Fragmente aus Bacillus alcalophilus HA1 wurden mit Vektor-DNA des an sich bekannten Plasmids pUB 110 in vitro auf an sich bekannte Weise neu kom biniert. Mit der erhaltenen in vitro neu kombinierten DNA wur den Protoplasten des Stammes Bacillus subtilis BD224 (Bacillus Genetic Stock Center 1A46) nach der von S. Chang und N. Cohen (1979, Mol. Gen. Genet. 168, 111-115) beschriebenen Methode transformiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit Neomycin selektiert. Aus einem Klon wurde die Plasmid-DNA nach dem Handbuch von Maniatis et al (Maniatis et al = T. Maniatis, E. F. Frisch, J. Sombrock, Molecular Cloning, A Laboratory Menual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) iso liert. Das in diesem Plasmid enthaltende Fragment aus der B. alcalophiliis-DNA hatte eine Größe von 4,1 KB und enthielt die vollständige DNA-Sequenz für die hochalkalische Protease aus Bacillus alcalophilus HAI (DSM 5466) (vgl. Beispiel 1 und 2 der EP 415 296).
Das die vollständige DNA-Sequenz für die hochalkalische Protea
se aus Bacillus alcalophilus HA1 (DSM 5466) enthaltende Plasmid
wurde mit Aval geschnitten. Die überstehenden Enden wurden auf
an sich bekannte Weise (Maniatis et al, S. 114) zum DNA-Dop
pelstrang aufgefüllt. Nach anschließender Restriktion dieser
DNA mit Xbal wurde das N-terminale 1.618 BP umfassende Fragment
isoliert und auf an sich bekannte Weise in den Vektor pBS klo
niert. Der resultierende Vektor enthielt das N-terminale Ende
der für die in Fig. 1 abgebildete Aminosäurensequenz codieren
den DNA (vgl. Beispiel 5 der EP 415 296).
In analoger Weise wurde ein Vektor erstellt, der ein 658 BP
umfassendes für das C-terminales Ende der entsprechenden Pro
tease-DNA codierendes Fragment enthielt. Hierfür wurde das die
vollständige DNA-Sequenz enthaltende Plasmid mit den Restrik
tionsendonukleasen Xbal und Asp718 geschnitten und in die ent
sprechende Schnittstelle des bekannten Vektors pBS kloniert
(vgl. Beispiel 7 der EP 415 296).
Die gerichteten Mutationen wurden in der das C-terminale oder
das N-terminale enthaltende DNA-Teilsequenz mit der von Kunkel,
T. A. (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492) beschrie
benen "primer extension" Technik durchgeführt. Hierzu wurden
die entsprechenden Vektoren zunächst in ihre uracilierten ein
zelsträngigen Analoga auf an sich bekannte Weise umgewandelt,
indem mit einem der beiden Vektoren transformierte E. coli
CJ236-Bakterien kultiviert wurden, welche zusätzlich mit dem
Helfer-Phagen M13 K07 (bezogen von Bio-Rad Laboratories, Rich
mond, Kalifornien) infiziert wurden. Das Bakterium E. coli
CJ236 ist einem an sich bekannten Uracil-N-Glycosylase-Mangel
mutante, welche bei der Replikation der Vektoren statt Thymidin
das Nukleotid Uracil in die DNA-Sequenz des Vektors einbaut.
Uracilierte Vektoren lassen sich auf an sich bekannte Weise
vorteilhaft für in vitro-Reaktionen der gerichteten Mutagenese
einsetzen, da nach Beendigung der Reaktionen der Uracil-haltige
DNA-Einzelstrang, der als Matritze zur Erzeugung mutierter DNA-
Stränge diente, durch Behandlung mit Uracil-N-Glycosylase be
seitigt werden kann. Der Einsatz der genannten Helfer-Phagen
war für die Synthese der Hüllproteine für die gebildete uraci
lierte einzelsträngige Vektor-DNA nötig. Umhüllte uracilierte
Einzelstrang-Vektor-DNA wurde aus dem transformierten Wirts
organismus E. coli CJ236 ausgeschleust und anschließend aus dem
Kulturmedium isoliert.
Die isolierten, uracilierten DNA-Einzelstrang-Vektoren des
C-terminalen bzw. N-terminalen Endes wurden mit synthetischen
Oligonukleotiden hybridisiert, welche eine Mutationsstelle
enthielten und gleichzeitig als Primer für die nachfolgende
Ergänzung zum vollständigen DNA-Doppelstrang mit Mutation dien
ten. Die hierbei eingesetzten synthetischen Oligonukleotide
wurden auf an sich bekannte Weise nach der Methode von Beauca
ge, S. L. und Caruthers, M. H. (1981, Tetrahedron Letters 22,
1859-1862) hergestellt. Die Synthese des zweiten DNA-Stranges
wurde auf an sich bekannte Weise mit Hilfe von T4-DNA-Polymera
se und nachfolgender Ligation mit T4-DNA-Ligase durchgeführt
(Kunkel et al, 1987, Methods in Enzymol. 154, 367-382). Die
gebildete Doppelstrang-Vektor-DNA wurde in E. coli MC 1061
transformiert und die mutierten Vektoren wurden durch Überprü
fen der entsprechenden unitären Restriktionsendonukleasen-Er
kennungsstellen, die mit den synthetischen Oligonukleotiden
eingeführt bzw. entfernt wurden, identifiziert.
Zur Herstellung von z. B. zwei Mutationen entweder im N-termi
nalen oder im C-terminalen Teil der Protease-DNA wurde das
Verfahren nach Einführung einer ersten Mutation in analoger
Weise unter Verwendung eines weiteren synthetischen Oligonu
kleotides zur Einführung einer zweiten Mutation wiederholt.
Es wurden Expressionsvektoren mit Mutationen im C-terminalen
Teil bzw. N-terminalen Teil der Protease-DNA-Sequenz herge
stellt, indem die durch die gerichtete Mutagenese erhaltenen
DNA-Sequenzen mit Restriktionsendonukleasen geschnitten wurden
und mit einer Vektor-DNA, welche den entsprechenden anderen
terminalen Teil der DNA-Sequenz sowie alle für die Expression
notwendigen Elemente enthielt, legiert wurden. Die erhaltenen
Vektoren stellten vollständige Expressionsvektoren mit geeigne
tem Leseraster zur Expression der entsprechend mutierten Mutea
se dar. Ausführlich ist die Herstellung dieser Expressionsvek
toren in Beispiel 16 der EP 415 296 beschrieben. Für die fol
genden Mutationen wurden Expressionsvektoren hergestellt:
DSM 5466 Mut. N114R/M216Q
DSM 5466 Mut. N115R/Q135R
DSM 5466 Mut. N42R/N114R/M216Q
DSM 5466 Mut. N42R/N114Q/N115Q
DSM 5466 Mut. N114R/N237P
DSM 5466 Mut. N42R/N114R
DSM 5466 Mut. Q12R/N42R/N114R
DSM 5466 Mut. N114R/N237P/T249R
DSM 5466 Mut. Q12R/N42R/N114R.
DSM 5466 Mut. N115R/Q135R
DSM 5466 Mut. N42R/N114R/M216Q
DSM 5466 Mut. N42R/N114Q/N115Q
DSM 5466 Mut. N114R/N237P
DSM 5466 Mut. N42R/N114R
DSM 5466 Mut. Q12R/N42R/N114R
DSM 5466 Mut. N114R/N237P/T249R
DSM 5466 Mut. Q12R/N42R/N114R.
Die mutierten hochalkalischen Proteasen wurden hergestellt,
indem B. subtilis BD 224 mit jeweils einen der obengenannten
Expressionsvektoren auf an sich bekannte Weise transformiert
wurden. Aus den Kulturüberständen dieser transformierten Stämme
wurden die mutierten hochalkalischen Proteasen nach bekannten
Verfahren isoliert. Ausführlicher Angaben zur Isolierung der
mutierten Proteasen finden sich in den Beispielen 16 und 18 der
EP 415 296.
Die durch Mutation in der Aminosäurensequenz variierten alkali
schen Proteasen auf Grundlage des Bacillus alcalophilus HA1
(DSM 5466) wurden in den in Beispiel 3 beschriebenen Waschver
suchen eingesetzt.
50 ml Luria-Broth pH 9,5 (10 g Hefe-Extrakt, 5 g Trypton,
5 g NaCl und 50 ml Carbonat-Puffer ad 1000 ml Aqua bidest.) in
500 ml Erlenmeyerkolben mit 3 Schikanen wurden mit einer Ein
zelkolonie des Stammes Bacillus sp. MF12 DSM 6845 (gewachsen
auf P8A-Agar-Platten) beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und
240 Upm inkubiert. Mit 2,5 ml dieser Kultur wurden 50 ml Haupt
kultur Medium (Soja 2%; Stärke 5%; Maisquellwasser 1%, Car
bonatpuffer 50 ml (Na₂CO₃ 4,2%)) in 500 ml-Erlenmeyerkolben
mit 3 Schikanen beimpft und für 48 Stunden bei 37°C und
240 Upm inkubiert.
Die Aktivität der Protease wurde in Delft Units (DU) bestimmt.
1000 DU ist die proteolytische Aktivität, die bei einem Volumen
von 1 ml einer 2% (w/w)igen Enzymlösung nach Abbau von Casein
eine Extinktionsdifferenz (1 cm Lichtweg; 275 nm; Bestimmung
gegen Blindprobentest) von 0,4000 ergibt.
Nach 48 Stunden betrug die proteolytische Aktivität im Kultur
überstand, gewonnen durch Zentrifugation für 15 Minuten bei
27 000 × g, 5000 DU/ml.
Das Temperatur-Optimum der in den Kulturüberständen enthaltenen
Proteasen wurde im Bereich von 40 bis 72°C bestimmt. Die Er
gebnisse sind in Tabelle 1 sowie in der Fig. 2 dargestellt.
Das Temperatur-Optimum der Protease aus Bacillus sp. MF12
DSM 6845 liegt bei 64°C.
Zur Bestimmung der Temperatur-Stabilität wurden der protease
haltige Überstand für 15 Minuten bei verschiedenen Temperaturen
inkubiert und anschließend die Restaktivität bestimmt. Die Er
gebnisse sind in der Tabelle 2 sowie in der Fig. 3 dargestellt.
Die Protease aus Bacillus sp. MF12 DSM 6845 ist bis 31°C sta
bil (Restaktivität < 90%) und zeigt nach 15-minütiger Inkuba
tion bei 50°C noch eine Restaktivität von 58%.
Zur Bestimmung des pH-Optimums der Protease aus Bacillus sp.
MF12 DSM 6845 wurde die Aktivität bei verschiedenen pH-Werten
bestimmt. Für die Einstellung der pH-Wert wurde im pH-Bereich
5,0 bis 7,0 Phosphat- (0,1 M), im pH-Bereich 7,0 bis 9,0 Tris-
HCl- (0,1 M) und im pH-Bereich 9,0 bis 13,0 Glycin-NaOH-Puffer
(0,1 M) verwendet. Die Werte der Aktivitätsbestimmung sind in
Fig. 4 dargestellt.
Das pH-Optimum der alkalischen Protease aus Bacillus sp. MF12
DSM 6845 liegt um pH 12. Bei pH 13 ist die Aktivität noch
< 90%.
Zur Untersuchung der pH-Stabilität wurde die Protease aus Ba
cillus sp. MF12 DSM 6845 für 24 Stunden in Puffern verschiede
nen pH-Wertes bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Rest
aktivität der Proteasen bestimmt. Für den pH-Bereich von 5 bis
7,1 wurde Phosphat-Puffer (0,1 M), für den pH-Bereich von 7,5
bis 9 Tris-HCL-Puffer (Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer)
(0,1 M) und für den pH-Bereich von 9 bis 12,1 Glycin/Natriumhy
droxid-Puffer (0,1 M) verwendet. Das Ergebnis ist in der Fig. 5
dargestellt.
Die alkalische Protease aus Bacillus sp. MF12 DSM 6845 besitzt
nach der 24-stündigen Inkubation im gesamten pH-Bereich noch
mindestens 70% Restaktivität und ist um pH 11 völlig stabil.
Es wurden Waschversuche mit angeschmutztem Testgewebe unter in
gewerblichen Verfahren üblichen Bedingungen durchgeführt. Als
Testgewebe wurde ein mit Blut, Milch und Tusche angeschmutztes
Polyester-Baumwoll-Mischgewebe (EMPA117, bezogen von der eidge
nössischen Materialprüfungsanstalt, St. Gallen, Schweiz) ein
mit Eigelb und Tusche angeschmutztes Polyester-Baumwoll-Misch
gewebe (EY-PC, eigene Herstellung) sowie ein mit Milch und
Tusche angeschmutztes Polyester-Baumwoll-Mischgewebe (M-PC,
eigene Herstellung) eingesetzt. Gewaschen wurde in Laborwasch
maschinen vom Typ Zelltex Polycolor, wobei als Waschmittelba
sisformulierungen die im gewerblichen Sektor üblichen unter den
Handelsnamen TEN COLOR® und TENAX CONC® (Hersteller Firma
J. P. Haas/Steinau) erhältlichen Vorwaschmittel verwendet wur
den. Gewaschen wurde im Temperaturbereich von 15°C bis 60°C
für 45 Minuten (2°C/min; 22,5 min Haltezeit bei 60°C) oder im
Temperaturbereich von 15°C bis 65°C für 25 Minuten (5°C/min;
15 min Haltezeit bei 65°C). Die Wasserhärte lag bei 150 dH;
die Enzymkonzentration betrug 0,71 mg reine Protease pro Liter
Waschlösung. Die enzymhaltige Waschmittellösung wirkte in einem
rotierenden Probengefäßkammer, das über ein Wasserbad entspre
chend dem Temperaturprogramm gesteuert wurde, auf das Testge
webe ein. Nach dem Waschvorgang wurde das Testgewebe zweimal
mit entsalztem Wasser gespült und anschließend gebügelt.
Die Waschleistung der Proteasen wurde durch Messung der Re
flexion des gewaschenen Testgewebes mit Hilfe eines Remissions
photometers bestimmt. Ebenfalls wurde die Reflexion des nur mit
der Waschmittelbasisformulierung gewaschenen Testgewebes ermit
telt. Die Differenz dieser beiden Reflexionswerte ist als soge
nannter Delta R-Wert ein Maß für die Waschleistung der jeweili
gen Protease. Zum Vergleich mit Proteasen des Standes der Tech
nik wurden alle Waschversuche ebenfalls unter identischen Be
dingungen für die kommerziell unter dem Handelsnamen Opticlean®
erhältliche Protease durchgeführt.
Tabelle 3 zeigt die Waschleistungen der erfindungsgemäß verwen
deten Proteasen mit einer bleichmittelfreien Waschmittelformu
lierung für gewerbliche Textilwaschverfahren, wie sie unter dem
Handelsnamen TENAX CONC. kommerziell erhältlich ist.
Tabelle 4 zeigt die Waschleistungen der erfindungsgemäß verwen
deten Proteasen mit einer unter dem Handelsnamen TEN-COLOR®
kommerziell erhältlichen Waschmittelformulierung für gewerb
liche Textilwaschverfahren, welche Bleichmittel auf Sauerstoff
basis (Perborat) enthält.
Die hohen Reflexionswerte der erfindungsgemäß verwendeten Pro
teasen belegen deren hohe Waschleistungen auf proteinver
schmutztes Gewebe unter den in gewerblichen Textilwaschverfah
ren üblichen Bedingungen (hochalkalische pH-Werte, lange Halte
zeiten bei hohen Temperaturen).
Zusätzlich neben der Waschwirksamkeit auf das Testgewebe EM-
PA117 wurden auch noch Waschversuche mit dem mit Eigelb-Tusche
angeschmutzten Testgewebe EY-PC und dem mit Milch-Tusche ange
schmutzten Gewebe M-PC durchgeführt. Außerdem wurden die Wasch
bedingungen auf eine Aufheizrate von 5°C/min und eine Halte
zeit von 15 min bei 65°C verschärft. Auch bei diesen Waschver
suchen wurde die bleichmittelhaltige Waschmittelformulierung
TEN-COLOR® für gewerbliche Textilwaschverfahren eingesetzt.
Tabelle 5 zeigt die dabei erhaltenen Ergebnisse.
Aus Tabelle 3 bis 5 wird deutlich, daß die erfindungsgemäß
verwendeten Proteasen sehr hohe Waschleistungen auf unter
schiedlichen Gewebearten zeigen, die mit unterschiedlichen
Proteinverunreinigungen angeschmutzt sind. Beeinträchtigungen
der Enzymstabilität durch das hochalkalische Millieu der Wasch
lauge, die hohe Waschtemperatur sowie durch das Bleichmittel
sind dabei praktisch nicht feststellbar. Bei der kurzen Wasch
zeit von nur 25 min werden dabei außergewöhnlich gute Wasch
leistungen festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen damit die
besonders gute Eignung der genannten Proteasen für gewerbliche
Textilwaschverfahren.
Claims (11)
1. Verwendung alkalischer Proteasen in Zusammensetzungen
für gewerbliche Textilwaschverfahren, dadurch gekennzeichnet,
daß man mindestens eine alkalische Protease ausgewählt aus der
Gruppe alkalischer Bacillus-Proteasen aus
- a) dem Bacillus-Stamm DSM 6845 und/oder
- b) dem Bacillus-Stamm DSM 5466 mit einer Aminosäurense quenz, welche sich von der in Fig. 1 angegebenen Ami nosäurensequenz durch wenigstens einen der Aminosäu renaustausche Q12R, N42R, N74R, N114R, N115R, Q135R, M216Q, N237P, T249R unterscheidet,
verwendet.
2. Verwendung alkalischer Proteasen nach Anspruch 1, da
durch gekennzeichnet, daß man eine alkalische Bacillus-Protease
aus dem Stamm DSM 6845 mit folgenden Eigenschaften verwendet:
- (1) Wirkung: Abbau von Proteinen und Peptiden;
- (2) pH-Optimum: etwa bei pH-Werten von 8,5-13,0,
- (3) pH-Stabilität: bei pH-Werten von 9,5-11,0 erweist sich die Protease als völlig stabil;
- (4) Temperatur-Optimum: etwa 64°C;
- (5) Temperatur-Stabilität: durch Inkubation der Protease bei Temperaturen bis 30°C für 15 Minuten wird die Protease nicht wesentlich in ihrer Aktivität beeinträchtigt; nach 15 Minuten Inkubation bei 40°C beträgt die Restaktivität der Protease wenigstens 75%.
3. Verwendung alkalischer Proteasen nach Anspruch 1, da
durch gekennzeichnet, daß man eine alkalische Bacillus-Protease
aus dem Stamm DSM 5466 mit einer Aminosäurensequenz, welche
sich von der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz durch
wenigstens einen der Aminosäurenaustausche Q12R, N42R, N114R,
N115R, Q135R, M216Q, N237P, T249R unterscheidet, verwendet.
4. Verwendung alkalischer Proteasen nach Anspruch 3, da
durch gekennzeichnet, daß man eine alkalische Bacillus-Protease
aus dem Stamm DSM 5466 mit einer Aminosäurensequenz, welche
sich von der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz durch die
Aminosäurenaustausche N42R/N114R/N115R oder N42R/N114R/M216Q
unterscheidet, verwendet.
5. Zusammensetzungen für gewerbliche Textilwaschverfahren,
dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine alkalische Pro
tease ausgewählt aus der Gruppe alkalischer Bacillus-Proteasen
- a) aus dem Bacillus-Stamm DSM 6845 und/oder
- b) aus dem Bacillus-Stamm DSM 5466 mit einer Aminosäurense quenz, welche sich von der in Fig. 1 angegebenen Aminosäu rensequenz durch wenigstens einen der Aminosäurenaustausche Q12R, N42R, N74R, N114R, N115R, Q135R, M216Q, N237P, T249R unterscheidet,
enthalten.
6. Zusammensetzungen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich
net, daß sie für Mehrlaugenverfahren, insbesondere Zweibadver
fahren, geeignete Vorwaschmittel sind.
7. Zusammensetzungen nach Anspruch 5 oder 6, dadurch ge
kennzeichnet, daß sie alkalische Bacillus-Proteasen mit einer
Aktivität von 50 000 bis 1 000 000 DU je Gramm Enzympräparat
enthalten.
8. Zusammensetzungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich
net, daß sie alkalische Bacillus-Proteasen in einer Menge von
0,1 bis 5,0 Gew.-% enthalten.
9. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 5 bis 8, da
durch gekennzeichnet, daß sie Sauerstoffbleichmittel enthalten.
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