DE60033954T2 - Molekularstruktur des rhd-negativ genortes - Google Patents

Molekularstruktur des rhd-negativ genortes Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nucleinsäuremolekülstruktur, die entweder die Hybrid-Rhesus-Box oder die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box oder die stromabwärts gelegene Rhesus-Box darstellt. Die Erfindung betrifft weiterhin den Nachweis von Nucleinsäuremolekülen, die eine Deletion des RhD-Gens tragen. Die Erfindung betrifft ebenfalls Oligonucleotide wie sie in den Ansprüchen identifiziert werden. Weiterhin betrifft die Erfindung Kits, die die vorstehend angeführten Verbindungen der Erfindung umfassen oder anwenden.
  • Das Rhesus-D-Antigen (ISST 004.001; RH1) ist das wichtigste Blutgruppenantigen, das durch ein Protein bestimmt wird. Anti-D-(Antikörper) sind die Hauptursache für hämolytische Erkrankungen bei Neugeborenen (Filbey, Acta Obstet. Gynecol. Scand. 74:687, 1995; Bowman, J. Semin. Perinatol. 21:39, 1997). Je nach Population fehlt das Antigen D 3% bis 25% der weißen Bevölkerung (Mourant, „The distribution of the human blond groups and other polymorphisms", London, Oxford University Press, 1976). Bei D-negativen Empfängern kann eine Immunisierung mit Anti-D leicht erfolgen (Urbaniak, Transfusion 21:64, 1981).
  • Die Antigene der RH-Blutgruppe sind in Proteinen enthalten, die durch zwei Gene, RHD und RHCE, codiert werden, welche an der chromosomalen Position 1p34.1-1p36 lokalisiert sind (Cherif-Zahar, Hum. Genet. 86:398, 1991; MacGeoch, Cytogenet. Cell Genet. 59:261, 1992), und dies wahrscheinlich innerhalb von weniger als 450.000. Basenpaaren (Bp) Abstand (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997). Beide Gene umfassen zehn Exons und ihre Strukturen sind hoch homolog. Die relative Orientierung der Gene, ihr Abstand und andere Gene, die möglicherweise zwischen ihnen liegen, waren lange Zeit unbekannt (Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998). Erst vor kurzem veröffentlichten Okuda et al. (Okuda, Biochem. Biophys. Res. Commun. 263:378, 1999) eine Sequenz von etwa 11.000 Bp, von der man annimmt, dass sie das DNA-Segment zwischen RHD und RHCE darstellt.
  • Bei Weißen liegt die überwiegende Mehrheit der D-negativen Haplotypen aufgrund einer Deletion des RHD-Gens vor. Diese Deletion überspannt das vollständige RHD-Gen, da RHD-spezifische Sequenzen, die von Exon 1 bis zur nicht translatieren 3'-Region reichen, fehlen (Gassner, Transfusion 37:1020, 1997). Der genaue Umfang der Deletion war bisher unbekannt, was die Möglichkeit offen lässt, dass benachbarte Gene ebenfalls betroffen sind.
  • Die Identifizierung des RHD-Gens als molekulare Basis des D-Antigens erlaubte die Vorhersage des RhD-Phänotyps durch DNA-Typisierung (Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998; Lo, Lancet 341:1147, 1993). Da die Struktur des vorherrschenden D-negativen Haplotyps jedoch unbekannt ist, war ein spezifischer Nachweis der RHD-Deletion nicht möglich, und die Unterscheidung zwischen homozygoten RHD+/RHD+- und heterozygoten RHD+/RHD--Individuen beruhte auf indirekten Verfahren. Diese Unterscheidung ist von klinischem Interesse, da insbesondere bei D-negativen Müttern mit Anti-D-Antikörpern das Risiko für ein betroffenes Kind bei einem RHD+/RHD+-Vater 100%, jedoch bei einem heterozygoten RHD+/RHD--Vater nur 50% beträgt.
  • Es wurden verschiedene indirekte Ansätze angewendet, um die Zygotie zu bestimmen: (i) eine einfache Vermutung, die auf dem Phänotyp basiert, ist bei etwa 95% aller Fälle korrekt, (ii) die Bestimmung der Dichte des D-Antigens, die durch Faktoren, wie z. B. der Anwesenheit des C-Antigens, gestört werden kann, und (iii) verschiedene Verfahren, die die parallele quantitative Amplifikation der RHD- und der RHCE-spezifischen Sequenzen umfassen (Cossu, Electrophoresis 17:1911, 1996; Döscher, Infusionsther. Transfusionsmed. 26 (Ergänzungsband 1):31, 1999 (Zusammenfassung)). Diese aufwendigen Verfahren könnten jedoch in Routine-Laboratorien nicht durchführbar sein. Darüber hinaus identifizierten einige Forscher Polymorphismen im RHCE-Gen oder in den benachbarten Sequenzen, die genetisch mit dem Fehlen des RHD-Gens verbunden sind (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997; Huang, Am. J. Hum. Genet. 58:133, 1996; Fujiwara, Hum. Genet. 104:301, 1999; Onda, Gene 159:225, 1995). Dieser indirekte Ansatz basierte auf dem Kopplungs-Ungleichgewicht, das die RHD-Deletion mit einem Polymorphismus in Beziehung setzte.
  • Darüber hinaus ist die Anwendbarkeit der RHD-PCR durch die unvollständige Kenntnis der vermutlich seltenen RHD-positiven Allele in RhD-negativen Individuen eingeschränkt. RHD-positive Allele in RhD-negativen Individuen werden durch RHD-CE-D-Hybrid-Gene (Huang, Blood 88:2326-2333, 1996; Faas, Transfusion 37:38-44, 1997; Faas, Transfusion 36:506-511, 1996), Nonsense-Mutationen (Avent, Blood 89:2568-2577, 1997), Verschiebungen des Leserasters (Andrews, Blood 92:1839-1840, 1998; Cherif-Zahar, Br. J. Haematol. 102:1263-1270, 1998) oder durch Pseudogene (Singleton, Blood 95:12-18, 2000) verursacht. Solche Allele kommen bei Afrikanern (Faas, Transfusion 37:38-44, 1997; Singleton, Blood 95:12-18, 2000) und Asiaten (Okuda, J. Clin. Invest. 100:373-379, 1997) häufig vor, sind aber bei Weißen selten. Dennoch legten neuere Analysen (Avent, Blood 89:2568-2577, 1997; Flegel, Transfus. Med. 8:281-302, 1998) nahe, dass sogar bei Weißen diese Allele die Hauptursache für eine unkorrekte Vorhersage des Rh-Phänotyps sind. Mehrere Beobachtungen bei Weißen (Avent, Blood 89:2568-2577, 1997; Hyland, Blood 84:321-324, 1994) deuteten an, dass diese Allele bei dem Cde- und dem cdE-Haplotyp gehäuft vorkommen.
  • Teile der vorliegenden Erfindung wurden in F.F. Wagner et al., Blood 95:3662-3668, 2000 veröffentlicht.
  • Der direkteste Ansatz zur Untersuchung des RHD-Genortes auf molekularer Ebene wäre eine PCR-Amplifikation, die die RHD-Deletionsstelle überspannt. Ein solcher Testansatz war bisher nicht verfügbar, da die Struktur des RHD-Genortes bei RhD-positiven und RhD-negativen Individuen nicht vollständig bekannt war.
  • Dementsprechend bestand das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem in der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren für eine verlässliche, auf Nucleinsäuren basierende, Analyse des Rhesus D-Genortes. Diese Mittel und Verfahren sollten unter anderem für den Nachweis und/oder die Unterscheidung zwischen RHD+/RHD+- und RHD+/RHD--Individuen geeignet sein.
  • Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen charakterisiert sind.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäuremolekülstruktur, die entweder die Hybrid-Rhesus-Box oder die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box oder die stromabwärts gelegene Rhesus-Box darstellt, deren Sequenzen in den 7 bis 9 gezeigt werden.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Nucleinsäuremolekülstruktur" als ein lineares DNA-Segment definiert, das im weitesten Sinne eine Kombination der vorstehend erwähnten Rhesus-Boxen umfasst, welche zusammen den Rhesus-Genort bestimmen. DNA-Sequenzen, die zu einer Molekülstruktur der Erfindung führen, umfassen die Folgenden: die Nucleotidsequenzstruktur umfasst die Hybrid-Rhesus-Box oder eine der beiden Rhesus-Boxen.
  • Die folgenden Sequenzen stellen Ausführungsformen dar, die in der Nucleinsäuremolekülstruktur der Erfindung enthalten sind.
  • Die Hybrid-Rhesus-Box wird unter der GenBank-Zugangs-Nummer AL252313 durch die Basen 33 bis 9.180 repräsentiert.
  • Die beiden Rhesus-Boxen mit dem dazwischen liegenden RHD-Gen bestehen aus der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box, die durch die GenBank-Zugangs-Nummer AL252311, Basen 34 bis 9.175, repräsentiert wird, dem RHD-Gen sowie der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box, die durch die GenBank-Zugangs-Nummer AL252312, Basen 23 bis 9.177, repräsentiert wird (vergleiche mit den 7 bis 9).
  • Während die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box 5' des RHD-Gens lokalisiert ist, ist die stromabwärts gelegene Rhesus-Box zwischen dem RHD- und dem SMP1-Gen in dieser Struktur der vorliegenden Erfindung lokalisiert. Der Begriff „Nucleinsäuremolekülstruktur" betrifft DNA-Segmente, die ausschließlich die Rhesus-Boxen umfassen, auf die hier Bezug genommen wird. Für ein besseres Verständnis des beanspruchten Gegenstands wird auf die nachstehenden 1 und 6 verwiesen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Nucleinsäuremolekülstruktur" auch jedes beliebige herstellbare Derivat der Nucleinsäuremolekülstruktur, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, an das eine Nucleinsäuresonde hybridisieren kann. Mit anderen Worten kann die Struktur der Erfindung durch synthetische oder durch halb-synthetische Verfahren hergestellt werden und kann somit aus Peptid-Nucleinsäuren bestehen oder diese umfassen. Der Begriff umfasst auch Nucleinsäure-Moleküle.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung beschreibt der Begriff "Rhesus-Box" stromaufwärts oder stromabwärts gelegene DNA-Segmente, die das RHD-Gen am 5'- und am 3'-Ende flankieren. Die drei Rhesus-Boxen sind durch ihre Nucleotidsequenzen definiert. Die Hybrid-Rhesus-Box wird in einer Ausführungsform durch die GenBank-Zugangs-Nummer AL252313, Basen 33 bis 9.180, repräsentiert. Die beiden Rhesus-Boxen mit dem dazwischen liegenden RHD-Gen bestehen aus der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box, die in einer Ausführungsform durch die GenBank-Zugangs-Nummer AL252311, Basen 34 bis 9.175, repräsentiert wird, und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box, die in einer Ausführungsform durch die GenBank-Zugangs-Nummer AL252312, Basen 23 bis 9.177, repräsentiert wird. Wie in den angehängten Beispielen erläutert wird, haben die Rhesus-Boxen bevorzugt eine Länge von etwa 9.000 Bp und weisen 98,6% Identität und die gleiche Orientierung auf. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die stromaufwärts und die stromabwärts gelegene Rhesus-Box mindestens zu 95% homolog. Die Länge der Rhesus-Boxen kann variieren. Es wird erwartet, dass die Länge dieser Rhesus-Boxen variieren kann, weil, neben anderen strukturellen Merkmalen, von multiplen repetitiven Elementen, von denen einige in Tandem-Anordnung organisiert sind, bekannt ist, dass sie für Verlängerungs- und Deletions-Ereignisse Neuanordnungen anfällig sind. Wenn solche Ereignisse auftreten, kann die Länge der Rhesus-Boxen auf weniger als 1.000 Nucleotide schrumpfen oder sie kann sich auf mehr als 20.000 Nucleotide ausdehnen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Identität" auf die Bestimmung der Sequenzidentität unter Verwendung von geeigneten Alignment-Programmen von Sequenzen wie z. B. BLAST.
  • Wie vorstehend angemerkt wurde, war die diagnostische Analyse von RHD-negativen Individuen auf molekularer Ebene bisher durch die Tatsache erschwert, dass die Gesamtstruktur des RHD/RHCE-Genortes unbekannt war. Nun wurde überraschenderweise herausgefunden, dass die beiden Gene RHD und RHCE in entgegengesetzter Orientierung vorliegen wobei ihre 3'-Enden benachbart sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde weiterhin herausgefunden, dass das RHD-Gen von zwei hoch homologen Rhesus-Boxen umgeben ist. Der physikalische Abstand zwischen RHD und RHCE beträgt etwa 30.000 Bp und enthält eine Rhesus-Box und das SMP1-Gen. Die Schnittstellen der RHD-Deletion bei den vorherrschenden RHD-negativen Haplotypen befinden sich in einer 1.463 Bp langen Identitäts-Region der Rhesus-Boxen. Ähnliche RHD-Deletionsereignisse können auch beliebige andere Regionen innerhalb der hoch homologen Rhesus-Boxen umfassen. Daher darf man annehmen, dass eine Region mit einer Schnittstelle, die eine andere RHD-Deletion als die übliche RHD-Deletion umfasst, an einer beliebigen Stelle innerhalb der vorstehend definierten Rhesus-Boxen auftreten kann.
  • Die entgegengesetzte Orientierung der beiden RH-Gene erklärt den unterschiedlichen Charakter der Hybridgene in der MNS- und der RH-Blutgruppe: die Gycophorin-Gene, welche die MNS-Antigene codieren, liegen in der gleichen Orientierung vor (Onda, Gene 159:225, 1995) und viele Rekombinationen können durch ein ungleiches Crossing-over erklärt werden, das zu einzelnen Hybridgenen führt (Blumenfeld, Hum. Mutat. 6:1999, 1995). Aufgrund der überraschenden Befunde, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, können die Ereignisse auf molekularer Ebene, die zu einem RHD-negativen (Genotyp) führen, nun besser verstanden werden. Bei dem RH-Genort ist es unwahrscheinlich, dass die invers orientierten Sequenzen ein ungleiches Crossing-over auslösen, und wenn dieses Ereignis stattfinden sollte, würde kein funktionelles Hybridgen daraus entstehen. Die Schussfolgerung, dass ein ungleiches Crossing-over am RH-Genort unwahrscheinlich ist, könnte erklären, warum die meisten RH-Hybridgene zum RHD-CE-D- oder zum RHCE-D-CE-Typ gehören und Bereiche homologer DNA umfassen, die in cis angeordnet sind, wie kürzlich berichtet wurde (Wagner, Blood 91:2157, 1998). Derzeit ist das RH-Gensystem der einzige gut untersuchte Genort, in dem zwei Gene in entgegengesetzter Orientierung vorliegen, was es zu einem Modellsystem für die Evolution von benachbarten, entgegengesetzt orientieren Genen macht, die in den Genomen häufig vorkommen.
  • Aufgrund der Struktur des RH-Genortes (1) wird das einfachstmögliche Modell für RHD-Gen-Deletionsereignisse vorgeschlagen (6). Obwohl der Anmelder nicht wünscht, an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird hinsichtlich der Entstehung des RhD-negativen Genotyps folgendes angenommen. Die RHD-Deletion kann durch ein ungleiches Crossing-over erklärt werden, das durch die hoch homologen Rhesus-Boxen ausgelöst wird, die das RHD-Gen flankieren. Die Hybrid-Typ-Rhesus-Box bei RHD-negativen Individuen entsteht, wenn ein Crossing-over stattfindet, das zu einem Deletionsereignis führt, und das eine Schnittstellenregion innerhalb der Identitätsregion der stromaufwärts und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Boxen umfasst. Die Hybrid-RHD-Box ist daher durch einen 5'-Sequenzanteil gekennzeichnet, der aus der stromaufwärts gelegenen RHD-Box stammt, und der mit einem 3'-Sequenzanteil aus der stromabwärts gelegenen RHD-Box fusioniert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Schnittstellenregion 903 Bp lang. Die Sequenz dieser bevorzugten Hybrid-Rhesus-Box wird in 4 gezeigt. In den spezifischen Ausführungsformen, die in den Beispielen beschrieben werden, befindet sich diese 903 Bp lange Schnittstellenregion in den Rhesus-Boxen in einem 1.463 Bp langen Sequenzbereich mit 99,9% Homologie, der dem menschlichen transponierbaren Element THE-1B und dem repetitiven DNA-Element 12 ähnelt ( 3). Interessanterweise besteht das über 60.000 Bp große DNA-Segment, das in dem RHD-negativen Haplotyp deletiert ist, nur aus bzw. enthält alle Sequenzen, die in dem RHD-positiven Haplotyp dupliziert sind.
  • Die Befunde der vorliegenden Erfindung, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, ermöglichen die Errichtung einer Zahl an leicht durchführbaren oder verfeinerten Verfahren für die Analyse des Genotyps eines Individuums hinsichtlich des RH-Genortes. Beispiele für solche Verfahren werden hierin nachstehend bereitgestellt.
  • Während der molekulare Mechanismus, der zu dem vorherrschenden RHD-negativen Haplotyp führt, nun offensichtlich ist, ist weniger klar, wie das viel ältere Duplikationsereignis zur Struktur der RH-Gene bei RHD-positiven Individuen führte. Die Duplikation der Rhesus-Box und der RH-Gene fand vermutlich in einem einzigen Ereignis statt, weil die Gesamthomologie der beiden Rhesus-Boxen sehr ähnlich zu der der RH-Gene ist. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, ist es verlockend zu spekulieren, dass die RHD-Duplikation in ursächlichem Zusammenhang mit einer doppelten Insertion des nahezu vollständigen Transposon-ähnlichen menschlichen THE-1B-Elements entstand. Zum Zeitpunkt der Duplikation war das offene Leseraster des THE-1B-Elements wahrscheinlich jedoch nicht funktionell.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Nucleinsäuremolekülstruktur für die vorherrschenden RHD-negativen Haplotypen repräsentativ, wie in den anhängigen Ansprüchen definiert wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „ist repräsentativ für" auf eine Nucleinsäuremolekülstruktur, die alle Sequenz- und Struktureigenschaften umfasst, um diese Struktur mit einer Gruppe von Molekülstrukturen in Beziehung zu setzen, die diese Eigenschaften ebenfalls aufweisen. In der vorstehenden bevorzugten Ausführungsform entsteht durch diese Eigenschaften der übliche RHD-negative Haplotyp. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet dies bevorzugt die Deletion des RHD-Gens, die das gesamte RHD-Gen und seine 5'-Region umfasst, die zwischen der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box lokalisiert sind.
  • Im vorliegenden Zusammenhang kann dies zum Beispiel auch bedeuten, dass alle Strukturen, die eine Nonsense-Mutation, Missense-Mutation, Spleißstellen-Mutation, teilweise Deletion, teilweise Insertion, teilweise Inversion oder eine Kombination davon im RHD-Gen enthalten, welche die Expression eines Proteinprodukts des RHD-Gens beenden oder stören, für den RHD-negativen Haplotyp repräsentativ sind.
  • Der Begriff „Haplotyp" betrifft eine Reihe gekoppelter Allele innerhalb einer definierten Region auf einem einzelnen mütterlichen oder väterlichen Chromosom.
  • Der Begriff „üblicher RHD-negativer Haplotyp" bezieht sich auf jeden beliebigen RhD-Antigen-negativen Haplotyp, der eine Hybrid-Rhesus-Box umfasst. Vorzugsweise ist das DNA-Segment deletiert, welches das gesamte RHD-Gen und seine 5'-Region umfasst, die zwischen der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box lokalisiert sind.
  • Die Erfindung betrifft eine als Rhesus-Box bezeichnete Nucleinsäuremolekülstruktur, die die Schnittstellenregion der RHD-Deletion bei den üblichen RHD-negativen Haplotypen flankiert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung beschreibt der Begriff „Schnittstellenregion der RHD-Deletion" ein eindeutiges DNA-Segment, das an einer RHD-Deletion beteiligt ist. Wie vorstehend angemerkt wurde, kann diese Deletion das Ergebnis eines ungleichen Crossing-over-Ereignisses sein, an dem sowohl die stromaufwärts als auch die stromabwärts gelegene Rhesus-Box beteiligt ist, wobei die dazwischen gelegenen Sequenzen deletiert werden, und das schließlich zu einer Nucleinsäuremolekülstruktur führt (die Rhesus-Boxen, auf die Bezug genommen wird, werden zur besseren Unterscheidung von der stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Rhesus-Box auch als Hybrid-Rhesus-Boxen bezeichnet), in der der 5'-Sequenzanteil der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box sich in enger räumlicher Nähe zu dem 3'-Sequenzanteil der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box befindet. Wie vorstehend erwähnt und in den 6 und 3 abgebildet, kann diese Region bevorzugt 903 Bp lang und in einem 1.463 Bp langen Sequenzbereich innerhalb der Rhesus-Boxen lokalisiert sein, wobei in diesem Segment eine Homologie von 99,9% besteht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist diese Region stromabwärts des 903 Bp umfassenden Fragments gelegen, befindet sich aber immer noch innerhalb des 1.463 Bp langen Sequenzbereiches. Dieses Fragment ist bevorzugt 556 bis 560 Bp lang. Die tatsächliche Schnittstelle kann variieren, so dass die Beiträge der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box bei verschiedenen Individuen unterschiedlich sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung liegen die Schnittstellen jedoch in jedem Fall in der stromaufwärts und in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box.
  • Die Hybrid-Rhesus-Box ist für die Analyse von RHD-negativen Haplotypen besonders nützlich. So können zum Beispiel Oligonucleotide verwendet werden, die mit Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, welche die Schnittstelle umfassen, die als Ergebnis der RHD-Deletion entstand. Man wird verstehen, dass solche Oligonucleotide mit einem wesentlichen Anteil hybridisieren müssen, der bevorzugt 20 Nucleotide umfasst, und die 5' und 3' der Region der eigentlichen Schnittstelle lokalisiert ist, um ein Indiz für ein Deletionsereignis darzustellen. Wenn zum Beispiel ein solches Oligonucleotid unter stringenten Bedingungen wie z. B. 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C hybridisiert wird, und die Sonde 943 Nucleotide lang wäre, dann sollte die hybridisierende Region Anteile umfassen, die sowohl 3' als auch 5' der Schnittstelle hybridisieren.
  • Zum Beispiel wird eine Rhesus-Box oder ein Teil davon, die/der die Region der Schnittstelle umspannt, amplifiziert. Anschließend wird das Amplifikationsprodukt in sequenzspezifischer Weise durch Hybridisierung mit einem Oligonucleotid von etwa sechs oder mehr Nucleotiden Länge untersucht.
  • Vorzugsweise wird ein DNA-Sequenzbereich, der eine Rhesus-Box oder einen Teil davon repräsentiert, und die Region der Schnittstelle umfasst, unter Verwendung von zwei Primern amplifiziert. Ein Primer kann in der Rhesus-Box 5' der Identitäts-Region lokalisiert sein und ist sowohl für die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box als auch für die Hybrid-Rhesus-Box spezifisch. Der andere Primer kann in der Rhesus-Box 3' der Identitäts-Region lokalisiert sein und ist sowohl für die stromabwärts gelegene Rhesus-Box als auch für die Hybrid-Rhesus-Box spezifisch. Bei dieser Anwendung ist die Anwesenheit eines Amplifikationsprodukts mit der erwarteten Größe ein Anzeichen für das Vorliegen einer Hybrid-Rhesus-Box und somit einer RHD-Deletion.
  • Eine andere mögliche Kombination der Primer ist folgende: ein Primer kann in der Rhesus-Box 5' der Identitäts-Region lokalisiert sein und ist sowohl für die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box als auch für die Hybrid-Rhesus-Box spezifisch. Der andere Primer kann in der Rhesus-Box 3' der Identitäts-Region lokalisiert sein. Bei dieser Anwendung wird die Anwesenheit einer Hybrid-Rhesus-Box durch die Untersuchung der Spezifität der Teile des Amplifikationsprodukts bestimmt, die zu einem DNA-Sequenzbereich der Rhesus-Box 3' der Identitäts-Region gehören. Dies kann zum Beispiel durch eine Hybridisierung mit einem Oligonucleotid erfolgen, das mit der Hybrid-Rhesus-Box und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box aber nicht mit der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box hybridisiert, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, aber in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, aber in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, oder durch Nucleotid-Sequenzierung.
  • Eine andere mögliche Kombination der Primer ist folgende: ein Primer kann in der Rhesus-Box 5' der Identitäts-Region lokalisiert sein. Der andere Primer kann in der Rhesus-Box 3' der Identitäts-Region lokalisiert sein und ist sowohl für die stromabwärts gelegene Rhesus-Box als auch für die Hybrid-Rhesus-Box spezifisch. Bei dieser Anwendung wird die Anwesenheit einer Hybrid-Rhesus-Box durch die Untersuchung der Spezifität der Teile des Amplifikationsprodukts bestimmt, die zu einem DNA-Sequenzbereich der Rhesus-Box 5' der Identitäts-Region gehören. Dies kann zum Beispiel durch eine Hybridisierung mit einem Nucleotid erfolgen, das mit der Hybrid-Rhesus-Box und der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box aber nicht mit der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box hybridisiert, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, aber in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, aber in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, oder durch Nucleotid-Sequenzierung.
  • Die Hybrid-Rhesus-Box kann auch als diagnostisches Mittel für die Anwesenheit einer RHD-Deletion dienen, wenn sie durch einen Anti-DNA-Antikörper untersucht wird, der für eine oder mehrere Ausführungsformen) der Hybrid-Box oder ein Fragment oder ein Derivat davon spezifisch ist, wie z. B. ein scFvFab- oder ein F(ab')2-Fragment, oder ein Aptamer usw.. Somit können Antikörper, Fragmente oder Derivate davon oder solche Aptamere durch Fachleute entsprechend der herkömmlichen Verfahren erzeugt werden (vergleiche zum Beispiel mit Harlow und Lane, „Antibodies, A Laborstory Manual", CSH Press, 1988, Cold Spring Harbor).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nucleinsäuremolekülstruktur, die für einen RHD-negativen Haplotyp repräsentativ ist, und die eine Deletion des RHD-Gens umfasst, an der die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box, die stromabwärts gelegene Rhesus-Box oder beide beteiligt sind.
  • Eine Nucleinsäuremolekülstruktur, welche die Rhesus-Box in den üblichen RHD-negativen Haplotypen flankiert, kann verwendet werden, um Primer für Amplifikationsreaktionen, wie z. B. eine Long-Range-PCR, für die molekulare Analyse des RHD-Genortes zu entwerfen.
  • Zum Beispiel wird ein DNA-Sequenzbereich, der für eine Rhesus-Box und für Teile ihrer flankierenden Regionen oder für Teile davon, die die Region der Schnittstelle umfassen, repräsentativ ist, unter Verwendung von zwei Primern amplifiziert. Ein Primer kann in der flankierenden 5'-Region der Rhesus-Box lokalisiert sein. Alternativ kann dieser Primer in der Rhesus-Box 5' der Identitäts-Region lokalisiert sein und ist sowohl für die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box als auch für die Hybrid-Rhesus-Box spezifisch. Der andere Primer kann in der flankierenden 3'-Region der Rhesus-Box lokalisiert sein. Alternativ kann dieser Primer in der Rhesus-Box 3' der Identitäts-Region lokalisiert sein und ist sowohl für die stromabwärts gelegene Rhesus-Box als auch für die Hybrid-Rhesus-Box spezifisch. Bei dieser Anwendung ist die Anwesenheit eines Amplifikationsprodukts mit der erwarteten Größe ein Anzeichen für das Vorliegen einer Hybrid-Rhesus-Box und somit einer RHD-Deletion.
  • Eine andere mögliche Kombination der Primer ist die folgende: ein Primer kann in der flankierenden 5'-Region der Rhesus-Box lokalisiert sein. Der andere Primer kann in der Rhesus-Box 3' der Identitäts-Region lokalisiert sein. Bei dieser Anwendung wird die Anwesenheit einer Hybrid-Rhesus-Box durch die Untersuchung der Spezifität der Teile des Amplifikationsprodukts bestimmt, die zu einem DNA-Sequenzbereich der Rhesus-Box 3' der Identitäts-Region gehören. Dies kann zum Beispiel durch eine Hybridisierung mit einem Oligonucleotid erfolgen, das mit der Hybrid-Rhesus-Box und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box aber nicht mit der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box hybridisiert, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, aber in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, aber in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, oder durch Nucleotid-Sequenzierung.
  • Eine andere mögliche Kombination der Primer ist die folgende: ein Primer kann in der Rhesus-Box 5' der Identitäts-Region lokalisiert sein. Der andere Primer kann in der flankierenden 3'-Region der Rhesus-Box lokalisiert sein. Bei dieser Anwendung wird die Anwesenheit einer Hybrid-Rhesus-Box durch die Untersuchung der Spezifität der Teile des Amplifikationsprodukts bestimmt, die zu einem DNA-Sequenzbereich der Rhesus-Box 5' der Identitäts-Region gehören. Dies kann zum Beispiel durch eine Hybridisierung mit einem Oligonucleotid erfolgen, das mit der Hybrid-Rhesus-Box und der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box aber nicht mit der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box hybridisiert, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, aber in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, oder durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym, das in der Hybrid-Rhesus-Box und in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box nicht schneidet, aber in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box schneidet, oder durch Sequenzierung der Nucleotidsequenz.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäuremolekülstruktur für RHD-positive Haplotypen repräsentativ, wie in den anhängigen Ansprüchen definiert wird.
  • Der Begriff „RHD-positiver Haplotyp" bezieht sich auf jeden beliebigen Haplotyp, der DNA-Sequenzen umfasst, die für das RHD-Gen spezifisch sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nucleinsäuremolekülstruktur, die für den üblichen RHD-positiven Haplotyp repräsentativ ist, wie in den anhängigen Ansprüchen definiert wird.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammt die Nucleinsäuremolekülstruktur aus einer Probe, die einen RHD-positiven Haplotyp umfasst, der serologisch als RhD-negativ eingestuft wurde, wie in den anhängigen Ansprüchen definiert wird.
  • In Zusammenhang mit dieser Erfindung beschreibt der Begriff „serologisch als RhD-negativ eingestuft" eine Probe, die auf die Anwesenheit des RhD-Antigens unter Verwendung von z. B. serologischen Routine-Testansätzen untersucht wurde, wobei das Ergebnis dieser Testansätze negativ war.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wurde die als RhD-negativ eingestufte Probe von einer kaukasischen Population erhalten.
  • Vor kurzem wurden verschiedene weitere RHD-positive Allele, die bei RhD-negativen Individuen auftraten, teilweise oder vollständig charakterisiert (Tabelle 9). Drei dieser zehn veröffentlichten RHD-Allele stellten RHD-CE-D-Hybrid-Allele dar, bei denen der RHCE-spezifische Sequenzbereich mindestens die Exons 4 bis 7 umfasste. Zu jedem dieser drei hybriden RHD-Allele wurden Allele gefunden, deren (PCR)-Muster mit ihnen in Einklang standen (Tabelle 9). Von den in dieser Studie beobachteten sieben RhD-negativen Mustern standen sechs im Einklang mit einem solchen Typ eines Hybrid-RHD-Allels. Sieben der zehn veröffentlichten RHD-Allele waren Deletionen, Nonsense-Mutationen oder ein Pseudogen. Keines dieser Allele trat in dieser Untersuchung auf, was möglicherweise bedeutet, dass diese bei Weißen selten vorkommen.
  • In einer weiteren noch stärker bevorzugten Ausführungsform korreliert die Nucleinsäuremolekülstruktur der Erfindung oder eine Nucleinsäure, die von dem RHD-Gen abgeleitet wurde, mit einem RhD-negativen Phänotyp.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für den spezifischen Nachweis eines RHD-negativen Haplotyps in einer Probe, dies erfolgt unter Verwendung einer beliebigen strukturellen Eigenschaft oder einer Nucleotidsequenz oder beiden der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülstruktur oder Kombinationen davon, durch Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, d. h. bevorzugt Amplifikations-Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und noch bevorzugter die PCR-RFLP, die PCR-SSP oder die Long-Range-RCR.
  • Das beschriebene PCR-RFLP- und das Long-Range-PCR-Verfahren verwenden entweder Rhesus-Box-Sequenzen oder die Rhesus-Box flankierenden Sequenzen. Durch die Verwendung der gleichen DNA-Sequenzbereiche oder Kombinationen davon können auch andere Verfahren wie z. B. das PCR-SSO-Verfahren oder Biochips entwickelt oder angewendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für den spezifischen Nachweis eines üblichen RHD-negativen Haplotyps bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Isolierung der DNA aus einer Blutprobe oder aus einer Probe, die von einem Blutspender erhalten wurde;
    • (b) Hybridisierung von mindestens zwei entgegengesetzt ausgerichteten Primern unter stingenten Bedingungen an die DNA, zur Ausführung einer PCR;
    • (c) Amplifikation der Zielsequenz;
    • (d) Auftrennung der Amplifikationsprodukte auf einem Gel; und
    • (e) Analyse der Amplikons.
  • Die Probe kann aus Blut, Serum, Speichel, Fäzes oder anderen Körperflüssigkeiten bestehen oder daraus abgeleitet werden. Die zu analysierende Probe kann behandelt werden, um unter anderem Nucleinsäuren zu extrahieren. Die Isolierung von DNA aus vorzugsweise durch EDTA oder durch Citrat gerinnungsgehemmten Blutproben kann durch modifizierte Aussalzungs-Verfahren durchgeführt werden wie z. B. unter Befolgung eines Standardverfahrens wie es in Gassner, Transfusion 37:1020, 1997 beschrieben wurde. Bei den Primern handelt es sich bevorzugt um Oligonucleotide, die entweder natürlich oder in einem gereinigten Restiktionsverdau vorkommen oder die synthetisch hergestellt werden. Die Primer sind bevorzugt einzelsträngig, um eine maximale Wirksamkeit bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu erreichen, und bevorzugt handelt es sich um Oligodeoxyribonucleotide. Im Allgemeinen wird die Reinigung dieser Primer vor ihrer Verwendung bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung empfohlen, wobei die Reinigung die hochauflösende Flüssigchromatographie (HPLC) oder die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) umfassen kann, und alle diese Verfahren den Fachleuten wohlbekannt sind. Amplifikationsverfahren wie die PCR oder die LCR sind im Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel in Flegel, Transfusion Medicine 8:281-302 (1998); Masskant, Transfusion 38:1015-1021 (1998) und in Legler, Transfusion 36:426-431 (1996) beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung besteht ein bevorzugtes Verfahren für den Nachweis der RHD-Deletion in der Durchführung einer PCR-RFLP unter Verwendung des Expand-High-Fidelity-PCR-Systems und unspezifischen Primern, die 5' des Endes der Rhesus-Box-Identitäts-Region binden, sowie Primern, die für die stromabwärts gelegene Rhesus-Box spezifisch sind, und 3' des Endes der Rhesus-Box-Identitäts-Region binden. Die PCR-Bedingungen umfassen vorzugsweise die Anlagerung bei 65°C und die Verlängerung über 10 Min. bei 68°C. Anschließend werden die PCR-Amplikons 3 Stunden bei 37°C mit PstI verdaut, und die Fragmente werden unter Verwendung eines 1 %-igen Agarosegels aufgetrennt. Weitere bevorzugte Verfahren werden in den Beispielen 8 und 9 näher beschrieben.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren für den spezifischen Nachweis eines üblichen RHD-negativen Haplotyps, das den Nachweis der Hybrid-Rhesus-Box umfasst.
  • Der Nachweis der Hybrid-Rhesus-Box liefert der durchführenden Person ein eindeutiges Ergebnis im Hinblick auf die Natur des entsprechenden RHD-Allels. Wenn die Hybrid-Rhesus-Box nachgewiesen werden kann, ist das RHD-Gen deletiert. Der Nachweis der Hybrid-Rhesus-Box wird bevorzugt durch die Verwendung eines Oligonucleotids durchgeführt, das mit der Region, die die Schnittstelle umfasst, spezifisch hybridisiert. Das für die Hybridisierung verwendete Oligonucleotid muss mit der Schnittstelle direkt hybridisieren und darüber hinaus mit mindestens 943 Nucleotiden 5' und 3' der Schnittstelle hybridisieren. Die Hybridisierung erfolgt bevorzugt unter stringenten Bedingungen wie Z. B. 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Die eigentliche Schnittstelle innerhalb der Hybrid-Rhesus-Box kann aufgrund der exakten Position des Crossing-over-Ereignisses variieren. Dementsprechend kann die Hybrid-Rhesus-Box ebenfalls durch Verwendung einer Reihe überlappender oder nicht überlappender Oligonucleotide, die für die Hybridisierung verwendet werden, nachgewiesen werden. Die Hybrid-Rhesus-Box kann auch unter Verwendung von anderen Vorschriften wie z. B. der Restriktionsanalyse (bevorzugt in Verbindung mit einer Southern-Blot-Analyse) oder von PCR-Verfahren, die hierin vorstehend beschrieben wurden, nachgewiesen werden.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren für den spezifischen Nachweis eines üblichen RHD-negativen Haplotyps, und umfasst eine Untersuchung der Nucleinsäuremolekülstruktur, die die Hybrid-Rhesus-Box und ihre flankierenden Regionen umfasst.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Untersuchung der Nucleinsäuremolekülstruktur Untersuchungsschritte wie z. B. die Gelelektrophorese unter Verwendung entweder von Agarosegelen oder von Polyacrylamidgelen, die Behandlung mit Restriktionsenzymen, Blotting-Verfahren wie Z. B. die Southern- oder die Northern-Blot-Analyse oder verwandte Verfahren wie z. B. einen Fluoreszenz gestützten Nachweis der Hybridisierung und andere Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für den spezifischen Nachweis eines RHD-negativen Haplotyps in einer Probe, das den Schritt des Nachweises einer beliebigen der Schnittstellenregionen umfasst, die in der vorliegenden Erfindung erwähnt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das vorstehend erwähnte Verfahren, in dem der Nachweis oder die Untersuchung die Bestimmung der Länge eines Nucleinsäuremoleküls umfasst, das die Hybrid-Rhesus-Box oder Teile davon enthält.
  • Auch bei dieser bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden Standard-Trennverfahren verwendet wie z. B. die Gelelektrophorese oder die Chromatographie oder die Standardverfahren der Nucleotidsequenzierung, wie sie den Fachleuten bekannt sind. Die vorliegende Erfindung verwendet für diesen Zweck vorzugsweise ein kommerziell erhältliches Sequenzierungs-Kit und ein automatisiertes Sequenzierungs-Gerät von Applied Biosystems (ABI 373A oder ABI 377), wie in Beispiel 5 näher beschrieben wird.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft das vorstehend erwähnte Verfahren, wobei der Nachweis oder die Untersuchung unter Verwendung einer PCR-RFLP, PCR-SSP oder Long-Range-PCR durchgeführt wird, oder unter Verwendung einer Sonde durchgeführt wird, die mit der Hybrid-Rhesus-Box spezifisch hybridisiert, vorzugsweise mit der Schnittstelle oder mit der Schnittstellenregion, die in 3 oder 4 abgebildet ist, oder die mit der stromaufwärts gelegenen oder mit der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box spezifisch hybridisiert, dies erfolgt bevorzugt durch Southern-Blot-Analyse, Gelelektrophorese, Biochip-Analyse, Bestimmung des Molekulargewichts oder durch Fluoreszenz.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „hybridisieren mit/an" auf stringente oder auf nicht stringente Bedingungen. Die Einstellung der Bedingungen ist den Fachleuten wohlbekannt und kann entsprechend Vorschriften bestimmt werden, die zum Beispiel in Sambrook et al. (siehe Literaturreferenzen) oder in Harnes und Higgins, „Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRC Press, Oxford (1985) beschrieben werden. Der Nachweis spezifisch hybridisierender Sequenzen erfordert in der Regel stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie z. B. 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Nicht-stringente Hybridisierungsbedingungen für den Nachweis von homologen und nicht exakt komplementären Sequenzen können durch 6 × SSC, 1% SDS bei 50°C oder bei 65°C eingestellt werden. Wie bekannt ist, stellen die Länge der Sonde und die Zusammensetzung der Nucleinsäure, die bestimmt werden soll, weitere Parameter für die Hybridisierungsbedingungen dar.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der die Nucleinsäuremolekülstruktur der Erfindung enthält.
  • Der Vektor kann für die Vermehrung und/oder die Expression verwendet werden, oder er kann für die Genübertragung oder für zielgesteuerte Anwendungen verwendet werden. Verfahren für die Herstellung solcher Vektoren sind im Fachgebiet wohlbekannt. Das Gleiche gilt für die Clonierung der Nucleinsäuren mit der Mutation in diese Vektoren sowie für die Vermehrung solcher Vektoren in geeigneten Wirten, usw.
  • Bei dem Vektor kann es sich insbesondere um ein Plasmid, ein Cosmid, ein Virus oder einen Bakteriophagen handeln, die üblicherweise bei den gentechnischen Verfahren verwendet werden, die das Nucleinsäuremolekül der Erfindung umfassen. Expressionsvektoren, die von Viren abstammen, wie z. B. von Retroviren, dem Vaccinia-Virus, dem Adeno-assoziierten Virus, Herpes-Viren oder dem Rinder-Papillom-Virus, können für die Anlieferung der Nucleinsäuremoleküle oder des Vektors der Erfindung in angezielte Zellpopulationen verwendet werden. Verfahren, die den Fachleuten wohlbekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante virale Vektoren zu konstruieren; vergleiche zum Beispiel mit den Verfahren, die in: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y (1989) und in: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989) beschrieben werden. Alternativ können die Polynucleotide und die Vektoren der Erfindung in Liposomen für die Zuführung zu Zielzellen rekonstituiert werden. Die Vektoren, die die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung enthalten, können in die Wirtszelle durch wohlbekannte Verfahren übertragen werden, die in Abhängigkeit von der Natur des zellulären Wirts variieren können. Für prokaryontische Zellen wird zum Beispiel üblicherweise die Calciumchlorid-Transfektion verwendet, während die Behandlung mit Calciumphosphat oder die Elektroporation für andere zelluläre Wirte verwendet werden; vergleiche mit Sambrook et al. vorstehend.
  • Solche Vektoren können weitere Gene enthalten wie z. B. Markergene, die eine Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen erlauben. Das Nucleinsäuremolekül der Erfindung wird mit den Expressions-Kontrollsequenzen funktionell verknüpft, um eine Expression in prokaryontischen oder in eukaryontischen Wirtszellen zu ermöglichen. Die Expression des Polynucleotids umfasst die Transkription des Polynucleotids in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Zellen sicherstellen, vorzugsweise in Säugerzellen, sind den Fachleuten wohlbekannt. Sie umfassen in der Regel regulatorische Sequenzen, welche die Initiation der Transkription sicherstellen und wahlweise PolyA-Signale, die ein Ende der Transkription und die Stabilisierung des Transkripts absichern. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- sowie Translations-Enhancer und/oder natürlicherweise assoziierte oder auch heterologe Promotorregionen umfassen. Mögliche regulatorische Elemente, welche die Expression in prokaryontischen Wirtszellen erlauben, umfassen z. B. den PL-, lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli, und Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Wirtszellen erlauben, sind der AOX1- oder der GAL1-Promotor in der Hefe oder der CMV-, der SV40-, der RSV-(Rous-Sarkom-Virus) Promotor, der CMV-Enhancer, der SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säuger- oder in anderen tierischen Zellen. Neben den Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente auch Transkriptions-Terminations-Signale stromabwärts des Nucleinsäuremoleküls umfassen wie z. B. die SV40-polyA-Stelle oder die tk-polyA-Stelle. Des Weiteren können in Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionssystem Leader-Sequenzen, die in der Lage sind, das Polypeptid in ein zelluläres Kompartiment zu dirigieren oder es zur Sekretion in das Medium veranlassen, an die codierende Sequenz des Polynucleotids der Erfindung angefügt werden. Solche Sequenzen sind den Fachleuten wohlbekannt. Die Leader-Sequenz(en) ist (werden) im geeigneten Leseraster mit den Translations-, Initiations- und Terminations-Sequenzen angefügt und bevorzugt wird eine Leader-Sequenz verwendet, die in der Lage ist, die Sekretion des translatierten Proteins oder eines Teil davon in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium zu steuern. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionprotein codieren, einschließlich eines C- oder N-terminalen Peptids für die Identifizierung, das gewünschte Eigenschaften verleiht wie z. B. Stabilität oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts. In diesem Zusammenhang sind geeignete Expressionsvektoren im Fachgebiet bekannt, wie z. B. der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) oder pSPORT1 (GIBCO BRL).
  • Bevorzugt handelt es sich bei den Expressions-Kontrollsequenzen um eukaryontische Promotorsysteme in Vektoren, die in der Lage sind, eukaryontische Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren, aber Kontrollsequenzen für prokaryontische Wirte können ebenfalls verwendet werden.
  • Wie vorstehend erwähnt, kann der Vektor der vorliegenden Erfindung auch ein Genübertragungsvektor oder ein Vektor für eine gezielte Zuführung sein. Die Gentherapie, die auf der Einbringung von therapeutischen Genen in die Zelle durch ex vivo- oder in vivo-Verfahren basiert, ist eine der wichtigsten Anwendungen der Genübertragung. Geeignete Vektoren für die in vitro- oder die in vivo-Gentherapie werden in der Literatur beschrieben und sind den Fachleuten bekannt; vergleiche z. B. mit Giordano, Nature Medicine 2:534-539 (1996); Schaper, Circ. Res. 79:911-919 (1996); Anderson, Science 256:808-813 (1992); Isner, Lancet 348:370-374 (1996); Muhlhauser, Circ. Res. 77:1077-1086 (1995); Wang, Nature Medicine 2:714-716 (1996); WO 94/29469 ; WO 97/000957 oder mit Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7:635-640 (1995) und den darin zitierten Literaturreferenzen. Die Polynucleotide und die Vektoren der Erfindung können für die direkte Einbringung oder für eine Einbringung über Liposomen oder virale Vektoren (z. B. adenoviral, retroviral) in die Zelle entworfen werden.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung einen nicht-menschlichen Wirt, der mit dem Vektor der Erfindung transformiert ist.
  • Geeignete Wirte umfassen transgene Tiere, Zellen wie z. B. Bakterien- oder Hefe-Zellen; Tier-Zellen, wobei Säugerzellen bevorzugt werden, Pilzzellen oder Insektenzellen. Die Transformationsverfahren umfassen Transfektion, Mikroinjektion, Elektroporation, usw. und sind den Fachleuten ebenfalls bekannt.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Oligonucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem Teil der Nucleinsäuremolekülstruktur oder den Nucleinsäuremolekülen der Erfindung hybridisiert, wobei die Region mit einer Schnittstelle der Gen-Konversion hybridisiert, wie sie in den anhängigen Ansprüchen charakterisiert wird.
  • Bei dieser Ausführungsform der Erfindung bedeutet dies, dass die Oligonucleotide mit der Schnittstelle direkt hybridisieren. Die Einstellung der stringenten Hybridisierungsbedingungen ist gut beschrieben wie zum Beispiel in: Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) oder in: Harnes und Higgins, „Nucleic acid hybridization, A practical approach", IRL Press, Oxford (1985). Daher wird der Nachweis der spezifisch hybridisierenden Sequenzen Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie z. B. 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C erfordern. Wie bekannt ist, stellen die Länge der Sonde und die Zusammensetzung der Nucleinsäure, die bestimmt werden soll, weitere Parameter für die stringenten Hybridisierungsbedingungen dar. Bei dem Oligonucleotid handelt es sich bevorzugt um ein Deoxynucleotid. Weiterhin wird bevorzugt, dass das Oligonucleotid 12 bis 50 Nucleotide und noch stärker bevorzugt, dass es 15 bis 24 Nucleotide umfasst. Die Hybridisierung an der Schnittstelle kann unter stringenten oder unter nicht stringenten Bedingungen erfolgen. Ein Beispiel für nicht stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung und Waschung bei 50°C mit 4 × SSC, 0,1% SDS.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Untersuchung des Vorliegens eines Nucleinsäuremoleküls, das ein mutiertes Rhesus D-Antigen enthält, oder eines Nucleinsäuremoleküls, das eine Deletion des RHD-Gens codiert, wie sie durch die Nucleinsäuremolekülstruktur oder das Nucleinsäuremolekül der Erfindung charakterisiert ist, in einer Probe, umfassend die Hybridisierung des Oligonucleotids der Erfindung unter stringenten Bedingungen mit Nucleinsäuremolekülen, die in der Probe enthalten sind, welche aus einem Menschen erhalten wurde, und den Nachweis der Hybridisierung.
  • Das Verfahren der Erfindung umfasst weiterhin bevorzugt den Verdau des Produkts dieser Hybridisierung mit einer Restriktionsendonuclease oder das Unterwerfen des Produkts dieser Hybridisierung dem Verdau mit einer Restriktionsendonuclease und die Analyse der Produkte dieses Verdaus.
  • Diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erlaubt durch bequeme Mittel die Unterscheidung zwischen einer erfolgreichen und einer nicht erfolgreichen Hybridisierung. Wenn zum Beispiel das Wildtyp-RHD-Gen eine Endonuclease-Restriktions-Schnittstelle enthält, ist eine Spaltung des hybridisierten Produkts durch ein geeignetes Restriktionsenzym möglich, wohingegen eine mutierte Sequenz kein doppelsträngiges Produkt liefern wird oder keine erkennbare Restriktions-Schnittstelle enthalten wird, und dementsprechend nicht gespalten werden kann. Die Analyse der Verdauprodukte kann durch herkömmliche Verfahren durchgeführt werden wie z. B. durch Gelelektrophorese, die wahlweise mit der Anfärbung der Nucleinsäure zum Beispiel mit Ethidiumbromid kombiniert werden kann. Kombinationen mit weiteren Verfahren wie z. B. der Southern-Blot-Analyse kommen ebenfalls in Betracht.
  • Der Nachweis der Hybridisierung kann zum Beispiel durch einen Antikörper gegen doppelsträngige DNA oder durch die Verwendung eines markierten Oligonucleotids erfolgen. Am bequemsten wird das Verfahren der Erfindung zusammen mit Blot-Verfahren wie z. B. der Southern- oder der Northern-Blot-Analyse und verwandten Verfahren angewendet. Die Markierung kann zum Beispiel nach Standardvorschriften erfolgen und umfasst die Markierung mit einer radioaktiven, Fluoreszenz-, Phosphoreszenz-, Chemilumineszenz- oder enzymatischen Markierung, usw.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren für die Untersuchung auf die Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls, das ein mutiertes Rhesus D-Antigen codiert, oder eines Nucleinsäuremoleküls, das eine Deletion des RHD-Gen enthält, wie sie durch die Nucleinsäuremolekülstruktur oder das Nucleinsäuremoleküle der Erfindung charakterisiert ist, in einer Probe, umfassend die Bestimmung der Nucleinsäuresequenz mindestens eines Teils der Nucleinsäuremolekülstruktur der Erfindung, wobei dieser Teil eine Schnittstelle des Hybrid-Gens codiert.
  • Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung weiterhin, vor der Bestimmung dieser Nucleinsäuresequenz, die Amplifikation mindestens eines Teils der Nucleinsäuremolekülstruktur.
  • Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren für eine Untersuchung auf die Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls, das eine Deletion des RHD-Gens enthält, wie sie durch die Nucleinsäuremolekülstruktur der Erfindung charakterisiert ist, in einer Probe, umfassend die Durchführung einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Primersatzes, der mindestens einen Teil der Sequenz amplifiziert, wobei mindestens einer der Primer, der bei dieser Amplifikationsreaktion verwendet wird, ein Oligonucleotid ist, wie es in den anhängigen Ansprüchen definiert wird.
  • Die Amplifikation erfolgt bevorzugt durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Andere Amplifikationsverfahren wie z. B. die Ligase-Kettenreaktion können ebenfalls verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der PCR um eine PCR-RFLP, PCR-SSP oder um eine Longe-Range-PCR.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Molekulargewicht des Amplifikationsprodukts analysiert. Bei einer solchen Analyse des Molekulargewichts werden für diesen Zweck Standardverfahren verwendet wie z. B. Agarose-Gelektrophorese, SDS-PAGE oder Massenspektrometrie wie z. B. MALDI-TOF, die den Fachleuten wohlbekannt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das RHD-positive Allele spezifisch nachweist, und das die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Isolierung der DNA aus einer Blutprobe oder aus einer Probe, die von einem Blutspender erhalten wurde;
    • (b) Hybridisierung von mindestens zwei entgegengesetzt orientieren Primern unter stringenten Bedingungen an die DNA, so dass eine PCR durchgeführt werden kann;
    • (c) Amplifikation der Zielsequenz;
    • (d) Auftrennung der Amplifikationsprodukte auf einem Gel; und
    • (e) Analyse der Amplikons.
  • Bezüglich der spezifischen Bedingungen, die bei den verschiedenen Schritten angewendet werden, wird auf die entsprechende Beschreibung hierin vorstehend verwiesen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die RHD-positiven Allele aus einer serologisch RhD-negativen Population. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die RhD-negative Probe von einer kaukasischen Population erhalten.
  • Bei dem Verfahren der Erfindung erfolgt die Amplifikation oder die Amplifikationsreaktion bevorzugt durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Andere Amplifikationsverfahren wie z. B. die Ligase-Kettenreaktion können ebenfalls verwendet werden.
  • Bei dem Verfahren der Erfindung handelt es sich bei der Probe bevorzugt um Blut, Serum, Plasma, fötales Gewebe, Speichel, Urin, Schleimhautgewebe, Schleim, vaginales Gewebe, fötales Gewebe, das aus der Vagina, der Haut, einem Haar, einem Haarfollikel oder einem anderen menschlichen Gewebe erhalten wurde.
  • Das Verfahren der Erfindung umfasst weiterhin bevorzugt den Schritt der Anreicherung von fötalen Zellen. Diese Anreicherung kann durch Verwendung geeigneter Antikörper, Lectine oder anderer Reagenzien erfolgen, die fötale Zelle spezifisch binden, oder durch ein beliebiges anderes Verfahren, durch das eine Trennung der mütterlichen und der fötalen Zellen erreicht werden kann, wie z. B. durch Dichtegradienten. Bei diesem Verfahren kann die fötale DNA oder mRNA aus mütterlichen Geweben wie Z. B. peripherem Blut, Serum oder Plasma ebenfalls bevorzugt extrahiert werden, dies erfolgt vorzugsweise gemäß herkömmlicher Verfahren.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird das Nucleinsäuremolekül oder das Proteinmaterial aus der Probe auf einem festen Träger fixiert.
  • Bei diesem Träger handelt es sich bevorzugt um einen Chip.
  • Die Vorteile von Chips sind im Fachgebiet wohlbekannt und brauchen hierin nicht in Einzelheiten diskutiert zu werden. Sie umfassen die geringe Größe sowie den leichten Zugang für eine Computer-basierte Analyse der Analyten.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Nucleinsäuremolekülstruktur der Erfindung für die Analyse eines negativen oder eines positiven Rhesus D-Phänotyps.
  • Die Analyse kann zum Beispiel auf Grundlage der hierin vorstehend beschriebenen Verfahren erfolgen.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, um zu bestimmen, ob einem Patienten, der eine Bluttransfusion benötigt, RhD-negatives Blut eines Spenders übertragen werden muss, umfassend den Schritt der Untersuchung einer Probe aus diesem Patienten auf die Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleinsäuremolekülstruktur(en) der Erfindung, wobei ein positives Untersuchungsergebnis für zwei unterschiedliche Nucleinsäuremolekülstrukturen oder Nucleinsäuremoleküle ein Indiz dafür ist, dass die Transfusion mit RhD-negativem Blut vorgenommen werden muss. Alternativ ist ein positives Untersuchungsergebnis für das gleichzeitige Vorliegen von zwei identischen Kopien der Nucleinsäuremolekülstruktur oder des Nucleinsäuremoleküls ein Indiz dafür, dass eine Transfusion mit RhD-negativem Blut vorgenommen werden muss.
  • Alternativ erlaubt ein negatives Untersuchungsergebnis bezüglich der Anwesenheit der Nucleinsäuremolekülstruktur, die den üblichen RHD-negativen Haplotyp repräsentiert, mit oder ohne einem negativen Untersuchungsergebnis für eine oder mehrere Nucleinsäuremolekülstruktur(en), die die anderen RHD-negativen Nucleinsäuremolekülstrukturen dieser Erfindung repräsentieren, eine Transfusion mit Blut, das als RhD-positiv typisiert wurde. Die Erfindung hat wichtige Auswirkungen für die Planung einer Transfusionstherapie beim Menschen. So kann nun zum Beispiel bequem untersucht werden, ob der Patient tatsächlich eine Transfusion mit RhD-negativem Blut benötigt, oder ob eine solche Vorsichtsmaßnahme nicht ergriffen werden muss.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, um zu bestimmen, ob das Blut eines Spenders für eine Transfusion bei einem Patienten, der sie benötigt, verwendet werden kann, umfassend den Schritt der Untersuchung einer Probe aus dem Spender auf die Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleinsäuremolekülstruktur(en) der Erfindung, wobei ein negatives Untersuchungsergebnis für die Nucleinsäuremolekülstrukturen, die den üblichen RHD-negativen Haplotyp repräsentieren, mit oder ohne einem negativen Untersuchungsergebnis für eine oder mehrere andere Nucleinsäuremolekülstruktur(en) oder Nucleinsäuremoleküle, die die anderen RHD-negativen Haplotypen dieser Erfindung repräsentieren, eine Transfusion des Spenderblutes an einen Patienten, der als RhD-negativ typisiert wurde, ausschließt.
  • Bei den Proben, auf die sich in den vorstehend erwähnten Verfahren bezogen wurde, kann es sich um Proben handeln, auf die sich in dieser Beschreibung durchgängig bezogen wird, wie z. B. Blut, Serum, usw.
  • Hinsichtlich der Richtlinien für die Transfusion eines Patienten auf Grundlage eines beliebigen der vorstehend erwähnten Verfahren, müssen die größtmöglichsten Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, so dass eine suboptimale Transfusionsmethode vermieden wird. Der Risikofaktor muss durch den behandelnden Arzt immer berücksichtigt werden. In jedem Fall ist das Risiko für den Patienten zu minimieren.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, um das Risiko einer RhD-negativen Mutter für die Empfängnis oder die Austragung eines RhD-positiven Fötus zu bestimmen, oder um das Risiko einer Mutter zu bestimmen, die einen Anti-D-Titer aufweist, einen Fötus zu empfangen oder auszutragen, der das Risiko aufweist, eine hämolytische Erkrankung des Neugeborenen zu entwickeln, umfassend den Schritt der Untersuchung einer Probe, die von dem Vater des Fötus erhalten wurde, auf die Anwesenheit einer oder mehrere der Nucleinsäuremolekülstruktur(en) oder Nucleinsäuremoleküle, der Erfindung, wobei ein negatives Untersuchungsergebnis für die Nucleinsäuremolekülstruktur(en) oder die Nucleinsäuremoleküle, die den üblichen RHD-negativen Haplotyp repräsentieren, mit oder ohne einem negativen Untersuchungsergebnis für eine oder mehrere Nucleinsäuremolekülstruktur(en) oder Nucleinsäuremoleküle, die die anderen RHD-negativen Haplotypen dieser Erfindung repräsentieren, ein Indiz für ein hohes Risiko für die Empfängnis eines RhD-positiven Fötus darstellt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung enthält die Nucleinsäuremolekülstruktur Mutationen oder Deletionen.
  • Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Untersuchung der Möglichkeit oder der Wahrscheinlichkeit eines Mannes, der Vater eines Kindes zu sein, und zwar durch die Untersuchung einer Probe, die von diesem Mann erhalten wurde, auf die Anwesenheit einer oder mehrere der Nucleinsäuremolekülstruktur(en) der Erfindung, wobei die Untersuchungsergebnisse verwendet werden, um Homozygotie, Heterozygotie oder die Abwesenheit einer beliebigen der Nucleinsäuremolekülstrukturen, die für den RHD-negativen Haplotyp der vorliegenden Erfindung repräsentativ sind, zu bestimmen, und wobei das Ergebnis dann dazu verwendet wird, um auf die Möglichkeit oder die Wahrscheinlichkeit dieses Mannes, der Vater des Kindes zu sein, zu schließen.
  • Somit und in Zusammenfassung stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Mittel für den Nachweis von RHD-Haplotypen bereit, umfassend die üblichen RHD-negative Haplotypen wie vorstehend beschrieben sowie die vermutlich seltenen RHD-positiven Allele in serologisch RhD-negativen Populationen. Diese RHD-positiven Allele, die RHD-Sequenzen enthalten und daher als RHD-positiv bestimmt wurden, können entweder RHD/RHCE-Hybridgene, Stopp-Codons, Spleißstellen-Mutationen oder Gendeletionen umfassen, die die Expression des RhD-Antigens beenden oder vermindern. Bei der Durchführung der verbesserten Nachweisverfahren der Erfindung wurde überraschenderweise herausgefunden, dass mehrere Proben, die als RhD-negativ bei serologischen Routineuntersuchungen bestimmt worden waren, RHD-positive Allele enthielten. Darüber hinaus waren einige dieser Proben sogar dann für das RhD-Antigen positiv, wenn ein Nachweis-Testansatz durchgeführt wurde, der auf Adsorption und Flution basierte, was bedeutet, dass die molekulare Basis (Ursache) der RHD-positiven Allele in RhD-negativen Individuen heterogener ist, als bisher angenommen wurde. Der offenbarte Inhalt der vorliegenden Erfindung stellt nun in vorteilhafter Weise neue und leicht durchführbare Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren bereit, um zu bestimmen, ob eine RHD-spezifische Sequenz einen RhD-positiven oder einen RhD-negativen Phänotyp verursacht.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff „Polymorphismus" das Vorliegen von mehr als einer genetischen Struktur oder eines Gens eines Haplotyps oder eines DNA-Segments in einer Population. Dennoch führt ein solcher genetischer Polymorphismus nicht immer zu einem unterschiedlichen Phänotyp, sondern kann nur auf genetischer Ebene nachgewiesen werden.
  • Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Kit, umfassend:
    • (a) das Oligonucleotid der Erfindung; und/oder
    • (b) ein Primerpaar, das zur Durchführung der Amplifikationsreaktion der Erfindung nützlich ist.
  • Die Teile des Kits können individuell in Gefäßen oder in Kombination in Behältern oder Mehrfach-Behältern verpackt sein. Das Kit der vorliegenden Erfindung kann in vorteilhafter Weise für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendet werden und kann unter anderem bei einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, auf die vorstehend Bezug genommen wurde. Die Herstellung der Kits erfolgt bevorzugt nach Standardverfahren, die den Fachleuten bekannt sind.
  • Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines Oligonucleotids für eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit einem Teil der Nucleinsäuremolekülstruktur der Erfindung, wobei der Teil mit einer Region hybridisiert, welche die Schnittstelle eines Hybridgens umfasst, oder mit dem komplementären Teil davon, wobei die Region, welche die Schnittstelle umfasst, dadurch gekennzeichnet ist, dass der 5'-Anteil der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box in enger räumlicher Nähe zu dem 3'-Anteil der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box vorliegt.
  • Die Figuren zeigen:
  • 1
  • Schematische Struktur des RH-Genortes. Die Positionen und die Orientierungen der Gene und die Rhesus-Boxen sind durch nicht ausgefüllte Pfeile beziehungsweise durch Dreiecke angezeigt (Teilabbildung A). Die Exons werden als vertikale Balken gezeigt und die Nummern der Exons sind angegeben. Die beiden RH-Gene liegen in entgegen gesetzter Orientierung vor, wobei die 3'-Enden einander gegenüber liegen und durch etwa 30.000 Bp getrennt sind. Ein drittes Gen, SMP1, besitzt die gleiche Orientierung wie RHD und liegt zwischen RHD und RHCE. Das RHD-Gen wird auf beiden Seiten durch die beiden hoch homologen Rhesus-Boxen (b) flankiert. Alle Exons sind kürzer als 200 Bp mit Ausnahme der 3'-terminalen Exons von RHD und SMP1. Die Daten, die verwendet wurden, um diese Struktur zu erstellen (Teilabbildung B), umfassen die Verlängerung von genomischen Sequenzen, die in den cDNAs repräsentiert sind (horizontale Pfeile), sowie die Identität und die Homologie mit genomischen Clonen (Balken a: Identität mit dJ465N24; b: Homologie von RHD zu dJ469D22; c: Homologie des 3'-Teils von RHD zu dJ465N24; d: Identität mit dJ469D22). Die Positionen der drei überbrückenden PCR-Reaktionen sind angegeben. Die genaue Position eines Nucleotid-Sequenzbereichs, der bereits von Okuda et al. (Okuda, Biochem. Biophys. Res. Commun. 263:378, 1999) als „Spacer"-Sequenz zwischen RHD und RHCE veröffentlicht wurde, ist durch den mit s markierten Balken angegeben.
  • 2
  • Chromosomale Organisation der DNA-Regionen, die 5' des RHD- und des RHCE-Gens lokalisiert sind. Die vorgeschlagenen Strukturen der 5'-flankierenden Regionen von RHCE und RHD sind abgebildet (Teilabbildung A). Insgesamt sind 4.941 Bp direkt 5' des ATG-Startcodons zwischen dem RHCE- und dem RHD-Gen homolog (vertikal schraffierte Balken). Hinter dieser Region der Homologie ist keine Homologie vorhanden (diagonal schraffierte Balken). Für die Konstruktion der Primer wurden die beiden genomischen Clone dJ469D22 und dJ465N24 verwendet. DJ469D22 umfasst die volle Länge der abgebildeten RHCE-Region, wohingegen dJ465N24 sich nur 466 Bp in die Homologie-Region erstreckt. Die Positionen mehrerer PCR-Primer sind angegeben (a, rey14a; b, rend32; c, rey15a; d, re014; e, re011d). Diese vorgeschlagene Struktur wird durch mehrere PCR-Reaktionen gestützt (Teilabbildung B). Die Vorwärts-Reaktionen erfolgten mit Primer a (RHCE-spezifisch, Bahn 1-3), Primer b (RHD-spezifisch, Bahn 4-6) und Primer c (RHCE- und RHD-Homologie-Region, Bahn 7-9). Es wurden keine Amplikons erhalten für Primer a mit dem RHD-spezifischen reversen Primer e (Bahn 2) und für Primer b mit RHD-negativer DNA (Bahn 6). Die anderen sieben PCR-Reaktionen ergaben Amplikons in den vorhergesagten Größen entsprechend der in Teilabbildung A gezeigten genomischen Struktur.
  • 3
  • Chromosomale Organisation der Rhesus-Boxen. Die physikalische Ausdehnung der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box (5' relativ zu RHD) beträgt 9.145 bp (schwarzer Balken). Etwa 63% der Nucleotidsequenz der Box besteht aus repetitiver DNA; die Arten der Wiederholungssequenz-(repeat) Familien sind angegeben. Die Gesamt-Homologie zwischen der stromaufwärts und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box beträgt 98,6%, aber innerhalb einer 1.463 Bp großen Identitäts-Region (horizontale Pfeile) gibt es nur eine einzige Insertion von 4 Bp (doppelte vertikale Linie). Eine CpG-Insel (doppelköpfiger Pfeil) befindet sich am 3'-Ende und liegt in der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box (3' relativ zu RHD) dem SMP1-Promotor benachbart.
  • 4
  • Die RHD-Gen-Deletion bei Rh-negativen Haplotypen. Es werden drei 3.100 Bp lange Segmente der Rhesus-Boxen gezeigt. Die obere Linie gibt die Nucleotidsequenz der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box bei D-positiven Individuen an und die untere Linie die Nucleotidsequenz der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box bei D-positiven Individuen. Die mittlere Linie zeigt die Nucleotidsequenz der einzigen Rhesus-Box, die bei Rh-negativen Individuen vorliegt. Sternchen bezeichnen identische Nucleotide. Die RHD-Deletion tritt in einem 903 Bp langen Segment mit vollständiger Identität auf, das Teil der 1.463 Bp langen Identitäts-Region ist. Die Positionen der Primer rez7 und mb31 sind angegeben (m bezeichnet eine Fehlpaarung). PstI-Restriktions-Schnittstellen sind durch Winkelzeichen (^) angegeben. Die drei Rhesus-Boxen wurden bei EMBL unter den Zugangsnummern AJ252311 (stromaufwärts gelegene Rhesus-Box), AJ252312 (stromabwärts gelegene Rhesus-Box), und AJ252313 (Hybrid-Rhesus-Box) hinterlegt.
  • 5
  • Zwei technische Verfahren für den spezifischen Nachweis der RHD-Deletion bei den üblichen RHD-negativen Haplotypen. Es wird eine Long-Range-PCR-Amplifikation mit Primern, die nicht in den Rhesus-Box-Sequenzen lokalisiert sind (Teilabbildung A), und eine PCR-RFLP mit Primern, die in den Rhesus-Boxen lokalisiert sind (Teilabbildung B), gezeigt. Die abgeleiteten Genotypen sind angegeben. Die Primer der Long-Range-PCR lagen 5' der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box (Primer rez4) und im Exon 1 des SMP1-Gens (Primer sr9). RHD-negative Haplotypen wurden spezifisch nachgewiesen (Teilabbildung A, Bahn 1-6). DNA, die für das RHD-Gen homozygot war, war negativ, weil die PCR den 70.000 Bp großen DNA-Sequenzbereich des RHD-Gens nicht amplifizieren kann. Bei dem PCR-RFLP-Verfahren wurden die PCR-Amplikons (Primer rez7 und mb31) mit PstI verdaut. Bei D-negativen liegen in dem Amplikon drei PstI-Schnittstellen vor (vergleiche mit 4), die zu Fragmenten mit Längen von 1.888 Bp, 564 Bp, 397 Bp und 179 Bp führen (Bahn 1 bis 3). Der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box von D-positiven Individuen fehlt eine PstI-Schnittstelle, was zu Fragmenten mit Längen von 1.888 Bp, 774 Bp und 397 Bp führt (Bahn 7 bis 9). Heterozygote RHD+/RHD--Individuen weisen sowohl Fragmente von 744 Bp als auch von 564 Bp auf (Bahn 4 bis 6). Das 564 Bp große Fragment erscheint schwächer, da Heterodimere durch PstI nicht geschnitten werden. Mit dem Primer mb31 kann die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box von D-positiven Individuen nicht amplifiziert werden.
  • 6
  • Modell des vorgeschlagenen Mechanismus, der die vorherrschenden RHD-negativen Haplotypen bei Weißen verursacht. Die physikalische Struktur des RHD- und des RHCE-Genortes ist abgebildet (Teilabbildung A). Ein ungleiches Crossing over zwischen der stromaufwärts und der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box kann durch ihre hohe Homologie ausgelöst werden (Teilabbildung B). Es wurde herausgefunden, dass die Schnittstellen-Region(en) in den Rhesus-Boxen im Bereich des 903 Bp großen Sequenzabschnittes 100% identisch sind (vergleiche mit 4). Die Trennung der überkreuzten (neu rekombinierten) Chromosomen ergibt die RHD-Genstruktur des bestehenden RHD-negativen Haplotyps (Teilabbildung C).
  • 7
  • DNA-Sequenz der Hybrid-Rhesus-Box bei RHD-negativen Individuen.
  • 8
  • DNA-Sequenz der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box bei D-positiven Individuen.
  • 9
  • DNA-Sequenz der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box bei D-positiven Individuen.
  • Die Beispiele erläutern die Erfindung:
  • Beispiel 1: Blutproben und Isolierung der DNA
  • Durch EDTA oder Citrat in der Gerinnung gehemmte Blutproben wurden von weißen Blutspendern gesammelt und als D-negativ bei einer Routine-Typisierung charakterisiert, welche einen Antiglobulin-Test mit einem Anti-D umfasst (Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer, Paul-Ehrlich-Institut; Richtlinien zur Blutgruppenbestimmung und Bluttransfusion (Hämotherapie). Köln: Deutscher Ärzte-Verlag, 1996; Wagner, Infusionsther. Transfusionsmed. 22:285-290, 1995). Wenn nötig, wurden die Proben zufällig nach spezifischen CcEe-Phänotypen gesammelt. Insgesamt wurden 314 ccddee-, 433 Ccddee-, 271 ccddEe-, 19 CcddEe, 24 CCddee-, 1 CcddEE- und 6 ccddEE-Proben untersucht. Die DNA wurde nach einem modifizierten Aussalzungs-Verfahren isoliert, wie es in Gassner et al., Tranfusion 37:1020, 1997 beschrieben wird.
  • Beispiel 2: Molekulare Charakterisierung
  • Alle Proben wurden mittels PCR-RFLP auf die Anwesenheit von vier unterschiedlichen RHD-spezifischen Polymorphismen hin untersucht, die im RHD-Promotor, in Intron 4, in Exon 7 und in der nicht translatierten 3'-Region des Exons 10 lokalisiert sind. Es wurden 48 Proben mit mindestens einer positiven PCR-Reaktion nachgewiesen (Tabelle 5). Diese Proben wurde weiter auf die Anwesenheit von RHD-spezifischen Polymorphismen im Exon 3, Exon 4, Exon 5, Exon 6, Exon 7, Intron 7 und Exon 9 hin untersucht. 26 Proben wiesen eines von acht distinkten PCR-Mustern in einem Gemisch von positiven und negativen Reaktionen auf (Tabelle 6). 22 Proben waren für alle untersuchten RHD-spezifischen Polymorphismen positiv und wurden acht RHD-Allelen zugeordnet, dies erfolgte durch eine RHD-spezifische Sequenzierung der zehn RHD-Exons aus der genomischen DNA (Tabelle 7). Für jedes PCR-Muster und jedes RHD-Allel wurde eine Probe serologisch untersucht. Dabei wurde durch Adsorption/Flution bestimmt, dass die Phänotypen schwach D, teilweise D und Del repräsentierten, oder (die Proben) wurden serologisch als D-negativ bestätigt (Tabelle 6 und 7).
  • Beispiel 3: Suche in DNA-Datenbanken und Analyse
  • Die GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) und die Chromosom 1-Datenbank des Sanger-Zentrums (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/nph-Blast_Server.html) wurden unter Verwendung des BLAST-Programmes mit cDNA-Sequenzen durchsucht, die für RHD (RhXIII, Zugangs-Nummer X63097) und RHCE (RhVI, Zugangs-Nummer X63095) repräsentativ waren. Dabei wurden der 84.810 Bp lange genomische Clon dJ469D22 (GenBank-Zugangs-Nummer AL031284), der 129.747 Bp lange genomische Clon dJ465N24 (GenBank-Zugangs-Nummer AL031432) und die 2.2345 Bp lange SMP1-cDNA (GenBank-Zugangs-Nummer AF081282) identifiziert. dJ469D22 stellt ein Hauptfragment des RHCE-Gens dar, das 33.340 Bp 5' des RHCE-Startcodons beginnt und 1.142 Bp 3' des Exons 9 endet. In dJ465N24 ist ein interner Sequenzabschnitt mit einer Länge von 1.418 Bp, der zwischen Position 120.158 und 121.568 lokalisiert ist, zu 96% mit dem 3'-Ende der RHD-cDNA homolog. Das 3'-Ende der SMP1-cDNA ist zu dem 3'-Ende der RHCE-cDNA in einem überlappenden Bereich von 58 Bp komplementär.
  • Beispiel 4: PCR
  • Sofern nicht anders erwähnt wurden die PCR-Reaktionen bei einer Anlagerungstemperatur von 60°C, einer 10-minütigen Verlängerung bei 68°C und einer Denaturierungstemperatur von 92°C unter Verwendung des Expand-Long-Template- oder des Expand-High-Fidelity-PCR-Systems (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) und den aufgelisteten Primern (Tabelle 1) durchgeführt. Diese PCR-Reaktionen wurden verwendet, um die Lücken in den flankierenden 3'-Regionen der RH-Gene zu überbrücken. Die PCR 1 erfolgte unter Verwendung der Primer rea7 und rend31 (PCR 2: rend32, sf1c; PCR 3: rea7, sf3). Die Struktur der flankierenden 5'-Regionen wurde mit PCR-Amplifikationen bestätigt, in denen die Sinn-Primer rend32, rey14a und rey15a und die Antisense-Primer re011d und re014 eingesetzt wurden. Die Größe des Introns 9 wurde zu etwa 9.000 Bp Länge abgeschätzt, dies basierte auf PCR-Amplifikationen, die unter Verwendung von rb10b und rr4 für RHD (re96 und rh7 für RHCE) durchgeführt wurden.
  • Beispiel 5: Nucleotidsequenzierung
  • Die Nucleotidsequenzierung wurde mit einer DNA-Sequenzierungs-Einheit (Prism-BigDye-Terminator-Cycle-Sequencing-Ready-Reaktionskit; ABI 373A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt.
  • Beispiel 6: Charakterisierung des RH-Genortes
  • Die physikalische Struktur des Genortes der RH-Gene wurde abgeleitet ( 1). Die Struktur wurde nach den folgenden Gesichtspunkten ermittelt: (i) Flankierende 3'-Regionen. Die flankierenden 3'-Regionen von RHD waren zu dem 3'-Teil von dJ465N24 stark homolog (1B, Region c). Diese Homologie setzt sich bis hinter das Ende der RHD-cDNA fort und dehnt sich über mindestens 8.000 Bp aus, wie durch die Tatsache bewiesen wird, dass es möglich war, PCR-Amplikons zu erhalten (1B, PCR 1). Sequenzen, die mit dem 3'-Teil von dJ465N24 homolog waren, lagen der 5'-Region des SMP1-Gens benachbart (1B: PCR 2). Das 3'-Ende des SMP1-Gens lag dem RHCE-Gen direkt benachbart, wie durch die Komplementarität der 3'-Enden der entsprechenden cDNAs angezeigt und durch eine PCR bestätigt wurde (1B, PCR 3). Weitere Details der flankierenden 3'-Region des RHD-Gens (Rhesus-Box) und das SMP1-Gen werden nachstehend beschrieben. (ii) Flankierende 5'-Regionen. dJ469D22 umfasste 33.340 Bp der flankierenden 5'-Region von RHCE. Bei RHD zeigte ein 466 Bp langer Bereich an Homologie zwischen dem 3'-Ende von dJ465N24 und dJ469D22 an, dass dJ465N24 die flankierende 5'-Sequenz des RHD-Gens enthalten könnte. Diese Annahme wurde durch eine PCR bestätigt (2). (iii) Analyse des YAC 38A-A10. Die DNA des YAC 38A-A10 (UK HGMP Resource Center, Cambridge, UK) wurde nach einer einzigen Wachstumsphase durch Standardverfahren (http://hdklab.wustl.edu/lab_manual/yeast) isoliert. Es wurde bestätigt, dass dieses YAC RH-DNA enthielt. Darüber hinaus deuteten Shotgun-Clonierungsexperimente an, dass einige seiner Insertionen vermutlich von dem X-Chromosom stammten (Daten werden nicht gezeigt). Von diesem YAC war bekannt, dass es die Exons 2 bis 10 des RHCE- und die Exons 1 bis 10 des RHD-Gens enthielt (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997), und daher wurde erwartet, dass es das DNA-Segment zwischen RHD und RHCE enthielt. Das Vorliegen von DNA-Segmenten, die unterschiedliche Teile des RH-Genortes repräsentierten, wurde für dieses YAC beobachtet (Tabelle 2). Die Ergebnisse stimmten mit der vorgeschlagenen Struktur des RH-Genortes, die in 1, Teilabbildung A gezeigt wird, überein.
  • Referenzbeispiel: Identifizierung von RHD-spezifischen Sequenzen im RHD-Promotor
  • Etwa 2.000 Bp der RHD-Promotorsequenz wurden durch Chromosomal Walking erhalten (GenomeWalker-Kit, Clontech, Heidelberg, Deutschland). D-positive und D-negative Proben wurden unter Verwendung der Primer re04 und re11d amplifiziert (Tabelle 1), und RHD- und RHCE-spezifische Sequenzen wurden für 1.200 Bp 5' des Start-Codons durch Sequenzierung mit internen Primern erhalten. Es wurde eine kleine Deletion im RHD-Gen identifiziert und dazu verwendet, den RHD-spezifischen Primer re011d zu entwerfen. Die 1.200 Bp lange Sequenz, die den RHD-Promotor enthält, wurde bei EMBL unter der Zugangs-Nummer AJ252314 hinterlegt.
  • Beispiel 7: Charakterisierung der Rhesus-Boxen
  • Zwei DNA-Segmente mit einer Länge von etwa 9.000 Bp, die 5' und 3' des RHD-Gens lokalisiert waren, waren hoch homolog, besaßen die gleiche Orientierung und wurden als „Rhesus-Boxen" bezeichnet (4). Die Rhesus-Boxen wurden unter Verwendung von internen Primern in zwei überlappenden Fragmenten amplifiziert und sequenziert, dies erfolgte unter Verwendung der Primerpaare rez4/rend31 und rend32/ree011 d (stromaufwärts gelegene Rhesus-Box), rea7/rend31 und rend32/sr9 (stromabwärts gelegene Rhesus-Box) und rez4/rend31 und rend32/sr9 (Hybrid-Rhesus-Box von RHD-negativen Individuen). Die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box (5' von RHD) war etwa 9.142 Bp lang und endete etwa 4.900 Bp 5' des RHD-Start-Codons. Die stromabwärts gelegene Rhesus-Box (3' von RHD) war 9.145 Bp lang und begann 104 Bp nach dem RHD-Stopp-Codon. Die Rhesus-Boxen umschlossen genau den Teil von RHD, der Homologie zu RHCE aufwies. Der zentrale Teil beider Rhesus-Boxen enthielt ein fast vollständiges Überbleibsel eines Transposon-ähnlichen Elements des Menschen (THE-1B). Das einzige offene Leseraster, das in der Regel in dem THE-1B-Element vorliegt, war jedoch aufgrund mehrerer Nucleotid-Abberationen, die in beiden Rhesus-Boxen parallel vorlagen, zerstört, einschließlich einer Nonsense-Mutation im Codon 4. Während zwischen den beiden Rhesus-Boxen eine Gesamt-Homologie von 98,6% bestand, war eine 1.463 Bp lange „Identitätsregion", die zwischen den Positionen 5.701 und 7.163 lokalisiert war, vollständig identisch, mit der einzigen Ausnahme einer Insertion von 4 T-Nucleotiden in einem polyT-Trakt.
  • Beispiel 8: Lokalisierung der RHD-Gen-Deletion bei RHD-negativen Haplotypen
  • Es wurde vermutet, dass die Homologie zwischen den beiden Rhesus-Boxen für den Mechanismus der RHD-Deletion bei den üblichen RHD-negativen Haplotypen verantwortlich ist. Die Nucleotidsequenz der Rhesus-Box in RHD-negativer DNA wurde bestimmt (5). Die einzelne Rhesus-Box, die bei RHD-negativen Individuen nachgewiesen wurde, wies eine hybride Struktur auf. Das 5'-Ende dieser Rhesus-Box repräsentierte die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box und das 3'-Ende die stromabwärts gelegene Rhesus-Box. Es wurde bestimmt, dass die 903 Bp lange Schnittstellenregion der RHD-Deletion in der Identitätsregion der Rhesus-Boxen lokalisiert war (4, Pfeil, der nach links weist).
  • Beispiel 9: Spezifischer Nachweis der RHD-Deletion mittels PCR
  • Es wurden zwei, auf einer PCR basierende, Verfahren für den spezifischen Nachweis der RHD-Deletion, die bei den vorherrschenden RHD-negativen Haplotypen vorliegt, entwickelt (6). Die Long-Range-PCR-SSP wurde unter Verwendung des Expand-Long-Template-PCR-Systems mit Puffer 3 und den Primern rez4 (5' der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box) und sr9 (SMP1-Exon1) durchgeführt. Die Anlagerung erfolgte bei 60°C und die Verlängerung über 20 Min. bei 68°C. Die PCR-Amplikons wurden unter Verwendung eines 1 %-igen Agarosegels aufgetrennt. Die PCR-RFLP, wurde unter Verwendung des Expand-High-Fidelity-PCR-Systems und den Primern rez7 (unspezifisch, 5' der Rhesus-Box-Identitätsregion) und mb31 (spezifisch für die stromabwärts gelegene Rhesus-Box, 3' der Rhesus-Box-Identitätsregion) durchgeführt. Die Anlagerung erfolgte bei 65°C und die Verlängerung über 10 Min. bei 68°C. Die PCR-Amplikons wurden 3 Stunden bei 37°C mit PstI verdaut und die Fragmente wurden unter Verwendung eines 1 %-igen Agarosegels aufgetrennt.
  • Diese Verfahren erlaubten den raschen und direkten Nachweis der üblichen RHD-negativen Haplotypen sogar dann, wenn sie in trans mit RHD-positiven Haplotypen vorlagen. Die PCR-RFLP wurde bei einer größeren Zahl an Proben weiter eingesetzt (Tabelle 3). Wie erwartet, wurden alle 33 Proben mit bekannten Genotypen korrekt typisiert. Bei 68 weiteren Proben, die für die am häufigsten vorkommenden Phänotypen repräsentativ waren, stimmten die Ergebnisse mit den bekannten Haplotyp-Häufigkeit in der Population überein.
  • Beispiel 10: RHD-PCR-SSP
  • Die PCR-SSP-Reaktionen (Tabelle 4) wurden nach einem bereits beschriebenen RHD-Exon-spezifischen PCR-SSP-Verfahren (Gassner, Transfusion, 37:1020-1026, 1997) angepasst und erweitert und so eingestellt, dass sie unter identischen Temperaturzyklus-Bedingungen abliefen. Die Konzentration der spezifischen Primer betrug bei allen Reaktionen 0,2 μM mit Ausnahme des Exons 6 (0,1 μM), des Introns 7 (0,4 μM) und des Exons 9 (0,4 μM). Bei den meisten Proben wurde Intron 4/Exon 7 mit einer Multiplex-Reaktion untersucht, die 0,2 μM Exon 7 (Primersatz ga71/ga72) und 0,1 μM der Primer für das Intron 4 enthielt. Jede Reaktion enthielt einen Satz an HGH-Primern (Gassner, Transfusion, 37:1020-1026, 1997) als interne Kontrolle in den Konzentrationen 0,05 μM für den Promotor, Intron 4 und Exon 7 mit ga71/ga72; 0,075 μM für Exon 10; 0,1 μM für Intron 7; 0,15 μM für Exon 3, Exon 4, Exon 7 mit rb26/re71 und Exon 9; 0,2 μM für Exon 5 und Exon 6. Die Konzentration an Mg2+ betrug 0,4 μM für Intron 7 und bei allen anderen Reaktionen 0,15 μM. Bei Exon 6 wurden 20% Lösung Q (Qiagen, Hilden, Deutschland) hinzugefügt.
  • Referenzbeispiel 2: Haplotyp-Frequenzen
  • Für alle Allele, die mehr als einmal beobachtet wurden, war die Hapiotyp-Zuordnung trivial. Es wurde angenommen, dass Allele, die nur einmal beobachtet wurden, mit dem Cde- oder dem cdE-Haplotyp statt mit dem cde-Haplotyp assoziiert waren, da kein RHD-positives Allel bei irgendeiner ccddee-Probe nachgewiesen wurde. Ein Allel, das in einer einzelnen CcddEe-Probe vorkam, wurde formal halb als Cde und halb als cdE gezählt. Es wurde angenommen, dass CCddee-Proben ein aberrantes und ein normales Cde-Allel enthielten. Die Häufigkeit eines bestimmten aberranten RHD-Allels in seinem Haplotyp wurde als die Zahl der beobachteten Proben dividiert durch die Zahl der entsprechenden Haplotypen unter Beobachtung (500 Cde, 302 cdE) berechnet. Die Populationsfrequenz eines RHD-Allels wurde aus der Frequenz dieses Allels in seinem Haplotyp und der bekannten Frequenz des Haplotyps in der örtlichen Bevölkerung berechnet (Wagner, Infusionsther. Transfusionsmed. 22:285-290, 1995). Die Haplotyp-Frequenzen wurden für jedes PCR-Muster berechnet sowie für jedes RHD-Allel (Tabelle 8). In Übereinstimmung mit einer vorangegangenen Studie in England durch Avent et al. (Avent, Blood 89:2568-2577, 1997) waren 4,9% der Cde-Haplotypen und 1,5% der cdE-Haplotypen in unserer Population RHD-positiv. Da kein RHD-positives Allel unter 314 ccddee-Proben nachgewiesen wurde, betrug die Frequenz des cde-Haplotyps weniger als 0,5% (obere Grenze eines einseitigen 95% Vertrauens-Intervalls, Poisson-Verteilung). Die drei Häufigkeiten unterschieden sich statistisch signifikant voneinander (p < 0,05; zweiseitiger Exact-Test nach Fisher für jeden paarweisen Vergleich und korrigiert nach Bonferoni-Holm). Es wurde abgeschätzt, dass die Populations-Frequenz eines beliebigen D-negativen RHD-positiven Haplotyps 1 : 1.606 beträgt. Del-Allele konnten nur in den vermuteten Cde-Haplotypen beobachtet werden. Etwa 3% der Proben, die das Antigen C trugen, und die als D-negativ bei der Blutbank-Routineuntersuchung typisiert worden waren, repräsentierten Del. Die Populations-Frequenz der Del-Allele betrug 1: 3.030. Tabelle 1. Primer
    Primer Nucleotidsequenz Lokalisierung Position
    rb10b ggctaaatattttgatgaccaagtt RHD cDNA 1,194 bis 1,217
    re011d gcagccaacttcccctgtg RHD Promotor –883 bis –901
    re014 gctctaccttggtcacctcc dJ469D22 52,189 bis 52,209
    re04 aggtcacatccatttatcccactg dJ469D22 53,968 bis 53,945
    re11d agaagatgggggaatctttttcct dJ469D22 51,193 bis 51,216
    re96 ttgtgactgggctagaaagaaggtg dJ469D22 242 bis 216
    rea7 tgttgcctgcatttgtacgtgag RHD cDNA 1,311 bis 1,333
    rend31 ttctgtctgggttggggaggg dJ465N24 128,649 bis 128,629
    rend32 ggaggggttaatatgggtggc dJ465N24 127,355 bis 127,375
    rend8b1 tttgtcctggttgcctgtggtc dJ465N24 69,296 bis 69,274
    rend8b2 caaatcctgttgactggtctcgg dJ465N24 68,451 bis 68,473
    rend9a1 aacggctccatcacccctaaag dJ465N24 50,008 bis 49,987
    rend9a2 cccactcctagataccaacccaag dJ465N24 49,059 bis 49,083
    rey14a ctttatgcactgcctcgttgaatc dJ469D22 56,792 bis 56,769
    rey14b ttgactggtgtggttgctgttg dJ469D22 55,863 bis 55,884
    rey15a gcagaaaggggagttgatgctg dJ469D22 55,416 bis 55,395
    rey7 ctgacaaagttgagagcccactg dJ469D22 62,324 bis 62,346
    rey8 ttaagcctacatccacatgctgag dJ469D22 62,854 bis 62,831
    rez2 ccttggtctgccagaattttca RHD cDNA 2738 bis 2717
    rez4 gtttggcatcataggagatttggc dJ465N24 120,101 bis 120,124
    rez7 cctgtccccatgattcagttacc dJ465N24 124,831 bis 124,854
    rh7 acgtacaaatgcaggcaac RHD cDNA 1,330 bis 1,312
    mb31 cctttttttgtttgtttttggcggtgc stromabwärts gelegene 6,710 bis 6,684
    rr4 agcttactggatgaccacca RHD cDNA Rhesus-Box 1,541 bis 1,522
    sf1 gactggggggaaaagcgcaatac SMP1 cDNA 142 bis 164
    sf1c gtattgcgcttttccccccagtc SMP1 cDNA 164 bis 142
    sf3 tgacttgctctcatcccacatg SMP1 cDNA 1,696 bis 1,717
    sm19 gggcttgaagcaagtaaatggaag SMP1 intron 1 –58 bis –35
    sr1 gctatcaatattttcttggttacagacac SMP1 cDNA 2,172 bis 2,144
    sr3 gttcactgccataagtcttcagtgc SMP1 cDNA 575 bis 551
    sr3kp tggccgcactgaagacttatgg SMP1 cDNA 546 bis 567
    sr45 cagctgcatctatgataatccacc SMP1 cDNA 224 bis 243
    sr47 atggacaagtccgaggtgatag SMP1 cDNA 315 bis 344
    sr47c atcacctcggacttgtccattc SMP1 cDNA 342 bis 321
    sr5 gcaatcagagatccaaaggccaac SMP1 cDNA 428 bis 405
    sr5c gttggcctttggatctctgattgc SMP1 cDNA 405 bis 428
    sr55 gacatagtataccctggaattgctgt SMP1 cDNA 472 bis 497
    sr55c acagcaattccagggtatactatgtc SMP1 cDNA 497 bis 472
    sr9 ctcccccgattttagccaagaa SMP1 cDNA 27 bis 6
    • Für den RHD-Promotor und die RHD-cDNA beziehen sich die Positionen auf den Abstand von dem A des Start-Codons. Für Introns beziehen sie sich auf den Abstand von der Intron/Exon-Verbindung. Für alle anderen Sequenzen einschließlich der SMP1-cDNA beziehen sie sich auf den Abstand von dem Start der veröffentlichten Sequenzen. Die Fehlpaarungen in den Primern rey14b, mb31 und sf3 wurden versehentlich eingefügt. Die Primer re11d, re014 und re04 stimmen mit dJ469D22 nicht exakt überein, da sie nach unseren Rohsequenzen entworfen wurden, die die flankierende 5'-Region des RHD-Gens überspannten.
    Figure 00410001
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    Figure 00430001
    Figure 00440001
    Figure 00450001
    Figure 00460001
    Tabelle 8. Geschätze Häufigkeiten in der Bevölkerung
    Häufigkeit
    PCR-Muster/Allel unter Cde/cdE in der Bevölkerung
    Muster 1 1:45 1:4,132
    Muster 2 1:125 1:11,364
    Muster 3 1:101 1:17,976
    Muster 4 1:500* 1:45,455*
    Muster 6 1:167 1:15,152
    Muster 7 1:302 1:53,929
    Muster 8 1:500 1:45,455
    RHD(W 16X) 1:250 1:22,727
    RHD(G212V) 1:500 1:45,455
    RHD(Y330X) 1:500 1:45,455
    RHD(G1153(+1)A) 1:500 1:45,455
    Beliebige D-negative 1:20/1:67✝ 1:1,607
    RHD(G486(+1)A) 1:167 1:15,152
    RHD(M295I) 1:71 1:6,493
    RHD(K409K) 1:100 1:9,091
    Beliebige Del 1:33⧧ 1:3,030
    • * Unter Annahme eines Cde-Haplotyps; ein cdE-Haplotyp würde zu einer Häufigkeit von 1:302 unter cdE und 1:53.929 in der Bevölkerung führen. Für die Statistik und die Summe der Häufigkeiten wurde der Haplotyp formal als 0,5 Cde und 0,5 cdE gezählt.
    • ✝ 1:20 unter Cde, 1:67 unter cdE.
    • ⧧ 1:33 relativ zu dem Cde-Haplotyp.
  • Figure 00480001
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  • Sequenzprotokoll
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Claims (34)

  1. Nucleinsäuremolekülstruktur, welche entweder die Rhesus Hybrid Box, die stromaufwärts gelegene Rhesus-Box oder die stromabwärts gelegene Rhesus-Box ist, und deren Sequenz in den SEQ ID NOs: 18 bis 20 gezeigt ist.
  2. Nucleinsäuremolekülstruktur nach Anspruch 1, welche die gemeinsamen RHD-negativen Haplotypen repräsentiert, wobei sich der RHD-negative Haplotyp auf jeden RhD Antigennegativen Haplotyp bezieht, der eine Hybrid-Rhesus-Box beinhaltet.
  3. Nucleinsäuremolekülstruktur nach Anspruch 1, welche einen RHD-negativen Haplotypen repräsentiert, umfassend eine RHD-Gen-Deletion in der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box, der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box oder in beiden.
  4. Nucleinsäuremolekülstruktur nach Anspruch 1, welche die gemeinsamen RHD-positiven Haplotypen repräsentiert, wobei sich der RHD-positive Haplotyp auf jeden Haplotyp bezieht, der DNA-Sequenzen enthält, die spezifisch für das RHD-Gen sind.
  5. Nucleinsäuremolekülstruktur nach Anspruch 1, abgeleitet aus einer Probe, welche einen RHD-positiven Haplotypen umfasst, welcher serologisch als RhD-negativ eingestuft wird, wobei sich der RHD-positive Haplotyp, welcher serologisch negativ eingestuft wird, auf eine Probe bezieht, welche auf das Vorhandensein des RhD-Antigens mittels routinemäßigen serologischen Tests getestet wurde, und für den die Ergebnisse dieser Tests negativ waren.
  6. Nucleinsäuremolekülstruktur nach Anspruch 5, wobei die Probe aus einer kaukasischen Population stammt.
  7. Verfahren zum spezifischen Nachweis eines RHD-negativen Haplotypen verursacht durch eine Nonsense-Mutation, Missense-Mutation, Spleißstellen-Mutation, teilweise Deletion, teilweise Insertion, teilweise Inversion oder eine Kombination dieser im RHD-Gen, wodurch die Expression eines Proteinproduktes des RHD-Gens in einer Probe beendet oder gestört wird, unter Verwendung der Hybrid-Rhesus-Box oder der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box oder der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box, deren Sequenzen jeweils in SEQ ID NOs: 18 bis 20 dargestellt sind, oder eines strukturellen Merkmales nach einem der Ansprüche 2 bis 6 mit Hilfe von Techniken, welche im Stand der Technik bekannt sind, vorzugsweise mittels PCR-RFLP, PCR-SSP oder Long-Range-PCR.
  8. Vektor, enthaltend eine Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  9. Nicht-menschlicher Wirt, welcher mit dem Vektor nach Anspruch 8 transformiert ist.
  10. Oligonucleotid, welches unter stringenten Bedingungen mit einem Teil der Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6 hybridisiert, wobei dieser Teil mit einer Region, welche den Schnittpunkt des Hybridgens einbezieht oder deren komplementären Strang hybridisiert; wobei die Region, welche den Schnittpunkt einbezieht, dadurch gekennzeichnet ist, dass der 5'-Teil der stromaufwärts gelegenen RHD-Box in großer räumlicher Nähe zum 3'-Teil der stromabwärts gelegenen RHD-Box liegt, und worin das Oligonucleotid 20 Nucleotide umfasst und sich 5' und 3' vom tatsächlichen Schnittpunkt befindet.
  11. Verfahren zum Testen des Vorhandenseins eines Nucleinsäuremoleküls, welches eine Deletion des RHD-Gens wie gekennzeichnet durch die Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6 trägt, in einer Probe, umfassend das Hybridisieren des Oligonucleotides nach Anspruch 10 unter stringenten Bedingungen an Nucleinsäuremoleküle, welche in einer Probe enthalten sind, die einem Menschen entnommen wurde, und Nachweis der Hybridisierung.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, des weiteren umfassend Verdau des Hybridisierungsproduktes mit einer Restriktionsendonuclease und Analyse des Produktes dieses Verdaus.
  13. Verfahren zum Testen des Vorhandenseins eines Nucleinsäuremoleküls, welches eine Deletion des RHD-Gens wie gekennzeichnet durch die Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6 trägt, in einer Probe, umfassend das Bestimmen der Nucleinsäuresequenz von wenigstens einem Teil der Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei dieser Teil den Schnittpunkt des Hybridgenes codiert.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, des weiteren umfassend Amplifikation wenigstens eines Teiles der Nucleinsäuremolekülstruktur vor dem Bestimmen der Nucleinsäuresequenz.
  15. Verfahren zum Testen des Vorhandenseins eines Nucleinsäuremoleküls, welches eine Deletion des RHD-Gens wie gekennzeichnet durch die Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6 trägt, in einer Probe, umfassend das Ausführen einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Primersatzes, welcher wenigstens einen Teil der Sequenz amplifiziert, wobei wenigstens einer der in der Amplifikationsreaktion verwendeten Primer ein Oligonucleotid ist, welches unter stringenten Bedingungen mit einem Teil der Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6 hybridisiert, wobei dieser Teil mit einer Region hybridisiert, welche den Schnittpunkt des Hybridgens beinhaltet, oder mit dem komplementären Teil davon, wobei die Region, welche den Schnittpunkt, dadurch gekennzeichnet ist, dass der 5'-Teil der stromaufwärts gelegenen RHD-Box in großer räumlicher Nähe zum 3'-Teil der stromabwärts gelegenen RHD-Box liegt.
  16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Amplifikation mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgt oder eine PCR ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die PCR eine PCR-RFLP, PCR-SSP oder eine Long-Range-PCR ist.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das Molekulargewicht des Amplifikationsproduktes analysiert wird.
  19. Verfahren zum Testen des Vorhandenseins einer Nucleinsäuremolekülstruktur nach Anspruch 5 oder 6, welche RHD-positive Allele codiert, umfassend die folgenden Schritte: (a) Isolieren der DNA aus einer Blutprobe oder aus einer Probe eines Blutspenders; (b) Hybridisieren von wenigstens zwei entgegengesetzt ausgerichteten Primern unter stringenten Bedingungen an die DNA zur Ausführung einer PCR; (c) Amplifizieren der Zielsequenz; (d) Auftrennen der Amplifikationsprodukte auf einem Gel; und (e) Analysieren der Amplikons.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die RHD-positiven Allele aus einer serologisch RhD-negativen Probe stammen.
  21. Verfahren nach den Ansprüchen 19 oder 20, wobei die Probe aus einer kaukasischen Population ausgewählt wurde.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 11 bis 21, wobei die Probe Blut, Serum, Plasma, fötales Gewebe, Speichel, Urin, Schleimhautgewebe, Schleim, Scheidengewebe, fötales Gewebe aus der Scheide, Haut, Haar, Haarfollikel oder anderes menschliches Gewebe ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 22 umfassend eine Anreicherung von fötalen Zellen oder die Extraktion von fötaler DNA oder mRNA von mütterlichem Gewebe, wie beispielsweise peripherem Blut, Serum oder Plasma.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 11 bis 23, wobei das Nucleinsäuremolekül oder proteinhaltige Material der Probe auf einem festen Träger fixiert wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der feste Träger ein Chip ist.
  26. Verwendung der Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Analyse eines negativen oder positiven Rhesus D-Phenotypen.
  27. Verfahren zur Ermittlung, ob einem Patienten, welcher eine Bluttransfusion benötigt, RhD-negatives Blut von einem Spender übertragen werden kann, umfassend den Schritt des Testens einer Probe des Patienten auf die Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleinsäuremolekülstrukturen nach einem der Ansprüche 2 und 5 und 6, wobei ein positiver Test für zwei verschiedene dieser Nucleinsäuremolekülstrukturen anzeigt, dass eine Transfusion mit Rh-negativem Blut notwendig ist.
  28. Verfahren zur Ermittlung, ob Blut eines Spenders für eine Bluttransfusion auf einen Patienten geeignet ist, der dessen bedarf, umfassend den Schritt des Testens der Probe des Spenders auf die Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleinsäuremolekülstrukturen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein negativer Test für die Nucleinsäurestruktur nach Anspruch 2 mit oder ohne einem negativen Test für eine oder mehrere Nucleinsäuremolekülstrukturen nach Anspruch 4 bis 6 die Verwendung des Blutes des Spenders für eine Transfusion auf einen Patienten, welcher RhD-negativ ist, ausschließt.
  29. Verfahren zur Einschätzung des Risikos, dass eine RhD-negative Mutter einen RhD-positiven Fötus empfängt oder trägt, oder des Risikos, dass eine Mutter, welche einen Anti-D Titer aufweist, einen Fötus empfängt oder trägt, welcher einem Risiko der Entwicklung einer hämolytischen Erkrankung von Neugeborenen ausgesetzt ist, umfassend das Testen einer Probe vom Vater des Fötus auf die Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleinsäuremolekülstrukturen nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Nucleinsäuremolekülstruktur Mutationen oder Deletionen trägt.
  31. Verfahren zur Einschätzung der Möglichkeit oder Wahrscheinlichkeit, dass ein Mann Vater eines Kindes ist, durch Testen einer Probe des Mannes auf die Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleinsäuremolekülstrukturen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Testergebnisse genutzt werden um Homozygotie, Heterozygotie oder die Abwesenheit einer beliebigen Nucleinsäuremolekülstruktur oder eines Nucleinsäuremoleküles nach Anspruch 2 und 4 bis 6 zu bestimmen, um die Möglichkeit oder Wahrscheinlichkeit, dass der Mann der Vater des Kindes ist, abzuleiten.
  32. Kit beinhaltend (a) das Oligonucleotid nach Anspruch 10; und/oder (b) ein Primerpaar für die Ausführung einer Amplifikationsreaktion nach einem der Ansprüche 15 bis 17.
  33. Verwendung eines Oligonucleotids zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen an einen Teil der Nucleinsäuremolekülstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei dieser Teil mit einer Region hybridisiert, welche den Schnittpunkt des Hybridgenes umfasst, oder an eine komplementäre Region davon, wobei diese Region, welche den Schnittpunkt beinhaltet, dadurch gekennzeichnet ist, dass der 5'-Teil der stromaufwärts gelegenen Rhesus-Box sich in großer räumlicher Nähe zum 3'-Teil der stromabwärts gelegenen Rhesus-Box befindet.
  34. Verfahren zum Testen des Vorhandenseins einer Nucleinsäuremolekülstruktur nach Anspruch 3, welche den gemeinsamen RHD-negativen Haplotyp repräsentiert, umfassend die folgenden Schritte: (a) Isolieren der DNA aus einer Blutprobe oder aus einer Probe eines Blutspenders; (b) Hybridisieren von wenigstens zwei entgegengesetzt ausgerichteten Primern unter stringenten Bedingungen an die DNA zur Ausführung einer PCR; (c) Amplifizieren der Zielsequenz; (d) Auftrennen des Amplifikationsproduktes auf einem Gel; und (e) Analysieren der Amplikons.
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