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Hintergrund
der Erfindung
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Calcineurin, ebenfalls bekannt als
Protein-Phosphatase 2B wurde zuerst in Rindergehirn identifiziert. Es
repräsentiert
eine kleine Familie von kalzium- und kalmodulin-abhängigen Serin/Threonin
Protein-Phosphatasen. Es wird in allen Säugetiergeweben, die überprüft wurden,
exprimiert und ist im Gehirn am reichlichsten vorhanden. In Lymphozyten
ist Calcineurin das wichtigste, lösliche Kalmodulin-bindende
Protein. Calcinenurin ist ein Heterodimer, das aus einer katalytischen
Untereinheit (A; 61 kD) und einer regulatorischen Untereinheit (B;
19 kD) besteht. Die A-Untereinheit enthält eine katalytische Domäne, eine
carboxy-terminale inhibitorische Domäne, eine B-Untereinheit-Bindungsstelle
und eine Kalmodulin-Bindungsstelle. Die Phosphatase-Aktivität der A-Untereinheit
wird durch Ca2+ sowohl durch Kalmodulin
als auch durch die B-Untereinheit reguliert. Die B-Untereinheit
weist lediglich eine Ca2+-abhängige regulatorische
Aktivität
auf und weist keine Phosphatase-Aktivität auf. Es
existieren zwei Gene, die eng verwandte (ungefähr 80% identische) A-Untereinheits-Isoformen,
nämlich
Aα und β, im Maus-,
menschlichen und Ratten-Genom codieren. Die α-Isoform ist die vorherrschende
Isoform, die in Gehirn, Thymus und in T-Zellen zu finden ist. Die Aα- und Aβ-Isoformen weisen
eine getrennte zelluläre
Verteilung im Gehirn auf, wobei Aα im
Hippocampus, in der Hirnrinde, im Kleinhirn bzw. Cerebellum und
im Striatum am häufigsten
vorkommen. Die unterschiedlichen Verteilungen der beiden Isozyme
legen nahe, dass sie spezielle Funktionen beim Modulieren der neuronalen
Aktivitäten
aufweisen können.
Die physiologischen Funktionen der unterschiedlichen Calcineurin
A-Isoformen wurden bis jetzt nicht definiert.
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J Neurochem 62 (1994) 803 offenbart,
dass das abnormal phosphorylierte Tau-Protein, das mit der Alzheimer-Krankheit
assoziiert ist, durch die Protein-Phosphatase-2B (PP-2B), ebenfalls
bekannt als Calcineurin, dephosphoryliert wird.
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WO-A-95/05466 offenbar die Expression
von Kinasen in transgenen nicht-menschlichen Tieren, die die Phosphorylierung
des Tau-Proteins modulieren, und dass die Hyperphosphorylierung
von Tau in AD (Alzheimer's
disease = Alzheimer Krankheit) durch eine (unspezifische) Abnormalität in der
Aktivität
von Kinasen und Phosphatasen verwsacht werden kann, die die Phosphorylierung
von Tau regulieren.
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Brain Pathol 4 (1984) 3 offenbart
transgene und Knockout-Mäuse
und deren Anwendung auf Modelle newologischer Erkrankungen.
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EP-A-0 544 942 offenbart Okadainsäure und
deren Aktivität
als Phosphatase-Inhibitor.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren, wie es in den Ansprüchen spezifiziert ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ebenfalls transgene, nicht-menschliche Säugetiere, wie beispielsweise
Nagetiere und insbesondere Mäuse,
denen ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, und die somit eine gestörte Calcineurin-Expression
aufweisen. In einer Ausführungsform
fehlt den transgenen, nicht-menschlichen Säugetieren der vorliegenden
Erfindung ein funktionelles Calcineurin-Aα-(CNAα)-Untereinheits-Gen, ein funktionelles
Calcinewin-Aβ (CNAβ)Untereinheits-Gen
oder sowohl CNAα als
auch CNAβ-Untereinheits-Gene.
In einer weiteren Ausführungsform
fehlt den transgenen, nicht-humanen Säugetieren (beispielsweise Nagetieren,
wie beispielsweise Mäuse
und Ratten) ein funktionelles Calcineurin-Gen (beispielsweise ein
Calcinerin-Untereinheits-Aα-Gen,
Calcineurin-Untereinheits-Aβ-Gen)
und sie exprimieren humanes Tau-Protein. In solchen transgenen Säugetieren
wird die Hyperphosphorylierung von humanem Tau-Protein exprimiert
und polymerisiert, was die Bildung gepaarter helikaler Filamente
zur Folge hat, die im Gehirn newofibrilläre Knäuel bilden. Einem dritten Typ
eines transgenen, nicht-humanen Säugetiers (beispielsweise Nagetiere,
wie beispielsweise Mäuse
und Ratten) fehlt ein funktionelles Calcineurin-Gen, exprimiert
humanes Tau-Protein und überexprimiert
das humane Amyloid-Vorläufer-Protein
und das humane Alzheimer Aβ-Protein.
Solche transgenen Säugetiere
zeigen sowohl die pathologischen Läsionen bzw. Verletzungen der
Alzheimer Krankheit – Amyloid-Ablagerungen
und gepaarte helikale Filamente (die newofibrilläre Knäuel bilden, die sich in den
Gehirnneuronen in der Alzheimer Krankheit akkumulieren) – und dienen
als verbessertes Modell für
die Alzheimer Krankheit, mit dem Arzneistoffe oder Mittel identifiziert
werden sollen, die die pathologischen Läsionen reduzieren (teilweise
oder vollständig).
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Wie hierin beschrieben, produziert
ein transgenes, nicht-humanes Säugetier,
dem ein funktionelles Calcineurin (CN)-Gen fehlt, in hohem Maße erhöhte Mengen
von hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Das transgene, nicht-humane
Säugetier
der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, Arzneistoffe oder
Mittel zu identifizieren, die durch oder als Folge ihrer Wirkung
auf CN dazu verwendet werden können, Arzneistoffe
oder Mittel, die immunsuppressive Wirkungen aufweisen, zu identifizieren,
einschließlich
Arzneistoffe und Mittel, die die Calcineurin Aα (CNAα)-Untereinheit, der Calcineurin
Aβ (CNAβ)-Untereinheit
beeinträchtigen.
Zusätzlich
können
weitere transgene Säugetiere
der vorliegenden Erfindung, hierin beschrieben, dazu verwendet werden,
Mittel zu identifizieren, die beim Reduzieren der Phosphorylierung
von Tau-Protein und bei der Produktion pathologischer Läsionen von
Nutzen sind, die für
die Alzheimer Krankheit charakteristisch sind.
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In einer Ausführungsform betrifft die vorliegeride
Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die
Phosphorylierung des Tau-Proteins im zentralen Nervensystems eines
Säugetiers
reduziert, umfassend die Schritte: a) einem transgenen, nicht-humanem
Säugetier,
dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, ein Mittel zu verabreichen,
das bezüglich
seiner Fähigkeit,
die Phosphorylierung des Tau-Proteins zu reduzieren, überprüft werden
soll; b) den Umfang zu bestimmen, in dem die Phosphorylierung des
Tau-Proteins im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers
eintritt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) den in b) bestimmten
Umfang mit dem Umfang zu vergleichen, in dem die Phosphorylierung
im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle eintritt. Wenn die Phosphorylierung
in einem geringeren Umfang im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen
Säugetiers
eintritt, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der
Kontrolle, reduziert das Mittel die Phosphorylierung des Tau-Proteins.
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In einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines
Mittels, das die Bildung gepaarter, helikaler Filamente (paired
helical filament = PHF) im Nervensystem eines Säugetiers reduziert, umfassend
die Schritte: a) einem transgenen, nicht-humanen Säugetier,
dem ein funktionelles CN-Gen fehlt und das humanes Tau-Protein exprimiert,
ein Mittel zu verabreichen, das bezüglich seiner Fähigkeit
zur Reduktion der PHF-Bildung überprüft werden
soll; b) das Ausmaß bzw.
den Umfang zu bestimmen, in dem die PHF-Bildung im Nervensystem
des transgenen, nicht-humanen Säugetiers
eintritt, dem das Mittel verabreicht wird; und c) den Umfang, der
in b) bestimmt wurde, mit dem, in dem die PHF-Bildung im Nervensystem
einer geeigneten Kontrolle eintritt, zu vergleichen, wobei, wenn
die PHF-Bildung in einem geringeren Umfang im Nervensystem des transgenen,
nicht-humanen Säugetiers
eintritt, dem das Mittel verabreicht wird als im Nervensystem der
Kontrolle, das Mittel die PHF-Bildung reduziert. In einer anderen
Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren
eines Mittels, das eine für
die Alzheimer Krankheit charakteristische Läsion im Nervensystem eines
Säugetiers
reduziert, umfassend die folgenden Schritte: a) Verabreichen eines
Mittels an ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles CN-Gen
fehlt, das humanes Tau-Protein exprimiert und das humane Amyloid-Vorläufer-Protein
und das humane Alzheimer Aβ-Protein überexprimiert,
das auf seine Fähigkeit überprüft werden
soll, eine Läsion
zu reduzieren, die für
die Alzheimer Krankheit charakteristisch ist; b) Bestimmen des Umfangs,
in dem die Läsion
im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers eintritt, dem das
Mittel verabreicht wird; und c) Vergleichen des in b) bestimmten
Umfangs mit dem Umfang, in dem die Läsion im Nervensystem einer
geeigneten Kontrolle eintritt; wobei, wenn die Läsion im Nervensystem des transgenen,
nicht-humanen Säugetiers,
dem das Mittel verabreicht wird, in einem geringeren Umfang auftritt
als im Nervensystem der Kontrolle, das Mittel eine Läsion reduziert,
die für
die Alzheimer Krankheit charakteristisch ist.
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Die pathologischen Läsionen,
die für
die Alzheimer Krankheit charakteristisch sind, können in einem Säugetier
unter Verwendung von Mitteln reduziert werden, die durch das Verfahren
der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, und schließen die
Bildung gepaarter helikaler Filamente (PHF) und Amyloid-Ablagerungen ein.
Zusätzlich
kann die Phosphorylierung von Tau-Protein, das mit der Alzheimer
Krankheit assoziiert ist, unter Verwendung von Mitteln reduziert
werden, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert
wurden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Phosphatase-Aktivität eines
Calcineurin Aβ-Untereinheits-Gens
im Nervensystem eines Säugetiers
reduziert, umfassend die folgenden Schritte: a) Verabreichen einem
transgenen, nicht-humanen Säugetier,
dem ein funktionelles Calcineurin Aβ-Untereinheits-Gen fehlt, ein Mittel,
das bezüglich
seiner Fähigkeit überprüft werden soll,
die Phosphatase-Aktivität einer
Calcineurin Aβ-Untereinheit
zu reduzieren; b) Bestimmen der Calcineurin-Aβ-Untereinheits-Phosphatase-Aktivität, die in
den Zellen im Nervensystem des transgenen, nicht-humanen Säugetiers
vorliegt, dem das Mittel verabreicht werden soll; und c) Vergleichen
der Calcineurin Aβ-Phosphatase-Aktivität, bestimmt
in b), mit der Calcineurin Aβ-Phosphatase-Aktivität in Zellen
im Nervensystem einer geeigneten Kontrolle, wobei, wenn die Aβ-Phosphatase-Aktivität in einem
geringeren Umfang im Nervensystem eines transgenen, nicht-humanen
Säugetiers
vorliegt, dem das Mittel verabreicht wird, als im Nervensystem der
Kontrolle, das Mittel die Phosphatase-Aktivität einer Calcineurin Aβ-Untereinheit reduziert.
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Das transgene, nicht-humane Säugetier,
dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, schließt Säugetiere ein, bei denen das
CN-Gen im Genom nicht vorliegt und Säugetiere, bei denen die strukturelle
oder funktionelle Aktivität
des CN-Gens, das im Genome des Säugetiers
vorliegt, gestört
wurde (beide Typen werden als Calcineurin-Knockout-Säugetiere
bezeichnet). Das CNAα-Untereinheits-Gen
und/oder das CNAβ-Untereirheits-Gen
kann zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung entfernt oder
funktionell gestört
werden. Beispielsweise kann, wie in Beispiel 1 beschrieben, das
Genom eines nicht-menschlichen Säugetiers
mit einer Sequenz rekombiniert werden, die in das Axon, das das
CNAα-Gen
des Tieres codiert, eingefügt
wird, was eine Störung
der CNAα-Expression
zur Folge hat. Weitere Verfahren zur Produktion eines CN-Knockout-Säugetiers
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch den Fachmann auf
dem Gebiet durch Routineexperimente bestimmt werden.
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Ein geeignetes Säugetier zur Verwendung in der
vorliegenden Erfindung ist ein Säugetier,
das nach Entfernung des CN-Gens und nach Störung der Funktion des CN-Gens
erhöhte
Mengen an hyperphosphoryliertem Tau-Protein produziert. Transgene,
nicht-humane Säugetiere
der vorliegenden Erfindung schließen Nagetiere (beispielsweise
Ratten, Mäuse)
und Primaten ein.
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Im Verfahren der vorliegenden Erfindung
wird die Bestimmung der Fähigkeit
eines Mittels, die mit der Alzheimer Krankheit assoziierten Läsionen zu
reduzieren, im Nervensystem des transgenen Säugetiers nachgewiesen. Insbesondere
kann die Wirkung des zu überprüfenden Mittels
im zentralen Nervensystem des transgenen Säugetiers bestimmt werden. Beispielsweise
kann das zu überprüfende Mittel
im Hirn des transgenen Säugetiers
bestimmt werden.
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Die Verfahren, die dazu verwendet
werden, die Fähigkeit
eines Mittels oder Arzneistoffes zu bestimmen, eine für die Alzheimer
Krankheit charakteristische Läsion
zu reduzieren, die die Phosphorylierung von Tau-Protein einschließt, sind
Routineverfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Beispielsweise kann, wie in Beispiel 1 beschrieben, die Bestimmung
des Umfangs, in dem die Phosphorylierung des Tau-Proteins im transgenen,
nicht-humanen Säugetier
der vorliegenden Erfindung eintritt, unter Verwendung von Anti-PHF-Antikörpern bestimmt
werden. Anti-PHF-Antikörper
können
ebenfalls dazu verwendet werden, den Umfang, in dem die PHF-Bildung
eintritt, zu bestimmen. Eine Überprüfung der
Reduktion von Amyloid-Ablagerungen kann unter Verwendung von Anti-β-Protein,
Thioflavin S oder Kongo-Rot bestimmt werden. Zusätzlich wurden Verhaltensbeobachtungen
des transgenen Säugetiers,
dem ein Mittel verabreicht wurde, zur Bestimmung der Fähigkeit
des Mittels, für
die Alzheimer Krankheit charakteristische Läsionen zu reduzieren, einschließlich der
Phosphorylierung des Tau-Proteins, angewendet.
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Wie hierin verwendet, kann "eine geeignete Kontrolle" eine oder mehrere
geeignete Kontrollen sein. Ein Beispiel für eine geeignete Kontrolle
ist ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, das die gleichen Charakteristika
wie das transgene Tier aufweist, dem ein Mittel, das überprüft werden
soll, verabreicht wird (das heißt,
das transgene, nicht-humane Test-Säugetier).
Die Test- und Kontroll-Nicht-Humanen-Säugetiere werden unter denselben
Bedingungen gehalten; sie unterscheiden sich lediglich in der Anwesenheit
(Testtier) oder Abwesenheit (Kontrolltier) des zu überprüfenden Mittels.
Beispielsweise kann eine geeignete Kontrolle, die zum Vergleichen
der Ergebnisse, die mit dem Mittel oder Arzneistoff der überprüft werden
soll, erzielt wurden, verwendet wird, folgendes sein: 1) ein transgenes,
nicht-humanes Säugetier,
dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, 2) ein transgenes, nichthumanes
Säugetier,
dem ein funktionelles CN-Gen fehlt und das ein humanes Tau-Protein
exprimiert oder 3) ein transgenes, nicht-humanes Säugetier,
dem ein funktionelles CN-Gen fehlt, ein humanes Tau-Protein exprimiert
und das humane APP-Protein überexprimiert;
4) ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles
CN-Gen fehlt, ein humanes Tau-Protein exprimiert und die humanen APP-
und die humanen Alzheimer Aβ-Proteine
in Abwesenheit des zu überprüfenden Mittels überexprimiert, und
5) Variationen hiervon. Beispielsweise ist in der Ausführungsform
zum Identifizieren eines Mittels, das die Phosphorylierung von Tau-Protein
im Nervensystem eines Säugetiers
reduziert, ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles
CN-Gen fehlt, eine geeignete Kontrolle. Die Menge der Phosphorylierung des
Tau-Proteins in dem transgenen, nichthumanen Kontrollsäugetier
wird in Abwesenheit des zu überprüfenden Mittels
bestimmt.
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Ein weiteres Beispiel für eine geeignete
Kontrolle sind normale Wurfgeschwister. Das heißt, um eine vollständige Calcineurin-Knockout-Maus
zu produzieren, werden zwei Mäuse,
die für
das CN-Gen heterozygot sind, gepaart, und drei Typen der Nachkommenschaft
werden produziert: Mäuse,
die für
das CN-heterozygot sind, Wildtyp(WT)-Mäuse und Mäuse, die bezüglich des
CN-Gens homozygot sind (das heißt
CN-Knockout-Mäuse).
Die Nachkommenschaft, die WT-Mäuse
sind, sind die normalen Wurfgeschwister, und können als geeignete Kontrolle
in den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Ein weiteres Beispiel
für eine
geeignete Kontrolle ist ein entsprechendes Wildtyp-Säugetier.
Andere Kontrollen können
durch den Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung von nicht mehr
als Routineexperimenten bestimmt werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein transgenes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles
Calcineurin-Gen fehlt. Zusätzlich
betrifft die vorliegende Erfindung ein transgenes, nicht-humanes
Säugetier,
dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, und das das humane
Tau-Protein exprimiert. Darüber
hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein transgenes, nicht-humanes
Säugetier,
dem ein funktionelles Calcineurin-Gen fehlt, das humane Tau-Protein
exprimiert und das humane Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) und/oder
das humane Alzheimerβ-Protein überexprimiert.
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Pathologische Läsionen, die das Alzheimer Krankheits-Gehirn
charakterisieren und die die Newodegeneration verursachen, die zu
Demenz führt,
schließen
die extrazellulären
Amyloid-Ablagerungen
und die intrazellulären
neurofibrillären
Knäuel
ein, die aus Bündeln
gepaarter helikaler Filamente zusammengesetzt sind, wie es im Elektronenmikroskop
zu sehen ist. Die Amyloid-Ablagerungen sind in erster Linie aus
einem ungefähr
42 Aminosäure
langen Peptid zusammengesetzt, bezeichnet als Aβ, das aus dem größeren Vorläufer-Protein,
genannt Amyloid-Vorläufer-Protein
oder APP, abgeleitet ist. Die gepaarten helikalen Filamente sind in
erster Linie aus dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau zusammengesetzt,
das abnormal mit zusätzlichen Phosphatgruppen
modifiziert wurde (hyperphosphoryliert). Der relative Beitrag dieser
beiden Läsionen
zum neuronalen Zelltod ist bis jetzt nicht bekannt, es wird jedoch
angenommen, dass diese von Bedeutung sind. Die Korrelation mit dem
neuronalen Zelltod und der Demenz ist beim Auftreten der neurofibrillären Knäuel am höchsten,
die die gepaarten helikalen Filamente in Neuronen enthalten. Es
wird deswegen als auf dem Gebiet axiomatisch akzeptiert, dass eine
erfolgreiche Behandlung für
die Alzheimer Krankheit die Bildung gepaarter helikaler Filamente
verhindern oder reduzieren, oder bereits gebildete Filamente entfernen
kann.
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Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existieren
keine Nagetier-Modelle, die gepaarte helikale Filamente produzieren
oder hyperphosphoryliertes Tau-Protein akkumulieren. Das Exemplar/Athena
transgene Maus-Modell für
die Alzheimer Krankheit überexprimiert
eine mutierte Form des APP-Gens (assoziiert mit familiärer Alzheimer
Krankheit) und zeigt einen gewissen synaptischen Verlust und die
Akkumulation von Amyloid, es erzeugt jedoch keine gepaarten helikalen
Filamente und zeigt keine klaren Lernstörungen (Games, D., et al.,
Nature, 373: 523–527
(1995). Es ist deswegen von Bedeutung, ein Maus-Modell zu entwickeln,
in dem sich gepaarte helikale Filamente bilden können. Ein solches Modell würde als
Ziel bzw. Target zum Testen potentieller Alzheimer-therapeutischer
Mittel dienen, die entwickelt wurden, um die Bildung gepaarter helikaler
Filamente zu reduzieren oder zu verhindern. Zusätzlich würde eine Tiermodell, vorzugsweise
ein Nagetier-Modell, das sowohl Amyloid-Ablagerungen als auch gepaarte
helikale Filamente zeigt, der humanen Alzheimer Krankheit am engsten ähneln und
würde das
Testen therapeutischer Gene ermöglichen,
die dazu vorgesehen sind, beide pathologischen Läsionen der Alzheimer Krankheit
zu reduzieren.
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Auf Basis der Entdeckung, dass die
Calcineurin-Knockout-Maus stark erhöhte Mengen an hyperphosphoryliertem
Tau-Protein produziert, wird ein Maus-Modell für die Alzheimer Krankheit,
in dem eine hyperphosphorylierte Form des humanen Tau-Proteins exprimiert
wird, in dem hyperphosphoryliertes humanes Tau-Protein und die Akkumulation
gepaarter helikaler Filamente gezeigt wird, und und in dem die Alzheimer
Amyloid-Ablagerungen des β-Proteins
und die gepaarten helikalen Filamente des hyperphosphorylierten
Tau-Proteins exprimiert wird, wie nachstehend beschrieben erzeugt.
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Die Calcineurin-Knockout-Maus wird
mit einer Maus-Linie gepaart, die bezüglich der Expression des humanen
Tau-Proteins homozygot ist. Diese letzteren Mäuse wurden durch transgene
Standardtechnologie erzeugt, bei der das humane Tau-Protein in befruchtete
Maus-Eizellen in
einem Konstrukt injiziert wird, das deren Expression unter der Kontrolle
des humanen THY1-Promotors ermöglicht.
In diesen Tieren liegt das transgene, humane Tau-Protein in Nervenzellkörpern, Axons
und Dendriten vor, und ist an geeigneten Stellen teilweise hyperphosphoryliert,
um gepaarte helikale Filamente zu produzieren, jedoch nicht in dem
Ausmaß des Maus-Tau-Proteins
in der Calcineurin-Knockout-Maus-Linie. Eine Paarung dieser beiden
Tiere erzeugt Nachkommenschaft, die alle ein ausgeschaltetes Calcineurin-Gen
auf einem Chromosom, ein normales Calcineurin-Gen auf dem homologen
Chromosom tragen wird, und deren Hälfte das humane Tau-Transgen
tragen wird.
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Der Genotyp der Nachkommenschaft
wird durch Entfernen eines kleinen Stückes des Schwanzes, Präparieren
von DNA und Durchführen
einer Southern Blot- oder PCR-Analyse zur Bestimmung, dass sie alle ein
ausgeschaltetes Calcineurin-Gen tragen, und das 50% das humane Tau-Transgen
tragen, bestimmt. Die Nachkommenschaft, die die humane Tau-Sequenz trägt, wird
bis zum Erwachsenenalter gezüchtet
und gepaart, um eine neue Reihe von Nachkommen zu erzeugen, von
denen 25% gemäß der Mendel'schen Gesetze bezüglich des
ausgeschalteten Calcineurin-Gens homozygot sind und entweder für das humane
Tau-Transgen homozygot
oder heterozygot sind. Die Genotypen dieser Tiere werden, wie vorher,
durch Analyse von Schwanz-DNA bestimmt. Tiere, die das ausgeschaltete
Calcineurin-Gen im homozygoten Zustand + das humane Tau-Transgen
entweder im heterozygoten oder homozygoten Zustand tragen, werden
weiter untersucht. Tiere, deren Genotypen durch die Analyse von
Schwanz-DNA bestimmt wurden, läßt man die
Geschlechtsreife erreichen, und sie werden untereinander gepaart,
um eine Linie von Tieren zu erzeugen, die die korrekten Genotypen
kontinuierlich aufweisen. Mäuse
mit unterschiedlichem Alter werden mit Fixiermittel perfundiert
und einer Immunzytochemie und Elektronenmikrokospie unterworfen,
um zu bestätigen,
dass sie humanes Tau-Protein exprimieren und das Calcineurin-Protein
nicht exprimieren.
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Phosphorylierungs-empfindliche Antikörper werden
wie für
die Calcineurin-Knockout-Maus beschrieben, verwendet, um zu bestätigen, dass
das humane Tau-Protein aufgrund des Fehlens von Calcineurin in seiner
Umgebung hyperphosphoryliert wird. Spezieller Fokus wird bezüglich des
Hippocampus vorgenommen, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass
er ein Bereich mit hoher Calcineurin-Expression und mit der größten Zunahme
der Hyperphosphorylierung von Tau aufgrund der Calcineurin-Knockout-Mutation,
ist.
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Neurofibrilläre Knoten werden durch modifizierte
Bielchowsky Silber-Färbung,
und durch Anti-PHF-Antikörper
identifiziert, und werden durch elektronenmikroskopische Identifizierung
bestimmt. Die Protein-Expressionsstudien werden durch Northern Blot-Analyse abgeschlossen,
um zu bestätigen,
dass das Calcineurin-Gen in diesen Genen nicht exprimiert wird.
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Wenn einmal eine Maus-Linie erzeugt
wurde, exprimiert sie hyperphosphoryliertes humanes Tau-Protein,
und vorzugsweise gepaarte helikale Filamente in den Neuronen bzw.
Nervenzellen des Hippocampus. Die Mäuse können auf mehreren Wegen verwendet
werden. Sie können
zunächst
direkt zum Screenen nach therapeutischen Mitteln, die die Hyperphosphorylierung
von Tau reduzieren und in der Produktion von gepaarten helikalen
Filamenten verwendet werden. Sie können ebenfalls dazu verwendet
werden, vermeintliche therapeutische Mittel auf ihre Wirksamkeit
bei der Vorbeugung der Hyperphosphorylierung von Tau und der Bildung
von gepaarten helikalen Filamenten zu testen. Diese Mäuse können ebenfalls
dazu verwendet werden, die ideale Dosis eines vermeintlichen therapeutischen
Mittels für
die Alzheimer Krankheit zu bestimmen.
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Die Mäuse können ebenfalls zur Erzeugung
eines weiter verbesserten Tiermodells für die Alzheimer Krankheit verwendet
werden. Zu diesem Zweck werden homozygote Mäuse, denen ein funktionelles
Calcineurin-Gen fehlt (Mäuse,
die bezüglich
des ausgeschalteten Calcineurin-Gens homozygot sind) und die das
humane Tau-Gen exprimieren, so dass hyperphosphoryliertes humanes
Tau-Protein und vorzugsweise PHF im Gehirn produziert wird, mit
dem Exemplar/Athena APP-transgenen Mäusen gepaart, die das APP-Protein
und das Alzheimer Aα-Protein überexprimieren
und als Folge Amyloid-Ablagerungen erzeugen. Der Zweck dieser Kreuzung
besteht darin, eine Nachkommenschaft zu erzeugen, die alle Eigenschaften
der Alzheimer Krankheit aufweisen, nämlich hyperphosphoryliertes
Tau, gepaarte helikale Filamente und Amyloid-Ablagerungen. Die Nachkommenschaft
dieser Kreuzung wird, wie vorher unter Verwendung einer Schwanz-DNA,
analysiert, um deren Genotyp zu bestätigen. Beispielsweise werden
zwei heterozygote Säugetiere
gekreuzt, von denen eines das humane Tau-Transgen exprimiert, und
das andere ein humanes APP-Transgen
exprimiert. Eine Schwanz-DNA-Analyse wird durchgeführt, um
zu bestimmen, welcher der Nachkommen beide Transgene trägt. Wenn
einerseits die Paarung zwischen einer homozygoten Version der transgenen
APP-Maus und einer homozygoten Version der transgenen, humanen Tau-Maus
durchgeführt
wird (die natürlich
bereits mit der homozygoten Calcineurin-Knockout-Mutation kombiniert
ist), dann sollte technisch die Schwanz-DNA-Analyse nicht notwendig sein, wird jedoch
nichtsdestoweniger in dem Fall durchgeführt, in dem die Keimbahn irgendeiner
der Mäuse
die Transgene verloren hat. Die Nachkommenschaft dieser Kreuzung
trägt somit
zwei humane Transgene, eines für
APP und eines für
Tau, unter verschiedenen Promotoren, jedoch beide im Nervensystem exprimiert,
plus einer homozygoten Knockout-Mutation im Calcineurin-Gen.
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Diese Mäuse produzieren Amyloid-Ablagerungen
und hyperphosphorylierte Taulgepaarte helikale Filamente, wodurch
die beiden Hauptkriterien für
ein Alzheimer Tiermodell erfüllt
werden. Die Mäuse
können dazu
verwendet werden, vermeintliche therapeutische Mittel für die Alzheimer
Krankheit zu screenen. Sie können
ebenfalls, genauso wie bei den oben erwähnten Mäusen, dazu verwendet werden,
vermeintliche diagnostische Tests für die Alzheimer Krankheit zu
testen, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, eine Analyse für die
Tropicamid-Überempfindlichkeit
der Pupille, das Vorliegen von Schlüssel-Proteinen, wie beispielsweise Antichymotrypsin,
APP, Aβ und
von hyperphosphoryliertem Tau im Serum und/oder cerobrospinaler
Flüssigkeit.
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Die Erfindung wird in den nachfolgenden
Beispielen veranschaulicht, die jedoch nicht als einschränkend aufgefasst
werden sollen.
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Beispiele
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Verfahren und Materialien
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Die folgenden Verfahren und Materialien
werden in den hierin beschriebenen Beispielen verwendet. Bezugnahmen,
die in den Beispielen 1–3
erwähnt
werden, sind solche, die in der gegenständlichen Anmeldung eingeschlossen
sind, die unmittelbar Beispiel 3 folgen.
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Konstruktion
von Targeting-Vektoren
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Das Targeting bzw. Ziel-Konstrukt,
das zur Störung
des CNAα-Gens
verwendet wurde, wurde zum Implementieren der kürzlich beschriebenen Doppel-Selektionstechnik
(Mansour, 1988; Mortensen, 1992) entwickelt. Murine CNAα cDNA wurde
durch PCR-Amplifikation aus Mausgehirn Gesamt-mRNA unter Verwendung von
Primern kloniert, die der CNAα cDNA-Sequenz
entsprechen (Kincaid, 1990; Zugangsnummer J05479), unter Verwendung
von Standardverfahren (Ausubel, 1994). Ein Bakteriophagenklon, der
einen Teil der katalytischen Acc-Domäne des Calcineurin codiert
(Kincaid, 1990), bezeichnet als MCAL-1, wurde durch Screenen einer
genomischen 129/Svj Leber-Bibliothek (Stratagene) mit muriner CNAα cDNA gewonnen.
Ein 13 kb EcoRI-Fragment aus Klon MCAL-1 wurde unter Verwendung
von Standardverfahren in Bluescript-tk subkloniert (Ausubel, 1994).
Die Intron-Exon-Grenzflächen des
murinen Calcineurin Aα-Gens
wurden durch Restriktions-Enzym-Stellenkartierung
und durch Nukleotid-Sequenz-Analyse definiert (Ausubel, 1994). Das
Neo-Gen wurde in
eine MluI-Stelle in der Mitte des Exons eingefügt, das Nukleotide 572–717 der
Maus CNAα mRNA-Sequenz
codierte (Zugangsnummer J05479; Kincaid, 1990). Sowohl neo als auch
tk wurden durch den Phosphorglyzerat-Kinase-Promotor gesteuert.
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Transfektion
und Selektion von mutierten ES-Zellen
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J1 ES-Zellen wurden auf Feeder-Layers
aus 7-bestrahlten, embryonalen Fibroblasten (EF)-Zellen, wie beschrieben (Li, 1992) gezüchtet. 1,5–2 × 107 J1-Zellen bei Passage 9–10 wurden trypsinisiert und
in 1 ml Elektroporations-Puffer resuspendiert (Thomas und Capecchi,
1987), außer,
dass die NaCl-Konzentration 137 mM betrug. 50 μg Konstrukt-DANN wurden durch
Elektroporation in J1 ES-Zellen eingebracht und in G418 und FIAU,
wie bereits früher
beschrieben, gezüchtet
(Li, 1992). Die überlebenden
Klone wurden 8-10 Tage nach Selektion aufgenommen und die DNA wurde
zur Southern Blot-Analyse extrahiert.
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Erzeugung
von Keimbahn-Chimären
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Heterozygote ES-Zellen wurden in
C57BI/6J Blastozysten injiziert und in den Uterus von pseudo-schwangeren
weiblichen Black Swiss-Mäusen,
wie beschrieben, reimplantiert (Bradley, 1987). Männliche Agouti-Nachkommen
(abgeleitet von den 129 ES-Zellen) wurden mit weiblichen Black Swiss-
oder C57BI/6J-Mäusen
gepaart. Die Schwanz-DNA von der Agouti-F1-Nachkommenschaft wurde
durch Southern Blot-Analyse bezüglich
der Keimbahn-Übertagung
des mutierten Alleles des CNAα-Gens
untersucht. Homozygote mutierte Mäuse wurden durch Paaren der
heterozygoten mutierten Mäuse
gewonnen. Die in den hierin präsentierten
Experimenten verwendeten Mäuse
waren 8-10 Wochen alt, und wiesen wie erwähnt entweder Black Swiss/129-Hintergrund
oder B6/129-Hintergrund auf.
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Erzeugung von Doppel-Knockout
ES-Zellen und RAG-2 Chimären
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Homozygote mutierte ES-Zellen wurden
aus heterozygoten CNAα+/-ES-Zellen, wie beschrieben, erzeugt (Mortensen,
1992) mit den nachfolgenden Modifikationen. 1–2 × 106 heterozygote
Knockout ES-Zellen von einem einzigen Klon wurden auf jede 10 cm
Platte auf G418-resistenten EF-Zellen in LIF-suplementierten (1000
U/ml) Medien ausplattiert. Nach 12 Stunden wurden 1,5 mg Trockenpulver
G418 pro ml-Kultur zugesetzt. Nach 4–6 Tagen der G418-Selektion
wurden die überlebenden
Kolonien aufgenommen und die Struktur des Calcineurin Aec-Gens wurde
durch Southern Blot-Analyse bestimmt.
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Doppel-Knockout-Zellen wurden in
RAG-2–/– Blastozysten
injiziert (Shinkai, 1992 entweder aus B6/129 oder FvB-Hintergrund,
um somatische Chimären
zu erzeugen (Chen, 1993). Der ES-Zellbeitrag zu den Chimären wurde
durch Hüllfarbe
(nur für
FvB-Hintergrund) und durch Messen der Anzahl von CD4+ und
CD8+ Lymphozyten im Periphärblut bestimmt.
Die in den Experimenten verwendeten Chimären waren 10 Wochen alt.
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Zytofluorometrische
Analysen
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Thymus, Lymphknoten und Milz wurden
aus B6/129 Wildtyp und mutierten Mäusen isoliert und in einer Einzell-Suspension
dispergiert. Die roten Blutzellen wurden durch Lyse mit Tris/NH4Cl-Lösung
für 5 Minuten bei
Raumtemperatur entfernt. Die Zell-Suspension wurde mit einem Nylonsieb
filtriert und zweimal mit Färbemedium
gewaschen, das aus HBSS mit reduziertem Phenolrot, Natriumazid,
BSA und EDTA bestand. 0,5 × 106 Zelle/25 μl/färben wurden mit 1 μg/10 μl/färben von
PE- oder FITC-markierten Antikörpern
inkubiert (PharMingen, San Diego, CA) für 15 Minuten auf Eis, einmal
gewaschen und mit 0,5% Formamid in Färbemedium fixiert. Eine Durchflußzytometrie
wurde unter Verwendung eines Zytofluorograph IIs Durchflusszytometers
und unter Verwendung eines Zell-Sorters durchgeführt (Becton-Dickinson, San
Jose, CA). Insgesamt 20.000 Zellen wurden bei jedem Färben aufgezeichnet.
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Eine in vivo-Immunisierung
und in vitro T-Zell Proliferation und Zytokin-Produktionsassays
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Acht bis zehn Wochen alte Wildtyp-
und homozygote mutierte Mäuse
von Black Swiss/129-Hintergrund
wurden mit 150 5 μg
Trinitrophenyl (TNP) gekoppelt an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)
immunisiert, oder mit 300 5 μg
TNP gekoppelt an Ovalbumin (OVA) in vollständigem Freund'schen Adjuvants über eine Fußkissen-Injektion
(Coligan, 1994). Sowohl die Wildtyp- als auch mutierten Mäuse wiesen
zumindest ein H-2b Allele in ihrem Genom
auf, wie durch PCR nachgewiesen, unter Verwendung der Primer, die
ein 1Ee-b abgeleitetes Fragment amplifizierten (Mathis, 1983); Dr.
Leslie Berg, Persönliche
Kommunikationen).
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Zehn Tage nach Immunisierung wurden
die Lymphknoten-Zellen geerntet. 2 × 105 Lymphknoten-Zellen/pro
Well wurden in 96-Well-Platten mit OVA allein restimuliert; oder
mit OVA plus 4 × 104 T-Zell-depletierten und bestrahlten C57BL/6
Milz-Zellen als exogene Antigen präsentierende Zellen; oder mit
OVA plus 10 Einheiten/ml exogenem IL-2. Bei 60 Stunden Stimulierung
wurde die Kultur für
6 Stunden mit 1 μCi/Well 3H-Thymidine gepulst. Die Experimente wurden
dreifach durchgeführt.
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Die T-Zell-Produktion von Zytokinen
wurde unter Verwendung von Standardverfahren gemessen. Lymphknoten-Zellen
von immunisierten Mäusen
wurden geerntet und mit 1 mg/ml OVA in vitro restimuliert. Überstände aus
2 × 105 Zellen/200μl/96-Well wurden nach 24 Stunden
geerntet. Die IL-2 Aktivität
in den Überständen wurde
durch Proliferation von HT-2 Zellen in Gegenwart eines IL-4 Antikörpers gemessen
(11B11). Bei 24 Stunden wurde die HT2-Kultur mit 1μCi/Well 3H-Thymidine für 6 Stunden gepulst. Überstände aus
6 × 105 Zellen/2005μl/96-Well wurden nach 60 Stunden
geerntet. Die IFNγ-Mengen
in den Überständen wurden durch
ELISA gemessen.
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Präparation
von T-Zell-Extrakten
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Milz- und Lymphknoten wurden aus
Wildtyp- und mutierten Mäusen
geerntet und wurden in Ein-Zell-Suspensionen dispergiert. Rote Blutzelle
wurden durch Lyse entfernt. Die Endkonzentrationen wurden auf 1,5–2,0 × 108 Zellen, suspendiert in 2 ml PBS, das 5%
fötales
Kalbsserum und 4 mM EDTA enthielt, eingestellt. Die Zellsuspensionen
wurden unter Verwendung einer Maus T-Zell-Anreicherungssäule (R&D Systems) bezüglich T-Zellen
angereichert. Die T-Zellen wurden dann mit Lyse-Puffer, der 50 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 15% Glyzerol, 0,1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT,
50 5 μg/ml
PMSF, 50 μg/ml
Sojatrypsin-Inhibitor, 5 μg/ml
Aprotinin, 5 μg/ml
Leupeptin enthielt, lysiert. Teilmengen von 8 × 106 Zellen
pro 50 μl
Lyse-Puffer wurden bis zur weiteren Analyse eingefroren.
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Herstellung
von Gehirnextrakten
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Unter Verwendung einer Sinterglas-Gewebs-Mühle wurde
ein einzelnes Mausgehirn in 50 ml/Puffer homogenisiert, der 50 mM
Tris pH 7,5, 15% Glyzerol, 0,1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 50 μ/ml PMSF, 50
5 μg/ml
Soja Trypsin-Inhibitor, 5 μg/ml
Aprotinin, 5 μg/ml
Leupeptin und 0,05% (v/v) NP-40 enthielt. Der Extrakt wurde einer
Zentrifugation unterworfen (10,000 × g) und der Überstand
wurde bei –80°C aufbewahrt,
bis er untersucht wurde. Das Protein wurde unter Verwendung des
Bio-Rad Assays gemessen, und die Konzentrationen betrugen typischerweise
zwischen 15 und 20 mg/ml.
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Western Blot
Analyse
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Die Menge an Calcineurin Aα in T-Zell-Extrakten
wurde durch Western Blot unter Verwendung von Standardverfahren
bestimmt. Zwanzig Mikrogramm T-Zell-Extrakt oder Gehirn-Homogenate
wurden durch SDS-PAGE auf einem 16% Tris/Glycingel (Novex) bei 150
Volt (konstante Spannung) fraktioniert und auf eine PVDF-Membran
(Immobilon) bei 100 Volt für
1,5 Stunden übertragen.
Im Anschluss an den Transfer wurde die Membran über Nacht bei 4°C in M-Blotto
blockiert. Die Membranen wurden kurz in PBS gespült, und entweder mit Kaninchen-Antikörper 82929
(spezifisch für
ein C-terminales Peptid, SNSSNIQ von humanem CNAα) oder Kaninchen-Antikörper 82948
(spezifisch für
die CNAβ-Reste
386–396,
LMTEGEDEFDG) umgesetzt. Kaninchen-Anti-Peptid-Antiserum wurde 1
: 10,000 verdünnt.
Die Membranen wurden gewaschen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur
in TBST inkubiert, das HRP-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper (Amersham)
verdünnt
1 : 10,000, enthielt. Die Membrane wurden in TBST gewaschen und
mit dem ECL Western Bloting-Nachweissystem (Amersham) entwickelt.
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Calcineurin
Phosphatase Assay
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Der Phosphatase Assay ist eine modifizierte
Version eines kürzlich
beschriebenen Verfahrens (Manalan und Klee, 1983; Liu, 1991). Das
Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen 60 μl) enthielt 50 mM MES (ph6.0), 100
mM NaCl, 6 mM Mg(OAc)2, 100 mM CaCl2, 100 mg/ml BSA (Fraktion V), 1,25 mM Okadainsäure (Calbiochem),
20 mM [33P] RII Peptid (600 cpm/pmol) und
T-Zell-Gehirn-Extrakt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei
30°C inkubiert.
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Die Reaktion wurde durch Zusatz von
100 ml eiskaltem 5% TCA/0,1 M Kalium-Phosphat (pH 7,0) beendet.
Das Präzipitat
wurde auf einer MultiScreen IP-Platte (Millipore) gesammelt. Ein
Viertel (40 ml) des terminierten Reaktionsgemisches wurde pro Well
aufgebracht, gewaschen und in einem Top-Count Scintillationszähler gezählt (Packard
Instrument Co.).
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Herstellung von markiertem
Phospho-R11-Peptid
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Das R11-Peptid (modifiziert nach
Manalan und Klee, 1983; Liu, 1991), DLDVPIPGRFDRRVSVAAE, wurde am
Serinrest mit 33P wie folgt phosphoryliert:
Das endgültige
Reaktionsgemisch enthielt 1,5 mg des synthetischen Peptid-Substrats,
20 mM MOPS (pH 7,0), 2 mM Mg(OAc)2, 1 mM γ-33P-ATP (spezifische Endaktivität 600 cpm/pmol),
13 mM DTT und 250 Einheiten der Protein-Kinase-Untereinheit. 50
ml 6 mg/ml DTTI wurden 250 Einheiten der Protein-Kinase-Untereinheit
zugesetzt und nach 10-minütiger Inkubation
wurde das DTT/Protein-Kinase-Gemisch den anderen Bestandteilen zugesetzt,
um die Phosphorylierungs-Reaktion zu beginnen, die für 50 Minuten
bei 30°C
durchgeführt
wurde. Das phosphorylierte Peptid wurde auf einer 1,0 ml Dowes AG-1
X8-Säule aufgereinigt,
die mit 30% Essigsäure
equilibriert war und wurde wie beschrieben konzentriert. Die Endkonzentration
des markierten Peptids wäre
zwischen 300–400
pmol [33P] Peptid/ml.
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Histologie
und Immunhistochemie
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Mäuse
wurden mit 2,5% Avertin anästhetisiert
und intrakardial mit Tyrodslösung,
gefolgt von 4% gepuffertem Paraformaldehyd perfundiert. Die Gehirne
wurden sofort entfernt und in 4% gepuffertem Paraformaldehyd bei
4°C über Nacht
fixiert. Sie wurden darauf in 4% gepuffertem Paraformaldehyd mit
10% Saccharose bei 4°C über Nacht
eingeweicht. Zwei bis drei pm dicke Koronalschnitte des Gehirns
und Schnitte, die zur Achse des Gehirnstammes mit angelagertem Cerebellum
Rückenmark
senkrecht sind, wurden routinemäßig verarbeitet
und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin
und Eosin, Luxol Fast Blue, Bielchowsky Silber und Cresyl Violett
(Nissl)-Färbungen
angefärbt.
Um die Flächen
zu bestimmen, die für
Gehirnschnitte repräsentativ
sind, wurden die Maximaldimensionen des Gehirns ungefähr auf der
Ebene des optischen Chiasmus und der mittleren Pons/Cerebellum in
den Schichten gemessen, und die Flächen wurden für jede Probe
berechnet.
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Paraffinschnitte wurden entparaffinisiert,
und wurden unter Verwendung der ABC- und ABC-AP-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers
(Vector, Burlingame, CA) immungefärbt. Um das Signal auf dem
fixierten Gewebe zu verstärken,
wurden gelegentlich die Schnitte bzw. Objektträger mit entweder 88% Ameisensäure für 10 Minuten
oder mit 0,1 M Citrat pH 6,0 für
10 Minuten in der Mikrowelle behandelt (um das Citrat zum Sieden
zu bringen).
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Morris Water Maze Task
(Morris Wasserlabyrinth-Aufgabe)
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Naive, erwachsene Mäuse (10–37 Wochen
alt) wurden verwendet. Die Trainingsvorrichtung für die räumliche
Version von Morris Water Maze war ein ringförmiger Polypropylen-Pool mit
einem Durchmesser von 120 cm. Die Fluchtplattform betrug 11,5 cm
Durchmesser. Das Maze bzw. das Labyrinth war in vier gleiche Quadranten
eingeteilt, und die Fluchtplattform war im Zentrum eines der vier
Quadranten angeordnet. Das Wasser wurde bei 78°F gehalten. Nicht-toxische Crayola-Weißpulverfarbe
wurde zugesetzt, um das Wasser opaque zu machen. Der Pool wurde
in einem Raum angeordnet, der eine Anzahl von Gegenständen an
den Wänden
aufwies und innerhalb des Raum, der durch eine im Pool schwimmende
Maus gesehen werden konnte. Vor dem Training ließ man jede Maus, damit sich
die Maus an das Wasser und die Fluchtplattform gewöhnen konnte,
30 Sekunden auf der Plattform verbleiben und eine Minute umherschwimmen,
und man ließ sie dann
das Erklettern der Plattform fünfmal üben. Die
Genotypen der experimentellen Subjekte waren für den Durchführer der
Experimente verblindet.
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Verstecktes
Plattformtraining
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Akquisition: Das Oberteil der Plattform
war 1 cm unter der Oberfläche
des Wassers, das für
das Tier, das im Pool schwimmt, unsichtbar war. Die Plattform-Anordnung
variierte zwischen unterschiedlichen Tieren, blieb jedoch immer
am selben Ort für
eine vorgegebene Maus. Vor jedem Versuch wurde die Maus 30 Sekunden
auf der Plattform angeordnet. Ein Versuch wurde durch Anordnen eines
Tieres entlang des Randes des Pools, der die Wand berührt, begonnen.
Der Startort alternierte bei 1 bis 4 Startorten, wobei jeder Versuch
am selben Tag an unterschiedlichen Startorten begann. Ein Subjekt
ließ man
60 Sekunden lang auf der Plattform, wobei dessen Bewegung durch
einen Computer verfolgt wurde. Die Zeit, die notwendig war, um die
Fluchtplattform zu lokalisieren (Fluchtlatenz) wurde bei jedem Versuch
bestimmt. Tiere, die die Plattform in 60 Sekunden nicht fanden,
wurden vom Durchführer
des Experimentes geleitet, und die Fluchtlatenz wurde als 61 Sekunden aufgezeichnet. Nach jedem Versuch
ließ man
die Tiere für
30 Sekunden auf der Plattform verbleiben. Mit den Tieren wurden
4 Versuche pro Tag für
acht aufeinander folgende Tage durchgeführt. Jeder Versuch in einem
Block von vier Versuchen wurde um jeweils eine Stunde getrennt (verteiltes
Versuchsverfahren).
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Probeversuch
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Eine Stunde nach dem letzten Trainingsversuch
wurde mit jedem Tier ein Probetest unternommen. Während des
Probetests ließ man
jedes Subjekt auf der Plattform 30 Sekunden verbleiben. Darauf wurde
die Plattform aus dem Pool entfernt, ohne dass das Tier diese Aktion
bemerkte. Ein Versuch wurde durch Anordnen der Maus ein wenig außerhalb
des Zentrums begonnen, gegenüber
dem Punkt gelegen, an dem sich die Plattform üblicherweise befand. Jedes
Tier ließ man
60 Sekunden den Pool durchsuchen. Zwei Messungen des Suchverhaltens
wurden bestimmt. Eine Quadrantensuchzeit-Messung wurde durch Bestimmen
der Menge der Zeit erzielt, die in jedem Quadranten zugebracht wurde.
Eine Plattform-Kreuzungsmessung wurde durch Zählen der Zeitpunkte erzielt,
in denen ein Subjekt den exakten Platz im Trainingsquadranten überquerte,
in dem die Plattform während
des Trainings lokalisiert war. Zum Vergleich würde die Anzahl von Zeitpunkten,
zu denen ein Subjekt den äquivalenten
Ort an jedem der anderen Quadranten überkreuzte, bestimmt.
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Zufälliger Plattformtest
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Am nächsten Tag des Probeversuches
ließ man
die Tiere einen Versuch mit der Plattform an ihrem ursprünglichen
Ort durchführen,
und drei Versuche mit der Plattform an einer der Plattformstellen
in den anderen drei Quadranten. Die durchschnittliche Fluchtlatenz
zur Plattform, wenn sie sich an ihrem Originalplatz befand, wurde
als die trainierte Plattform-Fluchtlatenz
der Mäuse
verwendet, und die durchschnittliche Zeit, die zur Lokalisierung
der Plattform verbraucht wurde, wenn sie sich an den drei neuen
Orten befand, wurde als die andere Plattform-Fluchtlatenz der Tiere
verwendet.
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Sichtbares Plattformtraining
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Nach der versteckten Plattform-Aufgabe
wurden dieselben Tiere dem sichtbaren Plattform-Training unterworfen. In der sichtbaren
Plattform-Aufgabe war die Plattform noch 1 cm unter der Wasseroberfläche, jedoch
wurde eine Flagge am Oberteil der Plattform angebracht, um diese
sichtbar zu machen. Das Trainingsverfahren war dasselbe wie bei
der versteckten Plattform-Aufgabe, außer dass die Plattform-Position
zwischen vier unterschiedlichen Positionen innerhalb jedes Blocks
von vier Versuchen alternierte, und dass die Ausgangsposition immer
gegenüber
der Position der Plattform war. Jede Maus ließ man 12 Versuche pro Tag durchführen, in
Blocks von jeweils vier Versuchen für drei aufeinander folgende
Tage (massiertes Versuchsverfahren). Jeder Block von vier Versuchen
war um jeweils eine Stunde voneinander getrennt.
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Angst-Konditionierung
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Erwachsene Mäuse wurden individuell für zumindest
eine Woche vor dem Verhaltenstest beherbergt. Sie wurden jeden Tag
für eine
Woche vor dem Testen behandelt, um Stress zu reduzieren. Die Angst-Konditionierung
und das kontext-abhängige
Lerntesten wurden in einer kleinen Nagetierkammer (Coulbourn) durchgeführt, die
einen Stab-Boden aus rostfreiem Stahl enthielten (5 mm Durchmesser,
beabstandet 1 cm), durch die Schocks durch durcheinandergebrachte
Füße verabreicht
werden konnten. Die Kammer wurde innerhalb eines schallgedämpften Kastens
(Coulbourn) mit einem Ventilationspropeller, der Hintergrundlärm bereitstellte,
angeordnet. Die Kammer wurde mit 1% Essigsäure gereinigt und vollständig getrocknet,
bevor jedes Tier in dieser angeordnet wurde. Das Frieren bzw. Zittern
wurde durch ein Zeitproben-Verfahren bestimmt, bei dem ein Beobachter,
der gegenüber
den Maus-Genotypen verblindet war, jede Maus 2 Sekunden einordnete.
Die Experimente wurden auf Videoband aufgenommen, und das Frieren
wurde erneut durch zwei Beobachter, die gegenüber den Maus-Genotypen verblindet
waren, bestimmt.
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Kontext-abhängige Angst-Konditionierung
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Einige der Tiere machten ein Morris
Water Maze-Training durch (6 Wildtyp und 6 Mutanten), und einige alters-gematchte
naive Tiere (3 Wildtyp und 2 Mutanten) wurden den nachfolgenden,
kontext-abhängigen Angst-Konditionierungs-Vorschriften
unterworfen. In der Konditionierungsphase wurden die Tiere in der Schock-Kammer
drei Minuten angeordnet und wurden anschließend drei Fuß-Schocks
unterworfen (0,5 mA Intensität,
1 s Dauer, 1 Minute Abstand). Die Mäuse wurden aus der Kammer 1
Minute nach dem letzten Fuß-Schock
entfernt. Bei 1, 2 oder 24 Stunden nach dem Training wurden die
Tiere erneut in die Schock-Kammer überführt, und
das Frieren wurde für
3 Minuten ohne jegliche Fuß-Schocks überwacht.
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Ton-abhängige Angst-Konditionierung
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Naive, adulte Tiere (9–17 Wochen
alt) (15 Wildtypen und 14 Mutanten) wurden in der Schock-Kammer für 3 Minuten
angeordnet, und wurden dann 20-sekündigen lauten Tönen ausgesetzt
(ungefähr
75 db, 1000 Hz, 3 Minuten Abstand) durch einen Lautsprecher, der
an der Kammer befestigt war. Ein Fuß-Schock (0,5 mA Intensität, 1 s Dauer)
wurde am Ende jedes Tones präsentiert.
Die Mäuse
wurden dann aus der Kammer 3 Minuten nach dem letzten Fuß-Schock
entfernt. Bei 1 Stunde, 2 Stunden oder 24 Stunden nach dem Training wurde
eine Gruppe von Mäusen
(Wildtyp n-6, Mutanten n-b) in Bezug auf ihr ton-abhängiges Lernen
getestet. Die Mäuse
wurden in einem leeren Kunststoff-Käfig angeordnet, der von der
Schock-Kammer verschieden war (um das Frieren aufgrund kontakt-unabhängiger Konditionierung
zu minimieren), und das Frieren wurde für 3 Minuten vor dem Ton und
anschließend
für 3 Minuten
in Gegenwart des Tones gescored. Eine weitere Gruppe von Mäusen (Wildtyp
n = 9, Mutanten n-8) wurde vierundzwanzig Stunden später in die
Schock-Kammer zurückgebracht,
um ihr kontext-abhängiges
Lernen zu testen. Das Frieren wurde für 3 Minuten überwacht.
Diese Gruppe von Tieren wurde ebenfalls auf ihr ton-abhängiges Lernen
48 Stunden nach dem Training getestet.
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Schmerzempfindlichkeits-Test
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Die Mäuse wurden bezüglich ihrer
Empfindlichkeit gegenüber
Fuß-Schocks
getestet. Die Tiere wurden in der Konditionierungs-Kammer angeordnet
und wurden Fuß-Schocks
(1 s Dauer) zunehmender Intensitäten ausgesetzt,
von 0,05 mA bis 0,40 mA, mit 0,05 mA Zunahmen. Die Intensitäten, die
nozizeptive Reaktionen verursachen, das heißt Zurückschrecken, Laufen/Hüpfen und
Vokalisierung, wurden bestimmt. Alle Tiere wurden bei derselben
Intensität
vor deren Erhöhung
getestet bis sie vokalisierten. Die Durchführer des Experimentes waren
gegenüber
den Genotypen der Subjekte verblindet.
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Elektrophysiologie
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Hippocampus-Schnitte von 16–18 Tagen
alten Mäusen
wurden durch Standard-Verfahren hergestellt. Experimente wurden
bei 27–29°C in normaler
bzw. physiologischer Ringerlösung
durchgeführt,
die 2,5 mM Kalzium, 1,3 mM Magnesium ohne zugesetztes Picrotoxin
durchgeführt.
Zwei-Pfad-Experiment-Vorschriften wurden verwendet, um zu ermöglichen,
dass LTP und LTD aus demselben Schnitt aufgezeichnet wurden, bei dem
zwei stimulierende Elektroden im Stratum Radiatum in CA1 an jedem
Ende angeordnet wurden, wobei die zwei Aufnahmeelektroden zwischen
den beiden stimulierenden Elektroden vorlagen. LTD wurde durch 1 Hz,
10 Minuten Stimulation induziert. LTP wurde mit 100 Hz, 1 Sekunde
Tetanus induziert, die zweimal mit 20-sekündigen Intervallen zwischen
dem Stimulus verabreicht wurden.
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Statistische
Analyse
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Die Daten von der versteckten Plattform-Morris
Water Maze-Aufgabe wiesen einen größeren Anteil gescorter Messungen
auf, somit ist eine Varianz-Analyse (ANOVA), die auf die Originaldaten
angewendet wurde, nicht geeignet. Wir behandelten die Fluchtlatenz
als binäre
Beobachtung, passten dann das verallgemeinerte lineare Modell für diese
binären
Daten unter Verwendung der Statistiksoftware GLIM oder Splus an.
Daten aus der sichtbaren Plattform Morris Water Maze-Aufgabe wurden
einer logarithmischen Transformation unterworfen, bevor ANOVA durchgeführt wurde.
Weil die Angst-Konditionierungs-Frier-Daten binomische Daten sind,
verwendeten wir zunächst
eine Standardbogen-Sinus-Transformation der Daten, um die Varianz
zu stabilisieren. Ein ANOVA wurde bezüglich des Sinus-Bogens der
Quadratwurzel des Prozentsatzes des Frierens durchgeführt.
-
Beispiel 1 Erzeugung von
CNAα–/– Mäusen
-
Calcineurin Aα-Knockout-Mäuse (CNAα–/–)
wurden durch Standardverfahren produziert (Bradley, 1987), was die
homologe Rekombination embryonaler Stamm (ES)-Zellen mit einschloss.
Der Gen-targeting Vector wurde durch Einfügen des Neomycin-Phosphortransferase
(neo) Gens in ein Exon konstruiert, das den Teil der katalytischen
Calcineurin-Domäne
codiert und durch Einfügen
des Thymidin-Kinase-Gens (tk) außerhalb des Homologiebereiches.
Lineare Konstrukt-DNA wurde in J1 ES-Zellen transfiziert, und die Kolonien wurden
bezüglich
Neomyzin und FIAU-Resistenz selektiert (Li, 1992; Mortensen, 1992).
DNA aus individuellen Klonen wurde durch Southern Blot-Analyse im
Anschluss an einen Verdau mit MscI und eine Hybridisierung mit der
1,2 kb-Sonde untersucht. Ein neues 7,5 kb-Fragment, ebenso wie das
18 kb-Fragment, das in Wildtyp-ES-Zell-DNA zu finden war, war in
CNAα+/–ES-Zell-DNA
zu finden. Heterozygote CNAα+/–ES-Zellen
wurden darauf in C57BL/6 Blastozyten injiziert, und einige der sich
ergebenden chimären
Mäuse übertrugen
das mutierte Gen auf die nächste
Generation, wenn sie mit Black Swiss-Mäusen gepaart wurden. CNAα–/– Mäuse wurden
durch Paaren der heterozygoten CNAα–/–Mäuse gewonnen.
-
Erzeugung von CNAα–/–-RAG-2–/–Chimären
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CNAα+/–ES-Zellen
wurden in hoher Konzentration von G418 gezüchtet, um nach ES-Zellen zu
selektieren, denen beide Kopien von funktionellen CNAα-Genen fehlten
(Mortensen, 1992). ES-Zell-Klone, die 1,5 mg/ml G418 überlebten,
wurden aufgenommen und durch Southern-Analyse analysiert. Die CNAα–/–Klon-DNA's wurden identifiziert,
weil ihnen das endogene 18 kb MscI-Fragment fehlte.
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Doppel-Knockout-ES-Zellen wurden
in RAG-2–/–Blastozysten
entweder aus B6/129 oder FvB-Hintergrund injiziert, um somatische
Chimären
zu erzeugen (Chen, 1993). In den RAG-2–/–Mäusen existieren keine reifen
T- und B-Zellen aufgrund ihres Unvermögens, eine Gen-Umordnung durchzumachen
(Shinkai, 1992). Deswegen sollten in den RAG-2–/–-Chimären alle
reifen T- und B-Zellen von den injizierten ES-Zellen kommen, die
CNAα–/– waren.
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Die funktionelle Störung des
Calcineurin Aα-Gens
wurde durch das Fehlen einer CNAα-Expression in Doppel-Knockout-ES-Zellen
bestätigt.
RNA vom Wildtyp, CNAα+/–und
CNAα–/– ES-Zellen
wurden durch Northern Blot-Analyse unter Verwendung des 5' Endes der CNAα cDNA (Nucleotide
95–714)
als Sonde charakterisiert. CNAα mRNA
wurde in Wildtyp-ES-Zellen
und in CNAα+/–ES-Zellen,
jedoch nicht in CNAα–/–ES-Zellen nachgewiesen.
-
Calcineurin-Aktivität in CNAα–/–T-Zellen
-
Die Calcineurin-Aktivität in diesen
Zellen wurde durch Western Blot und Enzym-Aktivitäts-Assay gemessen. Wildtyp-
und CNAα–/–gewonnene
T-Zell-Extrakte wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gelen
fraktioniert, auf eine Membran übertragen
und die Calcineurin Aα und Aβ Polypeptide
unter Verwendung der Calcineurin A-Untereinheits-α-Isoform
oder β-Isoform
spezifischen Antikörpern
identifiziert. Es existierte kein nachweisbares CNAα Polypeptid
in T-Zell-Extrakten aus den CNAα–/–Mäusen, während CNAα in Wildtyp-T-Zell-Extrakten leicht
nachweisbar war. Das CNAβ-Peptid
war weder in Wildtyp-, noch in mutierten T-Zellen mit dem β-Isoform-spezifischen
Antikörper
nachweisbar, selbst wenn das CNAβ-Peptid
im Gehirn leicht nachweisbar war.
-
Die restliche Calcineurin-Aktivität (d. h.
Oktadinsäure-resistent
und EGTA-empfindliche Phosphatase-Aktivität) wurde in denselben CNAα–/–T-Zell-Extrakten
gemessen (Martin und Wiederrecht, in Druck). Calcineurin's Phosphatase-Aktivität in CNAα–/–T-Zell-Extrakten
(169+32 pmol Substrat/Minute/mg Protein) betrug 34% der Aktivität, die in
Wildtyp-T-Zell-Extrakten
zu finden war (500 ± 77
pmol Substrat/Minute/mg Protein). Die Phosphatase-Aktivität sowohl
in Wildtyp-als auch in Mutanten-T-Zellen betrug 90–95%, gehemmt
durch FK506.
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Normale Entwicklung
von T- und B-Zell-Linien
-
CNAα–/– und
B-Zellen waren phänotypisch
normal, und die Zusammensetzung und Verteilung unterschiedlicher
Unterklassen von T- und B-Zell-Linien war in Thymus, Milz, Lymphknoten
und Knochenmark in den CNAα–/– Mäusen normal,
wie durch Färbung
mit Antikörpern
gegen TCRαβ, TCRγδ, CD3, CD4,
CD8, MHC Klasse I und II, Thy-1, IL-2Rα, B220, IgM, IgG, IgD, IgA,
IgE, CD23, S7 und Ly-1 gezeigt wurde. Im Vergleich mit den Wildtyp-Nachkommen
wiesen CNAα–/– Mäuse normale
Populationen von doppelt negativen (CD4–CD8–), doppelt positiven (CD4+CD8+)
und einfach positiven (CD4+CD8– oder
CD4– CD8+)
Thymozyten auf. Eine Färbung
mit unterschiedlichen Vβ-Antikörpern (Vβ5, Vβ6, Vβ8, Vβ9, Vβ11, Vβ13, Vβ14) zeigten, dass
diese Vβ-Darstellungen
in mutiertem Thymus dieselben wie bei der Wildtyp-Kontrolle waren.
Diese Erkenntnisse zeigten, dass ein funktionelles CNAα-Gen für die Reifung
sowohl von T- als auch B-Lymphozyten nicht erforderlich ist.
-
CNAα–/–T-Zellen
reagieren normalerweise auf Mitogene in vitro und bleiben gegenüber CsA
und FK506 empfindlich.
-
Wir testeten die Reaktionen der Wildtyp-
und mutierten T-Zellen auf die mitogene Stimulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat
(PMA) plus Ionomycin, Concanavalin A (ConA) und Anti-CD3ε Antikörper. Alle
drei Mitogene induzierten die CNAα–/–T-Zellen
dazu, genauso schnell wie die Wildtyp-T-Zellen zu proliferieren.
Weiterhin produzierten stimulierte Mutanten und Wildtyp-T-Zellen
dieselben Mengen an IL-2 und IL-4 und exprimierten normale Konzentrationen
an IL-2 Rezeptor auf der Oberfläche.
Somit schienen CNAα–/–T-Zellen
funktionell zu sein, wenn sie in vitro durch Mitogene stimuliert
wurden.
-
Calcineurin, insbesondere Calcineurin,
das die Aα-Untereinheit
enthält,
wurde als das Target für
Immunsuppressive Arzneistoffe CsA und FK506 impliziert, die die
TCR-vermittelte Proliferation und IL-2-Produktion normaler T-Zellen
hemmen (O'Keefe,
1992; Clipstone und Crabtree, 1992; Frantz, 1994; Tsuboi, 1994). Wir
testeten die Arzneistoff-Empfindlichkeit der CNAα–/–T-Zellen.
Wenn sie mit PMA plus Ionomycin, ConA oder αCD3ε-Antikörper stimuliert waren, wurden
CNAα–/–T-Zellen
und Wildtyp-T-Zellen, beide durch CsA und FK506 gehemmt, wie durch
Proliferation und durch IL-2 und IL-4-Produktion gemessen wurde.
CNAα–/–T-Zellen
waren sogar noch empfindlicher gegen diese Arzneistoffe als normale
T-Zellen mit einem
IC50, der 2-7-fach geringer als derjenige
der Wildtyp-T-Zellen war.
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Defective
T-Zell-Reaktionen von Protein-Antigenen
-
Um zu bestimmen, ob CNAα für eine normale
Immunreaktion erforderlich ist, maßen wir die Reaktionen von
Wild-Typ und CNAα–/–Mäusen auf
Hapten-Protein Antigene. Wildtyp- und CNAα–/–Mäuse wurden
mit TNP-KLH oder TNP-OVA über
eine Fußkissen-Injektion
(Coligan, 1994) immunisiert. Zehn Tage nach der Immunisierung wurden
die Lymphknotenzellen geerntet. Die Gesamtzahl an Zellen in den
Lymphknoten war in den immunisierten Wildtyp- und mutierten Mäusen ähnlich,
die sehr viel mehr waren als diejenigen in den Lymphknoten nicht
immunisierter Tiere. Auch war das CD4+: CD8+-Verhältnis
in den Lymphknoten der beiden Maustypen gleich. Wir schlossen, dass
die Wildtyp- und mutierten Maus-T-Zellen beide während der 10 Tage der Immunisierung
geprimt wurden. Jedoch poliferierten nach Restimulation mit KLH
oder OVA in vitro T-Zellen von
Wildtyp-Mäusen
genauso schnell wie T-Zellen von CNAα–/–Mäusen.
-
Der Zusatz normaler Antigen-präsentierender
Zellen oder IL-2 zu den in vitro-Kulturen ergänzte den proliferativen Defekt
von CNAα–/–T-Zellen
nicht.
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Der Defekt in der antigen-spezifischen
T-Zell-Reaktion könnte
entweder auf einen Defekt der CNAα–/–T-Zellen
oder auf einen Defekt in anderen Zellen zurückzuführen sein, deren Funktion für das Priming anigen-spezifischer
T-Zellen während
des Immunisierungs-Prozesses
erforderlich ist. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden,
immunisierten wir die RAG-2–/–CNAα–/–Chimären mit
TNP-OVA und restimulierten die Lymphknotenzellen mit dem Immunogen
nach 10 Tagen. CNAα–/–T-Zellen
der RAG-2-CNAα–/–Chimären proliferieren
nicht mehr so gut in Reaktion auf das Immunogen. In diesen RAG-2-CNAα–/–Chimären umfassten
die CNAα–/–ES-Zellen
ungefähr
10 Prozent der chimären
Tiere, wie es durch Hüllfarbe-Mitwirkung
beurteilt wurde. Lediglich T- und B-Zellen in den Chimären waren
vollkommen CNAα-defizient,
weil sie aus den injizierten CNAα–/–ES-Zellen
gewonnen wurden, während
bis zu 90% anderer Zelltypen aus dem RAG-2–/–CNAα+/+-Hintergrund gewonnen
wurden.
-
Die B-Zell-Funktion wurde in CNAα–/–Mläusen und
in RAG-2–/–CNAα–/–chimären Mäusen bestimmt,
die mit TNP-KLH oder TNP-OVA immunisiert wurden. Ähnliche
Serumtiter von Anti-TNP-Antikörper
(IgG1 und IgG2a) waren in immunisierten Wild-Typ, CNAα–/–Mäusen und
den immunisierten RAG-2–/–CNAα–/–chimären Mäusen zu
finden.
-
Nach Restimulierung mit den Immunogenen
sezernierten die Lymphknoten T-Zellen von immunisierten CNAα–/–Mäusen signifikant
weniger IL-2, IL-4 und IFNγ,
als die Lymphknoten T-Zellen von immunisierten normalen Mäusen (Tabelle
1 und nicht dargestellte Daten). IFNγ wurde in den TNP-OVA immunisierten
RAG-2 Chimären
nachgewiesen in einer Konzentration, die viel höher als die mutierten Mäuse war,
jedoch niedriger als die Wildtyp-Mäuse (Daten
nicht dargestellt), am wahrscheinlichsten, weil in den RAG-2 Chimären einige IFNγ sezernierende
Zellen, wie beispielsweise NK-Zellen aus dem RAG-2–/–CNAα+/+-Hintergrund stammten und
dazu in der Lage waren, IFNγ zu
sezernieren.
-
Tabelle
1.
IL-2 und IFNγ-Sekretion
durch Wildtyp-und CNAα
–/–T-Zellen
-
Tabelle 1. Wildtyp- und CNAα–/–Mäuse wurden
mit 300 μg
TNP-OVA immunisiert. Am Tag 10 wurden Lymphknotenzellen geerntet
und mit 1 mg/ml OVA in vitro restimuliert. Überstände aus 2 × 105Zellen/200μl/96-Well
wurden nach 24 Stunden geerntet. Die IL-2 Aktivität in den Überständen wurde
durch Proliferation von HT-2 Zellen in Gegenwart von αIL-4 Antikörper (11B11)
gemessen. Bei 24 Stunden wurde die HT-2 Kultur mit 1 μCi/Well 3H-Thimidin
für 6 Stunden
gepulst. Überstände aus
6 × 105 Zellen/200 μl/96-Well wurden nach 60 Stunden
geerntet. Die Mengen an IFNγ in
den Überständen wurden
durch ELISA gemessen. Lymphknotenzellen, die ohne Antigen kultiviert
wurden, produzierten keine nachweisbaren Lymphokine (nb, nicht bestimmt).
CNAα–/–T-Zellen
sezernierten signifikant weniger IL-2 (durchschnittlicher Wildtyp
= 12,5 Einheiten IL-2 Aktivität
vs. durchschnittl. CNAα–/– =
1,5; p < 0,003)
und IFNγ (durchschnittl.
Wildtyp = 513 Einheiten IFNγ Aktivität vs. CNAα–/– =
27; p < 0,005)
als die Wildtyp T-Zellen.
-
Diskussion
-
Wir haben eine CNAα–/–Maus
durch strukturelles Inaktivieren des CNAα-Gens erzeugt, was eine Störung der
CNAα-Expression
zur Folge hatte. Wir demonstrieren hierin, dass eine mehr als 65%ige
Reduktion der Calcineurin-Aktivität in den CNAα–/–T-Lymphozyten
existierte. Die B- und T-Zell-Entwicklung in diesen Mäusen scheint
normal voranzuschreiten. Die mutierten Mäuse weisen eine normale B-Zell-Reaktion,
jedoch eine defekte T-Zell-Reaktion in vivo auf. Die Immunreaktion
von RAG-2/CNAα–/–chimären Mäusen ist
ebenfalls mangelhaft, was darauf hinweist, dass T-Zellen per se
defektiv bzw. mangelhaft sind und kein anderer Aspekt der Immunreaktion.
Weiterhin blieben mutierte T-Zellen gegenüber FK506 und CsA empfindlich.
Diese Mäuse stellen
Informationen über
die physiologische Rolle von Calcineurin Aα und Aβ bereit und legen nahe, dass diese
beiden Polypeptide nicht identische Rollen in der T-Zell-Entwicklung
und -Funktion aufweisen.
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Frühere Studien und unsere eigenen
Daten zeigten, dass a die vorherrschende Isoform der beiden Hauptcalcineurin
A-Untereinheits-Isoformen α und β ist (Takaishi,
1991; Kuno, 1992; Guerini und Klee, 1991). In T-Zellen ist Aα für zumindest
65% der Calcineurin-Expression und Aktivität in diesen Zellen verantwortlich. Die
restliche calcineurinartige Aktivität in den mutierten T-Zellen
könnte
auf andere Calcineurin-Isoformen oder auf andere verwandte Phosphatasen
zurückzuführen sein.
Im Thymus ist Aα ebenfalls
die vorhenschende Isoform, weil wir, wenn wir eine murine Thymozyten-cDNA-Bibliothek
unter niedrig-stringenten Bedingungen mit einer CNAα cDNA voller
Länge screenten,
nicht dazu in der Lage waren, irgendwelche Aβ-Klone herauszuziehen, wohingegen
Aα-Klone
reichlich vorhanden waren (unveröffentlichte
Daten). In Abwesenheit des CNAα scheint
CNAβ nicht
nach oben reguliert werden, was gegen die Möglichkeit spricht, dass CNAβ die CNAα-Funktion
in seiner Abwesenheit substituiert.
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CNAα ist für eine normale in vivo antigen-spezifische
T-Zell-Reaktion erforderlich. Der Mangel bzw. Defekt der proliferativen
T-Zell-Reaktion ist nicht auf ein Fehlen einer normalen Antigen-Präsentation
zurückzuführen, weil
der Zusatz von exogenen Wildtyp-Antigen
präsentierenden
Zellen zum Zeitpunkt der in vitro Restimulation den Proliferations-Mangel nicht heilen
konnte. Ebenfalls existierte bei den immunisierten RAG2 somatischen
Chimären
eine normale Antigen-Präsentationsfunktion,
weil nur die reifen T- und B-Zellen lediglich von den injizierten
ES-Zellen gewonnen wurden, die CNAα-defizient waren, wohingegen
die anderen Zelltypen, einschließlich der Antigen-präsentierenden
Zellen, meistens RAG-2–/–CNAa+/+ waren.
Der proliferative Effekt existierte ebenfalls in den immunisierten
RAG-2 somatischen Chimären,
was nahe legt, dass der Defekt per se in T-Zellen anstelle anderer Zelltypen vorlag,
die für
die richtigen Immunisierungen von Bedeutung sein könnten.
-
Wenn Sie mit den Immunogenen in vitro
restimuliert wurden, versagten CNα–/–-Zellen
dabei, IFNγ zu sezernieren
(Tabelle 1). Dies stimmt mit den Erkenntnissen überein, dass CsA und FK506
die IFNγ mRNA
Expression hemmen (Reem, 1983; Tocci, 1989), was nahe legt, dass
CNAα für die IFNγ-Produktion
erforderlich ist. Ebenfalls sezenierten CNAα–/–T-Zellen
signifikant reduzierte Mengen in IL-2 und IL-4 (Tabelle 1 und nicht dargestellte
Daten) und bestätigte
hierdurch die in vitro-Studien, in denen gezeigt wurde, dass CsA
und FK506 die IL-2
und IL-4-Produktion hemmen (Bierer, 1991, Bloemena, 1988; Bloemena,
1989; Dumont, 1990; Herold, 1986; Hess, 1982; Johansson und Moller,
1990; Kumagai, 1988; Lin, 1991; Mattila, 1990; Orosz, 1982; Reem, 1983;
Sawada, 1987; Schreiber, 1992; Schreiber und Crabtree, 1992; Siekierka
und Sigal, 1992; Sigal und Dumont, 1992; Tocci, 1989). Die Daten
legten nahe, dass Calcineurin a in vivo für die normale Expression von IL-2,
IL-4 und IFNγ erforderlich
ist.
-
Interessanterweise reagierten CNAα–/–B-Zellen
normalerweise auf TNP-OVA und TNP-KLH, was nahe legt, dass die T-Zell-Hilfe
für die
Antikörper-Reaktion
normal war. Warum die T-Zellen,
die eine defektive antigen-spezifische Proliferations-Reaktion aufwiesen,
nach wie vor eine normale Hilfe für B-Zellen bezüglich der Antikörper-Produktion
bereitstellen konnten, ist unklar. Es ist möglich, dass, obwohl die mutierten
T-Zellen langsamer proliferierten und reduzierte Mengen an Lymphokinen
produzierten, die kleinere Menge an Lymphokinen und die kleinere
Anzahl aktivierter T-Zellen die vorlagen, ausreichend waren, um
den B-Zellen zu helfen, eine normale Antikörper-Reaktion aufzubauen.
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Die defektive in vivo T-Zell-Reaktion
mag auf Defekte in der T-Zell-Entwicklung zurückzuführen sein, weil angenommen
wird, dass Calcineurin eine Rolle in der T-Zell-Entwicklung spielt. Es wurde dargestellt,
dass CsA die Entwicklung reifer, einfach positiver (CD4+8– oder
CD4–8+ TCR-αβ+Thymozyten
hemmt (Jenkins, 1988; Gao, 1988). CsA stört ebenfalls die Deletion von
Zellen, die selbst-reaktive TCR's
in der Population einfach positiver Thymozyten tragen, die sich
möglicherweise
durch Hemmung des TCR-vermittelten Aktivierungs-induzierten Zelltodes
(Jenkins, 1988; Shi, 1989) entwickeln. Jedoch schien die Thymozyten-Entwicklung
in CNAα–/–Mäusen normal
zu sein, die eine normale Zusammensetzung reifer und unreifer T-Zellen
im Thymus und eine normale Vβ-Verwertung
aufweisen. Darüber
hinaus wurden weder die CNAα–/–Mäuse noch
die RAG-2-CNAα–/– Chimären mit
Autoimmun-Reaktionen in Verbindung gebracht (unsere unveröffentlichten
Beobachtungen). CNAα ist
für die
Reifung von Thymozyten nicht absolut erforderlich, und ist wahrscheinlich
für die
Vermittlung der Wirkung von CsA auf die Thymozyten-Entwicklung in einfach
positiven und auf die negative Selektion autoreaktiver Thymozyten
nicht erforderlich. Wir können
jedoch nicht die Möglichkeit
ausschließen, dass,
obwohl die mutierten T-Zellen phänotypisch
normal sind, sie ein wenig nach Thymus-Selektion anergisiert sind
und somit keine normale in vivo T-Zell-Reaktion errichten können.
-
Obwohl CNAα für die in vivo T-Zell-Reaktion
erforderlich ist, ist für
eine normale in vitro T-Zell-Reaktion auf
Mitogene dieses nicht erforderlich. CNAα–/–T-Zellen
reagierten auf in vitro Mitogen-Stimulierung normal. Dieses Ergebnis
scheint früheren
Erkenntnissen entgegenzuwirken, die CNAα mit der TCR vermittelten Proliferation
und IL-2-Produktion in Verbindung brachten (O'Keefe, 1992; Clipstone und Crabtree,
1992; Frantz, 1994, Tsuboi, 1994). Vielleicht ist Calcineurin Aα normalerweise
in das Transduzieren der TCR-vermittelten
Signale involviert, jedoch könnten αCD3ε und ConA
viel stärkere
Signale als das Antigen bereitstellen. Das heißt, diese Mitogene greifen
in andere Signal-Wege ein und vernebeln somit den Verlust der Calcineurin
Aα-Funktion.
-
Proliferation und Lymphokin-Produktion
von CNAα–/–T-Zellen
war darüber
hinaus sowohl durch CsA als auch FK506 vollkommen unhemmbar, was
nahe legt, dass andere Proteine die immunsuppressive Wirkung der
Arzneistoffe vermitteln können.
Eines dieser Proteine könnte
die Calcineurin Aβ-Untereinheit
sein. Wenn es in Aβ in
Jurkat-Zellen überexprimiert
wird, weist es dieselben biologischen Aktivitäten wie die überexprimierte
Aα-Untereinheit
auf (Dr,. Stephen J. O'Keefe,
nicht veröffentlichte
Ergebnisse). Weiterhin sind 90–95%
der übrigen
Calcineurin-Aktivität,
die in CNAα–/–T-Zellen
zu finden ist, die am wahrscheinlichsten CNAβ zuzuschreiben ist, FK506-empfindlich.
Diese beiden Beobachtungen legen nahe, dass CNAα–/– als
ein immunsuppressives Arzneistoff-Ziel in den CNAα–/–T-Zellen
dienen kann. Weitere Proteine könnten
ebenfalls die CsA und FK506-Hemmung vermitteln, weil die nicht-Calcineurin-vermittelte
und Aktivierungs-induzierte IL-2-Produktion in T-Zell-Linie 171
sowohl durch CsA als auch durch FK506 (Metcalfe, 1994) gehemmt wurde.
Jedoch wiesen CNAα–/–T-Zellen
eine Empfindlichkeit sowohl für
CsA als auch für
FK506 auf, was nahe legt, dass unter normalen Bedingungen, das heißt in Wildtyp
T-Zellen, CNAα das
primäre
Ziel des Arzneistoff-Immunophilin-Komplexes ist, was wahrscheinlich
auf die vorhenschende Präsenz
des CNAα-Proteins
in T-Zellen zurückzuführen ist.
-
Die Erkenntnis, dass CNAα–/–Mäuse einen
merklichen Mangel in der T-Zell-Immunität aufweisen, legt nahe, dass
Calcineurin α eine
relevante Isoform von Calcineurin sein kann, die die Immunsupsression
in Transplantations-Patienten vermittelt, die mit CsA oder FK506
behandelt werden. Jedoch verbleiben andere Ziele für diese
Arzneistoffe, weil CNAα–/–T-Zellen gegenüber FK506
und CsA empfindlich sind. Wir glauben, dass Calcineurin Aβ einige der
Funktionen von CNAα ersetzen
könnte.
Jedoch weist die Aα-Untereinheit
einzigartige physiologische Funktionen auf, weil die CNAα–/–Mäuse Defekte
in der T-Zell-Immunität
und in anderen physiologischen Prozessen aufweisen.
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Beispiel 2 Calcinein Aα, ein Target
für CsA
und FK506 ist ein Schlüssel-Signal-Molekül in der
Ausbildung des Langzeitgedächtnisses
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Calcineurin Aα (CNAα) Knockout-Mäuse wurden durch homologe Rekombinations-Standardtechniken erzeugt
und durch ES-Zell-Manipulationen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben
sind. Homozygote Mutanten sind nicht steril, sondern sind extrem
schlechte Zuchttiere. Deswegen wurden die homozygoten Mutanten,
die untersucht wurden, durch Paaren der heterozygoten Mutanten erzeugt,
die Black Swiss/129-Hintergrund aufwiesen. Die Wildtyp-Wurfgeschwister
aus diesen heterozygoten Paarungen wurden als Wildtyp-Kontrollen in den hierin
präsentierten
Studien verwendet (hierin nachstehend werden die homozygoten CNAα Knockout-Mäuse als
Mutanten bezeichnet, und die Wildtyp-Wurfgeschwister-Kontrollen werden als
Wildtyp bezeichnet).
-
Fehlen einer Calcineurin Aα Protein
und Phosphatase-Aktivität
im mutierten Gehirn beeinflusste seine Entwicklung nicht.
-
Die Einfügung einer Kopie eines neo-Gens
in ein Exon von Calcineurin Aα führt zur
strukturellen Störung
des Genes und der mRNA Transcription. Eine Western Blot-Analyse
von Ganzhirn-Homogenaten mit einem Calcineurin Aα spezifischen Peptid-Antikörper zeigte,
dass im mutierten Gehirn kein Calcineurin Aα-Protein exprimiert wurde, wohingegen
Calcineurin Aα im
Wildtyp-Gehirn sehr reichlich vorhanden war. In denselben Homogenat- Mengen sondierten
wir mit einem Calcineurin Aβ-spezifischen
Peptid-Antikörper.
Dort war eine ähnliche
Menge an Calcineurin Aβ in
den mutierten- und Wildtyp-Gehirnen vorliegend. Wir maßen ebenfalls
die Calcineurin-Aktivität,
d. h. die Okadainsäure-resistente
und EGTA-empfindliche
Phosphatase-Aktivität im
Gehirn. Die Calcineurin-Phosphatase-Aktivität war in großem Maße im mutierten
Gehirn reduziert. Die restliche Calcineurin-Aktivität im mutierten
Gehirn könnte
Calcineurin Aβ oder
anderen Calcineurin-Isoformen zuzuschreiben sein.
-
Wie von anderen und aus unseren eigenen
Daten gezeigt wird, ist Calcineurin Aα die vorherrschende Isoform
der Calcineurin A-Untereinheit im Gehirn, und macht mehr als 85%
des Gesamt-Calcineurin-Proteins aus, und mehr als 85% der Calcineurin-Phosphatase-Aktivität (Takaishi,
1991; Kuno, 1992). Bei Fehlen von Calcineurin Aα wurde die Expression und Aktivität der Aβ-Isoform
nicht nach oben reguliert, was nahe legt, dass Aα und Aβ unterschiedliche physiologische
Funktionen von sich selbst aus aufweisen, und dass Aβ sehr unwahrscheinlich
Aα bezüglich seiner
Funktion im mutierten Gehirn substituiert.
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Die mutierten Gehirne waren kleiner
als diejenigen der Wild-Typen. Das durchschnittliche Wildtyp-Gehirn
wiegt 494,4 mg (n = 5), wohingegen das durchschnittliche mutierte
Gehirn lediglich 408,8 mg (n = 4) wiegt, 85,7 mg leichter im Gewicht.
Die Dichte der mutierten Gehirne war höher als diejenigen der Wildtyp-Gehirne.
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Nach Fixierung in 4% Paraformaldehyd
bei 4°C über Nacht
und Übertragung
auf 10% Saccharose in 4% Paraformaldehyd sanken die mutierten Gehirne
zu Boden, während
die Wildtyp-Gehirne aufschwammen (n jeweils 4). Durch ein sehr einfaches
Verfahren bestimmt, waren die Volumina der mutierten Gehirne ungefähr 0,15
ml kleiner als diejenigen des Wildtyps, wohingegen sie lediglich
63 mg leichter waren, was eine 0,175 g/ml höhere Dichte zur Folge hatte
(nach 4%iger Paraformaldehyd-Fixierung).
-
Histologische Studien zeigten keine
groben Missbildungen oder andere Anomalien in den mutierten Gehirnen
(Daten nicht dargestellt). Es existierten keine Unterschiede, die
im allgemeinen Aufbau, neuronaler Morphologie und Neuronenanzahl
in der Hirnrinde, in den subkortikalen Nuklei, einschließlich der
Amygdala oder dem Rückmark
nachgewiesen wurden. Keine neurofibrillären Knäuel oder andere zytoplasmatische
Abnormalitäten
von Nervenzellen oder anderer Zellpopulationen wurden identifiziert,
und die Myelinisierung schien im gesamten zentralen Nervensystem
sowohl in Wildtyp- als auch mutierten Mäusen normal zu sein. Jedoch
schienen die mutierten Gehirne, insbesondere das Kleinhirn bzw.
Cerebellum kleiner als diejenigen der Wildtyp-Wurfgeschwister zu
sein. Durch Messen der Querschnittsflächen (mm2)
erschienen die Hirn-Hemisphären
in den Mutanten leicht kleiner als diejenigen im Wildtyp zu sein,
jedoch waren die Unterschiede statistisch nicht signifikant (Wildtyp
53 ± 4,8,
n = 5; Mutante 50,3 ± 4,8,
n = 5; p = 0,43). Im Kleinhirn und in den Hirnstämmen existierten keine spezifischen
Unterschiede zwischen den neuronalen und anderen Zellpopulationen,
jedoch erschienen diese Strukturen insgesamt kleiner zu sein (Wildtyp
44,5 ± 3,8,
n = 5; Mutanten 36,8 ± 4,1,
n = 5; p = 0,0012) und die Dichte der Faserwege erschienen in den
mutierten Mäusen
im Vergleich zu den Kontrollen weniger zu sein (Daten nicht dargestellt).
-
Phänotypen der mutierten Mäuse ähneln den
Manifestationen der CsA und FK506 Neurotoxizität
-
Mutierte Mäuse waren von den Wildtyp-
und heterozygoten Wurfgeschwistern nicht unterscheidbar, wenn sie
in einem Alter von drei Wochen abgestillt wurden. Sie pflegen und
ernähren
sich normal. Sie zeigten jedoch einige Phänotypen, die den Manifestationen
einer CsA- und FK506-Neurotoxizität, die früher beschrieben wurde, ähnlich war.
Die mutierten Mäuse
wiesen ein motorisches Koordinationsdefizit (Ataxie) auf. Es existierte
ein ernsthafter Tremor der Maße
der Bewegungen in den Mutanten. Dieses motorische Defizit betraf nicht
alle Mutanten im selben Ausmaß.
Einige Mutanten zeigten schwerere motorische Probleme als andere. Dieses
Phänomen
wurde noch deutlicher, wenn die Tiere älter wurden. Im Vergleich zu
den Wildtypen- wiesen die mutierten Mäuse einen anormalen Gang auf.
Sie konnten auf einer geraden Linie nicht gehen, und hatten ungleichmäßige Gangarten.
Die hinteren Gliedmaßen
neigten dazu, auf dem Boden nachgeschleppt zu werden, und bewegten
sich fast gleichzeitig anstelle einer alternierenden Bewegung. Schwere
Anfälle
wurden in den Mutanten beobachtet. Viele der Mutanten erfuhren ebenso
einen Gewichtsverlust.
-
Während
unserer Charakterisierung der CNAα–/–Mäuse erkannten
wir, dass diese Mäuse
eine reduzierte Lebenserwartung aufwiesen. Wenn sie in einem Alter
von drei Wochen gescort wurden, existierte signifikant weniger (15%)
homozygoter CNAα–/–Nachwuchs,
was sich aus der Zwischenkreuzung zwischen heterozygoten Eltern
(CNAα+/–xCNAα+/–)
ergab, als erwartet (25%, p < 10–30).
Die Überlebenden
CNAα–/–Mäuse machten
eine grob-normale Entwicklung durch, jedoch war ihre Lebenserwartung
dramatisch verkürzt.
Diese Mäuse wurden
in einer virusfreien Einrichtung aufgezogen, in denen immundefiziente
(RAG-2 defiziente) Mäuse
eine normale Lebenserwartung aufwiesen (unsere nicht veröffentlichte
Beobachtung). Pathologische Studien zeigten keine Hinweis auf ein
konsistentes Infektionsmuster oder auf Autoimmunreaktionen (unveröffentlichte
Beobachtungen). Deswegen spielt CNAα eine entscheidende Rolle in
einigen physiologischen Prozessen, die für ein verlängertes Überleben essentiell sind, obwohl
es für
die Entwicklung nicht absolut erforderlich ist.
-
Mangelhaftes
räumliches
Lernen in der Morris Water Maze-Aufgabe
-
Unter Verwendung der Morris Water
Maze-Aufgaben (Morris, 1981; Brandeis, 1989) testeten wir die mutierten
Mäuse bezüglich ihrer
räumlichen
Lernfähigkeiten,
eine Form von Lernen, die einen intakten Hippocampus erfordert (Morris,
1982; Sutherland, 1983). In dieser Aufgabe wurden die Tiere in einem
runden Pool aus opaquem Wasser angeordnet, und sie lernen aus dem
Wasser durch Schwimmen zu einer Plattform zu entfliehen. In der
räumlichen
Version der Morris Water Maze-Aufgabe ist die Plattform in Wasser
eingetaucht, und die Tiere müssen
den Ort der verborgenen Plattform im Vertrauen auf die räumlichen
Signale erlernen, die durch ferne visuelle Objekte bereitgestellt
werden, die den Pool umgeben. Während
jedes Versuchs wird das Tier an einem der vier Startstellen im Pool
angeordnet, und die Plattform-Position für jede individuelle Maus bleibt
während
des gesamten Trainings konstant. In der nicht-räumlichen Version der Morris
Water Maze-Aufgabe ist die Plattform für die im Pool schwimmenden
Tiere sichtbar, indem eine Flagge oben auf der Plattform angeordnet
wird. Für
jeden Versuch wurden die Tiere im Pool an einer der vier Startpositionen
angeordnet, während
die Plattform in einer der vier Plattform-Positionen alternierte.
In dieser Aufgabe müssen
die Tiere lernen, die Flagge mit der Position der Plattform in Verbindung
zu bringen, und die räumliche
Information ist irrelevant. Die verborgene Plattform- und die sichtbare
Plattform-Versionen der Morris Water Maze-Aufgaben sind bezüglich Motivation und der Erfordernisse
für das
Sehen und der Schwimmfähigkeit ähnlich.
Deswegen dient die sichtbare Plattform-Aufgabe als eine bedeutende
Kontrolle für
den verborgenen Plattformtest.
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Wir starteten durch Testen der Wildtyp-
(n = 11)- und der mutierten (n = 10)-Mäuse im verborgenen Plattform-Test
mit einem Block aus vier Versuchen pro Tag, wobei jeder Versuch
durch eine Stunde voneinander getrennt war. Das Training dauerte
acht Tage lang. Am achten Tag durchlief eine Stunde nach dem letzten Trainingsversuch
jedes Tier einen Probetest, bei dem die Plattform aus dem Pool entfernt
wurde und jedes Tier 60 Sekunden lang nach der Plattform suchen
gelassen wurde. Am nächsten
Tag des Probeversuches wurden die Mäuse einem zufallsbedingten
Plattform-Test unterzogen, das heißt ein Versuch mit der Plattform
in ihrer ursprünglichen
Anordnung und drei Versuche mit der Plattform an einer der Plattform-Stellen
in den anderen drei Quadranten. Vierundzwanzig Stunden später wurden
diese Tiere dem sichtbaren Plattform-Test mit drei Blöcken aus
jeden Tag vier Versuchen, neun Blöcken des Trainings insgesamt,
unterworfen. Die Daten wurden untersucht, nachdem das gesamte Training
abgeschlossen war.
-
Im sichtbaren Plattform-Test wurden
sowohl die Wildtypen als auch die Mutanten in zwei Gruppen eingeteilt.
Eine Gruppe (Wildtyp n = 10; Mutante n = 5) konnte die sichtbare
Plattform innerhalb einer vernünftigen Latenz
lokalisiert werden, wohingegen die andere (Wildtyp n = 1; Mutante
n = 5) dies nicht konnte, was am wahrscheinlichsten auf das Fehlen
einer Fluchtmotivation und, lediglich für Mutanten, auf ein motorisches
Defizit zurückzuführen ist.
Sowohl die Wildtyp- als auch mutierten Mäuse, die zur Durchführung der
sichtbaren Plattform-Aufgabe in der Lage sind, sollten eine ähnliche
Fluchtmotivation, Sehvermögen
und motorische Fähigkeiten
aufweisen, die zum Schwimmen zur Plattform erforderlich sind. So
wurden lediglich die Daten von solchen Mäusen, die die sichtbare Plattform-Aufgabe
durchführen
konnten, untersucht, und die anderen wurden ausgeschlossen.
-
Es existiert kein signifikanter Unterschied
zwischen den Wildtypen (n = 10) und den Mutanten (n = 5) in der
Durchführung
der sichtbaren Plattform-Aufgabe (p = 0,248), obwohl es zu Beginn
des Training schien, dass die Mutanten längere Zeit dazu benötigten,
die Plattform zu erreichen. Jedoch war die Gesamtleistung im verborgenen
Plattform-Test der Wildtypen signifikant besser als diejenige der
Mutanten (p < 0,00001).
Die Mutanten lernten nicht, wie die untergetauchte Plattform zu
lokalisieren war (p = 0,956) nach 32 Trainingsversuchen, wohingegen
die Wildtypen sich durch Training signifikant verbesserten (p < 0,00001).
-
Im Probentest, bei dem die Plattform
aus dem Pool entfernt wurde, benötigten
die Wildtypen signifikant mehr Zeit bei der Suche im Zielquadranten,
in dem sich die Plattform befand, als die Zeit, die sie in den anderen drei
Quadranten verbrachten (p < 0,001),
wohingegen die Mutanten nicht vorzugsweise den Zielquadranten durchsuchten
(p = 0,41). Ebenfalls überquerten
im Probentest die Wildtypen die Zielplattform-Position signifikant
häufiger
als die entsprechenden Positionen in den anderen drei Quadranten
(p < 0,03), wohingegen
die Mutanten die Zielplattformposition nicht häufiger als die anderen überquerten
(p = 0,39). Im zufallsbedingten Plattformtest wurden die Latenzen
zur Bestimmung der Plattform an ihrem originalen Ort (Ziel) oder
an anderen drei neuen Orten (andere) bestimmt. Die Wildtyp-Mäuse fanden
die Plattform an ihrer ursprünglichen
Position viel schneller als an den anderen Positionen (p < 0,001), wohingegen
kein Unterschied bezüglich
der Mutanten (p = 0,47) bestand. All diese Tests bestätigten,
dass unter Verwendung unserer Trainingsvorschrift die Wildtyp-Kontrollen
lernten und sich daran erinnerten, die Plattform unter Verwendung
räumlicher
Signale zu lokalisieren, und die Mutanten taten dies nicht.
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Angst-Konditionierungsstudien
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Die Angst-Konditionierung ist die
Form eines assoziativen Lernens, bei dem ein emotional neutraler konditionierter
Stimulus (CS), wie beispielsweise ein Ton, Licht oder die ausgeprägte bzw.
verschiedene Umgebung (Kontext), in der die Ereignisse eintreten,
mit einem aversiven, unkonditionierten Stimulus (US) gepaart wird,
wie beispielsweise ein Fuß-Schock. Der CS erwirbt
mittels seines Verhältnisses
zu dem US aversive Eigenschaften und zeigt Reaktionen, die charakteristischerweise
durch aversive Stimuli hervorgerufen werden, das heißt Frieren
bzw. Erstarren, Defäkation,
Piloerektion etc. (Blanchard und Blanchard, 1969; Bolles und Fanselow,
1980). In der kontext-abhängigen
Angst-Konditionierung ist der CS der Kontext, in dem die Tiere dem
US gegenüber
exponiert werden, und diese Art von Lernen hängt von Hippocampus- und amygdaler Funktionen
ab (Kim, 1993; Phillips und LeDoux, 1992). In der signal-abhängigen Angst-Konditionierung
ist der CS ein Ton, der in einer temporalen Weise mit dem US in
Beziehung steht, und diese Art von Lernen hängt von den Amygdala-, jedoch
nicht von den Hippocampus-Funktionen ab (Kim, 1993; Phillips und
LeDoux, 1992). Wir überprüften die
Leistung der mutierten Mäuse
sowohl in kontext- als auch ton-abhängigen Angst-Konditionierungs-Tests.
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Weil gezeigt wurde, dass Veränderungen
in der Schmerzempfindlichkeit die Frier-Performance beeinträchtigen (Fanselow und Bolles,
1979; Fanselow und Bolles, 1979; Fanselow, 1986), war es wichtig,
zu bestimmen, ob die Mutanten veränderte nozizeptive Reaktionen
auf Fuß-Schocks
aufwiesen, das heißt
Zurückweichen,
Rennen/Hüpfen
und Vokalisierung. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den
Schock-Intensitäten,
die verursachten, dass die Wildtypen und die Mutanten zurückschreckten
und vokalisierten (Zurückschrecken,
p = 0,71; Vokalisierung, p = 0,94). Tatsächlich war die Intensität, die verursachte,
dass die Mutanten liefen/hüpften,
geringer als diejenige für
die Wildtypen (p = 0,012). Dies legt nahe, dass die Schmerzempfindlichkeit
der Mutanten normal war, wenn nicht ein wenig mehr empfindlich als
die Wildtyp-Kontrollen. Somit konnte das Fehlen von Frieren in den
Angst-Konditionierungs-Tests nicht durch Veränderungen in der Schmerzempfindlichkeit
verursacht sein.
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Lernen und
Gedächtnis
in der ton-abhängigen
Angst-Konditionierung
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In der ton-abhängigen Angst-Konditionierung
wurden Wildtyp- und mutierte Tiere in der Schock-Kammer für drei Minuten
angeordnet und darauf drei 20-Sekunden langen, lauten Tönen (CS)
(3 Minuten Abstand) und einem Fuß-Schock (US) bei Beginn jedes
Tones ausgesetzt. Eine Stunde, zwei Stunden oder vierundzwanzig
Stunden nach dem anfänglichen
Training wurden die Tiere in einer anderen Kammer getestet, um die verwirrende
Wirkung der kontext-abhängigen
Konditionierung zu minimieren. Man ließ sie in der neuen Kammer drei
Minuten vor Beginn des Tones verbleiben, der zumindest für drei weitere
Minuten aufrechterhalten wurde. Das Frieren wurde durch ein Zeitabfrageverfahren überwacht.
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Die Wildtyp- und mutierten Mäuse verhielten
sich während
und sofort nach dem Training (p 0,396) ähnlich, und der Trainingseffekt
war für
beide Gruppen stark (p < 0,000001),
was nahe legt, dass kein Unterschied zwischen den Wildtypen und
Mutanten in ihrem assoziativen Lernvermögen und Kurzzeit-Gedächtnis bestand. Wenn
sie bei einer Stunde nach dem Training getestet wurden, wiesen die
Wildtypen im Vergleich zu den ersten drei Minuten ohne Ton ein signifikant
erhöhtes
Frieren bei Beginn des Tones (p = 0,0011) auf, was auf das Vorhandensein
einer ton-abhängigen
Erinnerung hinweist. Die Mutanten zeigten ebenfalls ein gewisses ton-abhängiges Gedächtnis,
wie es durch eine Zunahme des Frierens bei Beginn des Tones unter
Beweis gestellt wurde (p = 0,0034), dies sollte jedoch als gerigfügig signifikant
betrachtet werden, weil die Statistik inakkurat ist, wenn ihre Prozentsätze des
Frieren sehr klein waren. Bei einer Stunde nach dem Training existiert eine
signifikante Abnahme der tonabhängigen
Erinnerung für
die Mutanten, wenn sie mit den Wildtypen verglichen wurde (p = 0,0025).
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Wenn er bei zwei Stunden oder vierundzwanzig
Stunden nach dem Training getestet wurde, zeigte der Wildtyp ebenfalls
ein signifikant erhöhtes
Frieren bei Beginn des Tons (p = 0,026 bzw. p = 0,011), wohingegen die
Mutante dies nicht zeigte (p = 0,731 und p = 0,888), was nahe legt,
dass das geringe ton-abhängige
Gedächtnis,
das in den Mutanten bei einer Stunde nach dem Training vorlag, bei
zwei Stunden nach dem Training verloren gegangen war. Im Vergleich
zu den Wildtypen zeigten die Mutanten ein mangelhaftes ton-abhängiges Gedächtnis sowohl
nach zwei als auch vierundzwanzig Stunden nach dem Training (p =
0,0043 bzw. p < 0,00001).
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Bei zwei Stunden zeigten die Wildtypen
signifikant mehr ton-abhängiges
Frieren als bei einer Stunde, was eine Konsolidierung des Gedächtnisses
nahe legt (Rozin, 1976; Squire, 1984; Zerbolio, 1969; Rudy und Morledge,
1994; Kim, 1992). Es existierte kein Unterschied zwischen ihren
Leistungen bei zwei und vierundzwanzig Stunden nach dem Training.
Es existierte kein signifikanter Unterschied der Leistung der Mutanten zwischen
entweder einer und zwei Stunden oder zwei und vierundzwanzig Stunden
(p = 0,183 bzw. p = 0,473).
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Das Lernen
und das Gedächtnis
in der kontext-abhängigen
Angst-Konditionierung
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In der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung
wurden Wildtyp- und Mutanten-Tiere in der Schock-Kammer (CS) für drei Minuten
angeordnet, und wurden drei Fuß-Schocks
(US) (1 Minute Abstand) ausgesetzt. Bei ein, zwei und vierundzwanzig
Stunden nach dem Training wurden die Mäuse erneut in die Schock-Kammer
geführt,
um ihr kontext-abhängiges
Gedächtnis
für vier
Minuten zu testen.
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Sowohl die Wildtyp- als auch die
mutierten Mäuse
zeigten ein kontext-abhängiges
Lernen mit dem Drei-Fuß-Schock-Protokoll
(Wildtyp p = 0,015, Mutante p = 0,013). Insgesamt existierte kein
signifikanter Unterschied zwischen den Wildtyp- und mutierten Mäusen in
ihrer Leistung während
des Trainings (für
die Lernkurven, p = 0,497; für
die Frier-Reaktionen in den drei Minuten nach Beginn des ersten
Fuß-Schocks,
p = 0,158). Obwohl jedoch der mutierte- und Wild-Typ keine signifikanten
Unterschiede beim Frieren in der vierten und fünften Minute zeigte (p = 0,38
bzw. p = 0,43), fror die mutierte Maus weniger als der Wildtyp bei
der sechsten Minute (marginal signifikant, p = 0,050), was ein sehr
mildes Defizit im kontext-bezogenen Lernen in der Mutante nahe legt.
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Bei einem Test eine Stunde nach dem
Training bestand kein signifikanter Unterschied im Frieren im Kontext
zwischen dem Wildtyp und den mutierten Mäusen (p = 0,109), was eine ähnliche
Beibehaltung des kontext-abhängigen
Gedächtnisses
in beiden Gruppen nahe legt. Es schien jedoch eine leichte Neigung
bei den Mutanten zu bestehen, weniger als die Wildtypen zu frieren,
was auf das milde Lerndefizit der Mutanten zurückzuführen sein mag. Wenn sie bei
zwei und vierundzwanzig Stunden getestet wurden, zeigten die Mutanten
signifikant weniger Frieren als die Wildtypen (p = 0,011 bzw. p
= 0,0043). Es existierte jedoch keine Abnahme der Frier-Reaktion
für die
Mutanten zwischen einer und zwei Stunden nach dem Training (p =
0,78). Deswegen mag der signifikante Unterschied zwischen Wildtyp
und Mutante bei zwei Stunden durch die leichte Zunahme der Reaktion
des Wildtyps verursacht sein (p = 0,08) aufgrund des Gedächtnis-Konsolidierungsprozesses
(Rozin, 1976; Squire, 1984; Zerbolio, 1969; Rudy und Morledge, 1994;
Kim, 1992). Es existierte eine signifikante Abnahme in der Frier-Reaktion
für die
Mutanten zwischen zwei und vierundzwanzig Stunden (p = 0,023), wohingegen
die Reaktionen der Wildtypen ähnlich
blieben (p = 0,29). Dies legt nahe, dass die Mutanten begannen,
zwischen zwei und vierundzwanzig Stunden, am wahrscheinlichsten
aufgrund ihres Unvermögens,
Informationen zu einem Langzeitgedächtnis zu konsolidieren, verloren.
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Diskussion
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CNAα vermittelt die CsA und FK506
Neurotoxizität
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CsA und FK506 wurden erfolgreich
dazu verwendet, Transplantatabstoßungen in Gewebstransplantationen
zu vermeiden (Schreiber und Crabtree, 1992; Siekierka und Sigal,
1992). Diese Arzneistoffe binden an ihre jeweiligen Bindungsproteine,
Cyclophiline und FK506-Bindungsproteine (FKBP), die kollektiv als
Immunophiline bezeichnet werden. Der Arzneistoff-Immunophilin-Komplex
bindet an Calcineurin und hemmt die Phosphatase-Aktivität des Calcineurins (Liu, 1991)
und stellt somit dessen immunsuppressive Wirkungen sicher. Jedoch
ist die Verwendung dieser Arzneistoffe auch mit ernsthaften Nebenwirkungen
bzw. unerwünschten
Wirkungen verbunden, in erster Linie eine Neuro- und Nieren-Toxizität (Siekierka
und Sigal, 1992). Es ist sehr wichtig, zu bestimmen, ob die immunsuppressiven
Funktionen dieser Arzneistoffe und ihre Nebenwirkungen mechanistisch
verbunden sind. Diese Information wäre zur Behandlung von Transplantationspatienten
mit immunsuppressiven Arzneistoffen, und für die Entwicklung besserer
immunsuppressiver Arzneistoffe mit weniger Nebenwirkungen nützlich.
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Die CNAα-defizienten Mäuse zeigten
Symptome, die der durch CsA und FK506 induzierten Neuro-Toxizität ähnlich waren,
einschließlich
Veränderungen
der Gehirndichte, eines ernsthaften bzw. schwerwiegenden Tremors,
Anfälle,
cerebelarer Ataxie, Verhaltensstörungen,
Gewichtsverlust und erhöhter
Mortalität
(Miach, 1986; Wilson, 1988; Labar, 1986; Atkinson, 1984; Menegaux,
1994; Rodriguez, 1992; Appleton, 1989; Lane, 1988; Reece, 1991;
Truwit, 1991). Wir schlagen vor, das CNAα ein Mediator der Neuro-Toxizität der Arzneistoffe
ist. Wir haben ebenfalls kürzlich
demonstriert, dass CNAα eine
relevante Isoform bei der Vermittlung der immunsuppressiven Wirkung
der Arzneistoffe auf T-Zellen ist. Somit sind die immunsuppressiven
Funktionen von CsA und FK506 und deren Neuro-Toxizität mechanistisch
verbunden, das heißt
durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität der CNAα's.
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Es wurde vorgeschlagen, dass die
neuro-toxischen Wirkungen von CsA durch Metaboliten vermittelt wurden,
durch einen Effekt auf die Blut-Hirn-Schranke (Laue, 1988). Jedoch
war CsA in jedem untersuchten Maus-Organ zu finden, einschließlich des
Gehirns, nach subkutaner Verabreichung des Arzneistoffes in einer dosisabhängigen Weise
(Boland, 1984). Dies legte nahe, dass der Arzneistoff dazu in der
Lage war, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, abhängig von
seinen Serumkonzentrationen. Im Gehirn wurden FKBP12 (und zwölf Kilodalton
FK506 Bindungsprotein) und Cyclophiline in reichem Maße gefunden
und in Co-Lokalisierung mit Calcineurin (Steiner, 1992; Dawson,
1994; Snyder und Sabatini, 1995). Die gemeinsame bzw. Co-Lokalisierung
von FKBP12 und Cyclophilin mit Calcineurin würde es diesem ermöglichen,
an die Arzneistoffe zu binden, die in das Hirn eindringen und deren
Hemmung von Calcineurin zu vermitteln, wodurch die Neuro-Toxizität verursacht
wird. FKBP12-Lokalisierungen sind fast ausschließlich neuronal mit deutlichen
regionalen Variationen, die solchen von Calcineurin ähneln, während, selbst
wenn die Cyclophilin-Lokalisierungen
ebenfalls derjenigen von Calcineurin sehr ähnlich sind, einige Gehirnbereiche
existieren, die bezüglich
Cyclophilin angereichert sind, denen Calcineurin fehlt (Steiner,
1992; Dawson, 1994; Snyder und Sabatini, 1995). Der Unterschied
zwischen FKBP12 und der Cyclophilin-Lokalisierung würde voraussagen,
dass FK506 schwerere Nebenwirkungen aufweist. Tatsächlich weist
FK506 schwerere Neuro-Toxizität
als CsA auf (Anonym, 1994; Mueller, 1994). Diese Erkenntnisse stützen unsere
eigenen Erkenntnisse, dass CNAα die
CsA- und FK506-Neuro-Toxizität
vermittelt.
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Es wurde kürzlich vorgeschlagen, dass
der Emulgator für
CsA in klinischen i. V. Formulierungen bzw. Zubereitungen, nämlich Cremophor
EL, beinahe für
die gesamte Neuro-Toxizität
von klinisch hergestelltem CsA bezüglich der Wirkung auf die Elaboration
von Neuriten durch N1 E. 115 Neuroblastom-Zellen (Brat, 1992) verantwortlich
war. Im klinischen Sinne ist es wert zu betonen, dass, obwohl der
Emulgator ebenfalls zur Neuro-Toxizität beitragen
kann, die Wirkungen von CsA und FK506 selbst, das heißt die Hemmungen
der CSAα-Aktivität, ernste
neuronale Nebenwirkungen verursachen kann.
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Wenn verschiedene Blut- und Serumparameter,
einschließlich
ALT, Bilirubin, Urea bzw. Harnstoff, Creatinin und Glukose alleine
oder in einer multi-variablen Weise analysiert wurden, korrelierten
sie signifikant mit der Inzidenz und dem Schweregrad einer frühen postoperativen
Neuro-Toxizität,
was nahe legt, dass die Neuro-Toxizität im Anschluss an Lebertransplantationen
durch verschiedene Faktoren verursacht sein kann, und nicht ausschließlich eine
Arzneistoff-spezifische Nebenwirkung der Immunsuppression ist (Mueller,
1994). Selbst wenn unsere Daten zeigten, dass ein Fehlen von CNAα selbst ausreichend
ist, um die Neuro-Toxizität zu
verursachen, was nahe legt, dass dessen Nebenwirkung Arzneistoff-spezifisch
ist, können
wir die Möglichkeit
nicht ausschließen,
dass eine Fehlfunktion anderer Organe, die auf das Fehlen von CNAα zurückzuführen ist,
ebenfalls zum Symptom beiträgt.
Weitere Studien sind erforderlich, um diese Frage zu beantworten.
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CNAα-defiziente Mäuse weisen
eine erhöhte
Mortalitätsrate
auf, was auch bei CsA- und FK506 behandelten Kindern und erwachsenen
Patienten berichtet wurde (Menegaux, 1994) sowie auch bei Mäusen (Boespflug,
1989). Bei Ratten senkt CsA die Anfallsschwelle und erhöht möglicherweise
die Anfälligkeit
gegenüber
Anfällen
und 20 mg/kg/pro Tag i.p. CsA verursachten signifikante EEG-Abnormalitäten und
Mortalität
(Racusen, 1990). Warum diese Mäuse
starben ist für
uns unklar. Die CNAα-defizienten
Mäuse können als
Tiermodell zur Studie der immunsuppressiven Wirkung und Nebenwirkungen
von CsA und FK506 dienen.
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CNAα ist in das Hippocampus-abhängige räumliche
Lernen involviert und spielt eine entscheidende Rolle bei der Langzeit-Gedächtnisbildung
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Calcineurin Aα-defiziente Mäuse weisen
ein motorisches Defizit auf, das die Mutanten in unterschiedlichem
Ausmaß beeinträchtigt.
Jedoch ist dieses motorische Defizit nicht für das mangelhafte räumliche
Lernen in der Morris Water Maze-Aufgabe verantwortlich, weil diese Mutanten
die sichtbare Plattform genauso schnell wie die Wildtypen finden
können,
was nahe legt, dass die mutierten Mäuse die motorischen Fähigkeiten aufweisen,
die dazu erforderlich sind, in einer ähnlichen Geschwindigkeit wie
die Wildtyp-Mäuse
zu schwimmen. Dieses motorische Defizit ist nicht für das schwache
Defizit im kontextualen bzw. kontextbezogenen Lernen verantwortlich,
wenn sie in den Angst-Konditionierungsstudien bezüglich ihres
Langzeitgedächtnisses
getestet wurden, weil die mutierten Mäuse dazu in der Lage sind,
die frierende Körperhaltung
beizubehalten und eine Frier-Reaktion über eine verlängerte Zeitspanne
aufweisen.
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Diese Mäuse sind jeweils nicht blind,
weil sie die sichtbare Plattform sehen können. Wir können jedoch die Möglichkeit
nicht ausschließen,
dass diese Mäuse
ein wenig kurzsichtig sind, so dass sie die entfernteren räumlichen
Signale nicht genauso klar sehen können, obwohl eine Kurzsichtigkeit
von Mäusen
in der Literatur nicht berichtet wurde. Weiterhin ist die Schock-Kammer
für die
Angst-Konditionierungs-Studien eine sehr kleine Kammer. Die mutierten
Mäuse sollten
dazu in der Lage sein, den Kontext innerhalb der Kammer zu erkennen,
und sie weisen bis jetzt ein mildes Defizit im kontext-abhängigen Lernen
auf, was nahe legt, dass das Sehvermögen in unseren Studien kein
bestimmender Faktor ist.
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CNAα-defiziente Mäuse scheinen
ein normlales assoziatives Lernvermögen aufzuweisen, weil sie dazu
in der Lage waren, die sichtbare Plattform Morris Water Maze-Aufgabe
durchzuführen,
und hatten gegenüber
Fuß-Schocks
Angstreaktionen. Jedoch schien ihr Hippocampus-abhängiges Lernen
beeinträchtigt
zu sein. Die mutierten Mäuse
wiesen ein dramatisches Defizit beim raumbezogenen Lernen in der
verborgenen Plattform Morris Water Maze-Aufgabe auf, jedoch nur
ein geringes Defizit bei der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung.
Es wurde gezeigt, dass beide Aufgaben Hippocampus-abhängig waren
(Morris, 1982; Sutherland, 1983; Kim, 1993; Phillips und LeDoux,
1992).
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Es wurde nahe gelegt, dass, um den
Kontext zu konditionieren, ein Tier ein Konstrukt einer einheitlichen
konfiguralen Repräsentation
des Kontext aufwies (Nadel, 1985; Fanselow, 1990; Rudy, 1993). Es
ist somit möglich,
dass die Konstruktion einer solchen konfiguralen Darstellung durch
den Hippocampus eine Calcineurin α-Funktion
erfordert. In der kontextabhängigen
Angst-Konditionierung zeigten die mutierten Mäuse aufgrund eines milden Defizits
in der räumlichen
Informationsverarbeitung ein mildes Defizit im Lernen. In der verborgenen
Plattform Morris Water Maze-Aufgabe sind die räumlichen Signale viel weiter weg
und viel komplexer als die Schock-Kammer, so dass die Konstruktion
der "räumlichen
Karte" schwieriger
ist. Die größere Schwierigkeit
dieser Aufgabe macht es schwerer zu lernen, und somit war das Lerndefizit
in den mutierten Mäusen
schwerwiegender. Eine weitere Möglichkeit
besteht darin, dass in der Morris Water Maze-Aufgabe das Langzeitgedächtnis für das Lernen
in einem verteilten Versuchs-Verfahren für das Lernen entscheidend sein kann.
Somit würde
das Fehlen einer Langzeit-Gedächtnisfunktion
(wie unten diskutiert) in den mutierten Mäusen zum Fehlen eines Lernens
während
acht Tagen des Trainings beitragen. Ein Massentrainingsverfahren sollte
dazu in der Lage sein, das Fehlen an Langzeit-Gedächtnis zu
kompensieren. Dieses Argument wird durch die Erkenntnis unterstützt, dass
die CREB-defizienten Mäuse,
die ein mangelhaftes Langzeit-Gedächtnis aufweisen, mit einem
verteilten Trainings-Verfahren schlecht lernten, dass jedoch ihre
Leistung derjenigen der Wildtyp-Kontrollen während eines Massentraining-Verfahrens ähnlich war
(Bourtchuladze, 1994). Diese beiden Möglichkeiten stehen nicht im
Konflikt miteinander, wobei beide zu dem schwerwiegenden Lerndefizit der
mutierten Mäuse
in der verbogenen Plattform-Aufgabe beitragen können. Dies ist mit den früheren Erkenntnissen
konsistent, dass die Gedächtnisverschlechterung
durch Erhöhung
der Retentionsverzögerung
der Mengen an Material, das gelernt werden soll, verschlimmert wird
(Mishkin, 1978; ZolaMorgan und Squire, 1985; Squire und Zola-Morgan,
1991).
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Es wurde kürzlich gezeigt, dass zwei zeitlich
getrennte Formern des assoziativen Angst-Gedächtnisses
bestehen, Kurzzeit und Langzeit, die die Frier-Reaktion aktivieren,
die kurz nach dem Fuß-Schock
entsteht (Zerbolio, 1969; Kim, 1992; Rudy und Morledge, 1994; Bourtchuladze,
1994). Die unmittelbar nach den Fuß-Schocks gemessene Frier-Reaktion
ist das Ergebnis von assoziativem Lernen und Kurzzeit-Gedächtnis (Blanchard,
1976; Fanselow, 1986; Kim, 1992; Kim, 1993; Phillips und LeDoux,
1992; Rudy und Morledge, 1994; Bourtchuladze, 1994). Die CNAα-mutierten
Mäuse zeigten
eine normale Angstreaktion in der signalbedingten Angstreaktion,
und eine Gesamtnormalreaktion in der kontext-abhängigen Angst-Konditionierung, selbst
wenn in der sechsten Minuten das Frieren der Mutanten marginal signifikant
weniger betrug. Weiterhin war, wenn sie eine Stunde nach dem kontextabhängigen Training
getestet wurden, kein signifikanter Unterschied zwischen den Wildtyp- und den mutierten
Mäusen.
All dies legt nahe, dass ihr Kurzzeit-Gedächtnis normal ist.
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Die Bildung eines Langzeit- und stabilisierten
Angst-Gedähtnisses
erfordert einen zeitabhängigen Konsolidierungsprozess
(Rozin, 1976; Squire, 1984; Zerbolio, 1969; Rudy und Morledge, 1994;
Kim, 1992). Das Zeitfenster für
den Konsolidierungsprozess erwies sich als zwischen 10 Minuten bis
24 Stunden nach dem Training bei einer Ratte (Rudy und Morledge,
1994) und zwischen 15 Minuten bis 2 Stunden in Mäusen (Zerbolio, 1969). In unseren
Studien machten die Wildtyp-Kontrollen zwischen einer und zwei Stunden
nach dem Training eine Gedächtnis-Konsolidierung
durch, während
die mutierten Mäuse
dies nicht tun, was somit den schrittweisen Verlust des Angst-Gedächtnisses
in den Mutanten verursacht. Somit, wie Rudy und Morledge aus ihrer
Studie der infantilen Amnesie schlossen (Rudy und Morledge, 1994)
zeigen unsere Studien, dass CNAα-defiziente
Mäuse ein
mangelhaftes Langzeit-Gedächtnis
aufgrund eines Mangels in der Gedächtnis-Konsolidierung aufweisen.
Die Retentionsperiode für
das ton-abhängige
oder das kontext-abhängige
Kurzzeitgedächtnis
scheint verschieden zu sein, wobei das des ton-abhängigen Gedächtnisses
kürzer
ist. Dies stimmt mit früheren
Erkenntnissen überein,
dass der Zeitverlauf der Amnesie sich für unterschiedliche Aufgaben
unterscheidet, die unterschiedliche neuro-anatomische Strukturen
involvieren (Kim und Fanselow, 1992; Kim, 1993; Phillips und LeDoux,
1992; Bourtchuladze, 1994).
-
Warum das Fehlen an CNAα ein Defizit
in der Bildung des Langzeit-Gedächtnisses
verursachen kann, ist nicht klar. Wir möchten postulieren, dass CNAα ein Schlüsselsignal-Molekül in solchen
Prozessen ist. Jedoch, selbst wenn der mediale temporale Lappen
für die
Gedächtnisfunktion
von Bedeutung ist (Squire und ZolaMorgan, 1991), legen Beweismittel
ebenfalls nahe, dass das Kleinhirn in höhere, kognitive Funktionen
involviert ist (Middleton und Strick, 1994). Somit könnte das
kleinere Kleinhirn in den mutierten Mäusen deren Funktion beeinträchtigen.
Mehr Studien sind dazu erforderlich, um weiter die Rolle der CNAα's in den neuronalen
Aktivitäten
zu überprüfen.
-
Schlussfolgerungen
-
Wir schließen aus unserer Studie der
CNAα-defizienten
Mäuse,
dass CNAα die
CsA- und FK506-Neuro-Toxizität
vermittelt, und dass CNAα eine
Rolle bei der Prozessierung bzw. Verarbeitung räumlicher Informationen und
der Bildung des Langzeit-Gedächtnisses
spielt. Huang, Li und Kandel hatten postuliert, dass sowohl die
NMDA-abhängigen
als auch NMDA-unabhängigen
Wege bzw. Pfade ein gemeinsames Spätphasen LTP teilen, das mRNA
und Protein-Synthese-abhängig
ist, in das cAMP-abhängige
Kinase involviert ist, und das zu einer Gedächtnis-Konsolidierung führt (Huang,
1994). Es ist wahrscheinlich, dass Calcineurin ein Schlüsselsignal-Molekül in einem
solchen Prozess ist, dessen Aktivierung zur Transkription und Translation
von Proteinen führen
würde,
die für
einen gemeinsamen Gedächtnis-Konsolidierungsprozess
erforderlich sind.
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Beispiel 3 Tau und Neufilament
in Calineurin Aα-defizienten
Mäusen
-
Wir studierten die Rolle von Calcineurin
Aα in der
Regulierung des Phosphorylierungsstatus von Zytoskelett-Proteinen
im Gehirn. Bei Mäusen,
denen die α-Isoform
der Calcineurin A-Untereinheit
fehlt (CNAα), existiert
eine hyperphosphoryliertere Form des Tau-Proteins, das der Hauptbestandteil
der gepaarten helikalen Filamente (PHF) ist, die in der Alzheimer
Krankheit zu finden sind. Die Hyperphosphorylierung von Tau ist
in der Hippocampus-Moosfaser-Region
der mutierten Mäuse
tiefschürfender.
Zusätzlich
enthielten die Moosfaser-Axons
der CNAα Mäuse weniger
Neurofilament-Proteine als der Wildtyp. Elektromikroskopische Untersuchungen
von Moosfasern zeigten ein größeres Mikrotubuli/Neufilament-Verhältnis im
mutierten Gehirn als im Wildtyp-Gehirn. Unsere Erkenntnisse zeigen,
dass CNAα die
Phosphorylierungen von Zytoskelett-Proteinen reguliert, entweder
direkt oder indirekt. Der veränderte
Phosphorylierungsstatus von Tau kann funktionelle Folgen aufweisen,
die für
die Alzheimer Krankheit relevant sind.
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Die Alzheimer Krankheit ist eine
degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems, die Mängel im
Gedächtnis
und in der Kognition zur Folge hat. Die pathologischen Kennzeichen
dieser Erkrankung schließen
neuritische Plaque ein, die das Amyloid Aβ-Protein zusammen mit mehreren
pathologischen Chaperonen und neurofibrillären Knäueln (NFT) gepaarter helikaler
Filamente (PHF) enthalten. Es stellte sich heraus, dass Antikörper, die
gegen gereinigtes PHF gezüchtet
wurden, hyperphosphorylierte Formen des mikrotubuliassoziierten
Proteins Tau erkannten, von denen dann gezeigt wurde, dass sie die
Hauptbestandteile von PHF sind. Es wird angenommen, dass Tau normalerweise
in die Aufrechterhaltung und Entwicklung der axonalen Morphologie
involviert ist (Goedert, 1993).
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Es wurde gezeigt, dass Calcineurin
eine enge Verbindung mit der Zytoskelett-Bildung oder – Funktion aufweist.
In vitro dephosphoryliert Calcineurin mikrotubulus-assoziiertes
Protein 2 (MAP2) und Tau, die von PKA und CaM-Kinase phosphoryliert
werden, und Tubulin, das durch CaM-Kinase phosphoryliert wird (Goto, 1985;
Drewes, 1993; Gong, 1994). Calcineurin wurde aus adrenalem Zell-Zytoskelett
identifiziert und isoliert, und war dazu in der Lage, Zytoskelett-Proteine
zu dephosphorylieren (Papadopoulos, 1990; Papadopoulos, 1989). Es
wird ebenfalls mit dem Zytoskelett in Wachstumszapfen der sich entwickelnden
cerebellaren Neurone angereichert (Ferreira, 1993). In CsA injiziertem
Rattengehirn korreliert die Hemmung der Calcineurin-Phosphatase-Aktivität mit der
Akkumulierung von phosphoryliertem Neurofilament und vielleicht
von Tau (Tanaka, 1993).
-
Wegen der potentiellen Rolle des
Calcineurins in der Regulierung des Phosphorylierungs-Status und der Funktion
von Zytoskelett-Proteinen haben wir seine Funktion in vivo durch Überprüfung der
Phosphorylierung dieser Proteine in Mäusen überprüft, die bezüglich der α-Isoform der Calcineurin A-Untereinheit
(CNAα) defizient
waren. Mutierte Mäuse
zeigen eine größere Zunahme
im Grad der Tau-Phosphorylierung, wie durch Anti-PHF-Antikörper nachgewiesen.
Der Grad der PHF-Immun-Reaktivität
in den mutierten Mäusen
war in den Moosfasern des Hippocampus am höchsten. Im selben Areal existierte
eine gesenkte Neurofilament-Immun-Reaktivität im Mutanten-Hippocampus.
Diese Ergebnisse sind die ersten Dokumentationen einer Rolle für Calcineurin
in der Tau-Phosphorylierung in vivo und legen nahe, dass eine geeignete
Zytoskelett-Bildung von der korrekten Balance der Phosphorylierung
von Tau und vielleicht anderer Proteine abhängt.
-
Wir haben phosphorylierungs-abhängige oder
-unabhängige
Antikörper
verwendet, um die neuro-pathologischen Wirkungen des Verlustes der
CNAα-Funktion
zu untersuchen. Von speziellem Interesse war der PHF-1 monoklonale
Antikörper,
der gegen PHG gezüchtet
wurde, das aus an Alzheimer Krankheit erkrankten Gehirn aufgereinigt
wurde (Greenberg, 1992). Das Antigen, das von PHF-1 am klarsten
erkannt wurde, zeigte sich als eine phosphorylierte Form des mikrotubulus-assoziierten
Proteins Tau. Die Abhängigkeit
des PHF-1 Antikörpers
vom Phosphorylierungszustand von Tau wird durch die Tatsache demonstriert,
dass eine Immunfärbung
mit PHF-1 aufgehoben wird, wenn das PHF-Tau mit Calcineurin dephosphoryliert
wird (Gong, 1994). Ein anderer Antikörper, der in unserer Studie
verwendet wird, ist Tau-1 (Binder, 1985), der dephosphoryliertes Tau,
jedoch nichtphosphoryliertes Tau erkennt, was den spezifischen Nachweis
von Nicht-PHF-Tau ermöglicht. Zwei
andere Antikörper,
von denen angenommen wird, dass sie phosphorylierungs-unabhängig sind,
nämlich Tau-2
und 5E2 wurden ebenfalls getestet (Kosik, 1988).
-
Die Hirnhomogenate wurden aus 2–4 Monate
alten gematchten bzw. zueinander passenden Wild-Typ und mutierten
Mäusen
hergestellt, und der Phosphorylierungszustand der Proteine wurde
mit unterschiedlichen Antikörpern
sondiert. Eine Western-Analyse zeigte eine konsistente Zunahme (bis
zu 7-fach) der PHF-1 Immunreaktivität in mutierten Mäusen. Die
mutierten Mäuse
wiesen entweder die gleiche oder gelegentlich gering niedrigere
Menge an dephosphoryliertem Tau auf, wie durch die τ-1 Antikörper-Färbung dargestellt
wurde. Wenn die Blots mit den phosphorylierungs-unabhängigen Antikörpern Tau-2
und 5E2 immun gefärbt
wurden, existierte eine geringgradig stärkere Reaktion mit den mutierten
Mäusen
als mit dem Wildtyp (Daten nicht dargestellt). Dies zeigt an, dass
die erhöhte
Färbung
mit PHF-1 in den mutierten Mäusen
eine spezielle Zunahme der PHF-Form (hyperphosphoryliert) von Tau
eher als eine allgemeine Zunahme aller Formen von Tau wiederspiegelt.
Somit verursachte das Fehlen einer CNAα-Funktion eine Verschiebung
des Tau-Phosphorylierungszustandes
und ebenfalls vielleicht eine leichte Zunahme der Gesamt-Tau-Expression.
-
Wir haben als nächstes versucht, die Gehirnregionen
zu bestimmen, die durch Hyperphosphorylierung von Tau beeinträchtigt war,
und ob neurofibrilläre
Knäuel
im mutierten Gehirn zurückblieben.
Eine Immun-Histochemie wurde auf Hippocampus-Schnitte mit Anti-PHF-Antikörpern durchgeführt. Eine
erhöhte
Immun-Reaktivität
wurde konsistent im Hippocampus mutierter Mäuse beobachtet, wenn sie mit
Wildtyp-Mäusen
verglichen wurden. Die intensivste Immunreaktivität erfolgte
im Stratum Lucidum der CA3-Region, und eine gewisse Färbung wurde
ebenfalls im Hilus des Gyrus Dentatus beobachtet. Bei einigen der
mutierten Mäuse
wurde eine Färbung
sowohl in infra-pyramidalen als als suprapyramidalen Schichten beobachtet.
Die PHF-Färbung in
den Mutanten entsprach den Zellkörpern
von Körnern
und pyramidalen Zellen nicht. Die Lokalisierung und Orientierung
der Färbung
ist am meisten mit den Moosfaser Axons konsistent, die aus dem Gyrus
Dentatus in die CA3-Region vorspringen. Wir konnten unter Verwendung
von Kongo-Rot oder Bielchowsky's
Silber-Färbung
keine Plaque oder Knäuel
identifizieren. Das Fehlen von Silber-Färbungs-Plaques und Knäueln ist
nicht unerwartet, weil in der Alzheimer Krankheit eine positive
Immunfärbung
mit Anti-PHF-Antikörpern
jeglichen positiven Silber-Färbungs-Knäueln lange
Zeit vorhergeht (Braak, 1994).
-
Neurofilamente werden in unterschiedlichem
Umfang abhängig
von ihrer Lokalisierung und Reifung phosphoryliert. Es wurde vorgeschlagen,
dass sie die Axon-Dicke und Stabilität vermitteln und den Axon-durchmesser
modulieren (de Waegh, 1992; Hoffman und Cleveland, 1988). Eine Immunfärbung mit
einem Antikörper
(SMI32), der nichtphosphorylierte Neurofilamente erkennt, zeigte
keinen signifikanten Unterschied zwischen Wildtyp- und mutierten
Mäusen
(Daten nicht dargestellt). Eine Immunfärbung mit Antikörpern, die
gegen phosphoryliertes Neurofilament gerichtet sind, einschließlich SMI34
und SMI310, die intrazellulär und
extrazellulär
jeweils neurofibrilläre
Knäuel
färben,
zeigte eine leicht stärkere
Reaktion in Wildtyp- als in den mutierten Mäusen. Diese Daten legen nahe,
dass kein Unterschied im Phosphorylierungsstatus der Neurofilamente
zwischen den Wildtyp- und den mutierten Gehirnen bestand.
-
Wir beobachteten interessanterweise,
dass Verfahren, die eine starke Bielchowsky-Silber-Färbung in der CA3-Region in
den Wildtyp-Mäusen
zeigten, in mutierten Mäusen
nicht färbten.
-
Die Bielchowsky-Silber-Färbung markiert
normalerweise Axons, und ein Verlust einer solchen argyrofilen Färbung wurde
bei der Ischämie
in degenerierenden Axons beobachtet. Das Silber-Färbungsmuster
der Moosfasern des Wildtyp erinnerte an das Anti-PHF-Färbemuster der mutierten Moosfasern,
was nahe legt, dass die Moosfasern, die mit PHF-1 bei mutierten
Mäusen
positiv färbten,
mit Silber nicht färben.
Dieses Ergebnis könnte
entweder eine Reduktion der Anzahl von Moosfaser-Axons oder eine
Veränderung
ihres Zytoskeletts widerspiegeln, weil angenommen wird, dass diese
Silber-Färbung
Zytoskelett-Elemente
erkennt, insbesondere Neurofilamente.
-
Die Möglichkeit, dass die Neurofilamente
in Moosfasern in mutierten Mäusen
verändert
werden, wurde direkt durch Färben
von Schnitten mit einem Antikörper
gegen die 68 kD-Untereinheit
des Neufilaments in einer phosphorylierungs-unabhängigen Weise
getestet. Wir beobachteten eine viel stärkere NF-Färbung in den Moosfasern von
Wildtyp-Mäusen
als denjenigen von mutierten Mäusen.
-
Wir haben ebenfalls die Folgen dieser
Veränderungen
auf die Ultrastruktur dieser Axons auf der Ebene des Elektronenmikroskops
(EM) untersucht. Halbe Gehirne von perfundierten Tieren wurden postfixiert
und für die
EM prozessiert. Die Moosfasern wurden von den pyramidalen Neuronen
von CA3 aufgespürt.
EM-Studien zeigten, dass das Neurofilament-Mikrotubulus-Verhältnis im mutierten Moosfaserbereich
gesenkt war. Die Wildtyp- Moosfasern
wiesen viele Regionen mit reichlichen Neurofilamenten auf, wohingegen
in den mutierten Moosfasern die neurofilament-reichen Regionen weniger
häufig
waren. Diese Erkenntnis bestätigte
unsere Beobachtungen bei der Immunfärbung der Bielchowsky-Silber-Färbung.
-
Diskussion:
-
Tau ist ein mikrotubulus-assoziiertes
Protein, das in erster Linie in den Axons lokalisiert ist; es wurde vorgeschlagen,
dass es Kreuzbrücken
zwischen Mikrotubuli und zwischen Mikrotubuli und Neurofilamenten bildet
(Hirokawa, 1988). Es wurde darüber
hinaus gezeigt, dass Tau Mikrotubuli stabilisiert und deren Zusammenlagerung
fördert,
eine Eigenschaft, die wahrscheinlich durch den Phosphorylierungszustand
von Tau reguliert wird. Wenn Tau phosphoryliert wird, wird dessen
Fähigkeit,
die Mikrotubulus-Zusammenlagerung zu fördern, verringert (Brandt,
1994) (Drechsel, 1992; Lindwall und Cole, 1984). Es wurde kürzlich gezeigt,
dass abnormal phosphoryliertes Tau aus Alzheimer Gehirn die Mikrotubulus-Zusammenlagerung
hemmte, und dass seine Fähigkeit,
die Mikrotubulus-Zusammenlagerung zu fördern, nach Dephosphorylierung
wieder hergestellt wurde (Alonso, 1994). Es ist denkbar, dass eine
Verschiebung der Tau-Phosphorylierung die Zytoskelett-Funktion stören könnte.
-
Tau gewann eine spezielle Aufmerksamkeit,
wenn gezeigt wurde, dass die neurofibrillären Knäuel, die bei der Alzheimer
Krankheit akkumulieren, in erster Linie aus hyperphosphoryliertem
Tau zusammengesetzt sind. Unter Verwendung von Antikörpern gegen
phosphoryliertes Tau wurden Veränderungen
viel früher
nachgewiesen, als die Entwicklung der argyrofilen Färbung und
vor Auftreten irgendwelcher neurofibrillärer Knäuel von Amyloid-Plaque (Braak,
1994; Braak, 1994). Bei einer CNAα-defizienten
Maus waren wir nicht dazu in der Lage, irgendwelche neurofibrillären Knäuel nachzuweisen.
Es ist möglich,
dass wir in einem frühen
Stadium des Krankheits-Ausbruches suchten, und dass die Knäuel sich
bilden können,
wenn die Mäuse älter werden. Alternativ
können
die Eigenschaften des Maus-Tau-Proteins, insofern als neurofibrilläre Knäuel in den
Mäusen nicht
beobachtet wurden, die PHF-Bildung vorwegnehmen. Es ist zuletzt
möglich,
dass weitere Bestandteile für
die Bildung der Knäuel
verantwortlich sind, gerade wie pathologische Chaperone für die Alzheimer β-Protein-Polymerisierung
zu Amyloid- Filamenten
(Ma, 1994) erforderlich sind, wohingegen einige Bestandteile in CNAα-mutierten
Mäusen
nicht beeinträchtigt
werden.
-
Die Hippocampus-Moosfasern, die aus
den Körnerzellen
in CA3 hervorstehen, sind angenommenerweise in das Gedächtnis und
Lernen involviert. Die Körnerzellen
zeigen eine postnatale Neurogenese, und es wurde vorgeschlagen,
da s sie bezüglich
ihrer Fähigkeit,
zur Bildung neuer Synapsen, sehr plastisch sind. Eine solche Plastizität wird normalerweise
in sich entwickelnden Neuronen beobachtet, persistiert jedoch im
adulten Hippocampus vermutlich wegen des Bedarfs einer konstanten
synaptischen Umformung während
der Gedächtnisbildung
und -verarbeitung. Moosfasern weisen einen kleineren Durchmesser
als vielen Axons auf, und es wurde berichtet, dass kleine Axons
eine größere Menge
an Tau bezüglich
anderer mikrotubulus-assoziierter Proteine als die Axons mit großem Durchmesser
enthalten (Harada, 1994). Dies mag die herausragende PHF-Färbung im
Moosfaser-Bereich zur Folge haben.
-
Das Fehlen einer Färbung in
mutierten Moosfaser-Bereichen durch Anti-Neurofilament-Antikörper und durch
Bielchowsky-Silber legt nahe, dass die Neurofilamente in mutierten
Moosfaser-Axons nach unten reguliert sind. Diese Erkenntnis wurde
durch die EM-Überprüfung der
Moosfasern bestätigt.
Es wurde gezeigt, dass Tau sowohl an Neurofilamente als auch Mikrotubuli
bindet (Miyata, 1986). Weil die Hyperphosphorylierung die Fähigkeit
von Tau beeinträchtigt,
an Mikrotubuli zu binden und diese zu stabilisieren, ist wahrscheinlich,
dass die Hyperphosphorylierung ebenfalls die Tau-Bindung an NF reduzieren
könnte.
Die Interaktionen zwischen Tau und Neurofilamenten und Mikrotubuli
sind wahrscheinlich für
den axonalen Transport von Neurofilamenten von Bedeutung. Die Hyperphosphorylierung
von Tau mag diese Wechselwirkungen stören und mag zur Folge haben,
dass weniger Neurofilamente zu den Moosfasern transportiert werden.
Es ist jedoch möglich,
dass eine Überphosphorylierung
von Tau und ein Fehlen einer Neurofilament-Färbung
in den mutierten Moosfasern zwei unabhängige Phänomene sind, die auf das Fehlen
einer CNAα-Funktion
zurückzuführen sind.
-
Die regionale Spezifität der PHF-1-Immunfärbung, die
beobachtet wurde, erinnert an diejenige, die bei einigen Anfällen und
deren experimentellen Tiermodellen beeinflusst wurde. Bei Kindern
mit schwerer Epilepsie existiert eine Zunahme der Timm'schen Silberablagerungen
(angezeigt durch Sprießen)
in CA3 (Represa, 1989). Nach Anfachen oder Kainin-Säure-Behandlung
von Ratten (Epilepsie-Modelle) zeigten Moosfasern eine zunehmende
Timm'sche Zinkfärbung im
CA3-Bereich, wohingegen der CA1-Bereich nicht beeinträchtigt wurde
(Frotscher, 1983; Sutula, 1988; Represa, 1989). Die Kainin-Säure-Behandlung induzierte
ebenfalls eine vorübergehende
Zunahme der PHF-Tau-Immun-Reaktivität (nachgewiesen
durch den Alz50-Antikörper)
in den CA3-Neuronen (Elliot, 1993). Vielleicht reguliert CNAα einige Schlüssel-Bestandteile
des neuralen CA3-Kreislaufs, das den neurologischen Störungen gemeinsam
sein kann, wie beispielsweise der Alzheimer Krankheit und der Epilepsie.
-
Als Schlussfolgerung haben wir dargestellt,
dass in CNAα-defizienten
Mäusen
eine erhöhte
Konzentration bzw. Niveau einer PHF-Immun-Reaktivität in speziellen
Regionen des Hippocampus vorlag. Dies stellt die erste Verbindung
zwischen der Calcineurin-Aktivität
mit der Akkumulation von PHF-Tau in vivo bereit. Es ist wahrscheinlich,
dass die beobachteten Veränderungen
der Tau-Phosphorylierung und des axonalen Zytoskeletts einer Störung der
neuronalen Funktion in mutierten Mäusen zugrunde liegen. Ein „Ans Licht
bringen" der speziellen
funktionellen Veränderungen,
insbesondere im Hippocampus, könnte
sich für
das Verständnis der
normalen Physiologie, ebenso wie der Pathologie, bei neuro-degenerativen
Erkrankungen als Vorteil erweisen.
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Beispiel 4 Beurteilung
von Alzheimer's
PHF Tau in Mäusen
denen Calcineurin fehlt
-
Die in Beispiel 4 aufgeführten Literaturstellen
sind solche, die in den Gegenstand der Anmeldung unmittelbar im
Anschluss an Beispiel 4 eingeschlossen wurden. Mäuse, denen Calcineurin fehlt,
wurden wie oben beschrieben, hergestellt.
-
Protein-Verarbeitung und
Assay:
-
Gehirne wurden in 50 mM tris/0,2
mM EDTA mit 5 Durchläufen
(nach oben und unten) in einem Mattglas-Homogenisiergerät homogenisiert.
Die Homogenate wurden bezüglich
eines Proteins im Bradford Coomassie Blau-Bindungs-Assay untersucht
(Bradford, 1976), gemäß den Anweisungen
des Herstellers (BioRad; Richmond, CA). Protein-Assays wurden zweifach
durchgeführt.
Im Anschluss an das Mischen der Probe mit dem Färbe-Reagenz wurde die Extinktion
bei 600 nm abgelesen.
-
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
(SDS-PAGE)
-
Die Protein-Fraktionen wurden einer
SDS-PAGE in 4–20%
Gradientengelen unter Verwendung des diskontinuierlichen Laemmli-Puffer-Systems
unterworfen (Laemmli, et al., 1970). Zwanzig μg der gekochten Proben und von
Protein-Standards (Amersham, Arlington Heights, IL) wurden in jede
Well bzw. Vertiefung eingefüllt
und bei einem konstanten Strom von 20 mA/gel laufengelassen. Die
Gels wurden mit Coomassie Blau R-250 oder Silber angefärbt (Bio-Rad;
Richmond, CA).
-
Western Blotting
und Immun-Färbung
-
Zweifache SDS-PAGE-Gels wurden unmittelbar
zur elektrophoretischen Übertragung
verwendet. Die Übertragung
wurde unter Verwendung von 0,025 M Tris, 0,192 M Glyzin, 15% Methanol,
pH 8,3 (Towbin, et al., 1979) durchgeführt. Die Proteine wurden über Nacht
im Kaltraum bei einer konstanten Spannung von 30 Volt auf Immobilon-P-Membranen
(Millipore, Bedford, MA) übertragen.
Nach Beendigung der Übertragung wurden
die Membranen durch Inkubieren entweder mit 5% (g/v) Rinderserum-Albumin
oder 5% fettfreier Milch in 10 mM tris-gepufferter Salzlösung pH
7,4, 0,1% Tween-20 (TBST) für
1 Stunde blockiert. Nach Blockieren der unspezifischen Bindungsstellen
wurden die Membranen für
1–2 Stunden
mit der primären
Antikörperlösung bei
einem Titer inkubiert, der vom Hersteller empfohlen war, oder empirisch
im Labor bestimmt. Die Membranen wurden dann 1 × 15 und 2 × 5 Minuten mit TBST gewaschen.
Nach dem Waschen wurde die sekundäre Antikörper-Lösung, Meerettich-Peroxidase-konjugiertes
Antimaus-IgG (Pierce, Rockford, IL) zugesetzt und für 1 Stunde
inkubiert. Darauf wurden die Membranen erneut 1 × 15 und 4 × 5 Minuten wie vorher gewaschen. Die
Membranen wurden mit der chemilumineszenten Substratlösung ECL
angefärbt
(Amersham, Arlington Height, IL) gemäß den Instruktionen des Herstellers
und einem Kodak XAR-5 Film für
1–60 Minuten,
abhängig von
der Intensität
der beobachteten Banden ausgesetzt. Zur Quantifizierung der Banden
wurden die Filme gescannt, und die gefärbten Peaks wurden unter Verwendung
eines LKB-Ultroscan XL Densitometers (Pharmacia, Piscataway, NJ)
integriert.
-
Histochemie
und Immunzytochemie
-
Mäuse
mit Ketamin-HCl/Xylazin anästhetisiert
und transkardial mit Ames-Lösung
perfundiert, die Procain und Heparin enthielt, gefolgt von 1% Glutaraldehyd,
1 Formaldehyd. Als nächstes
wurden die Gehirne ausgeschnitten und in 4% Formaldehyd angeordnet.
Die Proben wurden in Paraffin eingebettet, und Schnitte wurden für Histochemie
und Immunzytochemie durchgeführt.
Die Schnitte wurden vor-paraffinisiert, und einige wurden mit Hämatoxilin
und Eosin, Bielchowsky-Silber, Luxal Fast Blue oder Kongo-Rot, wie
durch das AFPI-Handbuch beschrieben, gefärbt (Prophet et al., 1992).
Andere Schichten wurden unter Verwendung des ABC- und ABC-AP-Kits
gemäß den Anleitungen
des Herstellers immungefärbt
(Vector, Burlingame, CA). Um das Signal auf dem fixierten Gewebe
zu verstärken,
wurden gelegentlich Schichten entweder mit 88% Ameisensäure für 10 Minuten
oder 0,1 M Citrat pH 6,0 für
10 Minuten in der MikroWelle behandelt (wodurch das Citrat zum Sieden
gebracht wurde).
-
Ergebnisse
-
Phosphorylierungs-abhängige Antikörper wurden
zur Untersuchung der neuropathologischen Wirkungen der Deletierung
einer Isoform der kathalytischen Untereinheit (A) von Calcineurin
verwendet. Von speziellem Interesse war der monokonale PHF-1-Antikörper, der
gegen PHF gezüchtet
wurde, gereinigt aus Gehirn von Alzheimer Kranken (Greenberg et
al., 1992). Das Antigen, das von PHF-1 am besten erkannt wurde,
zeigte sich als die phosphorylierte Form des mikrotubulus-assoziierten
Proteins Tau. Die Abhängigkeit
des PHF-1-Antikörpers
vom Phosphorylierungszustand von Tau wird durch die Tatsache demonstriert,
dass eine Immun-Färbung mit
PHF-1 beseitigt wird, wenn das PHF-Tau mit Calcineurin dephosphoryliert
wird (Gong et al., 1994). Ein anderer Antikörper, der in der Studie verwendet
wird, ist τ-1
(Binder et al., 1985), der dephosphoryliertes Tau, jedoch nicht
phosphoryliertes Tau erkennt, und dadurch den spezifischen Nachweis
von nicht-PHF-Tau ermöglicht.
Zwei andere Antikörper, von
denen angenommen wird, dass sie phosphorylierungs-unabhängig sind,
nämlich
Tau-2 und 5E2, wurden ebenfalls getestet (Kosik et al., 1988).
-
In der ersten Reihe von Experimenten
wurden Gehirn-Homogenate aus 2–4
Monate alten Wildtyp-Mäusen
und Mäusen
hergestellt, bei denen die Expression von Calcineurin ausgeschaltet
war (Cn–)
und der Phosphorylierungs-Zustand der Proteine wurde mit unterschiedlichen
Antikörpern
sondiert. Zuerst wurde die Expression von Calcineurin unter Verwendung
eines monoklonalen Antikörpers
gegen Calcineurin überprüft (Transduction
Laboratories, Lexington, KY), und es zeigte sich, dass er in den
Calcineurin-Knockout-Mäusen signifikant
unterdrückt
war. Die restliche Färbung
ist wahrscheinlich auf Calcineurin β zurückzuführen, das im Rattengehirn in
den niedrigeren Konzentrationen exprimiert wird (Kuno et at., 1992).
Wenn Western Blots mit PHF-1 immun-gefärbt wurden, zeigten sich Banden
mit Molekulargewichten, die Tau entsprachen, eine konsistente Zunahme
(bis zum 4-fachen)
der Konzentration der PHF-1-Immunreaktivität in Cn Proben im Vergleich
zu Wildtyp-Proben aus im Alter angepassten Wurfgeschwistern. Wenn
diese Proben parallel laufen gelassen und mit Antikörper gegen
dephosphoryliertes Tau (Tau-1) gefärbt wurden, wiesen die Cn–-Mäuse entweder
die gleiche oder eine gelegentlich geringfügig niedrigere Tau-Färbung auf.
Die Tatsache, dass die Tau-1-Immunfärbung in Cr–-Mäusen nicht
erhöht
war, weist darauf hin, dass die erhöhte Färbung mit PHF-1 in den CN–-Mäusen eine
spezifische Zunahme der PHF-Form von Tau eher als eine allgemeine
Zunahme aller Formen von Tau wiederspiegelt. Wenn die Blots mit
den phosphorylierungs-unabhängigen
Antikörpern
Tau-1 und 5E2 immun-gefärbt
wurden, war eine gering stärkere
Reaktion mit den Knockout-Mäusen
als dem Wildtyp. Wir schließen
aus diesen Daten, dass die vorherrschende Wirkung von Tau, Calicineurin
auszuschalten, eine Verschiebung seines Phosphorylierungszustands
ist, mit einer vielleicht ebenfalls leichten Zunahme der absoluten
Tau-Konzentrationen.
-
Um die Wirkung der Calcineurin-Deletion
auf die Phosphorylierung anderer Zytoskelett-Proteine zu untersuchen, sondierten
wir die Western Blots mit verschiedenen phophorilierungs-abhängigen und
-unabhängigen
Antikörpern.
Normalerweise sind die Neurofilamente in unterschiedlichen Ausmaßen phosphoryliert,
abhängig
von ihrer Lokalisierung und Reifung. Es wird angenommen, dass ihre
Funktion die Modulierung des Axon-Durchmessers involviert, und es
wird angenommen, dass das Ausmaß der
Neurofilamente-Phosphorylierung den Abstand zwischen diesen reguliert
(de Waegh et al., 1992). Die Immunfärbung mit einem Antikörper (SMI32,
Sternberger Monoclonals, Baltimore, MD), der nicht-phosphorylierte
Neurofilamente (NF) erkennt, zeigte, dass die Konzentrationen an
NF-Proteinen zwischen Wildtyp- und CN–-Mäusen nicht
signifikant verschieden waren, obwohl in einigen CN–-Proben
eine stärkere
Färbung
einer Bande von ~50 KDa vorlag, die eine kreuzreaktive Form von
Tau präsentieren
mag. Eine Immunfärbung
mit Antikörpern,
die gegen phosphoryliertes NF gerichtet waren, schloss SMI34 und
SMI310 (Sternberger Monoclonals, Baltimore, MD) ein, die jeweils
intrazellulär
und extrazellulär
neurofibrilläre
Knäuel
(NFT) färben,
zeigten eine geringfügig
stärkere
Reaktion mit dem Wildtyp als den CN–-Proben,
was darauf hinweist, dass die Zunahme des phosphorylierten Tau's spezifisch ist,
und keine allgemeine Zunahme der Phosphorylierung von Zytoskelett-Proteinen widerspiegelt.
Die reduzierte Färbung
von phosphoryliertem NF in den CN–-Knockout-Mäusen könnte auf
eine allgemeine Reduktion der Expression von Neurofilamenten zurückzuführen sein.
Neurofilamente, von denen angenommen wird, dass sie Axon-Dicke und
Stabilität
vermitteln, werden in sich regenerierenden Neuriten nach unten reguliert,
die somit eine begleitende Zunahme des Mikrotubulus-Neurofilament-Verhältnisses
aufweisen (Hoffman et al., 1988). Zuletzt wurden mehrere andere
Antikörper
gegen unterschiedliche Zytoskelett-Proteine getestet, um auf unterschiedliche
Proteine zu prüfen,
und keine konsistenten Unterschiede der Immunreaktivität wurden
beobachtet.
-
Nach der Erkenntnis, dass die CN–Maus-Gehirne
eine höhere
Konzentration einer PHF-Immunreaktivität aufwiesen,
wünschten
wir, zu bestimmen, ob einige Areale des Gehirns mehr als andere
betroffen waren, und ob die PHF-Immunreaktivität von der Bildung neurofibrillärer Knäuel begleitet
wird. In der zweiten Reihe von Experimenten wurden Wildtyp- und
CN–-Mäuse mit
Fixiermittel perfundiert und Paraffinschnitte wurden aus ihren Gehirnen
hergestellt. Wenn die zweiten mit Anti-PHF-Antikörpern gefärbt wurden, wurde eine zunehmende
Immunreaktivität
konsistent im Hippocampus von CN–-Mäusen beobachtet,
wenn sie mit dem Wildtyp verglichen wurden. Die intensivste Immunreaktivität wurde
im Stratum Lucidum der beobachteten Region beobachtet; eine gewisse
Färbung
wurde ebenfalls im Hilus des Gyrus Dentatus beobachtet. Bei einigen
der CN–-Mäuse wurde
eine Färbung
sowohl in infrapyramidalen als auch suprapyramidalen Schichten beobachtet. Die
PHF-Färbung der
CN–-Mäuse entsprach
den Zellkörpern
von Körner-
und pyramidalen Zellen nicht, es ist jedoch auf Grundlage der Lokalisierung
und Orientierung am meisten mit der Markierung von Moosfaser-Axons,
die aus dem Gyrus Dentatus in CA3 hervorspringen, konsistent.
-
Das Auffinden von PHF-Tau in Moosfasern
der CN -Mäuse
veranlaßte
eine Parallelanalyse der Lokalisierung von Calcineurin. Schnitte,
die mit Anti-Calcineurin-Antikörper
markiert waren, zeigten eine starke Färbung im Hippocampus, und Striatum
im Wildtyp, jedoch nicht in den CN–-Knockouts,
wie erwartet. Der Unterschied der Calcineurin-Konzentrationen zwischen
Wildtyp- und CN–-Mäusen war in den Moosfasern – dem Gebiet,
das mit Anti-PHF-Antikörpern in
den Knockout-Mäusen
stark eingefärbt
war, besonders groß,
was demonstriert, das Calcineurin in Regionen depletiert bzw. abgereichert
ist, die eine erhöhte
Anti-PHF-Färbung aufweisen.
Andere Regionen des Hippocampus, wie beispielsweise CA1, zeigten
eine gewisse schwache Färbung
der CN -Mäuse,
die auf die β-Isoform
des Calcineurins zurückzuführen sein
mag. Besonders bedeutend wurde die Anti-Calcineurin-Färbung in Wildtyp-Mäusen in
CA1 in den Dendriten, anders als in CA3 lokalisiert, wo es in den
Moosfaser-Axons lokalisiert war. Weil Tau in erster Linie in den
Axons lokalisiert ist, ist es deswegen nicht überraschend, dass wir keine
Anti-PHF-Färbung
in der CA1-Region der CN–-Mäuse fanden.
-
Mehrere histochemische Färbungen
wurden dazu verwendet, die CN–-Gehirne bezüglich einer
potentiellen Pathologie zu untersuchen. Die Färbung von Schnitten mit Eosin-Hämatoxilin zeigte keine signifikanten Unterschiede
zwischen CN– und
dem Wildtyp. Wir konnten keine Plaque oder Knäuel unter Verwendung einer Kongorot-
oder Bielchowsky-Silber-Färbung identifizieren,
noch beobachteten wir grobe Veränderungen
in der Myelinisierung von Neuronen in diesen Mäusen durch Färbung mit
Luxol-Fast-Blue. Das Fehlen von Silber-Färbungs-Plaques und – Knäueln ist
nicht unerwartet, weil bei der Alzheimer Krankheit eine positive
Immunfärbung
mit Anti-PHF-Antikörpern
lange irgendwelchen positiven Silber-Färbungs-Knäueln vorangeht (Braak et al.,
1994). Wir beobachteten interessanterweise, dass Verfahren, die
eine starke Silber-Färbung
in der CA3-Region
in Wildtyp-Mäusen
zeigten, in CN -Mäusen
nicht färben.
Die Bielchowsky Silber-Färbung markiert
normalerweise Axons und ein Verlust einer solchen argyrofilen Färbung wurde
in sich degenerierenden Neurons bei der Ischämie beobachtet. Das Silber-Färbungsmuster der WT-Moosfasern
erinnerte an das Anti-PHF-Färbemuster
der CN – Moosfasern,
was nahe legt, dass die Moosfasern, die mit PHF-1 in CN–-Mäusen positiv
färbten,
mit Silber nicht färben.
Dieses Ergebnis könnte
entweder eine Reduktion der Anzahl von Moosfaser-Axons oder eine
Veränderung
in ihrem Zytoskelett widerspiegeln, weil angenommen wird, dass diese
Silber-Färbung
Zytoskelett-Elemente erkennt, insbesondere Neurofilamente (NF).
-
Die Möglichkeit, dass die Neurofilamente
in den CN -Mäusen
verändert
wurden, wurde direkt durch Färben
von Schnitten mit einem Anti-NF-Antikörper getestet, der die 68 KDa-Untereinheit in einer
phosphorylierungs-unabhängigen
Weise erkennt (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Wir beobachteten
eine viel stärkere
NF-Färbung
in den Moosfasern von Wildtyp-Mäusen
als von CN–-Mäusen, was
eine gesenkte Produktion oder eine erhöhte Abbauleistung neurofilamenter
Proteine nahe legt. In der Summe zeigen eine Reihe von immun- und
histochemischen Markierungsexperimenten ein reduziertes Niveau von
Neurofilamenten in den Moosfasern der CN -Mäuse, verbunden mit einer Zunahme
des Grads der Phosphorylierung eines mikrotubulus-assoziierten Schlüssel-Proteins,
nämlich
Tau.
-
Nach Beobachtung der drastischen
Veränderung
der Zytoskelett-Elemente in biochemischer Weise und Lokalisieren
der Veränderungen
auf die Moosfaser-Region wünschten
wir, die Folgen dieser Veränderungen
auf die Ultrastruktur dieser Axons auf der Elektronenmikroskop (EM)-Ebene
zu untersuchen. Halbe Gehirne aus perfundierten Tieren wurden postfixiert
und für
die EM verarbeitet. Die Moosfasern wurden von den pyramidalen Neuronen
von CA3 ausgehend verfolgt. Die Wildtyp-Moosfasern wiesen viele
Bereiche mit reichlichen Neurofilamenten und sehr wenig Mikrotubuli
auf. Andererseits war in den Moosfasern der CN–-Mäuse eine
fast vollständige
Abwesenheit von neurofilamentreichen Regionen, verbunden mit einem
reichlichen Vorhandensein von Mikrotubuli. Diese Erkenntnisse bestätigen unsere
Beobachtung bei der Immunfärbung
mit Anti-Neurofilament-Antikörpern
und der Bielchowsky-Silber-Färbung.
-
Diskussion
-
Die Funktion der Phosphatase-Calcineurine
im Gehirn wird nicht vollständig
verstanden. Es wurden mehrere Rollen vorgeschlagen, einschließlich der
Regulierung des neuronalen Zytoskeletts durch Dephosphorylierung
von Proteinen, wie beispielsweise Neurofilament-Proteinen und Tau. Eine weitere vorgeschlagene Rolle
ist die Regulierung der Langzeitunterdrückung (LTD) durch Dephosphorylierung
von Phosphatase I-Inhibitor und Aktivierung der Phosphatase I-Kaskade
(Mulkey et al., 1994). Zusätzlich
wurde vorgeschlagen, dass Calcineurin synaptische Vesikeln durch
Recyceln durch seine Wirkung auf Dynamin kontrolliert (Liu et al., 1994).
Diese Funktionen wurden entweder aus in vitro-Studien oder aus in vivo-Studien gefolgert,
bei denen die Calcineurin-Aktivität mit Inhibitoren, wie beispielsweise
Cyclosporin geblockt wurden. Eine Einschränkung auf Hemm-Experimente
besteht darin, dass die Inhibitoren, die verwendet wurden, indirekt
durch Immunophiline fungieren, und unterschiedliche Inhibitoren
binden unterschiedliche Immunophiline. Ebenfalls weisen Immunophiline
Prolin-Isomerase-Aktivitäten
auf, die andere Proteine als Calcineurin beeinträchtigen könnten. Durch Verwendung von
Knockout-Mäusen, bei
denen ein spezifisches Isotop von Calcineurin vollständig eliminiert
ist, können
wir direkt die Folgen dieser Depletion auf spezifische Endpunkte
einschätzen.
-
Der erste Endpunkt, den wir untersucht
haben, war die Phosphorylierung von Zytoskelett-Proteinen, wie beispielsweise Tau. Tau
ist ein mikrotubulus-assoziiertes Protein, das in erster Linie in
den Axons lokalisiert ist; es wurde vorgeschlagen, dass es Kreuz-Brücken zwischen
Mikrotubuli und Neurofilamenten bildet (Hikokawa et al., 1988).
Darüber
hinaus wurde gezeigt, dass Tau Mikrotubuli stabilisiert und deren
Zusammenlagerung fördert,
eine Eigenschaft, die wahrscheinlich durch den Phosphorylierungszustand
von Tau reguliert wird. Insbesondere wird, wenn Tau phosphoryliert
wird, seine Fähigkeit,
die Mikrotubulus-Anlagerung
zu fördern, vermindert
(Brandt, et al., 1994; Dreschsel et al., 1992; Lindwall et al.,
1984). Es wurde kürzlich
gezeigt, dass abnormal phophoriliertes Tau aus Alzheimer Gehirn
die Mikrotubulus-Anlagerung hemmte, und dass seine Fähigkeit,
die Mikrotubulus-Anlagerung
zu fördern,
nach Dephosphorylierung wieder hergestellt wurde (Alonso et al.,
1994).
-
Tau gewann ein spezielles Interesse,
wenn dargestellt wurde, dass die neurofibrilären Knäuel, die sich in der Alzheimer
Erkrankung akkumulieren, in erster Linie aus Tau zusammengesetzt
sind, das abnormal phosphoryliert ist. Unter Verwendung von Antikörpern gegen
hyperphosphoryliertes Tau wurden Veränderungen viel früher als
bei der Entwicklung einer argyrofilen Färbung nachgewiesen, und vor
Auftreten irgendwelcher NFT- oder Amyloid-Plaques (Braak et al., 1994; Braak et
al., 1994). Es wurde tatsächlich
gezeigt, dass eine Phosphorylierung von Tau seine Struktur verändert, in
dem es länger
und steifer gemacht wird (Hagestedt et al., 1989). Diese Erkenntnisse
veranlassten eine Erforschung von möglichen Mechanismen, durch
die Tau hyperphosphoryliert werden könnte. Wie oben erwähnt, phosphorylieren
mehrere Kinasen Tau, um PHF-artige immunreaktive Isoformen zu erzeugen
und mehrere Phosphatasen, einschließlich Calcineurin, werden PHF-Tau
in einen normaleren Phosphorylierungszustand zurückbringen. Calcineurin wurde
weiter kürzlich
mit anderen Phosphatasen in Verbindung gebracht, bei der Bildung
von PHF-Tau durch Studien bezüglich
einer Biopsie unterworfenen humanem Gehirngewebe, bei dem gezeigt
wurde, dass Tau normalerweise phosphoryliert ist, jedoch während der
Gewebsverarbeitung und Herstellung von Calcineurin und anderer Phosphatasen,
die normal nicht in Alzheimer-Gehirnen
vorliegen, dephosphoryliert werden (Matsuo et al., 1994). Diese Erkenntnisse
wurden hergenommen, um darauf hinzuweisen, dass bei der Alzheimer
Erkrankung Defizite der Phosphatasen, wie beispielsweise Calcineurin,
der Akkumulation von hyperphosphoryliertem Tau unterliegen könnten. Eine
weitere Studie, die die Konzentrationen von Calcineurin in Alzheimer
und normalem Kleinhirn und Neocortex Immunzytochemie überprüfte, fand
keine Unterschiede in der Protein-Konzentration zwischen den beiden
Gruppen. Jedoch befand sich Calcineurin um einige neurofibrilläre Knäuel herum,
und die Studie verglich Konzentrationen der Calcineurin-Enzym-Aktivität nicht
(Billingsley et al., 1994).
-
Unsere Experimente zeigen eine klare
und spezifische Wirkung auf das Deletieren der Hauptform von Calcineurin
im Mausgehirn. Der vorherrschendste Effekt, der beobachtet wurde,
war eine Zunahme des PHF-Typ Tau. Diese Beobachtung ist mit der
Fähigkeit
von Calcineurin konsistent, PHF-Tau in normales Tau in vitro umzuwandeln
(Drewes et al., 1993; Gong et al., 1994) und ist der erste in vivo-Beweis,
dass Calcineurin eine Rolle in der normalen Phosphorylierung/Dephosphorylierung
von Tau spielt. Es legt ebenfalls nahe, dass gesenkte Mengen einer
Calcineurin-Aktivität
der Akkumulation der PHF(phosphorylierten)-Form von Tau in der Alzheimer Krankheit
zugrunde liegen können.
Die Tatsache, dass eine erhöhte
Anti-PHF-Reaktivität
unter Verwendung zweier unabhängiger
Verfahren beobachtet wurde, nämlich
Western Bloting und Immunzytochemie auf perfundiertem und fixiertem
Gewebe, spricht dagegen, dass die erhöhte Phosphorylierung ein Artefakt
der Gewebsverarbeitung ist, bei der Phosphatasen und Kinasen aktiviert
werden. Obwohl wir nicht dazu in der Lage waren, NFT in den CN–-Mäusen zu
beobachten, können
wir die Möglichkeit
nicht ausschließen,
dass diese sich bilden werden, wenn die Mäuse älter werden. Diese Möglichkeit
wird durch die Tatsache gestützt,
dass Studien, die versuchten, eine Alzheimer Krankheit bereitzustellen,
geschlossen haben, dass die Hyperphosphorylierung von Tau die früheste Veränderung
ist, die in betroffenen Gehirnregionen beobachtet wird (Braak et
al., 1994). Alternativ, insoweit NFT in Mäusen während einer neurologischen
Erkrankung nicht beobachtet wurde, könnten die Eigenschaften von
Maus-Tau eine PHF-Bildung ausschließen. Es ist zuletzt möglich, dass andere
Bestandteile für
die Bildung der Knäuel
verantwortlich sind, gerade weil pathologische Chaperone dafür erforderlich
zu sein scheinen, dass das Alzheimer β-Protein zu Amyloid-Filamenten
polymerisiert (Ma et al., 1994).
-
Die Hippocampus-Moosfasern, die aus
Körnerzellen
in CA3 hervorsprangen, sind angenommenermaßen in das Gedächtnis und
Lernen involviert. Körnerzellen
zeigen eine postnatale Neurogenese, und es wurde vorgeschlagen,
dass sie bezüglich
ihrer Fähigkeit,
neue Synapsen zu bilden, sehr plastisch sind. Eine solche Plastizität wird normalerweise
in sich entwickelnden Neuronen beobachtet, persistiert jedoch im
adulten Hippocampus vermutlich wegen des Bedarfs einer konstanten
synaptischen Umformung während
der Gedächtnisbildung
und Prozessierung. Die Plastizität
der CA3-Region kann teilweise durch Calcineurin und Kalzium reguliert
werden. Die Färbung
von Schnitten mit einem Antikörper
gegen Calcineurin zeigt eine intensive Färbung in Wildtyp-Mäusen im
Hippocampus, einschließlich
der Moosfasern, wo wir die PHF-Immunfärbung in CN–-Mäusen beobachteten.
Moosfasern weisen einen kleineren Durchmesser als viele Axons auf,
und es wurde berichtet, dass kleine Axons eine größere Menge
an Tau bezüglich
anderer MAP's im
Vergleich zu Axons mit großem
Durchmesser aufweisen (Harada et al., 1994). Diese Tatsache mag
das vorherrschen der PHF-Färbung
in dieser Region erklären
helfen. Einige Regionen, wie beispielsweise CA1, zeigten eine Anti-Calcineuin-Immunreaktivität in Wildtyp-Mäusen, jedoch
keine PHF-Immunreaktivität
in CN–-Mäusen, vermutlich
weil Calcineurin in CA1 in den Dendriten lokalisiert war, die normalerweise
Tau nicht enthalten. Dies ist eine interessante Beobachtung, die
darauf hinweist, dass eine spezifische Phosphatase eine in vorherrschender Weise
axonale Lokalisierung in einer Synapse aufweisen kann (Moosfaser-CA-3) und eine dendritische
Lokalisierung in einer anderen aufweisen kann (CA3-CA1). Es zeigte
sich, dass diese beiden Hauptsynapsen des Hippocampus sich bezüglich ihres
elektrophysiologischen Verhaltens und der Neuro-Transmitter-Modulation unterscheiden,
wenn die Lern-Paradigmen, wie beispielsweise LTP, untersucht wurden.
Die unterschiedliche Calcineurin-Verteilung zwischen Axons und Dendriten
legt einen möglichen
Mechanismus nahe, durch den diese beiden Synapsen unterschiedlich
moduliert werden können; – entweder
kann Calcineuin in die synaptische Plastizität präynaptisch oder postsynaptisch
involviert sein. Es ist nicht klar, wie Calcineuin solche Mechanismen
bewirken kann, jedoch sind seine Auswirkungen auf die Zytoskelett-Proteine,
wie beispielsweise Tau und Dynamin, klare Kandidaten zur Veränderung
der Synapsen-Funktion. Es ist zuletzt wert zu erwähnen, dass
ein Kennzeichen der Alzheimer Krankheit das Auftreten von PHF-Tau
in den Zellkörpern
und Dendriten von ZNS-Neuronen ist, wohingegen normales Tau auf
die Axons beschränkt
ist. Die Zellen der CA1-Region des Hippocampus weisen insbesondere
eine Neigung dazu auf, PHF zu entwickeln. Nunmehr, als wir gezeigt haben,
dass Calcineurin in den Somas und Dendriten der Region vorliegt,
sollte eine Umkanalisierung von Tau zu den Dendriten, verbunden
mit einer reduzierten Calcineurin-Aktivität zu einer Hyperphosphorylierung
von Tau und seiner Akkumulierung von PHF führen, in einer ähnlichen
Weise wie bei der Alzheimer Krankheit.
-
Das Färben von Moosfasern in Wildtyp-Mäusen durch
Anti-Neurofilament-Antikörper
und Silber, und das Fehlen einer solchen Färbung in CN–-Mäusen legt
nahe, dass die Neurofilamente in CN–Moosfaser-Axons entweder
abwesend oder nach unten reguliert sind. Diese Erkenntnisse wurden
durch die EM-Überprüfung der Moosfasern
bestätigt.
Es existieren mehrere mögliche
Szenarios, die die Reduktion der Neurofilamente in den Moosfasern
erklären
können.
Zuerst kann Calcineurin eine direkte Wirkung auf Neurofilamente
durch Dephosphorylierung der Kopfregion von NF aufweisen. Weil die
Hemmung der Phosphatasen durch Okadain-Säure das Neurofilament-Netzwerk
stört,
ist plausibel, dass eine Deletieren von Calcineurin eine ähnliche
Wirkung nach sich ziehen könnte
(Sacher et al., 1992). Zweitens wurde gezeigt, dass die Interaktion
zwischen Neurofilamenten und Mikrotubuli stärker ist, wenn die Neuroflamente
in der Projektionsdomäne
der größten Untereinheit
dephosphoryliert sind (Miyasaka et al., 1993). Es ist somit möglich, dass
in den Körnerzellen
von CN–-Mäusen, aus
denen diese Moosfasern herstammen, eine Hyperphosphorylierung von
Neurofilamenten ihre Wechselwirkung mit Mikrotubuli schwächt und
daher den axonalen Transport schwächt. Drittens, weil gezeigt
wurde, dass Tau an Neufilamente, ebenso wie an Mikrotubuli bindet
(Miyata et al., 1986) und dass die Hyperphosphorylierung die Fähigkeit
von Tau beeinträchtigt,
Mikrotubuli zu stabilisieren und an diese zu binden, scheint es
wahrscheinlich, dass eine Hyperphosphorylierung ebenfalls die Tau-Bindung
an NF reduzieren könnte.
Zuletzt sind die Interaktionen zwischen Tau und den Neurofilamenten
und Mikrotubuli wahrscheinlich für
den axonalen Transport von Neurofilamenten von Bedeutung, die, wenn
sie gestört
ist, zur Folge haben würde,
dass wenigere Neurofilamente zu den Moosfasern transportiert und
an diese abgegeben werden. Zusammenfassend existieren mehrere Mittel,
durch die ein phosphorylierter Zustand von Tau die Plastizität und Stabilität von Axons
durch Beeinflussen der Wechselwirkung von Mikrotubuli mit Neurofilamenten
regulieren, und die Färbung
und Immunmarkierungs-Veränderungen
zur Folge haben könnte,
die wir im CN–-Hippocampus
beobachtet haben.
-
Die intensivste Färbung für PHF, die wir beobachtet haben,
erfolgte im Hippocampus, von dem ebenfalls gezeigt wurde, dass er
die höchsten
Konzentrationen an Calcineurin im Gehirn aufwies (Goto et al., 1986; Goto
et al.; 1993; Polli et al., 1991). Der Hippocampus wird bei mehreren
neuro-degenerativen und neurologischen Störungen beeinträchtigt,
die eine Veränderung
der Protein-Phosphorylierung einschließen können. Beispielsweise, wie bereits
erwähnt,
hat die Alzheimer Erkrankung Veränderungen
der Phosphorylierungen von Tau zur Folge, und beeinträchtigt insbesondere
den Hippocampus. Die regionale Spezifität der PHF-1-Immunfärbung, die beobachtet wurde,
erinnert ebenfalls sehr an das Areal, das bei einigen Anfällen betroffen
ist und an deren Tierexperiment-Modelle. Beispielsweise existiert
bei Kindern mit einer ernsten Epilepsie eine Zunahme der Timm'schen Ablagerungen,
was auf eine Keimung hinweist, in CA3 (Represa et al., 1989). Ebenfalls
wurde nach Anfachen- oder Kainin-Säure-Behandlung von Ratten (Epilepsie-Modelle)
beobachtet, dass Moosfasern eine erhöhte Timm'sche Zinkfärbung in der CA3-Region zeigten
(was auf eine Keimung hinweist), wohingegen die Ca1-Region unverändert blieb
(Frotscher et al., 1983; Represa et al., 1989, Sutula et al., 1988).
Es wurde darüber
hinaus berichtet, dass Kainin-Säure-Behandlung eine vorübergehende
Zunahme der CA3-Neuronen-Färbung
durch den alz50-Antikörper induzierte,
der, wie PHF-1 PHF-Tau erkennt (Elliot et al., 1993). Vielleicht
wird der spezielle Isotyp von Calcineurin, der in unseren Knockout-Mäusen deletiert
wurde, ebenfalls bei anderen neurologischen Störungen, wie beispielsweise
Epilepsie, beeinträchtigt.
-
Als Schlußfolgerung haben wir gezeigt,
dass in Mäusen,
in denen Calcineurin ausgeschaltet war, eine erhöhte Konzentration einer PHF-Immunreaktivität in speziellen
Regionen des Hippocampus vorliegt. Diese Erkenntnisse stellen die
erste Verbindung zwischen einer Calcineurin-Aktivität zu PHF
in vivo bereit, und sind mit früheren
in vitro-Beobachtungen konsistent, dass Calcineurin PHF-Tau zu normalem
Tau durch Dephosphorylierung umwandeln kann. Es ist wahrscheinlich,
dass die beobachteten Veränderungen
der Tau-Phosphorylierung
und des Axon-Skeletts einer Störung
der Nervenfunktion in CN–-Mäusen unterliegen. Ein "Ans Licht bringen" der speziellen funktionellen
Veränderungen,
insbesondere im Hippocampus, könnte
sich als beim Verständnis
der normalen Physiologie ebenso wie der pathologischen Manifestationen
bei Erkrankungen, wie beispielsweise der Alzheimer Krankheit und
Epilepsie als vorteilhaft erweisen.
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