DE69629563T2 - Bestimmung der funktion von calcineurin in immunosuppression und neurotoxizität - Google Patents

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    • A01K2267/0312Animal model for Alzheimer's disease

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Calcineurin, ebenfalls bekannt als Protein-Phosphatase 2B wurde zuerst in Rindergehirn identifiziert. Es repräsentiert eine kleine Familie von kalzium- und kalmodulin-abhängigen Serin/Threonin Protein-Phosphatasen. Es wird in allen Säugetiergeweben, die überprüft wurden, exprimiert und ist im Gehirn am reichlichsten vorhanden. In Lymphozyten ist Calcineurin das wichtigste, lösliche Kalmodulin-bindende Protein. Calcinenurin ist ein Heterodimer, das aus einer katalytischen Untereinheit (A; 61 kD) und einer regulatorischen Untereinheit (B; 19 kD) besteht. Die A-Untereinheit enthält eine katalytische Domäne, eine carboxy-terminale inhibitorische Domäne, eine B-Untereinheit-Bindungsstelle und eine Kalmodulin-Bindungsstelle. Die Phosphatase-Aktivität der A-Untereinheit wird durch Ca2+ sowohl durch Kalmodulin als auch durch die B-Untereinheit reguliert. Die B-Untereinheit weist lediglich eine Ca2+-abhängige regulatorische Aktivität auf und weist keine Phosphatase-Aktivität auf. Es existieren zwei Gene, die eng verwandte (ungefähr 80% identische) A-Untereinheits-Isoformen, nämlich Aα und β, im Maus-, menschlichen und Ratten-Genom codieren. Die α-Isoform ist die vorherrschende Isoform, die in Gehirn, Thymus und in T-Zellen zu finden ist. Die Aα- und Aβ-Isoformen weisen eine getrennte zelluläre Verteilung im Gehirn auf, wobei Aα im Hippocampus, in der Hirnrinde, im Kleinhirn bzw. Cerebellum und im Striatum am häufigsten vorkommen. Die unterschiedlichen Verteilungen der beiden Isozyme legen nahe, dass sie spezielle Funktionen beim Modulieren der neuronalen Aktivitäten aufweisen können. Die physiologischen Funktionen der unterschiedlichen Calcineurin A-Isoformen wurden bis jetzt nicht definiert.
  • J Neurochem 62 (1994) 803 offenbart, dass das abnormal phosphorylierte Tau-Protein, das mit der Alzheimer-Krankheit assoziiert ist, durch die Protein-Phosphatase-2B (PP-2B), ebenfalls bekannt als Calcineurin, dephosphoryliert wird.
  • WO-A-95/05466 offenbar die Expression von Kinasen in transgenen nicht-menschlichen Tieren, die die Phosphorylierung des Tau-Proteins modulieren, und dass die Hyperphosphorylierung von Tau in AD (Alzheimer's disease = Alzheimer Krankheit) durch eine (unspezifische) Abnormalität in der Aktivität von Kinasen und Phosphatasen verwsacht werden kann, die die Phosphorylierung von Tau regulieren.
  • Brain Pathol 4 (1984) 3 offenbart transgene und Knockout-Mäuse und deren Anwendung auf Modelle newologischer Erkrankungen.
  • EP-A-0 544 942 offenbart Okadainsäure und deren Aktivität als Phosphatase-Inhibitor.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, wie es in den Ansprüchen spezifiziert ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls transgene, nicht-menschliche Säugetiere, wie beispielsweise Nagetiere und insbesondere Mäuse, denen ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, und die somit eine gestörte Calcineurin-Expression aufweisen. In einer Ausführungsform fehlt den transgenen, nicht-menschlichen Säugetieren der vorliegenden Erfindung ein funktionelles Calcineurin-Aα-(CNAα)-Untereinheits-Gen, ein funktionelles Calcinewin-Aβ (CNAβ)Untereinheits-Gen oder sowohl CNAα als auch CNAβ-Untereinheits-Gene. In einer weiteren Ausführungsform fehlt den transgenen, nicht-humanen Säugetieren (beispielsweise Nagetieren, wie beispielsweise Mäuse und Ratten) ein funktionelles Calcineurin-Gen (beispielsweise ein Calcinerin-Untereinheits-Aα-Gen, Calcineurin-Untereinheits-Aβ-Gen) und sie exprimieren humanes Tau-Protein. In solchen transgenen Säugetieren wird die Hyperphosphorylierung von humanem Tau-Protein exprimiert und polymerisiert, was die Bildung gepaarter helikaler Filamente zur Folge hat, die im Gehirn newofibrilläre Knäuel bilden. Einem dritten Typ eines transgenen, nicht-humanen Säugetiers (beispielsweise Nagetiere, wie beispielsweise Mäuse und Ratten) fehlt ein funktionelles Calcineurin-Gen, exprimiert humanes Tau-Protein und überexprimiert das humane Amyloid-Vorläufer-Protein und das humane Alzheimer Aβ-Protein. Solche transgenen Säugetiere zeigen sowohl die pathologischen Läsionen bzw. Verletzungen der Alzheimer Krankheit – Amyloid-Ablagerungen und gepaarte helikale Filamente (die newofibrilläre Knäuel bilden, die sich in den Gehirnneuronen in der Alzheimer Krankheit akkumulieren) – und dienen als verbessertes Modell für die Alzheimer Krankheit, mit dem Arzneistoffe oder Mittel identifiziert werden sollen, die die pathologischen Läsionen reduzieren (teilweise oder vollständig).
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Wie hierin beschrieben, produziert ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin (CN)-Gen fehlt, in hohem Maße erhöhte Mengen von hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Das transgene, nicht-humane Säugetier der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, Arzneistoffe oder Mittel zu identifizieren, die durch oder als Folge ihrer Wirkung auf CN dazu verwendet werden können, Arzneistoffe oder Mittel, die immunsuppressive Wirkungen aufweisen, zu identifizieren, einschließlich Arzneistoffe und Mittel, die die Calcineurin Aα (CNAα)-Untereinheit, der Calcineurin Aβ (CNAβ)-Untereinheit beeinträchtigen. Zusätzlich können weitere transgene Säugetiere der vorliegenden Erfindung, hierin beschrieben, dazu verwendet werden, Mittel zu identifizieren, die beim Reduzieren der Phosphorylierung von Tau-Protein und bei der Produktion pathologischer Läsionen von Nutzen sind, die für die Alzheimer Krankheit charakteristisch sind.
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegeride Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Phosphorylierung des Tau-Proteins im zentralen Nervensystems eines Säugetiers reduziert, umfassend die Schritte: a) einem transgenen, nicht-humanem Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, ein Mittel zu verabreichen, das bezüglich seiner Fähigkeit, die Phosphorylierung des Tau-Proteins zu reduzieren, überprüft werden soll; b) den Umfang zu bestimmen, in dem die Phosphorylierung des Tau-Proteins im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers eintritt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) den in b) bestimmten Umfang mit dem Umfang zu vergleichen, in dem die Phosphorylierung im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle eintritt. Wenn die Phosphorylierung in einem geringeren Umfang im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers eintritt, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der Kontrolle, reduziert das Mittel die Phosphorylierung des Tau-Proteins.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Bildung gepaarter, helikaler Filamente (paired helical filament = PHF) im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, umfassend die Schritte: a) einem transgenen, nicht-humanen Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt und das humanes Tau-Protein exprimiert, ein Mittel zu verabreichen, das bezüglich seiner Fähigkeit zur Reduktion der PHF-Bildung überprüft werden soll; b) das Ausmaß bzw. den Umfang zu bestimmen, in dem die PHF-Bildung im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers eintritt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) den Umfang, der in b) bestimmt wurde, mit dem, in dem die PHF-Bildung im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle eintritt, zu vergleichen, wobei, wenn die PHF-Bildung in einem geringeren Umfang im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers eintritt, dem das Mittel verabreicht wird als im Nervensystem der Kontrolle, das Mittel die PHF-Bildung reduziert. In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das eine für die Alzheimer Krankheit charakteristische Läsion im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, umfassend die folgenden Schritte: a) Verabreichen eines Mittels an ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, das humanes Tau-Protein exprimiert und das humane Amyloid-Vorläufer-Protein und das humane Alzheimer Aβ-Protein überexprimiert, das auf seine Fähigkeit überprüft werden soll, eine Läsion zu reduzieren, die für die Alzheimer Krankheit charakteristisch ist; b) Bestimmen des Umfangs, in dem die Läsion im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers eintritt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) Vergleichen des in b) bestimmten Umfangs mit dem Umfang, in dem die Läsion im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle eintritt; wobei, wenn die Läsion im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers, dem das Mittel verabreicht wird, in einem geringeren Umfang auftritt als im Nervensystem der Kontrolle, das Mittel eine Läsion reduziert, die für die Alzheimer Krankheit charakteristisch ist.
  • Die pathologischen Läsionen, die für die Alzheimer Krankheit charakteristisch sind, können in einem Säugetier unter Verwendung von Mitteln reduziert werden, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, und schließen die Bildung gepaarter helikaler Filamente (PHF) und Amyloid-Ablagerungen ein. Zusätzlich kann die Phosphorylierung von Tau-Protein, das mit der Alzheimer Krankheit assoziiert ist, unter Verwendung von Mitteln reduziert werden, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Phosphatase-Aktivität eines Calcineurin Aβ-Untereinheits-Gens im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, umfassend die folgenden Schritte: a) Verabreichen einem transgenen, nicht-humanen Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin Aβ-Untereinheits-Gen fehlt, ein Mittel, das bezüglich seiner Fähigkeit überprüft werden soll, die Phosphatase-Aktivität einer Calcineurin Aβ-Untereinheit zu reduzieren; b) Bestimmen der Calcineurin-Aβ-Untereinheits-Phosphatase-Aktivität, die in den Zellen im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers vorliegt, dem das Mittel verabreicht werden soll; und c) Vergleichen der Calcineurin Aβ-Phosphatase-Aktivität, bestimmt in b), mit der Calcineurin Aβ-Phosphatase-Aktivität in Zellen im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle, wobei, wenn die Aβ-Phosphatase-Aktivität in einem geringeren Umfang im Nervensystem eines transgenen, nicht-humanen Säugetiers vorliegt, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der Kontrolle, das Mittel die Phosphatase-Aktivität einer Calcineurin Aβ-Untereinheit reduziert.
  • Das transgene, nicht-humane Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, schließt Säugetiere ein, bei denen das CN-Gen im Genom nicht vorliegt und Säugetiere, bei denen die strukturelle oder funktionelle Aktivität des CN-Gens, das im Genome des Säugetiers vorliegt, gestört wurde (beide Typen werden als Calcineurin-Knockout-Säugetiere bezeichnet). Das CNAα-Untereinheits-Gen und/oder das CNAβ-Untereirheits-Gen kann zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung entfernt oder funktionell gestört werden. Beispielsweise kann, wie in Beispiel 1 beschrieben, das Genom eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einer Sequenz rekombiniert werden, die in das Axon, das das CNAα-Gen des Tieres codiert, eingefügt wird, was eine Störung der CNAα-Expression zur Folge hat. Weitere Verfahren zur Produktion eines CN-Knockout-Säugetiers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch den Fachmann auf dem Gebiet durch Routineexperimente bestimmt werden.
  • Ein geeignetes Säugetier zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein Säugetier, das nach Entfernung des CN-Gens und nach Störung der Funktion des CN-Gens erhöhte Mengen an hyperphosphoryliertem Tau-Protein produziert. Transgene, nicht-humane Säugetiere der vorliegenden Erfindung schließen Nagetiere (beispielsweise Ratten, Mäuse) und Primaten ein.
  • Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Bestimmung der Fähigkeit eines Mittels, die mit der Alzheimer Krankheit assoziierten Läsionen zu reduzieren, im Nervensystem des transgenen Säugetiers nachgewiesen. Insbesondere kann die Wirkung des zu überprüfenden Mittels im zentralen Nervensystem des transgenen Säugetiers bestimmt werden. Beispielsweise kann das zu überprüfende Mittel im Hirn des transgenen Säugetiers bestimmt werden.
  • Die Verfahren, die dazu verwendet werden, die Fähigkeit eines Mittels oder Arzneistoffes zu bestimmen, eine für die Alzheimer Krankheit charakteristische Läsion zu reduzieren, die die Phosphorylierung von Tau-Protein einschließt, sind Routineverfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Beispielsweise kann, wie in Beispiel 1 beschrieben, die Bestimmung des Umfangs, in dem die Phosphorylierung des Tau-Proteins im transgenen, nicht-humanen Säugetier der vorliegenden Erfindung eintritt, unter Verwendung von Anti-PHF-Antikörpern bestimmt werden. Anti-PHF-Antikörper können ebenfalls dazu verwendet werden, den Umfang, in dem die PHF-Bildung eintritt, zu bestimmen. Eine Überprüfung der Reduktion von Amyloid-Ablagerungen kann unter Verwendung von Anti-β-Protein, Thioflavin S oder Kongo-Rot bestimmt werden. Zusätzlich wurden Verhaltensbeobachtungen des transgenen Säugetiers, dem ein Mittel verabreicht wurde, zur Bestimmung der Fähigkeit des Mittels, für die Alzheimer Krankheit charakteristische Läsionen zu reduzieren, einschließlich der Phosphorylierung des Tau-Proteins, angewendet.
  • Wie hierin verwendet, kann "eine geeignete Kontrolle" eine oder mehrere geeignete Kontrollen sein. Ein Beispiel für eine geeignete Kontrolle ist ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, das die gleichen Charakteristika wie das transgene Tier aufweist, dem ein Mittel, das überprüft werden soll, verabreicht wird (das heißt, das transgene, nicht-humane Test-Säugetier). Die Test- und Kontroll-Nicht-Humanen-Säugetiere werden unter denselben Bedingungen gehalten; sie unterscheiden sich lediglich in der Anwesenheit (Testtier) oder Abwesenheit (Kontrolltier) des zu überprüfenden Mittels. Beispielsweise kann eine geeignete Kontrolle, die zum Vergleichen der Ergebnisse, die mit dem Mittel oder Arzneistoff der überprüft werden soll, erzielt wurden, verwendet wird, folgendes sein: 1) ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, 2) ein transgenes, nichthumanes Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt und das ein humanes Tau-Protein exprimiert oder 3) ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, ein humanes Tau-Protein exprimiert und das humane APP-Protein überexprimiert; 4) ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, ein humanes Tau-Protein exprimiert und die humanen APP- und die humanen Alzheimer Aβ-Proteine in Abwesenheit des zu überprüfenden Mittels überexprimiert, und 5) Variationen hiervon. Beispielsweise ist in der Ausführungsform zum Identifizieren eines Mittels, das die Phosphorylierung von Tau-Protein im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, eine geeignete Kontrolle. Die Menge der Phosphorylierung des Tau-Proteins in dem transgenen, nichthumanen Kontrollsäugetier wird in Abwesenheit des zu überprüfenden Mittels bestimmt.
  • Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Kontrolle sind normale Wurfgeschwister. Das heißt, um eine vollständige Calcineurin-Knockout-Maus zu produzieren, werden zwei Mäuse, die für das CN-Gen heterozygot sind, gepaart, und drei Typen der Nachkommenschaft werden produziert: Mäuse, die für das CN-heterozygot sind, Wildtyp(WT)-Mäuse und Mäuse, die bezüglich des CN-Gens homozygot sind (das heißt CN-Knockout-Mäuse). Die Nachkommenschaft, die WT-Mäuse sind, sind die normalen Wurfgeschwister, und können als geeignete Kontrolle in den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Kontrolle ist ein entsprechendes Wildtyp-Säugetier. Andere Kontrollen können durch den Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, und das das humane Tau-Protein exprimiert. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, das humane Tau-Protein exprimiert und das humane Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) und/oder das humane Alzheimerβ-Protein überexprimiert.
  • Pathologische Läsionen, die das Alzheimer Krankheits-Gehirn charakterisieren und die die Newodegeneration verursachen, die zu Demenz führt, schließen die extrazellulären Amyloid-Ablagerungen und die intrazellulären neurofibrillären Knäuel ein, die aus Bündeln gepaarter helikaler Filamente zusammengesetzt sind, wie es im Elektronenmikroskop zu sehen ist. Die Amyloid-Ablagerungen sind in erster Linie aus einem ungefähr 42 Aminosäure langen Peptid zusammengesetzt, bezeichnet als Aβ, das aus dem größeren Vorläufer-Protein, genannt Amyloid-Vorläufer-Protein oder APP, abgeleitet ist. Die gepaarten helikalen Filamente sind in erster Linie aus dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau zusammengesetzt, das abnormal mit zusätzlichen Phosphatgruppen modifiziert wurde (hyperphosphoryliert). Der relative Beitrag dieser beiden Läsionen zum neuronalen Zelltod ist bis jetzt nicht bekannt, es wird jedoch angenommen, dass diese von Bedeutung sind. Die Korrelation mit dem neuronalen Zelltod und der Demenz ist beim Auftreten der neurofibrillären Knäuel am höchsten, die die gepaarten helikalen Filamente in Neuronen enthalten. Es wird deswegen als auf dem Gebiet axiomatisch akzeptiert, dass eine erfolgreiche Behandlung für die Alzheimer Krankheit die Bildung gepaarter helikaler Filamente verhindern oder reduzieren, oder bereits gebildete Filamente entfernen kann.
  • Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existieren keine Nagetier-Modelle, die gepaarte helikale Filamente produzieren oder hyperphosphoryliertes Tau-Protein akkumulieren. Das Exemplar/Athena transgene Maus-Modell für die Alzheimer Krankheit überexprimiert eine mutierte Form des APP-Gens (assoziiert mit familiärer Alzheimer Krankheit) und zeigt einen gewissen synaptischen Verlust und die Akkumulation von Amyloid, es erzeugt jedoch keine gepaarten helikalen Filamente und zeigt keine klaren Lernstörungen (Games, D., et al., Nature, 373: 523–527 (1995). Es ist deswegen von Bedeutung, ein Maus-Modell zu entwickeln, in dem sich gepaarte helikale Filamente bilden können. Ein solches Modell würde als Ziel bzw. Target zum Testen potentieller Alzheimer-therapeutischer Mittel dienen, die entwickelt wurden, um die Bildung gepaarter helikaler Filamente zu reduzieren oder zu verhindern. Zusätzlich würde eine Tiermodell, vorzugsweise ein Nagetier-Modell, das sowohl Amyloid-Ablagerungen als auch gepaarte helikale Filamente zeigt, der humanen Alzheimer Krankheit am engsten ähneln und würde das Testen therapeutischer Gene ermöglichen, die dazu vorgesehen sind, beide pathologischen Läsionen der Alzheimer Krankheit zu reduzieren.
  • Auf Basis der Entdeckung, dass die Calcineurin-Knockout-Maus stark erhöhte Mengen an hyperphosphoryliertem Tau-Protein produziert, wird ein Maus-Modell für die Alzheimer Krankheit, in dem eine hyperphosphorylierte Form des humanen Tau-Proteins exprimiert wird, in dem hyperphosphoryliertes humanes Tau-Protein und die Akkumulation gepaarter helikaler Filamente gezeigt wird, und und in dem die Alzheimer Amyloid-Ablagerungen des β-Proteins und die gepaarten helikalen Filamente des hyperphosphorylierten Tau-Proteins exprimiert wird, wie nachstehend beschrieben erzeugt.
  • Die Calcineurin-Knockout-Maus wird mit einer Maus-Linie gepaart, die bezüglich der Expression des humanen Tau-Proteins homozygot ist. Diese letzteren Mäuse wurden durch transgene Standardtechnologie erzeugt, bei der das humane Tau-Protein in befruchtete Maus-Eizellen in einem Konstrukt injiziert wird, das deren Expression unter der Kontrolle des humanen THY1-Promotors ermöglicht. In diesen Tieren liegt das transgene, humane Tau-Protein in Nervenzellkörpern, Axons und Dendriten vor, und ist an geeigneten Stellen teilweise hyperphosphoryliert, um gepaarte helikale Filamente zu produzieren, jedoch nicht in dem Ausmaß des Maus-Tau-Proteins in der Calcineurin-Knockout-Maus-Linie. Eine Paarung dieser beiden Tiere erzeugt Nachkommenschaft, die alle ein ausgeschaltetes Calcineurin-Gen auf einem Chromosom, ein normales Calcineurin-Gen auf dem homologen Chromosom tragen wird, und deren Hälfte das humane Tau-Transgen tragen wird.
  • Der Genotyp der Nachkommenschaft wird durch Entfernen eines kleinen Stückes des Schwanzes, Präparieren von DNA und Durchführen einer Southern Blot- oder PCR-Analyse zur Bestimmung, dass sie alle ein ausgeschaltetes Calcineurin-Gen tragen, und das 50% das humane Tau-Transgen tragen, bestimmt. Die Nachkommenschaft, die die humane Tau-Sequenz trägt, wird bis zum Erwachsenenalter gezüchtet und gepaart, um eine neue Reihe von Nachkommen zu erzeugen, von denen 25% gemäß der Mendel'schen Gesetze bezüglich des ausgeschalteten Calcineurin-Gens homozygot sind und entweder für das humane Tau-Transgen homozygot oder heterozygot sind. Die Genotypen dieser Tiere werden, wie vorher, durch Analyse von Schwanz-DNA bestimmt. Tiere, die das ausgeschaltete Calcineurin-Gen im homozygoten Zustand + das humane Tau-Transgen entweder im heterozygoten oder homozygoten Zustand tragen, werden weiter untersucht. Tiere, deren Genotypen durch die Analyse von Schwanz-DNA bestimmt wurden, läßt man die Geschlechtsreife erreichen, und sie werden untereinander gepaart, um eine Linie von Tieren zu erzeugen, die die korrekten Genotypen kontinuierlich aufweisen. Mäuse mit unterschiedlichem Alter werden mit Fixiermittel perfundiert und einer Immunzytochemie und Elektronenmikrokospie unterworfen, um zu bestätigen, dass sie humanes Tau-Protein exprimieren und das Calcineurin-Protein nicht exprimieren.
  • Phosphorylierungs-empfindliche Antikörper werden wie für die Calcineurin-Knockout-Maus beschrieben, verwendet, um zu bestätigen, dass das humane Tau-Protein aufgrund des Fehlens von Calcineurin in seiner Umgebung hyperphosphoryliert wird. Spezieller Fokus wird bezüglich des Hippocampus vorgenommen, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass er ein Bereich mit hoher Calcineurin-Expression und mit der größten Zunahme der Hyperphosphorylierung von Tau aufgrund der Calcineurin-Knockout-Mutation, ist.
  • Neurofibrilläre Knoten werden durch modifizierte Bielchowsky Silber-Färbung, und durch Anti-PHF-Antikörper identifiziert, und werden durch elektronenmikroskopische Identifizierung bestimmt. Die Protein-Expressionsstudien werden durch Northern Blot-Analyse abgeschlossen, um zu bestätigen, dass das Calcineurin-Gen in diesen Genen nicht exprimiert wird.
  • Wenn einmal eine Maus-Linie erzeugt wurde, exprimiert sie hyperphosphoryliertes humanes Tau-Protein, und vorzugsweise gepaarte helikale Filamente in den Neuronen bzw. Nervenzellen des Hippocampus. Die Mäuse können auf mehreren Wegen verwendet werden. Sie können zunächst direkt zum Screenen nach therapeutischen Mitteln, die die Hyperphosphorylierung von Tau reduzieren und in der Produktion von gepaarten helikalen Filamenten verwendet werden. Sie können ebenfalls dazu verwendet werden, vermeintliche therapeutische Mittel auf ihre Wirksamkeit bei der Vorbeugung der Hyperphosphorylierung von Tau und der Bildung von gepaarten helikalen Filamenten zu testen. Diese Mäuse können ebenfalls dazu verwendet werden, die ideale Dosis eines vermeintlichen therapeutischen Mittels für die Alzheimer Krankheit zu bestimmen.
  • Die Mäuse können ebenfalls zur Erzeugung eines weiter verbesserten Tiermodells für die Alzheimer Krankheit verwendet werden. Zu diesem Zweck werden homozygote Mäuse, denen ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt (Mäuse, die bezüglich des ausgeschalteten Calcineurin-Gens homozygot sind) und die das humane Tau-Gen exprimieren, so dass hyperphosphoryliertes humanes Tau-Protein und vorzugsweise PHF im Gehirn produziert wird, mit dem Exemplar/Athena APP-transgenen Mäusen gepaart, die das APP-Protein und das Alzheimer Aα-Protein überexprimieren und als Folge Amyloid-Ablagerungen erzeugen. Der Zweck dieser Kreuzung besteht darin, eine Nachkommenschaft zu erzeugen, die alle Eigenschaften der Alzheimer Krankheit aufweisen, nämlich hyperphosphoryliertes Tau, gepaarte helikale Filamente und Amyloid-Ablagerungen. Die Nachkommenschaft dieser Kreuzung wird, wie vorher unter Verwendung einer Schwanz-DNA, analysiert, um deren Genotyp zu bestätigen. Beispielsweise werden zwei heterozygote Säugetiere gekreuzt, von denen eines das humane Tau-Transgen exprimiert, und das andere ein humanes APP-Transgen exprimiert. Eine Schwanz-DNA-Analyse wird durchgeführt, um zu bestimmen, welcher der Nachkommen beide Transgene trägt. Wenn einerseits die Paarung zwischen einer homozygoten Version der transgenen APP-Maus und einer homozygoten Version der transgenen, humanen Tau-Maus durchgeführt wird (die natürlich bereits mit der homozygoten Calcineurin-Knockout-Mutation kombiniert ist), dann sollte technisch die Schwanz-DNA-Analyse nicht notwendig sein, wird jedoch nichtsdestoweniger in dem Fall durchgeführt, in dem die Keimbahn irgendeiner der Mäuse die Transgene verloren hat. Die Nachkommenschaft dieser Kreuzung trägt somit zwei humane Transgene, eines für APP und eines für Tau, unter verschiedenen Promotoren, jedoch beide im Nervensystem exprimiert, plus einer homozygoten Knockout-Mutation im Calcineurin-Gen.
  • Diese Mäuse produzieren Amyloid-Ablagerungen und hyperphosphorylierte Taulgepaarte helikale Filamente, wodurch die beiden Hauptkriterien für ein Alzheimer Tiermodell erfüllt werden. Die Mäuse können dazu verwendet werden, vermeintliche therapeutische Mittel für die Alzheimer Krankheit zu screenen. Sie können ebenfalls, genauso wie bei den oben erwähnten Mäusen, dazu verwendet werden, vermeintliche diagnostische Tests für die Alzheimer Krankheit zu testen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, eine Analyse für die Tropicamid-Überempfindlichkeit der Pupille, das Vorliegen von Schlüssel-Proteinen, wie beispielsweise Antichymotrypsin, APP, Aβ und von hyperphosphoryliertem Tau im Serum und/oder cerobrospinaler Flüssigkeit.
  • Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht, die jedoch nicht als einschränkend aufgefasst werden sollen.
  • Beispiele
  • Verfahren und Materialien
  • Die folgenden Verfahren und Materialien werden in den hierin beschriebenen Beispielen verwendet. Bezugnahmen, die in den Beispielen 1–3 erwähnt werden, sind solche, die in der gegenständlichen Anmeldung eingeschlossen sind, die unmittelbar Beispiel 3 folgen.
  • Konstruktion von Targeting-Vektoren
  • Das Targeting bzw. Ziel-Konstrukt, das zur Störung des CNAα-Gens verwendet wurde, wurde zum Implementieren der kürzlich beschriebenen Doppel-Selektionstechnik (Mansour, 1988; Mortensen, 1992) entwickelt. Murine CNAα cDNA wurde durch PCR-Amplifikation aus Mausgehirn Gesamt-mRNA unter Verwendung von Primern kloniert, die der CNAα cDNA-Sequenz entsprechen (Kincaid, 1990; Zugangsnummer J05479), unter Verwendung von Standardverfahren (Ausubel, 1994). Ein Bakteriophagenklon, der einen Teil der katalytischen Acc-Domäne des Calcineurin codiert (Kincaid, 1990), bezeichnet als MCAL-1, wurde durch Screenen einer genomischen 129/Svj Leber-Bibliothek (Stratagene) mit muriner CNAα cDNA gewonnen. Ein 13 kb EcoRI-Fragment aus Klon MCAL-1 wurde unter Verwendung von Standardverfahren in Bluescript-tk subkloniert (Ausubel, 1994). Die Intron-Exon-Grenzflächen des murinen Calcineurin Aα-Gens wurden durch Restriktions-Enzym-Stellenkartierung und durch Nukleotid-Sequenz-Analyse definiert (Ausubel, 1994). Das Neo-Gen wurde in eine MluI-Stelle in der Mitte des Exons eingefügt, das Nukleotide 572–717 der Maus CNAα mRNA-Sequenz codierte (Zugangsnummer J05479; Kincaid, 1990). Sowohl neo als auch tk wurden durch den Phosphorglyzerat-Kinase-Promotor gesteuert.
  • Transfektion und Selektion von mutierten ES-Zellen
  • J1 ES-Zellen wurden auf Feeder-Layers aus 7-bestrahlten, embryonalen Fibroblasten (EF)-Zellen, wie beschrieben (Li, 1992) gezüchtet. 1,5–2 × 107 J1-Zellen bei Passage 9–10 wurden trypsinisiert und in 1 ml Elektroporations-Puffer resuspendiert (Thomas und Capecchi, 1987), außer, dass die NaCl-Konzentration 137 mM betrug. 50 μg Konstrukt-DANN wurden durch Elektroporation in J1 ES-Zellen eingebracht und in G418 und FIAU, wie bereits früher beschrieben, gezüchtet (Li, 1992). Die überlebenden Klone wurden 8-10 Tage nach Selektion aufgenommen und die DNA wurde zur Southern Blot-Analyse extrahiert.
  • Erzeugung von Keimbahn-Chimären
  • Heterozygote ES-Zellen wurden in C57BI/6J Blastozysten injiziert und in den Uterus von pseudo-schwangeren weiblichen Black Swiss-Mäusen, wie beschrieben, reimplantiert (Bradley, 1987). Männliche Agouti-Nachkommen (abgeleitet von den 129 ES-Zellen) wurden mit weiblichen Black Swiss- oder C57BI/6J-Mäusen gepaart. Die Schwanz-DNA von der Agouti-F1-Nachkommenschaft wurde durch Southern Blot-Analyse bezüglich der Keimbahn-Übertagung des mutierten Alleles des CNAα-Gens untersucht. Homozygote mutierte Mäuse wurden durch Paaren der heterozygoten mutierten Mäuse gewonnen. Die in den hierin präsentierten Experimenten verwendeten Mäuse waren 8-10 Wochen alt, und wiesen wie erwähnt entweder Black Swiss/129-Hintergrund oder B6/129-Hintergrund auf.
  • Erzeugung von Doppel-Knockout ES-Zellen und RAG-2 Chimären
  • Homozygote mutierte ES-Zellen wurden aus heterozygoten CNAα+/-ES-Zellen, wie beschrieben, erzeugt (Mortensen, 1992) mit den nachfolgenden Modifikationen. 1–2 × 106 heterozygote Knockout ES-Zellen von einem einzigen Klon wurden auf jede 10 cm Platte auf G418-resistenten EF-Zellen in LIF-suplementierten (1000 U/ml) Medien ausplattiert. Nach 12 Stunden wurden 1,5 mg Trockenpulver G418 pro ml-Kultur zugesetzt. Nach 4–6 Tagen der G418-Selektion wurden die überlebenden Kolonien aufgenommen und die Struktur des Calcineurin Aec-Gens wurde durch Southern Blot-Analyse bestimmt.
  • Doppel-Knockout-Zellen wurden in RAG-2–/– Blastozysten injiziert (Shinkai, 1992 entweder aus B6/129 oder FvB-Hintergrund, um somatische Chimären zu erzeugen (Chen, 1993). Der ES-Zellbeitrag zu den Chimären wurde durch Hüllfarbe (nur für FvB-Hintergrund) und durch Messen der Anzahl von CD4+ und CD8+ Lymphozyten im Periphärblut bestimmt. Die in den Experimenten verwendeten Chimären waren 10 Wochen alt.
  • Zytofluorometrische Analysen
  • Thymus, Lymphknoten und Milz wurden aus B6/129 Wildtyp und mutierten Mäusen isoliert und in einer Einzell-Suspension dispergiert. Die roten Blutzellen wurden durch Lyse mit Tris/NH4Cl-Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Die Zell-Suspension wurde mit einem Nylonsieb filtriert und zweimal mit Färbemedium gewaschen, das aus HBSS mit reduziertem Phenolrot, Natriumazid, BSA und EDTA bestand. 0,5 × 106 Zelle/25 μl/färben wurden mit 1 μg/10 μl/färben von PE- oder FITC-markierten Antikörpern inkubiert (PharMingen, San Diego, CA) für 15 Minuten auf Eis, einmal gewaschen und mit 0,5% Formamid in Färbemedium fixiert. Eine Durchflußzytometrie wurde unter Verwendung eines Zytofluorograph IIs Durchflusszytometers und unter Verwendung eines Zell-Sorters durchgeführt (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Insgesamt 20.000 Zellen wurden bei jedem Färben aufgezeichnet.
  • Eine in vivo-Immunisierung und in vitro T-Zell Proliferation und Zytokin-Produktionsassays
  • Acht bis zehn Wochen alte Wildtyp- und homozygote mutierte Mäuse von Black Swiss/129-Hintergrund wurden mit 150 5 μg Trinitrophenyl (TNP) gekoppelt an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) immunisiert, oder mit 300 5 μg TNP gekoppelt an Ovalbumin (OVA) in vollständigem Freund'schen Adjuvants über eine Fußkissen-Injektion (Coligan, 1994). Sowohl die Wildtyp- als auch mutierten Mäuse wiesen zumindest ein H-2b Allele in ihrem Genom auf, wie durch PCR nachgewiesen, unter Verwendung der Primer, die ein 1Ee-b abgeleitetes Fragment amplifizierten (Mathis, 1983); Dr. Leslie Berg, Persönliche Kommunikationen).
  • Zehn Tage nach Immunisierung wurden die Lymphknoten-Zellen geerntet. 2 × 105 Lymphknoten-Zellen/pro Well wurden in 96-Well-Platten mit OVA allein restimuliert; oder mit OVA plus 4 × 104 T-Zell-depletierten und bestrahlten C57BL/6 Milz-Zellen als exogene Antigen präsentierende Zellen; oder mit OVA plus 10 Einheiten/ml exogenem IL-2. Bei 60 Stunden Stimulierung wurde die Kultur für 6 Stunden mit 1 μCi/Well 3H-Thymidine gepulst. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.
  • Die T-Zell-Produktion von Zytokinen wurde unter Verwendung von Standardverfahren gemessen. Lymphknoten-Zellen von immunisierten Mäusen wurden geerntet und mit 1 mg/ml OVA in vitro restimuliert. Überstände aus 2 × 105 Zellen/200μl/96-Well wurden nach 24 Stunden geerntet. Die IL-2 Aktivität in den Überständen wurde durch Proliferation von HT-2 Zellen in Gegenwart eines IL-4 Antikörpers gemessen (11B11). Bei 24 Stunden wurde die HT2-Kultur mit 1μCi/Well 3H-Thymidine für 6 Stunden gepulst. Überstände aus 6 × 105 Zellen/2005μl/96-Well wurden nach 60 Stunden geerntet. Die IFNγ-Mengen in den Überständen wurden durch ELISA gemessen.
  • Präparation von T-Zell-Extrakten
  • Milz- und Lymphknoten wurden aus Wildtyp- und mutierten Mäusen geerntet und wurden in Ein-Zell-Suspensionen dispergiert. Rote Blutzelle wurden durch Lyse entfernt. Die Endkonzentrationen wurden auf 1,5–2,0 × 108 Zellen, suspendiert in 2 ml PBS, das 5% fötales Kalbsserum und 4 mM EDTA enthielt, eingestellt. Die Zellsuspensionen wurden unter Verwendung einer Maus T-Zell-Anreicherungssäule (R&D Systems) bezüglich T-Zellen angereichert. Die T-Zellen wurden dann mit Lyse-Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15% Glyzerol, 0,1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 50 5 μg/ml PMSF, 50 μg/ml Sojatrypsin-Inhibitor, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin enthielt, lysiert. Teilmengen von 8 × 106 Zellen pro 50 μl Lyse-Puffer wurden bis zur weiteren Analyse eingefroren.
  • Herstellung von Gehirnextrakten
  • Unter Verwendung einer Sinterglas-Gewebs-Mühle wurde ein einzelnes Mausgehirn in 50 ml/Puffer homogenisiert, der 50 mM Tris pH 7,5, 15% Glyzerol, 0,1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 50 μ/ml PMSF, 50 5 μg/ml Soja Trypsin-Inhibitor, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin und 0,05% (v/v) NP-40 enthielt. Der Extrakt wurde einer Zentrifugation unterworfen (10,000 × g) und der Überstand wurde bei –80°C aufbewahrt, bis er untersucht wurde. Das Protein wurde unter Verwendung des Bio-Rad Assays gemessen, und die Konzentrationen betrugen typischerweise zwischen 15 und 20 mg/ml.
  • Western Blot Analyse
  • Die Menge an Calcineurin Aα in T-Zell-Extrakten wurde durch Western Blot unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt. Zwanzig Mikrogramm T-Zell-Extrakt oder Gehirn-Homogenate wurden durch SDS-PAGE auf einem 16% Tris/Glycingel (Novex) bei 150 Volt (konstante Spannung) fraktioniert und auf eine PVDF-Membran (Immobilon) bei 100 Volt für 1,5 Stunden übertragen. Im Anschluss an den Transfer wurde die Membran über Nacht bei 4°C in M-Blotto blockiert. Die Membranen wurden kurz in PBS gespült, und entweder mit Kaninchen-Antikörper 82929 (spezifisch für ein C-terminales Peptid, SNSSNIQ von humanem CNAα) oder Kaninchen-Antikörper 82948 (spezifisch für die CNAβ-Reste 386–396, LMTEGEDEFDG) umgesetzt. Kaninchen-Anti-Peptid-Antiserum wurde 1 : 10,000 verdünnt. Die Membranen wurden gewaschen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur in TBST inkubiert, das HRP-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper (Amersham) verdünnt 1 : 10,000, enthielt. Die Membrane wurden in TBST gewaschen und mit dem ECL Western Bloting-Nachweissystem (Amersham) entwickelt.
  • Calcineurin Phosphatase Assay
  • Der Phosphatase Assay ist eine modifizierte Version eines kürzlich beschriebenen Verfahrens (Manalan und Klee, 1983; Liu, 1991). Das Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen 60 μl) enthielt 50 mM MES (ph6.0), 100 mM NaCl, 6 mM Mg(OAc)2, 100 mM CaCl2, 100 mg/ml BSA (Fraktion V), 1,25 mM Okadainsäure (Calbiochem), 20 mM [33P] RII Peptid (600 cpm/pmol) und T-Zell-Gehirn-Extrakt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei 30°C inkubiert.
  • Die Reaktion wurde durch Zusatz von 100 ml eiskaltem 5% TCA/0,1 M Kalium-Phosphat (pH 7,0) beendet. Das Präzipitat wurde auf einer MultiScreen IP-Platte (Millipore) gesammelt. Ein Viertel (40 ml) des terminierten Reaktionsgemisches wurde pro Well aufgebracht, gewaschen und in einem Top-Count Scintillationszähler gezählt (Packard Instrument Co.).
  • Herstellung von markiertem Phospho-R11-Peptid
  • Das R11-Peptid (modifiziert nach Manalan und Klee, 1983; Liu, 1991), DLDVPIPGRFDRRVSVAAE, wurde am Serinrest mit 33P wie folgt phosphoryliert: Das endgültige Reaktionsgemisch enthielt 1,5 mg des synthetischen Peptid-Substrats, 20 mM MOPS (pH 7,0), 2 mM Mg(OAc)2, 1 mM γ-33P-ATP (spezifische Endaktivität 600 cpm/pmol), 13 mM DTT und 250 Einheiten der Protein-Kinase-Untereinheit. 50 ml 6 mg/ml DTTI wurden 250 Einheiten der Protein-Kinase-Untereinheit zugesetzt und nach 10-minütiger Inkubation wurde das DTT/Protein-Kinase-Gemisch den anderen Bestandteilen zugesetzt, um die Phosphorylierungs-Reaktion zu beginnen, die für 50 Minuten bei 30°C durchgeführt wurde. Das phosphorylierte Peptid wurde auf einer 1,0 ml Dowes AG-1 X8-Säule aufgereinigt, die mit 30% Essigsäure equilibriert war und wurde wie beschrieben konzentriert. Die Endkonzentration des markierten Peptids wäre zwischen 300–400 pmol [33P] Peptid/ml.
  • Histologie und Immunhistochemie
  • Mäuse wurden mit 2,5% Avertin anästhetisiert und intrakardial mit Tyrodslösung, gefolgt von 4% gepuffertem Paraformaldehyd perfundiert. Die Gehirne wurden sofort entfernt und in 4% gepuffertem Paraformaldehyd bei 4°C über Nacht fixiert. Sie wurden darauf in 4% gepuffertem Paraformaldehyd mit 10% Saccharose bei 4°C über Nacht eingeweicht. Zwei bis drei pm dicke Koronalschnitte des Gehirns und Schnitte, die zur Achse des Gehirnstammes mit angelagertem Cerebellum Rückenmark senkrecht sind, wurden routinemäßig verarbeitet und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin, Luxol Fast Blue, Bielchowsky Silber und Cresyl Violett (Nissl)-Färbungen angefärbt. Um die Flächen zu bestimmen, die für Gehirnschnitte repräsentativ sind, wurden die Maximaldimensionen des Gehirns ungefähr auf der Ebene des optischen Chiasmus und der mittleren Pons/Cerebellum in den Schichten gemessen, und die Flächen wurden für jede Probe berechnet.
  • Paraffinschnitte wurden entparaffinisiert, und wurden unter Verwendung der ABC- und ABC-AP-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Vector, Burlingame, CA) immungefärbt. Um das Signal auf dem fixierten Gewebe zu verstärken, wurden gelegentlich die Schnitte bzw. Objektträger mit entweder 88% Ameisensäure für 10 Minuten oder mit 0,1 M Citrat pH 6,0 für 10 Minuten in der Mikrowelle behandelt (um das Citrat zum Sieden zu bringen).
  • Morris Water Maze Task (Morris Wasserlabyrinth-Aufgabe)
  • Naive, erwachsene Mäuse (10–37 Wochen alt) wurden verwendet. Die Trainingsvorrichtung für die räumliche Version von Morris Water Maze war ein ringförmiger Polypropylen-Pool mit einem Durchmesser von 120 cm. Die Fluchtplattform betrug 11,5 cm Durchmesser. Das Maze bzw. das Labyrinth war in vier gleiche Quadranten eingeteilt, und die Fluchtplattform war im Zentrum eines der vier Quadranten angeordnet. Das Wasser wurde bei 78°F gehalten. Nicht-toxische Crayola-Weißpulverfarbe wurde zugesetzt, um das Wasser opaque zu machen. Der Pool wurde in einem Raum angeordnet, der eine Anzahl von Gegenständen an den Wänden aufwies und innerhalb des Raum, der durch eine im Pool schwimmende Maus gesehen werden konnte. Vor dem Training ließ man jede Maus, damit sich die Maus an das Wasser und die Fluchtplattform gewöhnen konnte, 30 Sekunden auf der Plattform verbleiben und eine Minute umherschwimmen, und man ließ sie dann das Erklettern der Plattform fünfmal üben. Die Genotypen der experimentellen Subjekte waren für den Durchführer der Experimente verblindet.
  • Verstecktes Plattformtraining
  • Akquisition: Das Oberteil der Plattform war 1 cm unter der Oberfläche des Wassers, das für das Tier, das im Pool schwimmt, unsichtbar war. Die Plattform-Anordnung variierte zwischen unterschiedlichen Tieren, blieb jedoch immer am selben Ort für eine vorgegebene Maus. Vor jedem Versuch wurde die Maus 30 Sekunden auf der Plattform angeordnet. Ein Versuch wurde durch Anordnen eines Tieres entlang des Randes des Pools, der die Wand berührt, begonnen. Der Startort alternierte bei 1 bis 4 Startorten, wobei jeder Versuch am selben Tag an unterschiedlichen Startorten begann. Ein Subjekt ließ man 60 Sekunden lang auf der Plattform, wobei dessen Bewegung durch einen Computer verfolgt wurde. Die Zeit, die notwendig war, um die Fluchtplattform zu lokalisieren (Fluchtlatenz) wurde bei jedem Versuch bestimmt. Tiere, die die Plattform in 60 Sekunden nicht fanden, wurden vom Durchführer des Experimentes geleitet, und die Fluchtlatenz wurde als 61 Sekunden aufgezeichnet. Nach jedem Versuch ließ man die Tiere für 30 Sekunden auf der Plattform verbleiben. Mit den Tieren wurden 4 Versuche pro Tag für acht aufeinander folgende Tage durchgeführt. Jeder Versuch in einem Block von vier Versuchen wurde um jeweils eine Stunde getrennt (verteiltes Versuchsverfahren).
  • Probeversuch
  • Eine Stunde nach dem letzten Trainingsversuch wurde mit jedem Tier ein Probetest unternommen. Während des Probetests ließ man jedes Subjekt auf der Plattform 30 Sekunden verbleiben. Darauf wurde die Plattform aus dem Pool entfernt, ohne dass das Tier diese Aktion bemerkte. Ein Versuch wurde durch Anordnen der Maus ein wenig außerhalb des Zentrums begonnen, gegenüber dem Punkt gelegen, an dem sich die Plattform üblicherweise befand. Jedes Tier ließ man 60 Sekunden den Pool durchsuchen. Zwei Messungen des Suchverhaltens wurden bestimmt. Eine Quadrantensuchzeit-Messung wurde durch Bestimmen der Menge der Zeit erzielt, die in jedem Quadranten zugebracht wurde. Eine Plattform-Kreuzungsmessung wurde durch Zählen der Zeitpunkte erzielt, in denen ein Subjekt den exakten Platz im Trainingsquadranten überquerte, in dem die Plattform während des Trainings lokalisiert war. Zum Vergleich würde die Anzahl von Zeitpunkten, zu denen ein Subjekt den äquivalenten Ort an jedem der anderen Quadranten überkreuzte, bestimmt.
  • Zufälliger Plattformtest
  • Am nächsten Tag des Probeversuches ließ man die Tiere einen Versuch mit der Plattform an ihrem ursprünglichen Ort durchführen, und drei Versuche mit der Plattform an einer der Plattformstellen in den anderen drei Quadranten. Die durchschnittliche Fluchtlatenz zur Plattform, wenn sie sich an ihrem Originalplatz befand, wurde als die trainierte Plattform-Fluchtlatenz der Mäuse verwendet, und die durchschnittliche Zeit, die zur Lokalisierung der Plattform verbraucht wurde, wenn sie sich an den drei neuen Orten befand, wurde als die andere Plattform-Fluchtlatenz der Tiere verwendet.
  • Sichtbares Plattformtraining
  • Nach der versteckten Plattform-Aufgabe wurden dieselben Tiere dem sichtbaren Plattform-Training unterworfen. In der sichtbaren Plattform-Aufgabe war die Plattform noch 1 cm unter der Wasseroberfläche, jedoch wurde eine Flagge am Oberteil der Plattform angebracht, um diese sichtbar zu machen. Das Trainingsverfahren war dasselbe wie bei der versteckten Plattform-Aufgabe, außer dass die Plattform-Position zwischen vier unterschiedlichen Positionen innerhalb jedes Blocks von vier Versuchen alternierte, und dass die Ausgangsposition immer gegenüber der Position der Plattform war. Jede Maus ließ man 12 Versuche pro Tag durchführen, in Blocks von jeweils vier Versuchen für drei aufeinander folgende Tage (massiertes Versuchsverfahren). Jeder Block von vier Versuchen war um jeweils eine Stunde voneinander getrennt.
  • Angst-Konditionierung
  • Erwachsene Mäuse wurden individuell für zumindest eine Woche vor dem Verhaltenstest beherbergt. Sie wurden jeden Tag für eine Woche vor dem Testen behandelt, um Stress zu reduzieren. Die Angst-Konditionierung und das kontext-abhängige Lerntesten wurden in einer kleinen Nagetierkammer (Coulbourn) durchgeführt, die einen Stab-Boden aus rostfreiem Stahl enthielten (5 mm Durchmesser, beabstandet 1 cm), durch die Schocks durch durcheinandergebrachte Füße verabreicht werden konnten. Die Kammer wurde innerhalb eines schallgedämpften Kastens (Coulbourn) mit einem Ventilationspropeller, der Hintergrundlärm bereitstellte, angeordnet. Die Kammer wurde mit 1% Essigsäure gereinigt und vollständig getrocknet, bevor jedes Tier in dieser angeordnet wurde. Das Frieren bzw. Zittern wurde durch ein Zeitproben-Verfahren bestimmt, bei dem ein Beobachter, der gegenüber den Maus-Genotypen verblindet war, jede Maus 2 Sekunden einordnete. Die Experimente wurden auf Videoband aufgenommen, und das Frieren wurde erneut durch zwei Beobachter, die gegenüber den Maus-Genotypen verblindet waren, bestimmt.
  • Kontext-abhängige Angst-Konditionierung
  • Einige der Tiere machten ein Morris Water Maze-Training durch (6 Wildtyp und 6 Mutanten), und einige alters-gematchte naive Tiere (3 Wildtyp und 2 Mutanten) wurden den nachfolgenden, kontext-abhängigen Angst-Konditionierungs-Vorschriften unterworfen. In der Konditionierungsphase wurden die Tiere in der Schock-Kammer drei Minuten angeordnet und wurden anschließend drei Fuß-Schocks unterworfen (0,5 mA Intensität, 1 s Dauer, 1 Minute Abstand). Die Mäuse wurden aus der Kammer 1 Minute nach dem letzten Fuß-Schock entfernt. Bei 1, 2 oder 24 Stunden nach dem Training wurden die Tiere erneut in die Schock-Kammer überführt, und das Frieren wurde für 3 Minuten ohne jegliche Fuß-Schocks überwacht.
  • Ton-abhängige Angst-Konditionierung
  • Naive, adulte Tiere (9–17 Wochen alt) (15 Wildtypen und 14 Mutanten) wurden in der Schock-Kammer für 3 Minuten angeordnet, und wurden dann 20-sekündigen lauten Tönen ausgesetzt (ungefähr 75 db, 1000 Hz, 3 Minuten Abstand) durch einen Lautsprecher, der an der Kammer befestigt war. Ein Fuß-Schock (0,5 mA Intensität, 1 s Dauer) wurde am Ende jedes Tones präsentiert. Die Mäuse wurden dann aus der Kammer 3 Minuten nach dem letzten Fuß-Schock entfernt. Bei 1 Stunde, 2 Stunden oder 24 Stunden nach dem Training wurde eine Gruppe von Mäusen (Wildtyp n-6, Mutanten n-b) in Bezug auf ihr ton-abhängiges Lernen getestet. Die Mäuse wurden in einem leeren Kunststoff-Käfig angeordnet, der von der Schock-Kammer verschieden war (um das Frieren aufgrund kontakt-unabhängiger Konditionierung zu minimieren), und das Frieren wurde für 3 Minuten vor dem Ton und anschließend für 3 Minuten in Gegenwart des Tones gescored. Eine weitere Gruppe von Mäusen (Wildtyp n = 9, Mutanten n-8) wurde vierundzwanzig Stunden später in die Schock-Kammer zurückgebracht, um ihr kontext-abhängiges Lernen zu testen. Das Frieren wurde für 3 Minuten überwacht. Diese Gruppe von Tieren wurde ebenfalls auf ihr ton-abhängiges Lernen 48 Stunden nach dem Training getestet.
  • Schmerzempfindlichkeits-Test
  • Die Mäuse wurden bezüglich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Fuß-Schocks getestet. Die Tiere wurden in der Konditionierungs-Kammer angeordnet und wurden Fuß-Schocks (1 s Dauer) zunehmender Intensitäten ausgesetzt, von 0,05 mA bis 0,40 mA, mit 0,05 mA Zunahmen. Die Intensitäten, die nozizeptive Reaktionen verursachen, das heißt Zurückschrecken, Laufen/Hüpfen und Vokalisierung, wurden bestimmt. Alle Tiere wurden bei derselben Intensität vor deren Erhöhung getestet bis sie vokalisierten. Die Durchführer des Experimentes waren gegenüber den Genotypen der Subjekte verblindet.
  • Elektrophysiologie
  • Hippocampus-Schnitte von 16–18 Tagen alten Mäusen wurden durch Standard-Verfahren hergestellt. Experimente wurden bei 27–29°C in normaler bzw. physiologischer Ringerlösung durchgeführt, die 2,5 mM Kalzium, 1,3 mM Magnesium ohne zugesetztes Picrotoxin durchgeführt. Zwei-Pfad-Experiment-Vorschriften wurden verwendet, um zu ermöglichen, dass LTP und LTD aus demselben Schnitt aufgezeichnet wurden, bei dem zwei stimulierende Elektroden im Stratum Radiatum in CA1 an jedem Ende angeordnet wurden, wobei die zwei Aufnahmeelektroden zwischen den beiden stimulierenden Elektroden vorlagen. LTD wurde durch 1 Hz, 10 Minuten Stimulation induziert. LTP wurde mit 100 Hz, 1 Sekunde Tetanus induziert, die zweimal mit 20-sekündigen Intervallen zwischen dem Stimulus verabreicht wurden.
  • Statistische Analyse
  • Die Daten von der versteckten Plattform-Morris Water Maze-Aufgabe wiesen einen größeren Anteil gescorter Messungen auf, somit ist eine Varianz-Analyse (ANOVA), die auf die Originaldaten angewendet wurde, nicht geeignet. Wir behandelten die Fluchtlatenz als binäre Beobachtung, passten dann das verallgemeinerte lineare Modell für diese binären Daten unter Verwendung der Statistiksoftware GLIM oder Splus an. Daten aus der sichtbaren Plattform Morris Water Maze-Aufgabe wurden einer logarithmischen Transformation unterworfen, bevor ANOVA durchgeführt wurde. Weil die Angst-Konditionierungs-Frier-Daten binomische Daten sind, verwendeten wir zunächst eine Standardbogen-Sinus-Transformation der Daten, um die Varianz zu stabilisieren. Ein ANOVA wurde bezüglich des Sinus-Bogens der Quadratwurzel des Prozentsatzes des Frierens durchgeführt.
  • Beispiel 1 Erzeugung von CNAα–/– Mäusen
  • Calcineurin Aα-Knockout-Mäuse (CNAα–/–) wurden durch Standardverfahren produziert (Bradley, 1987), was die homologe Rekombination embryonaler Stamm (ES)-Zellen mit einschloss. Der Gen-targeting Vector wurde durch Einfügen des Neomycin-Phosphortransferase (neo) Gens in ein Exon konstruiert, das den Teil der katalytischen Calcineurin-Domäne codiert und durch Einfügen des Thymidin-Kinase-Gens (tk) außerhalb des Homologiebereiches. Lineare Konstrukt-DNA wurde in J1 ES-Zellen transfiziert, und die Kolonien wurden bezüglich Neomyzin und FIAU-Resistenz selektiert (Li, 1992; Mortensen, 1992). DNA aus individuellen Klonen wurde durch Southern Blot-Analyse im Anschluss an einen Verdau mit MscI und eine Hybridisierung mit der 1,2 kb-Sonde untersucht. Ein neues 7,5 kb-Fragment, ebenso wie das 18 kb-Fragment, das in Wildtyp-ES-Zell-DNA zu finden war, war in CNAα+/–ES-Zell-DNA zu finden. Heterozygote CNAα+/–ES-Zellen wurden darauf in C57BL/6 Blastozyten injiziert, und einige der sich ergebenden chimären Mäuse übertrugen das mutierte Gen auf die nächste Generation, wenn sie mit Black Swiss-Mäusen gepaart wurden. CNAα–/– Mäuse wurden durch Paaren der heterozygoten CNAα–/–Mäuse gewonnen.
  • Erzeugung von CNAα–/–-RAG-2–/–Chimären
  • CNAα+/–ES-Zellen wurden in hoher Konzentration von G418 gezüchtet, um nach ES-Zellen zu selektieren, denen beide Kopien von funktionellen CNAα-Genen fehlten (Mortensen, 1992). ES-Zell-Klone, die 1,5 mg/ml G418 überlebten, wurden aufgenommen und durch Southern-Analyse analysiert. Die CNAα–/–Klon-DNA's wurden identifiziert, weil ihnen das endogene 18 kb MscI-Fragment fehlte.
  • Doppel-Knockout-ES-Zellen wurden in RAG-2–/–Blastozysten entweder aus B6/129 oder FvB-Hintergrund injiziert, um somatische Chimären zu erzeugen (Chen, 1993). In den RAG-2–/–Mäusen existieren keine reifen T- und B-Zellen aufgrund ihres Unvermögens, eine Gen-Umordnung durchzumachen (Shinkai, 1992). Deswegen sollten in den RAG-2–/–-Chimären alle reifen T- und B-Zellen von den injizierten ES-Zellen kommen, die CNAα–/– waren.
  • Die funktionelle Störung des Calcineurin Aα-Gens wurde durch das Fehlen einer CNAα-Expression in Doppel-Knockout-ES-Zellen bestätigt. RNA vom Wildtyp, CNAα+/–und CNAα–/– ES-Zellen wurden durch Northern Blot-Analyse unter Verwendung des 5' Endes der CNAα cDNA (Nucleotide 95–714) als Sonde charakterisiert. CNAα mRNA wurde in Wildtyp-ES-Zellen und in CNAα+/–ES-Zellen, jedoch nicht in CNAα–/–ES-Zellen nachgewiesen.
  • Calcineurin-Aktivität in CNAα–/–T-Zellen
  • Die Calcineurin-Aktivität in diesen Zellen wurde durch Western Blot und Enzym-Aktivitäts-Assay gemessen. Wildtyp- und CNAα–/–gewonnene T-Zell-Extrakte wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gelen fraktioniert, auf eine Membran übertragen und die Calcineurin Aα und Aβ Polypeptide unter Verwendung der Calcineurin A-Untereinheits-α-Isoform oder β-Isoform spezifischen Antikörpern identifiziert. Es existierte kein nachweisbares CNAα Polypeptid in T-Zell-Extrakten aus den CNAα–/–Mäusen, während CNAα in Wildtyp-T-Zell-Extrakten leicht nachweisbar war. Das CNAβ-Peptid war weder in Wildtyp-, noch in mutierten T-Zellen mit dem β-Isoform-spezifischen Antikörper nachweisbar, selbst wenn das CNAβ-Peptid im Gehirn leicht nachweisbar war.
  • Die restliche Calcineurin-Aktivität (d. h. Oktadinsäure-resistent und EGTA-empfindliche Phosphatase-Aktivität) wurde in denselben CNAα–/–T-Zell-Extrakten gemessen (Martin und Wiederrecht, in Druck). Calcineurin's Phosphatase-Aktivität in CNAα–/–T-Zell-Extrakten (169+32 pmol Substrat/Minute/mg Protein) betrug 34% der Aktivität, die in Wildtyp-T-Zell-Extrakten zu finden war (500 ± 77 pmol Substrat/Minute/mg Protein). Die Phosphatase-Aktivität sowohl in Wildtyp-als auch in Mutanten-T-Zellen betrug 90–95%, gehemmt durch FK506.
  • Normale Entwicklung von T- und B-Zell-Linien
  • CNAα–/– und B-Zellen waren phänotypisch normal, und die Zusammensetzung und Verteilung unterschiedlicher Unterklassen von T- und B-Zell-Linien war in Thymus, Milz, Lymphknoten und Knochenmark in den CNAα–/– Mäusen normal, wie durch Färbung mit Antikörpern gegen TCRαβ, TCRγδ, CD3, CD4, CD8, MHC Klasse I und II, Thy-1, IL-2Rα, B220, IgM, IgG, IgD, IgA, IgE, CD23, S7 und Ly-1 gezeigt wurde. Im Vergleich mit den Wildtyp-Nachkommen wiesen CNAα–/– Mäuse normale Populationen von doppelt negativen (CD4–CD8–), doppelt positiven (CD4+CD8+) und einfach positiven (CD4+CD8– oder CD4– CD8+) Thymozyten auf. Eine Färbung mit unterschiedlichen Vβ-Antikörpern (Vβ5, Vβ6, Vβ8, Vβ9, Vβ11, Vβ13, Vβ14) zeigten, dass diese Vβ-Darstellungen in mutiertem Thymus dieselben wie bei der Wildtyp-Kontrolle waren. Diese Erkenntnisse zeigten, dass ein funktionelles CNAα-Gen für die Reifung sowohl von T- als auch B-Lymphozyten nicht erforderlich ist.
  • CNAα–/–T-Zellen reagieren normalerweise auf Mitogene in vitro und bleiben gegenüber CsA und FK506 empfindlich.
  • Wir testeten die Reaktionen der Wildtyp- und mutierten T-Zellen auf die mitogene Stimulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) plus Ionomycin, Concanavalin A (ConA) und Anti-CD3ε Antikörper. Alle drei Mitogene induzierten die CNAα–/–T-Zellen dazu, genauso schnell wie die Wildtyp-T-Zellen zu proliferieren. Weiterhin produzierten stimulierte Mutanten und Wildtyp-T-Zellen dieselben Mengen an IL-2 und IL-4 und exprimierten normale Konzentrationen an IL-2 Rezeptor auf der Oberfläche. Somit schienen CNAα–/–T-Zellen funktionell zu sein, wenn sie in vitro durch Mitogene stimuliert wurden.
  • Calcineurin, insbesondere Calcineurin, das die Aα-Untereinheit enthält, wurde als das Target für Immunsuppressive Arzneistoffe CsA und FK506 impliziert, die die TCR-vermittelte Proliferation und IL-2-Produktion normaler T-Zellen hemmen (O'Keefe, 1992; Clipstone und Crabtree, 1992; Frantz, 1994; Tsuboi, 1994). Wir testeten die Arzneistoff-Empfindlichkeit der CNAα–/–T-Zellen. Wenn sie mit PMA plus Ionomycin, ConA oder αCD3ε-Antikörper stimuliert waren, wurden CNAα–/–T-Zellen und Wildtyp-T-Zellen, beide durch CsA und FK506 gehemmt, wie durch Proliferation und durch IL-2 und IL-4-Produktion gemessen wurde. CNAα–/–T-Zellen waren sogar noch empfindlicher gegen diese Arzneistoffe als normale T-Zellen mit einem IC50, der 2-7-fach geringer als derjenige der Wildtyp-T-Zellen war.
  • Defective T-Zell-Reaktionen von Protein-Antigenen
  • Um zu bestimmen, ob CNAα für eine normale Immunreaktion erforderlich ist, maßen wir die Reaktionen von Wild-Typ und CNAα–/–Mäusen auf Hapten-Protein Antigene. Wildtyp- und CNAα–/–Mäuse wurden mit TNP-KLH oder TNP-OVA über eine Fußkissen-Injektion (Coligan, 1994) immunisiert. Zehn Tage nach der Immunisierung wurden die Lymphknotenzellen geerntet. Die Gesamtzahl an Zellen in den Lymphknoten war in den immunisierten Wildtyp- und mutierten Mäusen ähnlich, die sehr viel mehr waren als diejenigen in den Lymphknoten nicht immunisierter Tiere. Auch war das CD4+: CD8+-Verhältnis in den Lymphknoten der beiden Maustypen gleich. Wir schlossen, dass die Wildtyp- und mutierten Maus-T-Zellen beide während der 10 Tage der Immunisierung geprimt wurden. Jedoch poliferierten nach Restimulation mit KLH oder OVA in vitro T-Zellen von Wildtyp-Mäusen genauso schnell wie T-Zellen von CNAα–/–Mäusen.
  • Der Zusatz normaler Antigen-präsentierender Zellen oder IL-2 zu den in vitro-Kulturen ergänzte den proliferativen Defekt von CNAα–/–T-Zellen nicht.
  • Der Defekt in der antigen-spezifischen T-Zell-Reaktion könnte entweder auf einen Defekt der CNAα–/–T-Zellen oder auf einen Defekt in anderen Zellen zurückzuführen sein, deren Funktion für das Priming anigen-spezifischer T-Zellen während des Immunisierungs-Prozesses erforderlich ist. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, immunisierten wir die RAG-2–/–CNAα–/–Chimären mit TNP-OVA und restimulierten die Lymphknotenzellen mit dem Immunogen nach 10 Tagen. CNAα–/–T-Zellen der RAG-2-CNAα–/–Chimären proliferieren nicht mehr so gut in Reaktion auf das Immunogen. In diesen RAG-2-CNAα–/–Chimären umfassten die CNAα–/–ES-Zellen ungefähr 10 Prozent der chimären Tiere, wie es durch Hüllfarbe-Mitwirkung beurteilt wurde. Lediglich T- und B-Zellen in den Chimären waren vollkommen CNAα-defizient, weil sie aus den injizierten CNAα–/–ES-Zellen gewonnen wurden, während bis zu 90% anderer Zelltypen aus dem RAG-2–/–CNAα+/+-Hintergrund gewonnen wurden.
  • Die B-Zell-Funktion wurde in CNAα–/–Mläusen und in RAG-2–/–CNAα–/–chimären Mäusen bestimmt, die mit TNP-KLH oder TNP-OVA immunisiert wurden. Ähnliche Serumtiter von Anti-TNP-Antikörper (IgG1 und IgG2a) waren in immunisierten Wild-Typ, CNAα–/–Mäusen und den immunisierten RAG-2–/–CNAα–/–chimären Mäusen zu finden.
  • Nach Restimulierung mit den Immunogenen sezernierten die Lymphknoten T-Zellen von immunisierten CNAα–/–Mäusen signifikant weniger IL-2, IL-4 und IFNγ, als die Lymphknoten T-Zellen von immunisierten normalen Mäusen (Tabelle 1 und nicht dargestellte Daten). IFNγ wurde in den TNP-OVA immunisierten RAG-2 Chimären nachgewiesen in einer Konzentration, die viel höher als die mutierten Mäuse war, jedoch niedriger als die Wildtyp-Mäuse (Daten nicht dargestellt), am wahrscheinlichsten, weil in den RAG-2 Chimären einige IFNγ sezernierende Zellen, wie beispielsweise NK-Zellen aus dem RAG-2–/–CNAα+/+-Hintergrund stammten und dazu in der Lage waren, IFNγ zu sezernieren.
  • Tabelle 1. IL-2 und IFNγ-Sekretion durch Wildtyp-und CNAα–/–T-Zellen
    Figure 00260001
  • Tabelle 1. Wildtyp- und CNAα–/–Mäuse wurden mit 300 μg TNP-OVA immunisiert. Am Tag 10 wurden Lymphknotenzellen geerntet und mit 1 mg/ml OVA in vitro restimuliert. Überstände aus 2 × 105Zellen/200μl/96-Well wurden nach 24 Stunden geerntet. Die IL-2 Aktivität in den Überständen wurde durch Proliferation von HT-2 Zellen in Gegenwart von αIL-4 Antikörper (11B11) gemessen. Bei 24 Stunden wurde die HT-2 Kultur mit 1 μCi/Well 3H-Thimidin für 6 Stunden gepulst. Überstände aus 6 × 105 Zellen/200 μl/96-Well wurden nach 60 Stunden geerntet. Die Mengen an IFNγ in den Überständen wurden durch ELISA gemessen. Lymphknotenzellen, die ohne Antigen kultiviert wurden, produzierten keine nachweisbaren Lymphokine (nb, nicht bestimmt). CNAα–/–T-Zellen sezernierten signifikant weniger IL-2 (durchschnittlicher Wildtyp = 12,5 Einheiten IL-2 Aktivität vs. durchschnittl. CNAα–/– = 1,5; p < 0,003) und IFNγ (durchschnittl. Wildtyp = 513 Einheiten IFNγ Aktivität vs. CNAα–/– = 27; p < 0,005) als die Wildtyp T-Zellen.
  • Diskussion
  • Wir haben eine CNAα–/–Maus durch strukturelles Inaktivieren des CNAα-Gens erzeugt, was eine Störung der CNAα-Expression zur Folge hatte. Wir demonstrieren hierin, dass eine mehr als 65%ige Reduktion der Calcineurin-Aktivität in den CNAα–/–T-Lymphozyten existierte. Die B- und T-Zell-Entwicklung in diesen Mäusen scheint normal voranzuschreiten. Die mutierten Mäuse weisen eine normale B-Zell-Reaktion, jedoch eine defekte T-Zell-Reaktion in vivo auf. Die Immunreaktion von RAG-2/CNAα–/–chimären Mäusen ist ebenfalls mangelhaft, was darauf hinweist, dass T-Zellen per se defektiv bzw. mangelhaft sind und kein anderer Aspekt der Immunreaktion. Weiterhin blieben mutierte T-Zellen gegenüber FK506 und CsA empfindlich. Diese Mäuse stellen Informationen über die physiologische Rolle von Calcineurin Aα und Aβ bereit und legen nahe, dass diese beiden Polypeptide nicht identische Rollen in der T-Zell-Entwicklung und -Funktion aufweisen.
  • Frühere Studien und unsere eigenen Daten zeigten, dass a die vorherrschende Isoform der beiden Hauptcalcineurin A-Untereinheits-Isoformen α und β ist (Takaishi, 1991; Kuno, 1992; Guerini und Klee, 1991). In T-Zellen ist Aα für zumindest 65% der Calcineurin-Expression und Aktivität in diesen Zellen verantwortlich. Die restliche calcineurinartige Aktivität in den mutierten T-Zellen könnte auf andere Calcineurin-Isoformen oder auf andere verwandte Phosphatasen zurückzuführen sein. Im Thymus ist Aα ebenfalls die vorhenschende Isoform, weil wir, wenn wir eine murine Thymozyten-cDNA-Bibliothek unter niedrig-stringenten Bedingungen mit einer CNAα cDNA voller Länge screenten, nicht dazu in der Lage waren, irgendwelche Aβ-Klone herauszuziehen, wohingegen Aα-Klone reichlich vorhanden waren (unveröffentlichte Daten). In Abwesenheit des CNAα scheint CNAβ nicht nach oben reguliert werden, was gegen die Möglichkeit spricht, dass CNAβ die CNAα-Funktion in seiner Abwesenheit substituiert.
  • CNAα ist für eine normale in vivo antigen-spezifische T-Zell-Reaktion erforderlich. Der Mangel bzw. Defekt der proliferativen T-Zell-Reaktion ist nicht auf ein Fehlen einer normalen Antigen-Präsentation zurückzuführen, weil der Zusatz von exogenen Wildtyp-Antigen präsentierenden Zellen zum Zeitpunkt der in vitro Restimulation den Proliferations-Mangel nicht heilen konnte. Ebenfalls existierte bei den immunisierten RAG2 somatischen Chimären eine normale Antigen-Präsentationsfunktion, weil nur die reifen T- und B-Zellen lediglich von den injizierten ES-Zellen gewonnen wurden, die CNAα-defizient waren, wohingegen die anderen Zelltypen, einschließlich der Antigen-präsentierenden Zellen, meistens RAG-2–/–CNAa+/+ waren. Der proliferative Effekt existierte ebenfalls in den immunisierten RAG-2 somatischen Chimären, was nahe legt, dass der Defekt per se in T-Zellen anstelle anderer Zelltypen vorlag, die für die richtigen Immunisierungen von Bedeutung sein könnten.
  • Wenn Sie mit den Immunogenen in vitro restimuliert wurden, versagten CNα–/–-Zellen dabei, IFNγ zu sezernieren (Tabelle 1). Dies stimmt mit den Erkenntnissen überein, dass CsA und FK506 die IFNγ mRNA Expression hemmen (Reem, 1983; Tocci, 1989), was nahe legt, dass CNAα für die IFNγ-Produktion erforderlich ist. Ebenfalls sezenierten CNAα–/–T-Zellen signifikant reduzierte Mengen in IL-2 und IL-4 (Tabelle 1 und nicht dargestellte Daten) und bestätigte hierdurch die in vitro-Studien, in denen gezeigt wurde, dass CsA und FK506 die IL-2 und IL-4-Produktion hemmen (Bierer, 1991, Bloemena, 1988; Bloemena, 1989; Dumont, 1990; Herold, 1986; Hess, 1982; Johansson und Moller, 1990; Kumagai, 1988; Lin, 1991; Mattila, 1990; Orosz, 1982; Reem, 1983; Sawada, 1987; Schreiber, 1992; Schreiber und Crabtree, 1992; Siekierka und Sigal, 1992; Sigal und Dumont, 1992; Tocci, 1989). Die Daten legten nahe, dass Calcineurin a in vivo für die normale Expression von IL-2, IL-4 und IFNγ erforderlich ist.
  • Interessanterweise reagierten CNAα–/–B-Zellen normalerweise auf TNP-OVA und TNP-KLH, was nahe legt, dass die T-Zell-Hilfe für die Antikörper-Reaktion normal war. Warum die T-Zellen, die eine defektive antigen-spezifische Proliferations-Reaktion aufwiesen, nach wie vor eine normale Hilfe für B-Zellen bezüglich der Antikörper-Produktion bereitstellen konnten, ist unklar. Es ist möglich, dass, obwohl die mutierten T-Zellen langsamer proliferierten und reduzierte Mengen an Lymphokinen produzierten, die kleinere Menge an Lymphokinen und die kleinere Anzahl aktivierter T-Zellen die vorlagen, ausreichend waren, um den B-Zellen zu helfen, eine normale Antikörper-Reaktion aufzubauen.
  • Die defektive in vivo T-Zell-Reaktion mag auf Defekte in der T-Zell-Entwicklung zurückzuführen sein, weil angenommen wird, dass Calcineurin eine Rolle in der T-Zell-Entwicklung spielt. Es wurde dargestellt, dass CsA die Entwicklung reifer, einfach positiver (CD4+8 oder CD48+ TCR-αβ+Thymozyten hemmt (Jenkins, 1988; Gao, 1988). CsA stört ebenfalls die Deletion von Zellen, die selbst-reaktive TCR's in der Population einfach positiver Thymozyten tragen, die sich möglicherweise durch Hemmung des TCR-vermittelten Aktivierungs-induzierten Zelltodes (Jenkins, 1988; Shi, 1989) entwickeln. Jedoch schien die Thymozyten-Entwicklung in CNAα–/–Mäusen normal zu sein, die eine normale Zusammensetzung reifer und unreifer T-Zellen im Thymus und eine normale Vβ-Verwertung aufweisen. Darüber hinaus wurden weder die CNAα–/–Mäuse noch die RAG-2-CNAα–/– Chimären mit Autoimmun-Reaktionen in Verbindung gebracht (unsere unveröffentlichten Beobachtungen). CNAα ist für die Reifung von Thymozyten nicht absolut erforderlich, und ist wahrscheinlich für die Vermittlung der Wirkung von CsA auf die Thymozyten-Entwicklung in einfach positiven und auf die negative Selektion autoreaktiver Thymozyten nicht erforderlich. Wir können jedoch nicht die Möglichkeit ausschließen, dass, obwohl die mutierten T-Zellen phänotypisch normal sind, sie ein wenig nach Thymus-Selektion anergisiert sind und somit keine normale in vivo T-Zell-Reaktion errichten können.
  • Obwohl CNAα für die in vivo T-Zell-Reaktion erforderlich ist, ist für eine normale in vitro T-Zell-Reaktion auf Mitogene dieses nicht erforderlich. CNAα–/–T-Zellen reagierten auf in vitro Mitogen-Stimulierung normal. Dieses Ergebnis scheint früheren Erkenntnissen entgegenzuwirken, die CNAα mit der TCR vermittelten Proliferation und IL-2-Produktion in Verbindung brachten (O'Keefe, 1992; Clipstone und Crabtree, 1992; Frantz, 1994, Tsuboi, 1994). Vielleicht ist Calcineurin Aα normalerweise in das Transduzieren der TCR-vermittelten Signale involviert, jedoch könnten αCD3ε und ConA viel stärkere Signale als das Antigen bereitstellen. Das heißt, diese Mitogene greifen in andere Signal-Wege ein und vernebeln somit den Verlust der Calcineurin Aα-Funktion.
  • Proliferation und Lymphokin-Produktion von CNAα–/–T-Zellen war darüber hinaus sowohl durch CsA als auch FK506 vollkommen unhemmbar, was nahe legt, dass andere Proteine die immunsuppressive Wirkung der Arzneistoffe vermitteln können. Eines dieser Proteine könnte die Calcineurin Aβ-Untereinheit sein. Wenn es in Aβ in Jurkat-Zellen überexprimiert wird, weist es dieselben biologischen Aktivitäten wie die überexprimierte Aα-Untereinheit auf (Dr,. Stephen J. O'Keefe, nicht veröffentlichte Ergebnisse). Weiterhin sind 90–95% der übrigen Calcineurin-Aktivität, die in CNAα–/–T-Zellen zu finden ist, die am wahrscheinlichsten CNAβ zuzuschreiben ist, FK506-empfindlich. Diese beiden Beobachtungen legen nahe, dass CNAα–/– als ein immunsuppressives Arzneistoff-Ziel in den CNAα–/–T-Zellen dienen kann. Weitere Proteine könnten ebenfalls die CsA und FK506-Hemmung vermitteln, weil die nicht-Calcineurin-vermittelte und Aktivierungs-induzierte IL-2-Produktion in T-Zell-Linie 171 sowohl durch CsA als auch durch FK506 (Metcalfe, 1994) gehemmt wurde. Jedoch wiesen CNAα–/–T-Zellen eine Empfindlichkeit sowohl für CsA als auch für FK506 auf, was nahe legt, dass unter normalen Bedingungen, das heißt in Wildtyp T-Zellen, CNAα das primäre Ziel des Arzneistoff-Immunophilin-Komplexes ist, was wahrscheinlich auf die vorhenschende Präsenz des CNAα-Proteins in T-Zellen zurückzuführen ist.
  • Die Erkenntnis, dass CNAα–/–Mäuse einen merklichen Mangel in der T-Zell-Immunität aufweisen, legt nahe, dass Calcineurin α eine relevante Isoform von Calcineurin sein kann, die die Immunsupsression in Transplantations-Patienten vermittelt, die mit CsA oder FK506 behandelt werden. Jedoch verbleiben andere Ziele für diese Arzneistoffe, weil CNAα–/–T-Zellen gegenüber FK506 und CsA empfindlich sind. Wir glauben, dass Calcineurin Aβ einige der Funktionen von CNAα ersetzen könnte. Jedoch weist die Aα-Untereinheit einzigartige physiologische Funktionen auf, weil die CNAα–/–Mäuse Defekte in der T-Zell-Immunität und in anderen physiologischen Prozessen aufweisen.
  • Beispiel 2 Calcinein Aα, ein Target für CsA und FK506 ist ein Schlüssel-Signal-Molekül in der Ausbildung des Langzeitgedächtnisses
  • Calcineurin Aα (CNAα) Knockout-Mäuse wurden durch homologe Rekombinations-Standardtechniken erzeugt und durch ES-Zell-Manipulationen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind. Homozygote Mutanten sind nicht steril, sondern sind extrem schlechte Zuchttiere. Deswegen wurden die homozygoten Mutanten, die untersucht wurden, durch Paaren der heterozygoten Mutanten erzeugt, die Black Swiss/129-Hintergrund aufwiesen. Die Wildtyp-Wurfgeschwister aus diesen heterozygoten Paarungen wurden als Wildtyp-Kontrollen in den hierin präsentierten Studien verwendet (hierin nachstehend werden die homozygoten CNAα Knockout-Mäuse als Mutanten bezeichnet, und die Wildtyp-Wurfgeschwister-Kontrollen werden als Wildtyp bezeichnet).
  • Fehlen einer Calcineurin Aα Protein und Phosphatase-Aktivität im mutierten Gehirn beeinflusste seine Entwicklung nicht.
  • Die Einfügung einer Kopie eines neo-Gens in ein Exon von Calcineurin Aα führt zur strukturellen Störung des Genes und der mRNA Transcription. Eine Western Blot-Analyse von Ganzhirn-Homogenaten mit einem Calcineurin Aα spezifischen Peptid-Antikörper zeigte, dass im mutierten Gehirn kein Calcineurin Aα-Protein exprimiert wurde, wohingegen Calcineurin Aα im Wildtyp-Gehirn sehr reichlich vorhanden war. In denselben Homogenat- Mengen sondierten wir mit einem Calcineurin Aβ-spezifischen Peptid-Antikörper. Dort war eine ähnliche Menge an Calcineurin Aβ in den mutierten- und Wildtyp-Gehirnen vorliegend. Wir maßen ebenfalls die Calcineurin-Aktivität, d. h. die Okadainsäure-resistente und EGTA-empfindliche Phosphatase-Aktivität im Gehirn. Die Calcineurin-Phosphatase-Aktivität war in großem Maße im mutierten Gehirn reduziert. Die restliche Calcineurin-Aktivität im mutierten Gehirn könnte Calcineurin Aβ oder anderen Calcineurin-Isoformen zuzuschreiben sein.
  • Wie von anderen und aus unseren eigenen Daten gezeigt wird, ist Calcineurin Aα die vorherrschende Isoform der Calcineurin A-Untereinheit im Gehirn, und macht mehr als 85% des Gesamt-Calcineurin-Proteins aus, und mehr als 85% der Calcineurin-Phosphatase-Aktivität (Takaishi, 1991; Kuno, 1992). Bei Fehlen von Calcineurin Aα wurde die Expression und Aktivität der Aβ-Isoform nicht nach oben reguliert, was nahe legt, dass Aα und Aβ unterschiedliche physiologische Funktionen von sich selbst aus aufweisen, und dass Aβ sehr unwahrscheinlich Aα bezüglich seiner Funktion im mutierten Gehirn substituiert.
  • Die mutierten Gehirne waren kleiner als diejenigen der Wild-Typen. Das durchschnittliche Wildtyp-Gehirn wiegt 494,4 mg (n = 5), wohingegen das durchschnittliche mutierte Gehirn lediglich 408,8 mg (n = 4) wiegt, 85,7 mg leichter im Gewicht. Die Dichte der mutierten Gehirne war höher als diejenigen der Wildtyp-Gehirne.
  • Nach Fixierung in 4% Paraformaldehyd bei 4°C über Nacht und Übertragung auf 10% Saccharose in 4% Paraformaldehyd sanken die mutierten Gehirne zu Boden, während die Wildtyp-Gehirne aufschwammen (n jeweils 4). Durch ein sehr einfaches Verfahren bestimmt, waren die Volumina der mutierten Gehirne ungefähr 0,15 ml kleiner als diejenigen des Wildtyps, wohingegen sie lediglich 63 mg leichter waren, was eine 0,175 g/ml höhere Dichte zur Folge hatte (nach 4%iger Paraformaldehyd-Fixierung).
  • Histologische Studien zeigten keine groben Missbildungen oder andere Anomalien in den mutierten Gehirnen (Daten nicht dargestellt). Es existierten keine Unterschiede, die im allgemeinen Aufbau, neuronaler Morphologie und Neuronenanzahl in der Hirnrinde, in den subkortikalen Nuklei, einschließlich der Amygdala oder dem Rückmark nachgewiesen wurden. Keine neurofibrillären Knäuel oder andere zytoplasmatische Abnormalitäten von Nervenzellen oder anderer Zellpopulationen wurden identifiziert, und die Myelinisierung schien im gesamten zentralen Nervensystem sowohl in Wildtyp- als auch mutierten Mäusen normal zu sein. Jedoch schienen die mutierten Gehirne, insbesondere das Kleinhirn bzw. Cerebellum kleiner als diejenigen der Wildtyp-Wurfgeschwister zu sein. Durch Messen der Querschnittsflächen (mm2) erschienen die Hirn-Hemisphären in den Mutanten leicht kleiner als diejenigen im Wildtyp zu sein, jedoch waren die Unterschiede statistisch nicht signifikant (Wildtyp 53 ± 4,8, n = 5; Mutante 50,3 ± 4,8, n = 5; p = 0,43). Im Kleinhirn und in den Hirnstämmen existierten keine spezifischen Unterschiede zwischen den neuronalen und anderen Zellpopulationen, jedoch erschienen diese Strukturen insgesamt kleiner zu sein (Wildtyp 44,5 ± 3,8, n = 5; Mutanten 36,8 ± 4,1, n = 5; p = 0,0012) und die Dichte der Faserwege erschienen in den mutierten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen weniger zu sein (Daten nicht dargestellt).
  • Phänotypen der mutierten Mäuse ähneln den Manifestationen der CsA und FK506 Neurotoxizität
  • Mutierte Mäuse waren von den Wildtyp- und heterozygoten Wurfgeschwistern nicht unterscheidbar, wenn sie in einem Alter von drei Wochen abgestillt wurden. Sie pflegen und ernähren sich normal. Sie zeigten jedoch einige Phänotypen, die den Manifestationen einer CsA- und FK506-Neurotoxizität, die früher beschrieben wurde, ähnlich war. Die mutierten Mäuse wiesen ein motorisches Koordinationsdefizit (Ataxie) auf. Es existierte ein ernsthafter Tremor der Maße der Bewegungen in den Mutanten. Dieses motorische Defizit betraf nicht alle Mutanten im selben Ausmaß. Einige Mutanten zeigten schwerere motorische Probleme als andere. Dieses Phänomen wurde noch deutlicher, wenn die Tiere älter wurden. Im Vergleich zu den Wildtypen- wiesen die mutierten Mäuse einen anormalen Gang auf. Sie konnten auf einer geraden Linie nicht gehen, und hatten ungleichmäßige Gangarten. Die hinteren Gliedmaßen neigten dazu, auf dem Boden nachgeschleppt zu werden, und bewegten sich fast gleichzeitig anstelle einer alternierenden Bewegung. Schwere Anfälle wurden in den Mutanten beobachtet. Viele der Mutanten erfuhren ebenso einen Gewichtsverlust.
  • Während unserer Charakterisierung der CNAα–/–Mäuse erkannten wir, dass diese Mäuse eine reduzierte Lebenserwartung aufwiesen. Wenn sie in einem Alter von drei Wochen gescort wurden, existierte signifikant weniger (15%) homozygoter CNAα–/–Nachwuchs, was sich aus der Zwischenkreuzung zwischen heterozygoten Eltern (CNAα+/–xCNAα+/–) ergab, als erwartet (25%, p < 10–30). Die Überlebenden CNAα–/–Mäuse machten eine grob-normale Entwicklung durch, jedoch war ihre Lebenserwartung dramatisch verkürzt. Diese Mäuse wurden in einer virusfreien Einrichtung aufgezogen, in denen immundefiziente (RAG-2 defiziente) Mäuse eine normale Lebenserwartung aufwiesen (unsere nicht veröffentlichte Beobachtung). Pathologische Studien zeigten keine Hinweis auf ein konsistentes Infektionsmuster oder auf Autoimmunreaktionen (unveröffentlichte Beobachtungen). Deswegen spielt CNAα eine entscheidende Rolle in einigen physiologischen Prozessen, die für ein verlängertes Überleben essentiell sind, obwohl es für die Entwicklung nicht absolut erforderlich ist.
  • Mangelhaftes räumliches Lernen in der Morris Water Maze-Aufgabe
  • Unter Verwendung der Morris Water Maze-Aufgaben (Morris, 1981; Brandeis, 1989) testeten wir die mutierten Mäuse bezüglich ihrer räumlichen Lernfähigkeiten, eine Form von Lernen, die einen intakten Hippocampus erfordert (Morris, 1982; Sutherland, 1983). In dieser Aufgabe wurden die Tiere in einem runden Pool aus opaquem Wasser angeordnet, und sie lernen aus dem Wasser durch Schwimmen zu einer Plattform zu entfliehen. In der räumlichen Version der Morris Water Maze-Aufgabe ist die Plattform in Wasser eingetaucht, und die Tiere müssen den Ort der verborgenen Plattform im Vertrauen auf die räumlichen Signale erlernen, die durch ferne visuelle Objekte bereitgestellt werden, die den Pool umgeben. Während jedes Versuchs wird das Tier an einem der vier Startstellen im Pool angeordnet, und die Plattform-Position für jede individuelle Maus bleibt während des gesamten Trainings konstant. In der nicht-räumlichen Version der Morris Water Maze-Aufgabe ist die Plattform für die im Pool schwimmenden Tiere sichtbar, indem eine Flagge oben auf der Plattform angeordnet wird. Für jeden Versuch wurden die Tiere im Pool an einer der vier Startpositionen angeordnet, während die Plattform in einer der vier Plattform-Positionen alternierte. In dieser Aufgabe müssen die Tiere lernen, die Flagge mit der Position der Plattform in Verbindung zu bringen, und die räumliche Information ist irrelevant. Die verborgene Plattform- und die sichtbare Plattform-Versionen der Morris Water Maze-Aufgaben sind bezüglich Motivation und der Erfordernisse für das Sehen und der Schwimmfähigkeit ähnlich. Deswegen dient die sichtbare Plattform-Aufgabe als eine bedeutende Kontrolle für den verborgenen Plattformtest.
  • Wir starteten durch Testen der Wildtyp- (n = 11)- und der mutierten (n = 10)-Mäuse im verborgenen Plattform-Test mit einem Block aus vier Versuchen pro Tag, wobei jeder Versuch durch eine Stunde voneinander getrennt war. Das Training dauerte acht Tage lang. Am achten Tag durchlief eine Stunde nach dem letzten Trainingsversuch jedes Tier einen Probetest, bei dem die Plattform aus dem Pool entfernt wurde und jedes Tier 60 Sekunden lang nach der Plattform suchen gelassen wurde. Am nächsten Tag des Probeversuches wurden die Mäuse einem zufallsbedingten Plattform-Test unterzogen, das heißt ein Versuch mit der Plattform in ihrer ursprünglichen Anordnung und drei Versuche mit der Plattform an einer der Plattform-Stellen in den anderen drei Quadranten. Vierundzwanzig Stunden später wurden diese Tiere dem sichtbaren Plattform-Test mit drei Blöcken aus jeden Tag vier Versuchen, neun Blöcken des Trainings insgesamt, unterworfen. Die Daten wurden untersucht, nachdem das gesamte Training abgeschlossen war.
  • Im sichtbaren Plattform-Test wurden sowohl die Wildtypen als auch die Mutanten in zwei Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe (Wildtyp n = 10; Mutante n = 5) konnte die sichtbare Plattform innerhalb einer vernünftigen Latenz lokalisiert werden, wohingegen die andere (Wildtyp n = 1; Mutante n = 5) dies nicht konnte, was am wahrscheinlichsten auf das Fehlen einer Fluchtmotivation und, lediglich für Mutanten, auf ein motorisches Defizit zurückzuführen ist. Sowohl die Wildtyp- als auch mutierten Mäuse, die zur Durchführung der sichtbaren Plattform-Aufgabe in der Lage sind, sollten eine ähnliche Fluchtmotivation, Sehvermögen und motorische Fähigkeiten aufweisen, die zum Schwimmen zur Plattform erforderlich sind. So wurden lediglich die Daten von solchen Mäusen, die die sichtbare Plattform-Aufgabe durchführen konnten, untersucht, und die anderen wurden ausgeschlossen.
  • Es existiert kein signifikanter Unterschied zwischen den Wildtypen (n = 10) und den Mutanten (n = 5) in der Durchführung der sichtbaren Plattform-Aufgabe (p = 0,248), obwohl es zu Beginn des Training schien, dass die Mutanten längere Zeit dazu benötigten, die Plattform zu erreichen. Jedoch war die Gesamtleistung im verborgenen Plattform-Test der Wildtypen signifikant besser als diejenige der Mutanten (p < 0,00001). Die Mutanten lernten nicht, wie die untergetauchte Plattform zu lokalisieren war (p = 0,956) nach 32 Trainingsversuchen, wohingegen die Wildtypen sich durch Training signifikant verbesserten (p < 0,00001).
  • Im Probentest, bei dem die Plattform aus dem Pool entfernt wurde, benötigten die Wildtypen signifikant mehr Zeit bei der Suche im Zielquadranten, in dem sich die Plattform befand, als die Zeit, die sie in den anderen drei Quadranten verbrachten (p < 0,001), wohingegen die Mutanten nicht vorzugsweise den Zielquadranten durchsuchten (p = 0,41). Ebenfalls überquerten im Probentest die Wildtypen die Zielplattform-Position signifikant häufiger als die entsprechenden Positionen in den anderen drei Quadranten (p < 0,03), wohingegen die Mutanten die Zielplattformposition nicht häufiger als die anderen überquerten (p = 0,39). Im zufallsbedingten Plattformtest wurden die Latenzen zur Bestimmung der Plattform an ihrem originalen Ort (Ziel) oder an anderen drei neuen Orten (andere) bestimmt. Die Wildtyp-Mäuse fanden die Plattform an ihrer ursprünglichen Position viel schneller als an den anderen Positionen (p < 0,001), wohingegen kein Unterschied bezüglich der Mutanten (p = 0,47) bestand. All diese Tests bestätigten, dass unter Verwendung unserer Trainingsvorschrift die Wildtyp-Kontrollen lernten und sich daran erinnerten, die Plattform unter Verwendung räumlicher Signale zu lokalisieren, und die Mutanten taten dies nicht.
  • Angst-Konditionierungsstudien
  • Die Angst-Konditionierung ist die Form eines assoziativen Lernens, bei dem ein emotional neutraler konditionierter Stimulus (CS), wie beispielsweise ein Ton, Licht oder die ausgeprägte bzw. verschiedene Umgebung (Kontext), in der die Ereignisse eintreten, mit einem aversiven, unkonditionierten Stimulus (US) gepaart wird, wie beispielsweise ein Fuß-Schock. Der CS erwirbt mittels seines Verhältnisses zu dem US aversive Eigenschaften und zeigt Reaktionen, die charakteristischerweise durch aversive Stimuli hervorgerufen werden, das heißt Frieren bzw. Erstarren, Defäkation, Piloerektion etc. (Blanchard und Blanchard, 1969; Bolles und Fanselow, 1980). In der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung ist der CS der Kontext, in dem die Tiere dem US gegenüber exponiert werden, und diese Art von Lernen hängt von Hippocampus- und amygdaler Funktionen ab (Kim, 1993; Phillips und LeDoux, 1992). In der signal-abhängigen Angst-Konditionierung ist der CS ein Ton, der in einer temporalen Weise mit dem US in Beziehung steht, und diese Art von Lernen hängt von den Amygdala-, jedoch nicht von den Hippocampus-Funktionen ab (Kim, 1993; Phillips und LeDoux, 1992). Wir überprüften die Leistung der mutierten Mäuse sowohl in kontext- als auch ton-abhängigen Angst-Konditionierungs-Tests.
  • Weil gezeigt wurde, dass Veränderungen in der Schmerzempfindlichkeit die Frier-Performance beeinträchtigen (Fanselow und Bolles, 1979; Fanselow und Bolles, 1979; Fanselow, 1986), war es wichtig, zu bestimmen, ob die Mutanten veränderte nozizeptive Reaktionen auf Fuß-Schocks aufwiesen, das heißt Zurückweichen, Rennen/Hüpfen und Vokalisierung. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den Schock-Intensitäten, die verursachten, dass die Wildtypen und die Mutanten zurückschreckten und vokalisierten (Zurückschrecken, p = 0,71; Vokalisierung, p = 0,94). Tatsächlich war die Intensität, die verursachte, dass die Mutanten liefen/hüpften, geringer als diejenige für die Wildtypen (p = 0,012). Dies legt nahe, dass die Schmerzempfindlichkeit der Mutanten normal war, wenn nicht ein wenig mehr empfindlich als die Wildtyp-Kontrollen. Somit konnte das Fehlen von Frieren in den Angst-Konditionierungs-Tests nicht durch Veränderungen in der Schmerzempfindlichkeit verursacht sein.
  • Lernen und Gedächtnis in der ton-abhängigen Angst-Konditionierung
  • In der ton-abhängigen Angst-Konditionierung wurden Wildtyp- und mutierte Tiere in der Schock-Kammer für drei Minuten angeordnet und darauf drei 20-Sekunden langen, lauten Tönen (CS) (3 Minuten Abstand) und einem Fuß-Schock (US) bei Beginn jedes Tones ausgesetzt. Eine Stunde, zwei Stunden oder vierundzwanzig Stunden nach dem anfänglichen Training wurden die Tiere in einer anderen Kammer getestet, um die verwirrende Wirkung der kontext-abhängigen Konditionierung zu minimieren. Man ließ sie in der neuen Kammer drei Minuten vor Beginn des Tones verbleiben, der zumindest für drei weitere Minuten aufrechterhalten wurde. Das Frieren wurde durch ein Zeitabfrageverfahren überwacht.
  • Die Wildtyp- und mutierten Mäuse verhielten sich während und sofort nach dem Training (p 0,396) ähnlich, und der Trainingseffekt war für beide Gruppen stark (p < 0,000001), was nahe legt, dass kein Unterschied zwischen den Wildtypen und Mutanten in ihrem assoziativen Lernvermögen und Kurzzeit-Gedächtnis bestand. Wenn sie bei einer Stunde nach dem Training getestet wurden, wiesen die Wildtypen im Vergleich zu den ersten drei Minuten ohne Ton ein signifikant erhöhtes Frieren bei Beginn des Tones (p = 0,0011) auf, was auf das Vorhandensein einer ton-abhängigen Erinnerung hinweist. Die Mutanten zeigten ebenfalls ein gewisses ton-abhängiges Gedächtnis, wie es durch eine Zunahme des Frierens bei Beginn des Tones unter Beweis gestellt wurde (p = 0,0034), dies sollte jedoch als gerigfügig signifikant betrachtet werden, weil die Statistik inakkurat ist, wenn ihre Prozentsätze des Frieren sehr klein waren. Bei einer Stunde nach dem Training existiert eine signifikante Abnahme der tonabhängigen Erinnerung für die Mutanten, wenn sie mit den Wildtypen verglichen wurde (p = 0,0025).
  • Wenn er bei zwei Stunden oder vierundzwanzig Stunden nach dem Training getestet wurde, zeigte der Wildtyp ebenfalls ein signifikant erhöhtes Frieren bei Beginn des Tons (p = 0,026 bzw. p = 0,011), wohingegen die Mutante dies nicht zeigte (p = 0,731 und p = 0,888), was nahe legt, dass das geringe ton-abhängige Gedächtnis, das in den Mutanten bei einer Stunde nach dem Training vorlag, bei zwei Stunden nach dem Training verloren gegangen war. Im Vergleich zu den Wildtypen zeigten die Mutanten ein mangelhaftes ton-abhängiges Gedächtnis sowohl nach zwei als auch vierundzwanzig Stunden nach dem Training (p = 0,0043 bzw. p < 0,00001).
  • Bei zwei Stunden zeigten die Wildtypen signifikant mehr ton-abhängiges Frieren als bei einer Stunde, was eine Konsolidierung des Gedächtnisses nahe legt (Rozin, 1976; Squire, 1984; Zerbolio, 1969; Rudy und Morledge, 1994; Kim, 1992). Es existierte kein Unterschied zwischen ihren Leistungen bei zwei und vierundzwanzig Stunden nach dem Training. Es existierte kein signifikanter Unterschied der Leistung der Mutanten zwischen entweder einer und zwei Stunden oder zwei und vierundzwanzig Stunden (p = 0,183 bzw. p = 0,473).
  • Das Lernen und das Gedächtnis in der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung
  • In der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung wurden Wildtyp- und Mutanten-Tiere in der Schock-Kammer (CS) für drei Minuten angeordnet, und wurden drei Fuß-Schocks (US) (1 Minute Abstand) ausgesetzt. Bei ein, zwei und vierundzwanzig Stunden nach dem Training wurden die Mäuse erneut in die Schock-Kammer geführt, um ihr kontext-abhängiges Gedächtnis für vier Minuten zu testen.
  • Sowohl die Wildtyp- als auch die mutierten Mäuse zeigten ein kontext-abhängiges Lernen mit dem Drei-Fuß-Schock-Protokoll (Wildtyp p = 0,015, Mutante p = 0,013). Insgesamt existierte kein signifikanter Unterschied zwischen den Wildtyp- und mutierten Mäusen in ihrer Leistung während des Trainings (für die Lernkurven, p = 0,497; für die Frier-Reaktionen in den drei Minuten nach Beginn des ersten Fuß-Schocks, p = 0,158). Obwohl jedoch der mutierte- und Wild-Typ keine signifikanten Unterschiede beim Frieren in der vierten und fünften Minute zeigte (p = 0,38 bzw. p = 0,43), fror die mutierte Maus weniger als der Wildtyp bei der sechsten Minute (marginal signifikant, p = 0,050), was ein sehr mildes Defizit im kontext-bezogenen Lernen in der Mutante nahe legt.
  • Bei einem Test eine Stunde nach dem Training bestand kein signifikanter Unterschied im Frieren im Kontext zwischen dem Wildtyp und den mutierten Mäusen (p = 0,109), was eine ähnliche Beibehaltung des kontext-abhängigen Gedächtnisses in beiden Gruppen nahe legt. Es schien jedoch eine leichte Neigung bei den Mutanten zu bestehen, weniger als die Wildtypen zu frieren, was auf das milde Lerndefizit der Mutanten zurückzuführen sein mag. Wenn sie bei zwei und vierundzwanzig Stunden getestet wurden, zeigten die Mutanten signifikant weniger Frieren als die Wildtypen (p = 0,011 bzw. p = 0,0043). Es existierte jedoch keine Abnahme der Frier-Reaktion für die Mutanten zwischen einer und zwei Stunden nach dem Training (p = 0,78). Deswegen mag der signifikante Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante bei zwei Stunden durch die leichte Zunahme der Reaktion des Wildtyps verursacht sein (p = 0,08) aufgrund des Gedächtnis-Konsolidierungsprozesses (Rozin, 1976; Squire, 1984; Zerbolio, 1969; Rudy und Morledge, 1994; Kim, 1992). Es existierte eine signifikante Abnahme in der Frier-Reaktion für die Mutanten zwischen zwei und vierundzwanzig Stunden (p = 0,023), wohingegen die Reaktionen der Wildtypen ähnlich blieben (p = 0,29). Dies legt nahe, dass die Mutanten begannen, zwischen zwei und vierundzwanzig Stunden, am wahrscheinlichsten aufgrund ihres Unvermögens, Informationen zu einem Langzeitgedächtnis zu konsolidieren, verloren.
  • Diskussion
  • CNAα vermittelt die CsA und FK506 Neurotoxizität
  • CsA und FK506 wurden erfolgreich dazu verwendet, Transplantatabstoßungen in Gewebstransplantationen zu vermeiden (Schreiber und Crabtree, 1992; Siekierka und Sigal, 1992). Diese Arzneistoffe binden an ihre jeweiligen Bindungsproteine, Cyclophiline und FK506-Bindungsproteine (FKBP), die kollektiv als Immunophiline bezeichnet werden. Der Arzneistoff-Immunophilin-Komplex bindet an Calcineurin und hemmt die Phosphatase-Aktivität des Calcineurins (Liu, 1991) und stellt somit dessen immunsuppressive Wirkungen sicher. Jedoch ist die Verwendung dieser Arzneistoffe auch mit ernsthaften Nebenwirkungen bzw. unerwünschten Wirkungen verbunden, in erster Linie eine Neuro- und Nieren-Toxizität (Siekierka und Sigal, 1992). Es ist sehr wichtig, zu bestimmen, ob die immunsuppressiven Funktionen dieser Arzneistoffe und ihre Nebenwirkungen mechanistisch verbunden sind. Diese Information wäre zur Behandlung von Transplantationspatienten mit immunsuppressiven Arzneistoffen, und für die Entwicklung besserer immunsuppressiver Arzneistoffe mit weniger Nebenwirkungen nützlich.
  • Die CNAα-defizienten Mäuse zeigten Symptome, die der durch CsA und FK506 induzierten Neuro-Toxizität ähnlich waren, einschließlich Veränderungen der Gehirndichte, eines ernsthaften bzw. schwerwiegenden Tremors, Anfälle, cerebelarer Ataxie, Verhaltensstörungen, Gewichtsverlust und erhöhter Mortalität (Miach, 1986; Wilson, 1988; Labar, 1986; Atkinson, 1984; Menegaux, 1994; Rodriguez, 1992; Appleton, 1989; Lane, 1988; Reece, 1991; Truwit, 1991). Wir schlagen vor, das CNAα ein Mediator der Neuro-Toxizität der Arzneistoffe ist. Wir haben ebenfalls kürzlich demonstriert, dass CNAα eine relevante Isoform bei der Vermittlung der immunsuppressiven Wirkung der Arzneistoffe auf T-Zellen ist. Somit sind die immunsuppressiven Funktionen von CsA und FK506 und deren Neuro-Toxizität mechanistisch verbunden, das heißt durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität der CNAα's.
  • Es wurde vorgeschlagen, dass die neuro-toxischen Wirkungen von CsA durch Metaboliten vermittelt wurden, durch einen Effekt auf die Blut-Hirn-Schranke (Laue, 1988). Jedoch war CsA in jedem untersuchten Maus-Organ zu finden, einschließlich des Gehirns, nach subkutaner Verabreichung des Arzneistoffes in einer dosisabhängigen Weise (Boland, 1984). Dies legte nahe, dass der Arzneistoff dazu in der Lage war, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, abhängig von seinen Serumkonzentrationen. Im Gehirn wurden FKBP12 (und zwölf Kilodalton FK506 Bindungsprotein) und Cyclophiline in reichem Maße gefunden und in Co-Lokalisierung mit Calcineurin (Steiner, 1992; Dawson, 1994; Snyder und Sabatini, 1995). Die gemeinsame bzw. Co-Lokalisierung von FKBP12 und Cyclophilin mit Calcineurin würde es diesem ermöglichen, an die Arzneistoffe zu binden, die in das Hirn eindringen und deren Hemmung von Calcineurin zu vermitteln, wodurch die Neuro-Toxizität verursacht wird. FKBP12-Lokalisierungen sind fast ausschließlich neuronal mit deutlichen regionalen Variationen, die solchen von Calcineurin ähneln, während, selbst wenn die Cyclophilin-Lokalisierungen ebenfalls derjenigen von Calcineurin sehr ähnlich sind, einige Gehirnbereiche existieren, die bezüglich Cyclophilin angereichert sind, denen Calcineurin fehlt (Steiner, 1992; Dawson, 1994; Snyder und Sabatini, 1995). Der Unterschied zwischen FKBP12 und der Cyclophilin-Lokalisierung würde voraussagen, dass FK506 schwerere Nebenwirkungen aufweist. Tatsächlich weist FK506 schwerere Neuro-Toxizität als CsA auf (Anonym, 1994; Mueller, 1994). Diese Erkenntnisse stützen unsere eigenen Erkenntnisse, dass CNAα die CsA- und FK506-Neuro-Toxizität vermittelt.
  • Es wurde kürzlich vorgeschlagen, dass der Emulgator für CsA in klinischen i. V. Formulierungen bzw. Zubereitungen, nämlich Cremophor EL, beinahe für die gesamte Neuro-Toxizität von klinisch hergestelltem CsA bezüglich der Wirkung auf die Elaboration von Neuriten durch N1 E. 115 Neuroblastom-Zellen (Brat, 1992) verantwortlich war. Im klinischen Sinne ist es wert zu betonen, dass, obwohl der Emulgator ebenfalls zur Neuro-Toxizität beitragen kann, die Wirkungen von CsA und FK506 selbst, das heißt die Hemmungen der CSAα-Aktivität, ernste neuronale Nebenwirkungen verursachen kann.
  • Wenn verschiedene Blut- und Serumparameter, einschließlich ALT, Bilirubin, Urea bzw. Harnstoff, Creatinin und Glukose alleine oder in einer multi-variablen Weise analysiert wurden, korrelierten sie signifikant mit der Inzidenz und dem Schweregrad einer frühen postoperativen Neuro-Toxizität, was nahe legt, dass die Neuro-Toxizität im Anschluss an Lebertransplantationen durch verschiedene Faktoren verursacht sein kann, und nicht ausschließlich eine Arzneistoff-spezifische Nebenwirkung der Immunsuppression ist (Mueller, 1994). Selbst wenn unsere Daten zeigten, dass ein Fehlen von CNAα selbst ausreichend ist, um die Neuro-Toxizität zu verursachen, was nahe legt, dass dessen Nebenwirkung Arzneistoff-spezifisch ist, können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass eine Fehlfunktion anderer Organe, die auf das Fehlen von CNAα zurückzuführen ist, ebenfalls zum Symptom beiträgt. Weitere Studien sind erforderlich, um diese Frage zu beantworten.
  • CNAα-defiziente Mäuse weisen eine erhöhte Mortalitätsrate auf, was auch bei CsA- und FK506 behandelten Kindern und erwachsenen Patienten berichtet wurde (Menegaux, 1994) sowie auch bei Mäusen (Boespflug, 1989). Bei Ratten senkt CsA die Anfallsschwelle und erhöht möglicherweise die Anfälligkeit gegenüber Anfällen und 20 mg/kg/pro Tag i.p. CsA verursachten signifikante EEG-Abnormalitäten und Mortalität (Racusen, 1990). Warum diese Mäuse starben ist für uns unklar. Die CNAα-defizienten Mäuse können als Tiermodell zur Studie der immunsuppressiven Wirkung und Nebenwirkungen von CsA und FK506 dienen.
  • CNAα ist in das Hippocampus-abhängige räumliche Lernen involviert und spielt eine entscheidende Rolle bei der Langzeit-Gedächtnisbildung
  • Calcineurin Aα-defiziente Mäuse weisen ein motorisches Defizit auf, das die Mutanten in unterschiedlichem Ausmaß beeinträchtigt. Jedoch ist dieses motorische Defizit nicht für das mangelhafte räumliche Lernen in der Morris Water Maze-Aufgabe verantwortlich, weil diese Mutanten die sichtbare Plattform genauso schnell wie die Wildtypen finden können, was nahe legt, dass die mutierten Mäuse die motorischen Fähigkeiten aufweisen, die dazu erforderlich sind, in einer ähnlichen Geschwindigkeit wie die Wildtyp-Mäuse zu schwimmen. Dieses motorische Defizit ist nicht für das schwache Defizit im kontextualen bzw. kontextbezogenen Lernen verantwortlich, wenn sie in den Angst-Konditionierungsstudien bezüglich ihres Langzeitgedächtnisses getestet wurden, weil die mutierten Mäuse dazu in der Lage sind, die frierende Körperhaltung beizubehalten und eine Frier-Reaktion über eine verlängerte Zeitspanne aufweisen.
  • Diese Mäuse sind jeweils nicht blind, weil sie die sichtbare Plattform sehen können. Wir können jedoch die Möglichkeit nicht ausschließen, dass diese Mäuse ein wenig kurzsichtig sind, so dass sie die entfernteren räumlichen Signale nicht genauso klar sehen können, obwohl eine Kurzsichtigkeit von Mäusen in der Literatur nicht berichtet wurde. Weiterhin ist die Schock-Kammer für die Angst-Konditionierungs-Studien eine sehr kleine Kammer. Die mutierten Mäuse sollten dazu in der Lage sein, den Kontext innerhalb der Kammer zu erkennen, und sie weisen bis jetzt ein mildes Defizit im kontext-abhängigen Lernen auf, was nahe legt, dass das Sehvermögen in unseren Studien kein bestimmender Faktor ist.
  • CNAα-defiziente Mäuse scheinen ein normlales assoziatives Lernvermögen aufzuweisen, weil sie dazu in der Lage waren, die sichtbare Plattform Morris Water Maze-Aufgabe durchzuführen, und hatten gegenüber Fuß-Schocks Angstreaktionen. Jedoch schien ihr Hippocampus-abhängiges Lernen beeinträchtigt zu sein. Die mutierten Mäuse wiesen ein dramatisches Defizit beim raumbezogenen Lernen in der verborgenen Plattform Morris Water Maze-Aufgabe auf, jedoch nur ein geringes Defizit bei der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung. Es wurde gezeigt, dass beide Aufgaben Hippocampus-abhängig waren (Morris, 1982; Sutherland, 1983; Kim, 1993; Phillips und LeDoux, 1992).
  • Es wurde nahe gelegt, dass, um den Kontext zu konditionieren, ein Tier ein Konstrukt einer einheitlichen konfiguralen Repräsentation des Kontext aufwies (Nadel, 1985; Fanselow, 1990; Rudy, 1993). Es ist somit möglich, dass die Konstruktion einer solchen konfiguralen Darstellung durch den Hippocampus eine Calcineurin α-Funktion erfordert. In der kontextabhängigen Angst-Konditionierung zeigten die mutierten Mäuse aufgrund eines milden Defizits in der räumlichen Informationsverarbeitung ein mildes Defizit im Lernen. In der verborgenen Plattform Morris Water Maze-Aufgabe sind die räumlichen Signale viel weiter weg und viel komplexer als die Schock-Kammer, so dass die Konstruktion der "räumlichen Karte" schwieriger ist. Die größere Schwierigkeit dieser Aufgabe macht es schwerer zu lernen, und somit war das Lerndefizit in den mutierten Mäusen schwerwiegender. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass in der Morris Water Maze-Aufgabe das Langzeitgedächtnis für das Lernen in einem verteilten Versuchs-Verfahren für das Lernen entscheidend sein kann. Somit würde das Fehlen einer Langzeit-Gedächtnisfunktion (wie unten diskutiert) in den mutierten Mäusen zum Fehlen eines Lernens während acht Tagen des Trainings beitragen. Ein Massentrainingsverfahren sollte dazu in der Lage sein, das Fehlen an Langzeit-Gedächtnis zu kompensieren. Dieses Argument wird durch die Erkenntnis unterstützt, dass die CREB-defizienten Mäuse, die ein mangelhaftes Langzeit-Gedächtnis aufweisen, mit einem verteilten Trainings-Verfahren schlecht lernten, dass jedoch ihre Leistung derjenigen der Wildtyp-Kontrollen während eines Massentraining-Verfahrens ähnlich war (Bourtchuladze, 1994). Diese beiden Möglichkeiten stehen nicht im Konflikt miteinander, wobei beide zu dem schwerwiegenden Lerndefizit der mutierten Mäuse in der verbogenen Plattform-Aufgabe beitragen können. Dies ist mit den früheren Erkenntnissen konsistent, dass die Gedächtnisverschlechterung durch Erhöhung der Retentionsverzögerung der Mengen an Material, das gelernt werden soll, verschlimmert wird (Mishkin, 1978; ZolaMorgan und Squire, 1985; Squire und Zola-Morgan, 1991).
  • Es wurde kürzlich gezeigt, dass zwei zeitlich getrennte Formern des assoziativen Angst-Gedächtnisses bestehen, Kurzzeit und Langzeit, die die Frier-Reaktion aktivieren, die kurz nach dem Fuß-Schock entsteht (Zerbolio, 1969; Kim, 1992; Rudy und Morledge, 1994; Bourtchuladze, 1994). Die unmittelbar nach den Fuß-Schocks gemessene Frier-Reaktion ist das Ergebnis von assoziativem Lernen und Kurzzeit-Gedächtnis (Blanchard, 1976; Fanselow, 1986; Kim, 1992; Kim, 1993; Phillips und LeDoux, 1992; Rudy und Morledge, 1994; Bourtchuladze, 1994). Die CNAα-mutierten Mäuse zeigten eine normale Angstreaktion in der signalbedingten Angstreaktion, und eine Gesamtnormalreaktion in der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung, selbst wenn in der sechsten Minuten das Frieren der Mutanten marginal signifikant weniger betrug. Weiterhin war, wenn sie eine Stunde nach dem kontextabhängigen Training getestet wurden, kein signifikanter Unterschied zwischen den Wildtyp- und den mutierten Mäusen. All dies legt nahe, dass ihr Kurzzeit-Gedächtnis normal ist.
  • Die Bildung eines Langzeit- und stabilisierten Angst-Gedähtnisses erfordert einen zeitabhängigen Konsolidierungsprozess (Rozin, 1976; Squire, 1984; Zerbolio, 1969; Rudy und Morledge, 1994; Kim, 1992). Das Zeitfenster für den Konsolidierungsprozess erwies sich als zwischen 10 Minuten bis 24 Stunden nach dem Training bei einer Ratte (Rudy und Morledge, 1994) und zwischen 15 Minuten bis 2 Stunden in Mäusen (Zerbolio, 1969). In unseren Studien machten die Wildtyp-Kontrollen zwischen einer und zwei Stunden nach dem Training eine Gedächtnis-Konsolidierung durch, während die mutierten Mäuse dies nicht tun, was somit den schrittweisen Verlust des Angst-Gedächtnisses in den Mutanten verursacht. Somit, wie Rudy und Morledge aus ihrer Studie der infantilen Amnesie schlossen (Rudy und Morledge, 1994) zeigen unsere Studien, dass CNAα-defiziente Mäuse ein mangelhaftes Langzeit-Gedächtnis aufgrund eines Mangels in der Gedächtnis-Konsolidierung aufweisen. Die Retentionsperiode für das ton-abhängige oder das kontext-abhängige Kurzzeitgedächtnis scheint verschieden zu sein, wobei das des ton-abhängigen Gedächtnisses kürzer ist. Dies stimmt mit früheren Erkenntnissen überein, dass der Zeitverlauf der Amnesie sich für unterschiedliche Aufgaben unterscheidet, die unterschiedliche neuro-anatomische Strukturen involvieren (Kim und Fanselow, 1992; Kim, 1993; Phillips und LeDoux, 1992; Bourtchuladze, 1994).
  • Warum das Fehlen an CNAα ein Defizit in der Bildung des Langzeit-Gedächtnisses verursachen kann, ist nicht klar. Wir möchten postulieren, dass CNAα ein Schlüsselsignal-Molekül in solchen Prozessen ist. Jedoch, selbst wenn der mediale temporale Lappen für die Gedächtnisfunktion von Bedeutung ist (Squire und ZolaMorgan, 1991), legen Beweismittel ebenfalls nahe, dass das Kleinhirn in höhere, kognitive Funktionen involviert ist (Middleton und Strick, 1994). Somit könnte das kleinere Kleinhirn in den mutierten Mäusen deren Funktion beeinträchtigen. Mehr Studien sind dazu erforderlich, um weiter die Rolle der CNAα's in den neuronalen Aktivitäten zu überprüfen.
  • Schlussfolgerungen
  • Wir schließen aus unserer Studie der CNAα-defizienten Mäuse, dass CNAα die CsA- und FK506-Neuro-Toxizität vermittelt, und dass CNAα eine Rolle bei der Prozessierung bzw. Verarbeitung räumlicher Informationen und der Bildung des Langzeit-Gedächtnisses spielt. Huang, Li und Kandel hatten postuliert, dass sowohl die NMDA-abhängigen als auch NMDA-unabhängigen Wege bzw. Pfade ein gemeinsames Spätphasen LTP teilen, das mRNA und Protein-Synthese-abhängig ist, in das cAMP-abhängige Kinase involviert ist, und das zu einer Gedächtnis-Konsolidierung führt (Huang, 1994). Es ist wahrscheinlich, dass Calcineurin ein Schlüsselsignal-Molekül in einem solchen Prozess ist, dessen Aktivierung zur Transkription und Translation von Proteinen führen würde, die für einen gemeinsamen Gedächtnis-Konsolidierungsprozess erforderlich sind.
  • Beispiel 3 Tau und Neufilament in Calineurin Aα-defizienten Mäusen
  • Wir studierten die Rolle von Calcineurin Aα in der Regulierung des Phosphorylierungsstatus von Zytoskelett-Proteinen im Gehirn. Bei Mäusen, denen die α-Isoform der Calcineurin A-Untereinheit fehlt (CNAα), existiert eine hyperphosphoryliertere Form des Tau-Proteins, das der Hauptbestandteil der gepaarten helikalen Filamente (PHF) ist, die in der Alzheimer Krankheit zu finden sind. Die Hyperphosphorylierung von Tau ist in der Hippocampus-Moosfaser-Region der mutierten Mäuse tiefschürfender. Zusätzlich enthielten die Moosfaser-Axons der CNAα Mäuse weniger Neurofilament-Proteine als der Wildtyp. Elektromikroskopische Untersuchungen von Moosfasern zeigten ein größeres Mikrotubuli/Neufilament-Verhältnis im mutierten Gehirn als im Wildtyp-Gehirn. Unsere Erkenntnisse zeigen, dass CNAα die Phosphorylierungen von Zytoskelett-Proteinen reguliert, entweder direkt oder indirekt. Der veränderte Phosphorylierungsstatus von Tau kann funktionelle Folgen aufweisen, die für die Alzheimer Krankheit relevant sind.
  • Die Alzheimer Krankheit ist eine degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems, die Mängel im Gedächtnis und in der Kognition zur Folge hat. Die pathologischen Kennzeichen dieser Erkrankung schließen neuritische Plaque ein, die das Amyloid Aβ-Protein zusammen mit mehreren pathologischen Chaperonen und neurofibrillären Knäueln (NFT) gepaarter helikaler Filamente (PHF) enthalten. Es stellte sich heraus, dass Antikörper, die gegen gereinigtes PHF gezüchtet wurden, hyperphosphorylierte Formen des mikrotubuliassoziierten Proteins Tau erkannten, von denen dann gezeigt wurde, dass sie die Hauptbestandteile von PHF sind. Es wird angenommen, dass Tau normalerweise in die Aufrechterhaltung und Entwicklung der axonalen Morphologie involviert ist (Goedert, 1993).
  • Es wurde gezeigt, dass Calcineurin eine enge Verbindung mit der Zytoskelett-Bildung oder – Funktion aufweist. In vitro dephosphoryliert Calcineurin mikrotubulus-assoziiertes Protein 2 (MAP2) und Tau, die von PKA und CaM-Kinase phosphoryliert werden, und Tubulin, das durch CaM-Kinase phosphoryliert wird (Goto, 1985; Drewes, 1993; Gong, 1994). Calcineurin wurde aus adrenalem Zell-Zytoskelett identifiziert und isoliert, und war dazu in der Lage, Zytoskelett-Proteine zu dephosphorylieren (Papadopoulos, 1990; Papadopoulos, 1989). Es wird ebenfalls mit dem Zytoskelett in Wachstumszapfen der sich entwickelnden cerebellaren Neurone angereichert (Ferreira, 1993). In CsA injiziertem Rattengehirn korreliert die Hemmung der Calcineurin-Phosphatase-Aktivität mit der Akkumulierung von phosphoryliertem Neurofilament und vielleicht von Tau (Tanaka, 1993).
  • Wegen der potentiellen Rolle des Calcineurins in der Regulierung des Phosphorylierungs-Status und der Funktion von Zytoskelett-Proteinen haben wir seine Funktion in vivo durch Überprüfung der Phosphorylierung dieser Proteine in Mäusen überprüft, die bezüglich der α-Isoform der Calcineurin A-Untereinheit (CNAα) defizient waren. Mutierte Mäuse zeigen eine größere Zunahme im Grad der Tau-Phosphorylierung, wie durch Anti-PHF-Antikörper nachgewiesen. Der Grad der PHF-Immun-Reaktivität in den mutierten Mäusen war in den Moosfasern des Hippocampus am höchsten. Im selben Areal existierte eine gesenkte Neurofilament-Immun-Reaktivität im Mutanten-Hippocampus. Diese Ergebnisse sind die ersten Dokumentationen einer Rolle für Calcineurin in der Tau-Phosphorylierung in vivo und legen nahe, dass eine geeignete Zytoskelett-Bildung von der korrekten Balance der Phosphorylierung von Tau und vielleicht anderer Proteine abhängt.
  • Wir haben phosphorylierungs-abhängige oder -unabhängige Antikörper verwendet, um die neuro-pathologischen Wirkungen des Verlustes der CNAα-Funktion zu untersuchen. Von speziellem Interesse war der PHF-1 monoklonale Antikörper, der gegen PHG gezüchtet wurde, das aus an Alzheimer Krankheit erkrankten Gehirn aufgereinigt wurde (Greenberg, 1992). Das Antigen, das von PHF-1 am klarsten erkannt wurde, zeigte sich als eine phosphorylierte Form des mikrotubulus-assoziierten Proteins Tau. Die Abhängigkeit des PHF-1 Antikörpers vom Phosphorylierungszustand von Tau wird durch die Tatsache demonstriert, dass eine Immunfärbung mit PHF-1 aufgehoben wird, wenn das PHF-Tau mit Calcineurin dephosphoryliert wird (Gong, 1994). Ein anderer Antikörper, der in unserer Studie verwendet wird, ist Tau-1 (Binder, 1985), der dephosphoryliertes Tau, jedoch nichtphosphoryliertes Tau erkennt, was den spezifischen Nachweis von Nicht-PHF-Tau ermöglicht. Zwei andere Antikörper, von denen angenommen wird, dass sie phosphorylierungs-unabhängig sind, nämlich Tau-2 und 5E2 wurden ebenfalls getestet (Kosik, 1988).
  • Die Hirnhomogenate wurden aus 2–4 Monate alten gematchten bzw. zueinander passenden Wild-Typ und mutierten Mäusen hergestellt, und der Phosphorylierungszustand der Proteine wurde mit unterschiedlichen Antikörpern sondiert. Eine Western-Analyse zeigte eine konsistente Zunahme (bis zu 7-fach) der PHF-1 Immunreaktivität in mutierten Mäusen. Die mutierten Mäuse wiesen entweder die gleiche oder gelegentlich gering niedrigere Menge an dephosphoryliertem Tau auf, wie durch die τ-1 Antikörper-Färbung dargestellt wurde. Wenn die Blots mit den phosphorylierungs-unabhängigen Antikörpern Tau-2 und 5E2 immun gefärbt wurden, existierte eine geringgradig stärkere Reaktion mit den mutierten Mäusen als mit dem Wildtyp (Daten nicht dargestellt). Dies zeigt an, dass die erhöhte Färbung mit PHF-1 in den mutierten Mäusen eine spezielle Zunahme der PHF-Form (hyperphosphoryliert) von Tau eher als eine allgemeine Zunahme aller Formen von Tau wiederspiegelt. Somit verursachte das Fehlen einer CNAα-Funktion eine Verschiebung des Tau-Phosphorylierungszustandes und ebenfalls vielleicht eine leichte Zunahme der Gesamt-Tau-Expression.
  • Wir haben als nächstes versucht, die Gehirnregionen zu bestimmen, die durch Hyperphosphorylierung von Tau beeinträchtigt war, und ob neurofibrilläre Knäuel im mutierten Gehirn zurückblieben. Eine Immun-Histochemie wurde auf Hippocampus-Schnitte mit Anti-PHF-Antikörpern durchgeführt. Eine erhöhte Immun-Reaktivität wurde konsistent im Hippocampus mutierter Mäuse beobachtet, wenn sie mit Wildtyp-Mäusen verglichen wurden. Die intensivste Immunreaktivität erfolgte im Stratum Lucidum der CA3-Region, und eine gewisse Färbung wurde ebenfalls im Hilus des Gyrus Dentatus beobachtet. Bei einigen der mutierten Mäuse wurde eine Färbung sowohl in infra-pyramidalen als als suprapyramidalen Schichten beobachtet. Die PHF-Färbung in den Mutanten entsprach den Zellkörpern von Körnern und pyramidalen Zellen nicht. Die Lokalisierung und Orientierung der Färbung ist am meisten mit den Moosfaser Axons konsistent, die aus dem Gyrus Dentatus in die CA3-Region vorspringen. Wir konnten unter Verwendung von Kongo-Rot oder Bielchowsky's Silber-Färbung keine Plaque oder Knäuel identifizieren. Das Fehlen von Silber-Färbungs-Plaques und Knäueln ist nicht unerwartet, weil in der Alzheimer Krankheit eine positive Immunfärbung mit Anti-PHF-Antikörpern jeglichen positiven Silber-Färbungs-Knäueln lange Zeit vorhergeht (Braak, 1994).
  • Neurofilamente werden in unterschiedlichem Umfang abhängig von ihrer Lokalisierung und Reifung phosphoryliert. Es wurde vorgeschlagen, dass sie die Axon-Dicke und Stabilität vermitteln und den Axon-durchmesser modulieren (de Waegh, 1992; Hoffman und Cleveland, 1988). Eine Immunfärbung mit einem Antikörper (SMI32), der nichtphosphorylierte Neurofilamente erkennt, zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen Wildtyp- und mutierten Mäusen (Daten nicht dargestellt). Eine Immunfärbung mit Antikörpern, die gegen phosphoryliertes Neurofilament gerichtet sind, einschließlich SMI34 und SMI310, die intrazellulär und extrazellulär jeweils neurofibrilläre Knäuel färben, zeigte eine leicht stärkere Reaktion in Wildtyp- als in den mutierten Mäusen. Diese Daten legen nahe, dass kein Unterschied im Phosphorylierungsstatus der Neurofilamente zwischen den Wildtyp- und den mutierten Gehirnen bestand.
  • Wir beobachteten interessanterweise, dass Verfahren, die eine starke Bielchowsky-Silber-Färbung in der CA3-Region in den Wildtyp-Mäusen zeigten, in mutierten Mäusen nicht färbten.
  • Die Bielchowsky-Silber-Färbung markiert normalerweise Axons, und ein Verlust einer solchen argyrofilen Färbung wurde bei der Ischämie in degenerierenden Axons beobachtet. Das Silber-Färbungsmuster der Moosfasern des Wildtyp erinnerte an das Anti-PHF-Färbemuster der mutierten Moosfasern, was nahe legt, dass die Moosfasern, die mit PHF-1 bei mutierten Mäusen positiv färbten, mit Silber nicht färben. Dieses Ergebnis könnte entweder eine Reduktion der Anzahl von Moosfaser-Axons oder eine Veränderung ihres Zytoskeletts widerspiegeln, weil angenommen wird, dass diese Silber-Färbung Zytoskelett-Elemente erkennt, insbesondere Neurofilamente.
  • Die Möglichkeit, dass die Neurofilamente in Moosfasern in mutierten Mäusen verändert werden, wurde direkt durch Färben von Schnitten mit einem Antikörper gegen die 68 kD-Untereinheit des Neufilaments in einer phosphorylierungs-unabhängigen Weise getestet. Wir beobachteten eine viel stärkere NF-Färbung in den Moosfasern von Wildtyp-Mäusen als denjenigen von mutierten Mäusen.
  • Wir haben ebenfalls die Folgen dieser Veränderungen auf die Ultrastruktur dieser Axons auf der Ebene des Elektronenmikroskops (EM) untersucht. Halbe Gehirne von perfundierten Tieren wurden postfixiert und für die EM prozessiert. Die Moosfasern wurden von den pyramidalen Neuronen von CA3 aufgespürt. EM-Studien zeigten, dass das Neurofilament-Mikrotubulus-Verhältnis im mutierten Moosfaserbereich gesenkt war. Die Wildtyp- Moosfasern wiesen viele Regionen mit reichlichen Neurofilamenten auf, wohingegen in den mutierten Moosfasern die neurofilament-reichen Regionen weniger häufig waren. Diese Erkenntnis bestätigte unsere Beobachtungen bei der Immunfärbung der Bielchowsky-Silber-Färbung.
  • Diskussion:
  • Tau ist ein mikrotubulus-assoziiertes Protein, das in erster Linie in den Axons lokalisiert ist; es wurde vorgeschlagen, dass es Kreuzbrücken zwischen Mikrotubuli und zwischen Mikrotubuli und Neurofilamenten bildet (Hirokawa, 1988). Es wurde darüber hinaus gezeigt, dass Tau Mikrotubuli stabilisiert und deren Zusammenlagerung fördert, eine Eigenschaft, die wahrscheinlich durch den Phosphorylierungszustand von Tau reguliert wird. Wenn Tau phosphoryliert wird, wird dessen Fähigkeit, die Mikrotubulus-Zusammenlagerung zu fördern, verringert (Brandt, 1994) (Drechsel, 1992; Lindwall und Cole, 1984). Es wurde kürzlich gezeigt, dass abnormal phosphoryliertes Tau aus Alzheimer Gehirn die Mikrotubulus-Zusammenlagerung hemmte, und dass seine Fähigkeit, die Mikrotubulus-Zusammenlagerung zu fördern, nach Dephosphorylierung wieder hergestellt wurde (Alonso, 1994). Es ist denkbar, dass eine Verschiebung der Tau-Phosphorylierung die Zytoskelett-Funktion stören könnte.
  • Tau gewann eine spezielle Aufmerksamkeit, wenn gezeigt wurde, dass die neurofibrillären Knäuel, die bei der Alzheimer Krankheit akkumulieren, in erster Linie aus hyperphosphoryliertem Tau zusammengesetzt sind. Unter Verwendung von Antikörpern gegen phosphoryliertes Tau wurden Veränderungen viel früher nachgewiesen, als die Entwicklung der argyrofilen Färbung und vor Auftreten irgendwelcher neurofibrillärer Knäuel von Amyloid-Plaque (Braak, 1994; Braak, 1994). Bei einer CNAα-defizienten Maus waren wir nicht dazu in der Lage, irgendwelche neurofibrillären Knäuel nachzuweisen. Es ist möglich, dass wir in einem frühen Stadium des Krankheits-Ausbruches suchten, und dass die Knäuel sich bilden können, wenn die Mäuse älter werden. Alternativ können die Eigenschaften des Maus-Tau-Proteins, insofern als neurofibrilläre Knäuel in den Mäusen nicht beobachtet wurden, die PHF-Bildung vorwegnehmen. Es ist zuletzt möglich, dass weitere Bestandteile für die Bildung der Knäuel verantwortlich sind, gerade wie pathologische Chaperone für die Alzheimer β-Protein-Polymerisierung zu Amyloid- Filamenten (Ma, 1994) erforderlich sind, wohingegen einige Bestandteile in CNAα-mutierten Mäusen nicht beeinträchtigt werden.
  • Die Hippocampus-Moosfasern, die aus den Körnerzellen in CA3 hervorstehen, sind angenommenerweise in das Gedächtnis und Lernen involviert. Die Körnerzellen zeigen eine postnatale Neurogenese, und es wurde vorgeschlagen, da s sie bezüglich ihrer Fähigkeit, zur Bildung neuer Synapsen, sehr plastisch sind. Eine solche Plastizität wird normalerweise in sich entwickelnden Neuronen beobachtet, persistiert jedoch im adulten Hippocampus vermutlich wegen des Bedarfs einer konstanten synaptischen Umformung während der Gedächtnisbildung und -verarbeitung. Moosfasern weisen einen kleineren Durchmesser als vielen Axons auf, und es wurde berichtet, dass kleine Axons eine größere Menge an Tau bezüglich anderer mikrotubulus-assoziierter Proteine als die Axons mit großem Durchmesser enthalten (Harada, 1994). Dies mag die herausragende PHF-Färbung im Moosfaser-Bereich zur Folge haben.
  • Das Fehlen einer Färbung in mutierten Moosfaser-Bereichen durch Anti-Neurofilament-Antikörper und durch Bielchowsky-Silber legt nahe, dass die Neurofilamente in mutierten Moosfaser-Axons nach unten reguliert sind. Diese Erkenntnis wurde durch die EM-Überprüfung der Moosfasern bestätigt. Es wurde gezeigt, dass Tau sowohl an Neurofilamente als auch Mikrotubuli bindet (Miyata, 1986). Weil die Hyperphosphorylierung die Fähigkeit von Tau beeinträchtigt, an Mikrotubuli zu binden und diese zu stabilisieren, ist wahrscheinlich, dass die Hyperphosphorylierung ebenfalls die Tau-Bindung an NF reduzieren könnte. Die Interaktionen zwischen Tau und Neurofilamenten und Mikrotubuli sind wahrscheinlich für den axonalen Transport von Neurofilamenten von Bedeutung. Die Hyperphosphorylierung von Tau mag diese Wechselwirkungen stören und mag zur Folge haben, dass weniger Neurofilamente zu den Moosfasern transportiert werden. Es ist jedoch möglich, dass eine Überphosphorylierung von Tau und ein Fehlen einer Neurofilament-Färbung in den mutierten Moosfasern zwei unabhängige Phänomene sind, die auf das Fehlen einer CNAα-Funktion zurückzuführen sind.
  • Die regionale Spezifität der PHF-1-Immunfärbung, die beobachtet wurde, erinnert an diejenige, die bei einigen Anfällen und deren experimentellen Tiermodellen beeinflusst wurde. Bei Kindern mit schwerer Epilepsie existiert eine Zunahme der Timm'schen Silberablagerungen (angezeigt durch Sprießen) in CA3 (Represa, 1989). Nach Anfachen oder Kainin-Säure-Behandlung von Ratten (Epilepsie-Modelle) zeigten Moosfasern eine zunehmende Timm'sche Zinkfärbung im CA3-Bereich, wohingegen der CA1-Bereich nicht beeinträchtigt wurde (Frotscher, 1983; Sutula, 1988; Represa, 1989). Die Kainin-Säure-Behandlung induzierte ebenfalls eine vorübergehende Zunahme der PHF-Tau-Immun-Reaktivität (nachgewiesen durch den Alz50-Antikörper) in den CA3-Neuronen (Elliot, 1993). Vielleicht reguliert CNAα einige Schlüssel-Bestandteile des neuralen CA3-Kreislaufs, das den neurologischen Störungen gemeinsam sein kann, wie beispielsweise der Alzheimer Krankheit und der Epilepsie.
  • Als Schlussfolgerung haben wir dargestellt, dass in CNAα-defizienten Mäusen eine erhöhte Konzentration bzw. Niveau einer PHF-Immun-Reaktivität in speziellen Regionen des Hippocampus vorlag. Dies stellt die erste Verbindung zwischen der Calcineurin-Aktivität mit der Akkumulation von PHF-Tau in vivo bereit. Es ist wahrscheinlich, dass die beobachteten Veränderungen der Tau-Phosphorylierung und des axonalen Zytoskeletts einer Störung der neuronalen Funktion in mutierten Mäusen zugrunde liegen. Ein „Ans Licht bringen" der speziellen funktionellen Veränderungen, insbesondere im Hippocampus, könnte sich für das Verständnis der normalen Physiologie, ebenso wie der Pathologie, bei neuro-degenerativen Erkrankungen als Vorteil erweisen.
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  • Beispiel 4 Beurteilung von Alzheimer's PHF Tau in Mäusen denen Calcineurin fehlt
  • Die in Beispiel 4 aufgeführten Literaturstellen sind solche, die in den Gegenstand der Anmeldung unmittelbar im Anschluss an Beispiel 4 eingeschlossen wurden. Mäuse, denen Calcineurin fehlt, wurden wie oben beschrieben, hergestellt.
  • Protein-Verarbeitung und Assay:
  • Gehirne wurden in 50 mM tris/0,2 mM EDTA mit 5 Durchläufen (nach oben und unten) in einem Mattglas-Homogenisiergerät homogenisiert. Die Homogenate wurden bezüglich eines Proteins im Bradford Coomassie Blau-Bindungs-Assay untersucht (Bradford, 1976), gemäß den Anweisungen des Herstellers (BioRad; Richmond, CA). Protein-Assays wurden zweifach durchgeführt. Im Anschluss an das Mischen der Probe mit dem Färbe-Reagenz wurde die Extinktion bei 600 nm abgelesen.
  • Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)
  • Die Protein-Fraktionen wurden einer SDS-PAGE in 4–20% Gradientengelen unter Verwendung des diskontinuierlichen Laemmli-Puffer-Systems unterworfen (Laemmli, et al., 1970). Zwanzig μg der gekochten Proben und von Protein-Standards (Amersham, Arlington Heights, IL) wurden in jede Well bzw. Vertiefung eingefüllt und bei einem konstanten Strom von 20 mA/gel laufengelassen. Die Gels wurden mit Coomassie Blau R-250 oder Silber angefärbt (Bio-Rad; Richmond, CA).
  • Western Blotting und Immun-Färbung
  • Zweifache SDS-PAGE-Gels wurden unmittelbar zur elektrophoretischen Übertragung verwendet. Die Übertragung wurde unter Verwendung von 0,025 M Tris, 0,192 M Glyzin, 15% Methanol, pH 8,3 (Towbin, et al., 1979) durchgeführt. Die Proteine wurden über Nacht im Kaltraum bei einer konstanten Spannung von 30 Volt auf Immobilon-P-Membranen (Millipore, Bedford, MA) übertragen. Nach Beendigung der Übertragung wurden die Membranen durch Inkubieren entweder mit 5% (g/v) Rinderserum-Albumin oder 5% fettfreier Milch in 10 mM tris-gepufferter Salzlösung pH 7,4, 0,1% Tween-20 (TBST) für 1 Stunde blockiert. Nach Blockieren der unspezifischen Bindungsstellen wurden die Membranen für 1–2 Stunden mit der primären Antikörperlösung bei einem Titer inkubiert, der vom Hersteller empfohlen war, oder empirisch im Labor bestimmt. Die Membranen wurden dann 1 × 15 und 2 × 5 Minuten mit TBST gewaschen. Nach dem Waschen wurde die sekundäre Antikörper-Lösung, Meerettich-Peroxidase-konjugiertes Antimaus-IgG (Pierce, Rockford, IL) zugesetzt und für 1 Stunde inkubiert. Darauf wurden die Membranen erneut 1 × 15 und 4 × 5 Minuten wie vorher gewaschen. Die Membranen wurden mit der chemilumineszenten Substratlösung ECL angefärbt (Amersham, Arlington Height, IL) gemäß den Instruktionen des Herstellers und einem Kodak XAR-5 Film für 1–60 Minuten, abhängig von der Intensität der beobachteten Banden ausgesetzt. Zur Quantifizierung der Banden wurden die Filme gescannt, und die gefärbten Peaks wurden unter Verwendung eines LKB-Ultroscan XL Densitometers (Pharmacia, Piscataway, NJ) integriert.
  • Histochemie und Immunzytochemie
  • Mäuse mit Ketamin-HCl/Xylazin anästhetisiert und transkardial mit Ames-Lösung perfundiert, die Procain und Heparin enthielt, gefolgt von 1% Glutaraldehyd, 1 Formaldehyd. Als nächstes wurden die Gehirne ausgeschnitten und in 4% Formaldehyd angeordnet. Die Proben wurden in Paraffin eingebettet, und Schnitte wurden für Histochemie und Immunzytochemie durchgeführt. Die Schnitte wurden vor-paraffinisiert, und einige wurden mit Hämatoxilin und Eosin, Bielchowsky-Silber, Luxal Fast Blue oder Kongo-Rot, wie durch das AFPI-Handbuch beschrieben, gefärbt (Prophet et al., 1992). Andere Schichten wurden unter Verwendung des ABC- und ABC-AP-Kits gemäß den Anleitungen des Herstellers immungefärbt (Vector, Burlingame, CA). Um das Signal auf dem fixierten Gewebe zu verstärken, wurden gelegentlich Schichten entweder mit 88% Ameisensäure für 10 Minuten oder 0,1 M Citrat pH 6,0 für 10 Minuten in der MikroWelle behandelt (wodurch das Citrat zum Sieden gebracht wurde).
  • Ergebnisse
  • Phosphorylierungs-abhängige Antikörper wurden zur Untersuchung der neuropathologischen Wirkungen der Deletierung einer Isoform der kathalytischen Untereinheit (A) von Calcineurin verwendet. Von speziellem Interesse war der monokonale PHF-1-Antikörper, der gegen PHF gezüchtet wurde, gereinigt aus Gehirn von Alzheimer Kranken (Greenberg et al., 1992). Das Antigen, das von PHF-1 am besten erkannt wurde, zeigte sich als die phosphorylierte Form des mikrotubulus-assoziierten Proteins Tau. Die Abhängigkeit des PHF-1-Antikörpers vom Phosphorylierungszustand von Tau wird durch die Tatsache demonstriert, dass eine Immun-Färbung mit PHF-1 beseitigt wird, wenn das PHF-Tau mit Calcineurin dephosphoryliert wird (Gong et al., 1994). Ein anderer Antikörper, der in der Studie verwendet wird, ist τ-1 (Binder et al., 1985), der dephosphoryliertes Tau, jedoch nicht phosphoryliertes Tau erkennt, und dadurch den spezifischen Nachweis von nicht-PHF-Tau ermöglicht. Zwei andere Antikörper, von denen angenommen wird, dass sie phosphorylierungs-unabhängig sind, nämlich Tau-2 und 5E2, wurden ebenfalls getestet (Kosik et al., 1988).
  • In der ersten Reihe von Experimenten wurden Gehirn-Homogenate aus 2–4 Monate alten Wildtyp-Mäusen und Mäusen hergestellt, bei denen die Expression von Calcineurin ausgeschaltet war (Cn) und der Phosphorylierungs-Zustand der Proteine wurde mit unterschiedlichen Antikörpern sondiert. Zuerst wurde die Expression von Calcineurin unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Calcineurin überprüft (Transduction Laboratories, Lexington, KY), und es zeigte sich, dass er in den Calcineurin-Knockout-Mäusen signifikant unterdrückt war. Die restliche Färbung ist wahrscheinlich auf Calcineurin β zurückzuführen, das im Rattengehirn in den niedrigeren Konzentrationen exprimiert wird (Kuno et at., 1992). Wenn Western Blots mit PHF-1 immun-gefärbt wurden, zeigten sich Banden mit Molekulargewichten, die Tau entsprachen, eine konsistente Zunahme (bis zum 4-fachen) der Konzentration der PHF-1-Immunreaktivität in Cn Proben im Vergleich zu Wildtyp-Proben aus im Alter angepassten Wurfgeschwistern. Wenn diese Proben parallel laufen gelassen und mit Antikörper gegen dephosphoryliertes Tau (Tau-1) gefärbt wurden, wiesen die Cn-Mäuse entweder die gleiche oder eine gelegentlich geringfügig niedrigere Tau-Färbung auf. Die Tatsache, dass die Tau-1-Immunfärbung in Cr-Mäusen nicht erhöht war, weist darauf hin, dass die erhöhte Färbung mit PHF-1 in den CN-Mäusen eine spezifische Zunahme der PHF-Form von Tau eher als eine allgemeine Zunahme aller Formen von Tau wiederspiegelt. Wenn die Blots mit den phosphorylierungs-unabhängigen Antikörpern Tau-1 und 5E2 immun-gefärbt wurden, war eine gering stärkere Reaktion mit den Knockout-Mäusen als dem Wildtyp. Wir schließen aus diesen Daten, dass die vorherrschende Wirkung von Tau, Calicineurin auszuschalten, eine Verschiebung seines Phosphorylierungszustands ist, mit einer vielleicht ebenfalls leichten Zunahme der absoluten Tau-Konzentrationen.
  • Um die Wirkung der Calcineurin-Deletion auf die Phosphorylierung anderer Zytoskelett-Proteine zu untersuchen, sondierten wir die Western Blots mit verschiedenen phophorilierungs-abhängigen und -unabhängigen Antikörpern. Normalerweise sind die Neurofilamente in unterschiedlichen Ausmaßen phosphoryliert, abhängig von ihrer Lokalisierung und Reifung. Es wird angenommen, dass ihre Funktion die Modulierung des Axon-Durchmessers involviert, und es wird angenommen, dass das Ausmaß der Neurofilamente-Phosphorylierung den Abstand zwischen diesen reguliert (de Waegh et al., 1992). Die Immunfärbung mit einem Antikörper (SMI32, Sternberger Monoclonals, Baltimore, MD), der nicht-phosphorylierte Neurofilamente (NF) erkennt, zeigte, dass die Konzentrationen an NF-Proteinen zwischen Wildtyp- und CN-Mäusen nicht signifikant verschieden waren, obwohl in einigen CN-Proben eine stärkere Färbung einer Bande von ~50 KDa vorlag, die eine kreuzreaktive Form von Tau präsentieren mag. Eine Immunfärbung mit Antikörpern, die gegen phosphoryliertes NF gerichtet waren, schloss SMI34 und SMI310 (Sternberger Monoclonals, Baltimore, MD) ein, die jeweils intrazellulär und extrazellulär neurofibrilläre Knäuel (NFT) färben, zeigten eine geringfügig stärkere Reaktion mit dem Wildtyp als den CN-Proben, was darauf hinweist, dass die Zunahme des phosphorylierten Tau's spezifisch ist, und keine allgemeine Zunahme der Phosphorylierung von Zytoskelett-Proteinen widerspiegelt. Die reduzierte Färbung von phosphoryliertem NF in den CN-Knockout-Mäusen könnte auf eine allgemeine Reduktion der Expression von Neurofilamenten zurückzuführen sein. Neurofilamente, von denen angenommen wird, dass sie Axon-Dicke und Stabilität vermitteln, werden in sich regenerierenden Neuriten nach unten reguliert, die somit eine begleitende Zunahme des Mikrotubulus-Neurofilament-Verhältnisses aufweisen (Hoffman et al., 1988). Zuletzt wurden mehrere andere Antikörper gegen unterschiedliche Zytoskelett-Proteine getestet, um auf unterschiedliche Proteine zu prüfen, und keine konsistenten Unterschiede der Immunreaktivität wurden beobachtet.
  • Nach der Erkenntnis, dass die CNMaus-Gehirne eine höhere Konzentration einer PHF-Immunreaktivität aufwiesen, wünschten wir, zu bestimmen, ob einige Areale des Gehirns mehr als andere betroffen waren, und ob die PHF-Immunreaktivität von der Bildung neurofibrillärer Knäuel begleitet wird. In der zweiten Reihe von Experimenten wurden Wildtyp- und CN-Mäuse mit Fixiermittel perfundiert und Paraffinschnitte wurden aus ihren Gehirnen hergestellt. Wenn die zweiten mit Anti-PHF-Antikörpern gefärbt wurden, wurde eine zunehmende Immunreaktivität konsistent im Hippocampus von CN-Mäusen beobachtet, wenn sie mit dem Wildtyp verglichen wurden. Die intensivste Immunreaktivität wurde im Stratum Lucidum der beobachteten Region beobachtet; eine gewisse Färbung wurde ebenfalls im Hilus des Gyrus Dentatus beobachtet. Bei einigen der CN-Mäuse wurde eine Färbung sowohl in infrapyramidalen als auch suprapyramidalen Schichten beobachtet. Die PHF-Färbung der CN-Mäuse entsprach den Zellkörpern von Körner- und pyramidalen Zellen nicht, es ist jedoch auf Grundlage der Lokalisierung und Orientierung am meisten mit der Markierung von Moosfaser-Axons, die aus dem Gyrus Dentatus in CA3 hervorspringen, konsistent.
  • Das Auffinden von PHF-Tau in Moosfasern der CN -Mäuse veranlaßte eine Parallelanalyse der Lokalisierung von Calcineurin. Schnitte, die mit Anti-Calcineurin-Antikörper markiert waren, zeigten eine starke Färbung im Hippocampus, und Striatum im Wildtyp, jedoch nicht in den CN-Knockouts, wie erwartet. Der Unterschied der Calcineurin-Konzentrationen zwischen Wildtyp- und CN-Mäusen war in den Moosfasern – dem Gebiet, das mit Anti-PHF-Antikörpern in den Knockout-Mäusen stark eingefärbt war, besonders groß, was demonstriert, das Calcineurin in Regionen depletiert bzw. abgereichert ist, die eine erhöhte Anti-PHF-Färbung aufweisen. Andere Regionen des Hippocampus, wie beispielsweise CA1, zeigten eine gewisse schwache Färbung der CN -Mäuse, die auf die β-Isoform des Calcineurins zurückzuführen sein mag. Besonders bedeutend wurde die Anti-Calcineurin-Färbung in Wildtyp-Mäusen in CA1 in den Dendriten, anders als in CA3 lokalisiert, wo es in den Moosfaser-Axons lokalisiert war. Weil Tau in erster Linie in den Axons lokalisiert ist, ist es deswegen nicht überraschend, dass wir keine Anti-PHF-Färbung in der CA1-Region der CN-Mäuse fanden.
  • Mehrere histochemische Färbungen wurden dazu verwendet, die CN-Gehirne bezüglich einer potentiellen Pathologie zu untersuchen. Die Färbung von Schnitten mit Eosin-Hämatoxilin zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen CN und dem Wildtyp. Wir konnten keine Plaque oder Knäuel unter Verwendung einer Kongorot- oder Bielchowsky-Silber-Färbung identifizieren, noch beobachteten wir grobe Veränderungen in der Myelinisierung von Neuronen in diesen Mäusen durch Färbung mit Luxol-Fast-Blue. Das Fehlen von Silber-Färbungs-Plaques und – Knäueln ist nicht unerwartet, weil bei der Alzheimer Krankheit eine positive Immunfärbung mit Anti-PHF-Antikörpern lange irgendwelchen positiven Silber-Färbungs-Knäueln vorangeht (Braak et al., 1994). Wir beobachteten interessanterweise, dass Verfahren, die eine starke Silber-Färbung in der CA3-Region in Wildtyp-Mäusen zeigten, in CN -Mäusen nicht färben. Die Bielchowsky Silber-Färbung markiert normalerweise Axons und ein Verlust einer solchen argyrofilen Färbung wurde in sich degenerierenden Neurons bei der Ischämie beobachtet. Das Silber-Färbungsmuster der WT-Moosfasern erinnerte an das Anti-PHF-Färbemuster der CN – Moosfasern, was nahe legt, dass die Moosfasern, die mit PHF-1 in CN-Mäusen positiv färbten, mit Silber nicht färben. Dieses Ergebnis könnte entweder eine Reduktion der Anzahl von Moosfaser-Axons oder eine Veränderung in ihrem Zytoskelett widerspiegeln, weil angenommen wird, dass diese Silber-Färbung Zytoskelett-Elemente erkennt, insbesondere Neurofilamente (NF).
  • Die Möglichkeit, dass die Neurofilamente in den CN -Mäusen verändert wurden, wurde direkt durch Färben von Schnitten mit einem Anti-NF-Antikörper getestet, der die 68 KDa-Untereinheit in einer phosphorylierungs-unabhängigen Weise erkennt (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Wir beobachteten eine viel stärkere NF-Färbung in den Moosfasern von Wildtyp-Mäusen als von CN-Mäusen, was eine gesenkte Produktion oder eine erhöhte Abbauleistung neurofilamenter Proteine nahe legt. In der Summe zeigen eine Reihe von immun- und histochemischen Markierungsexperimenten ein reduziertes Niveau von Neurofilamenten in den Moosfasern der CN -Mäuse, verbunden mit einer Zunahme des Grads der Phosphorylierung eines mikrotubulus-assoziierten Schlüssel-Proteins, nämlich Tau.
  • Nach Beobachtung der drastischen Veränderung der Zytoskelett-Elemente in biochemischer Weise und Lokalisieren der Veränderungen auf die Moosfaser-Region wünschten wir, die Folgen dieser Veränderungen auf die Ultrastruktur dieser Axons auf der Elektronenmikroskop (EM)-Ebene zu untersuchen. Halbe Gehirne aus perfundierten Tieren wurden postfixiert und für die EM verarbeitet. Die Moosfasern wurden von den pyramidalen Neuronen von CA3 ausgehend verfolgt. Die Wildtyp-Moosfasern wiesen viele Bereiche mit reichlichen Neurofilamenten und sehr wenig Mikrotubuli auf. Andererseits war in den Moosfasern der CN-Mäuse eine fast vollständige Abwesenheit von neurofilamentreichen Regionen, verbunden mit einem reichlichen Vorhandensein von Mikrotubuli. Diese Erkenntnisse bestätigen unsere Beobachtung bei der Immunfärbung mit Anti-Neurofilament-Antikörpern und der Bielchowsky-Silber-Färbung.
  • Diskussion
  • Die Funktion der Phosphatase-Calcineurine im Gehirn wird nicht vollständig verstanden. Es wurden mehrere Rollen vorgeschlagen, einschließlich der Regulierung des neuronalen Zytoskeletts durch Dephosphorylierung von Proteinen, wie beispielsweise Neurofilament-Proteinen und Tau. Eine weitere vorgeschlagene Rolle ist die Regulierung der Langzeitunterdrückung (LTD) durch Dephosphorylierung von Phosphatase I-Inhibitor und Aktivierung der Phosphatase I-Kaskade (Mulkey et al., 1994). Zusätzlich wurde vorgeschlagen, dass Calcineurin synaptische Vesikeln durch Recyceln durch seine Wirkung auf Dynamin kontrolliert (Liu et al., 1994). Diese Funktionen wurden entweder aus in vitro-Studien oder aus in vivo-Studien gefolgert, bei denen die Calcineurin-Aktivität mit Inhibitoren, wie beispielsweise Cyclosporin geblockt wurden. Eine Einschränkung auf Hemm-Experimente besteht darin, dass die Inhibitoren, die verwendet wurden, indirekt durch Immunophiline fungieren, und unterschiedliche Inhibitoren binden unterschiedliche Immunophiline. Ebenfalls weisen Immunophiline Prolin-Isomerase-Aktivitäten auf, die andere Proteine als Calcineurin beeinträchtigen könnten. Durch Verwendung von Knockout-Mäusen, bei denen ein spezifisches Isotop von Calcineurin vollständig eliminiert ist, können wir direkt die Folgen dieser Depletion auf spezifische Endpunkte einschätzen.
  • Der erste Endpunkt, den wir untersucht haben, war die Phosphorylierung von Zytoskelett-Proteinen, wie beispielsweise Tau. Tau ist ein mikrotubulus-assoziiertes Protein, das in erster Linie in den Axons lokalisiert ist; es wurde vorgeschlagen, dass es Kreuz-Brücken zwischen Mikrotubuli und Neurofilamenten bildet (Hikokawa et al., 1988). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Tau Mikrotubuli stabilisiert und deren Zusammenlagerung fördert, eine Eigenschaft, die wahrscheinlich durch den Phosphorylierungszustand von Tau reguliert wird. Insbesondere wird, wenn Tau phosphoryliert wird, seine Fähigkeit, die Mikrotubulus-Anlagerung zu fördern, vermindert (Brandt, et al., 1994; Dreschsel et al., 1992; Lindwall et al., 1984). Es wurde kürzlich gezeigt, dass abnormal phophoriliertes Tau aus Alzheimer Gehirn die Mikrotubulus-Anlagerung hemmte, und dass seine Fähigkeit, die Mikrotubulus-Anlagerung zu fördern, nach Dephosphorylierung wieder hergestellt wurde (Alonso et al., 1994).
  • Tau gewann ein spezielles Interesse, wenn dargestellt wurde, dass die neurofibrilären Knäuel, die sich in der Alzheimer Erkrankung akkumulieren, in erster Linie aus Tau zusammengesetzt sind, das abnormal phosphoryliert ist. Unter Verwendung von Antikörpern gegen hyperphosphoryliertes Tau wurden Veränderungen viel früher als bei der Entwicklung einer argyrofilen Färbung nachgewiesen, und vor Auftreten irgendwelcher NFT- oder Amyloid-Plaques (Braak et al., 1994; Braak et al., 1994). Es wurde tatsächlich gezeigt, dass eine Phosphorylierung von Tau seine Struktur verändert, in dem es länger und steifer gemacht wird (Hagestedt et al., 1989). Diese Erkenntnisse veranlassten eine Erforschung von möglichen Mechanismen, durch die Tau hyperphosphoryliert werden könnte. Wie oben erwähnt, phosphorylieren mehrere Kinasen Tau, um PHF-artige immunreaktive Isoformen zu erzeugen und mehrere Phosphatasen, einschließlich Calcineurin, werden PHF-Tau in einen normaleren Phosphorylierungszustand zurückbringen. Calcineurin wurde weiter kürzlich mit anderen Phosphatasen in Verbindung gebracht, bei der Bildung von PHF-Tau durch Studien bezüglich einer Biopsie unterworfenen humanem Gehirngewebe, bei dem gezeigt wurde, dass Tau normalerweise phosphoryliert ist, jedoch während der Gewebsverarbeitung und Herstellung von Calcineurin und anderer Phosphatasen, die normal nicht in Alzheimer-Gehirnen vorliegen, dephosphoryliert werden (Matsuo et al., 1994). Diese Erkenntnisse wurden hergenommen, um darauf hinzuweisen, dass bei der Alzheimer Erkrankung Defizite der Phosphatasen, wie beispielsweise Calcineurin, der Akkumulation von hyperphosphoryliertem Tau unterliegen könnten. Eine weitere Studie, die die Konzentrationen von Calcineurin in Alzheimer und normalem Kleinhirn und Neocortex Immunzytochemie überprüfte, fand keine Unterschiede in der Protein-Konzentration zwischen den beiden Gruppen. Jedoch befand sich Calcineurin um einige neurofibrilläre Knäuel herum, und die Studie verglich Konzentrationen der Calcineurin-Enzym-Aktivität nicht (Billingsley et al., 1994).
  • Unsere Experimente zeigen eine klare und spezifische Wirkung auf das Deletieren der Hauptform von Calcineurin im Mausgehirn. Der vorherrschendste Effekt, der beobachtet wurde, war eine Zunahme des PHF-Typ Tau. Diese Beobachtung ist mit der Fähigkeit von Calcineurin konsistent, PHF-Tau in normales Tau in vitro umzuwandeln (Drewes et al., 1993; Gong et al., 1994) und ist der erste in vivo-Beweis, dass Calcineurin eine Rolle in der normalen Phosphorylierung/Dephosphorylierung von Tau spielt. Es legt ebenfalls nahe, dass gesenkte Mengen einer Calcineurin-Aktivität der Akkumulation der PHF(phosphorylierten)-Form von Tau in der Alzheimer Krankheit zugrunde liegen können. Die Tatsache, dass eine erhöhte Anti-PHF-Reaktivität unter Verwendung zweier unabhängiger Verfahren beobachtet wurde, nämlich Western Bloting und Immunzytochemie auf perfundiertem und fixiertem Gewebe, spricht dagegen, dass die erhöhte Phosphorylierung ein Artefakt der Gewebsverarbeitung ist, bei der Phosphatasen und Kinasen aktiviert werden. Obwohl wir nicht dazu in der Lage waren, NFT in den CN-Mäusen zu beobachten, können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass diese sich bilden werden, wenn die Mäuse älter werden. Diese Möglichkeit wird durch die Tatsache gestützt, dass Studien, die versuchten, eine Alzheimer Krankheit bereitzustellen, geschlossen haben, dass die Hyperphosphorylierung von Tau die früheste Veränderung ist, die in betroffenen Gehirnregionen beobachtet wird (Braak et al., 1994). Alternativ, insoweit NFT in Mäusen während einer neurologischen Erkrankung nicht beobachtet wurde, könnten die Eigenschaften von Maus-Tau eine PHF-Bildung ausschließen. Es ist zuletzt möglich, dass andere Bestandteile für die Bildung der Knäuel verantwortlich sind, gerade weil pathologische Chaperone dafür erforderlich zu sein scheinen, dass das Alzheimer β-Protein zu Amyloid-Filamenten polymerisiert (Ma et al., 1994).
  • Die Hippocampus-Moosfasern, die aus Körnerzellen in CA3 hervorsprangen, sind angenommenermaßen in das Gedächtnis und Lernen involviert. Körnerzellen zeigen eine postnatale Neurogenese, und es wurde vorgeschlagen, dass sie bezüglich ihrer Fähigkeit, neue Synapsen zu bilden, sehr plastisch sind. Eine solche Plastizität wird normalerweise in sich entwickelnden Neuronen beobachtet, persistiert jedoch im adulten Hippocampus vermutlich wegen des Bedarfs einer konstanten synaptischen Umformung während der Gedächtnisbildung und Prozessierung. Die Plastizität der CA3-Region kann teilweise durch Calcineurin und Kalzium reguliert werden. Die Färbung von Schnitten mit einem Antikörper gegen Calcineurin zeigt eine intensive Färbung in Wildtyp-Mäusen im Hippocampus, einschließlich der Moosfasern, wo wir die PHF-Immunfärbung in CN-Mäusen beobachteten. Moosfasern weisen einen kleineren Durchmesser als viele Axons auf, und es wurde berichtet, dass kleine Axons eine größere Menge an Tau bezüglich anderer MAP's im Vergleich zu Axons mit großem Durchmesser aufweisen (Harada et al., 1994). Diese Tatsache mag das vorherrschen der PHF-Färbung in dieser Region erklären helfen. Einige Regionen, wie beispielsweise CA1, zeigten eine Anti-Calcineuin-Immunreaktivität in Wildtyp-Mäusen, jedoch keine PHF-Immunreaktivität in CN-Mäusen, vermutlich weil Calcineurin in CA1 in den Dendriten lokalisiert war, die normalerweise Tau nicht enthalten. Dies ist eine interessante Beobachtung, die darauf hinweist, dass eine spezifische Phosphatase eine in vorherrschender Weise axonale Lokalisierung in einer Synapse aufweisen kann (Moosfaser-CA-3) und eine dendritische Lokalisierung in einer anderen aufweisen kann (CA3-CA1). Es zeigte sich, dass diese beiden Hauptsynapsen des Hippocampus sich bezüglich ihres elektrophysiologischen Verhaltens und der Neuro-Transmitter-Modulation unterscheiden, wenn die Lern-Paradigmen, wie beispielsweise LTP, untersucht wurden. Die unterschiedliche Calcineurin-Verteilung zwischen Axons und Dendriten legt einen möglichen Mechanismus nahe, durch den diese beiden Synapsen unterschiedlich moduliert werden können; – entweder kann Calcineuin in die synaptische Plastizität präynaptisch oder postsynaptisch involviert sein. Es ist nicht klar, wie Calcineuin solche Mechanismen bewirken kann, jedoch sind seine Auswirkungen auf die Zytoskelett-Proteine, wie beispielsweise Tau und Dynamin, klare Kandidaten zur Veränderung der Synapsen-Funktion. Es ist zuletzt wert zu erwähnen, dass ein Kennzeichen der Alzheimer Krankheit das Auftreten von PHF-Tau in den Zellkörpern und Dendriten von ZNS-Neuronen ist, wohingegen normales Tau auf die Axons beschränkt ist. Die Zellen der CA1-Region des Hippocampus weisen insbesondere eine Neigung dazu auf, PHF zu entwickeln. Nunmehr, als wir gezeigt haben, dass Calcineurin in den Somas und Dendriten der Region vorliegt, sollte eine Umkanalisierung von Tau zu den Dendriten, verbunden mit einer reduzierten Calcineurin-Aktivität zu einer Hyperphosphorylierung von Tau und seiner Akkumulierung von PHF führen, in einer ähnlichen Weise wie bei der Alzheimer Krankheit.
  • Das Färben von Moosfasern in Wildtyp-Mäusen durch Anti-Neurofilament-Antikörper und Silber, und das Fehlen einer solchen Färbung in CN-Mäusen legt nahe, dass die Neurofilamente in CNMoosfaser-Axons entweder abwesend oder nach unten reguliert sind. Diese Erkenntnisse wurden durch die EM-Überprüfung der Moosfasern bestätigt. Es existieren mehrere mögliche Szenarios, die die Reduktion der Neurofilamente in den Moosfasern erklären können. Zuerst kann Calcineurin eine direkte Wirkung auf Neurofilamente durch Dephosphorylierung der Kopfregion von NF aufweisen. Weil die Hemmung der Phosphatasen durch Okadain-Säure das Neurofilament-Netzwerk stört, ist plausibel, dass eine Deletieren von Calcineurin eine ähnliche Wirkung nach sich ziehen könnte (Sacher et al., 1992). Zweitens wurde gezeigt, dass die Interaktion zwischen Neurofilamenten und Mikrotubuli stärker ist, wenn die Neuroflamente in der Projektionsdomäne der größten Untereinheit dephosphoryliert sind (Miyasaka et al., 1993). Es ist somit möglich, dass in den Körnerzellen von CN-Mäusen, aus denen diese Moosfasern herstammen, eine Hyperphosphorylierung von Neurofilamenten ihre Wechselwirkung mit Mikrotubuli schwächt und daher den axonalen Transport schwächt. Drittens, weil gezeigt wurde, dass Tau an Neufilamente, ebenso wie an Mikrotubuli bindet (Miyata et al., 1986) und dass die Hyperphosphorylierung die Fähigkeit von Tau beeinträchtigt, Mikrotubuli zu stabilisieren und an diese zu binden, scheint es wahrscheinlich, dass eine Hyperphosphorylierung ebenfalls die Tau-Bindung an NF reduzieren könnte. Zuletzt sind die Interaktionen zwischen Tau und den Neurofilamenten und Mikrotubuli wahrscheinlich für den axonalen Transport von Neurofilamenten von Bedeutung, die, wenn sie gestört ist, zur Folge haben würde, dass wenigere Neurofilamente zu den Moosfasern transportiert und an diese abgegeben werden. Zusammenfassend existieren mehrere Mittel, durch die ein phosphorylierter Zustand von Tau die Plastizität und Stabilität von Axons durch Beeinflussen der Wechselwirkung von Mikrotubuli mit Neurofilamenten regulieren, und die Färbung und Immunmarkierungs-Veränderungen zur Folge haben könnte, die wir im CN-Hippocampus beobachtet haben.
  • Die intensivste Färbung für PHF, die wir beobachtet haben, erfolgte im Hippocampus, von dem ebenfalls gezeigt wurde, dass er die höchsten Konzentrationen an Calcineurin im Gehirn aufwies (Goto et al., 1986; Goto et al.; 1993; Polli et al., 1991). Der Hippocampus wird bei mehreren neuro-degenerativen und neurologischen Störungen beeinträchtigt, die eine Veränderung der Protein-Phosphorylierung einschließen können. Beispielsweise, wie bereits erwähnt, hat die Alzheimer Erkrankung Veränderungen der Phosphorylierungen von Tau zur Folge, und beeinträchtigt insbesondere den Hippocampus. Die regionale Spezifität der PHF-1-Immunfärbung, die beobachtet wurde, erinnert ebenfalls sehr an das Areal, das bei einigen Anfällen betroffen ist und an deren Tierexperiment-Modelle. Beispielsweise existiert bei Kindern mit einer ernsten Epilepsie eine Zunahme der Timm'schen Ablagerungen, was auf eine Keimung hinweist, in CA3 (Represa et al., 1989). Ebenfalls wurde nach Anfachen- oder Kainin-Säure-Behandlung von Ratten (Epilepsie-Modelle) beobachtet, dass Moosfasern eine erhöhte Timm'sche Zinkfärbung in der CA3-Region zeigten (was auf eine Keimung hinweist), wohingegen die Ca1-Region unverändert blieb (Frotscher et al., 1983; Represa et al., 1989, Sutula et al., 1988). Es wurde darüber hinaus berichtet, dass Kainin-Säure-Behandlung eine vorübergehende Zunahme der CA3-Neuronen-Färbung durch den alz50-Antikörper induzierte, der, wie PHF-1 PHF-Tau erkennt (Elliot et al., 1993). Vielleicht wird der spezielle Isotyp von Calcineurin, der in unseren Knockout-Mäusen deletiert wurde, ebenfalls bei anderen neurologischen Störungen, wie beispielsweise Epilepsie, beeinträchtigt.
  • Als Schlußfolgerung haben wir gezeigt, dass in Mäusen, in denen Calcineurin ausgeschaltet war, eine erhöhte Konzentration einer PHF-Immunreaktivität in speziellen Regionen des Hippocampus vorliegt. Diese Erkenntnisse stellen die erste Verbindung zwischen einer Calcineurin-Aktivität zu PHF in vivo bereit, und sind mit früheren in vitro-Beobachtungen konsistent, dass Calcineurin PHF-Tau zu normalem Tau durch Dephosphorylierung umwandeln kann. Es ist wahrscheinlich, dass die beobachteten Veränderungen der Tau-Phosphorylierung und des Axon-Skeletts einer Störung der Nervenfunktion in CN-Mäusen unterliegen. Ein "Ans Licht bringen" der speziellen funktionellen Veränderungen, insbesondere im Hippocampus, könnte sich als beim Verständnis der normalen Physiologie ebenso wie der pathologischen Manifestationen bei Erkrankungen, wie beispielsweise der Alzheimer Krankheit und Epilepsie als vorteilhaft erweisen.
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Claims (12)

  1. Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Phosphorylierung von Tau-Protein (beispielsweise humanem Tau-Protein) im Nervensystem eines Säugetieres reduziert, und das die folgenden Schritte umfasst: a) Verabreichen eines Mittels, das auf seine Fähigkeit zur Reduzierung der Phosphorylierung von Tau-Protein überprüft werden soll, an ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt; b) Bestimmen des Ausmaßes, in dem eine Phosphorylierung von Tau-Protein im Nervensystem des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers auftritt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) Vergleichen des in b) bestimmten Ausmaßes mit dem Umfang, in dem die Phosphorylierung im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle auftritt, wobei, wenn eine Phosphorylierung in einem geringeren Ausmaß im Nervensystem des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der Kontrolle auftritt, das Mittel die Phosphorylierung von Tau-Protein reduziert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in b) das Ausmaß, in dem die Phosphorylierung auftritt, durch Folgendes bestimmt wird: a) Kombinieren von Gehirnzellen, die aus dem transgenen nicht menschlichen Säugetier gewonnen wurden und die so behandelt wurden, dass Tau-Protein zur Bindung mit Antikörpern mit ani-paarigen helikalen Fragment-Antikörpern verfügbar gemacht wird und b) Nachweisen einer Bindung der Antikörper an ein Tau-Protein.
  3. Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die paarige helikale Filament-Bildung im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, das die folgenden Schritte umfasst: a) Verabreichen eines Mittels, das auf seine Fähigkeit zur Reduzierung einer paarigen helikalen Filament-Bildung überprüft werden soll, an ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt und das humanes Tau-Protein exprimiert; b) Bestimmen des Ausmaßes, in dem eine paarige helikale Filament-Bildung im Nervensystem des transgenen nicht-menschlichen Tieres auftritt, dem das Mittel verabreicht wurde; und c) Vergleichen des Ausmaßes, das in b) bestimmt wurde, mit dem Ausmaß, in dem eine paarige helikale Filament-Bildung im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle auftritt, wobei, wenn eine paarige helikale Filament-Bildung in einem geringeren Ausmaß im Nervensystem des transgenen nicht-menschlichen Säugetieres, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der Kontrolle auftritt, das Mittel die paarige helikale Filament-Bildung reduziert.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei in b) das Ausmaß, in dem eine paarige helikale Filament-Bildung auftritt, durch Folgendes bestimmt wird: a) Kombinieren von Gehirnzellen mit anti-paarigen helikalen Filament-Antikörpern und b) Nachweisen einer Bindung der Antikörper an Gehirnzellen.
  5. Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das eine für die Alzheimerkrankheit charakteristische Läsion im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, und das die folgenden Schritte umfasst: a) Verabreichen eines Mittels, das auf seine Fähigkeit zur Reduktion einer für die Alzheimerkrankheit charakteristischen Läsion überprüft werden soll, an ein transgenes nichthumanes Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, das humanes Tau-Protein exprimiert, das das humane Amyloid-Vorläufer-Protein und das humane Alzheimer Aβ-Protein überexprimiert; b) Bestimmen des Ausmaßes, in dem eine Läsion im Nervensystem des transgenen nichthumanen Säugetiers auftritt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) Vergleichen des Ausmaßes, das in b) bestimmt wurde mit dem Ausmaß, in dem die Läsion im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle eintritt; wobei, wenn die Läsion in einem geringeren Umfang im Nervensystem des transgenen nichtmenschlichen Tieres, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der Kontrolle auftritt, das Mittel eine für die Alzheimerkrankheit charakteristische Läsion reduziert.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das transgene nichtmenschliche Tier eine Maus und das Calcineurin-Gen ein Calcineurin Aα-Untereinheitsgen oder ein Calcineurin Aβ-Untereinheitsgen ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei in b) das Ausmaß, in dem die Läsion auftritt, durch Folgendes bestimmt wird: a) Kombinieren von Gehirnzellen mit anti-paarigen helikalen Fragment-Antikörpern und b) Nachweisen der Bindung der Antikörper an Gehirnzellen.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5–7, wobei die für die Alzheimerkrankheit charakteristische Läsion aus der Gruppe ausgewählt i t, die aus Folgendem besteht: Amyloid-Ablagerungen und paarige helikale Filament-Bildung.
  9. Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Phosphataseaktivität einer Calcineurin Aβ-Untereinheit im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, das die folgenden Schritte umfasst: a) Verabreichen eines Mittels, das auf seine Fähigkeit zur Reduzierung der Phosphataseaktivität einer Calcineurin Aα-Untereinheit überprüft werden soll, an ein transgenes nichtmenschliches Säugetier (beispielsweise eine Maus), der ein funktionelles Calcineurin Aβ-Untereinheitsgen fehlt; b) Bestimmen der Phosphataseaktivität der Calcineurin Aβ-Untereinheit, die in den Zel-len im Nervensystem des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers vorliegt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) Vergleichen der Calcineurin Aβ Phosphataseaktivität, die in b) bestimmt wurde, mit der Calcineurin Aβ Phosphataseaktivität in Zellen im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle, wobei, wenn eine Calcineurin Aβ Phosphataseaktivität in einem geringeren Ausmaß im Nevensystem des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers vorliegt, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der Kontrolle, das Mittel die Phosphataseaktivität der Calcineurin Aβ-Untereinheit reduziert.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in b) die Calcineurin Aβ Phosphataseaktivität durch Bestimmen des Ausmaßes bestimmt wird, in dem Tau-Protein (beispielsweise humanes Tau-Protein) in Zellen des Nervensystems des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers phosphoryliert wird.
  11. Transgenes nicht-menschliches Säugetier, dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, das beispielsweise (a) humanes Tau-Protein exprimiert; und (b) wahlweise das humane Amyloid-Vorläufer-Protein und das humane Alzheimer Aβ-Protein exprimiert.
  12. Verfahren zum Erzeugen eines Mittels zur Verwendung in: (a) der Reduktion pathologischer Läsionen, die für die Alzheimerkrankheit charakteristisch sind oder (b) in der Reduktion der Phosphorylierung von Tau-Protein, die mit der Alzheimerkrankheit verbunden ist, umfassend den Schritt, ein Mittel wie in einem der Ansprüche 1, 3, 5 oder 9 gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zu identifizieren.
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