DE69734194T2 - Verfahren zur bestimmung des cholesteringehalts von high-density-lipoproteinen - Google Patents

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • Y10S436/824—Immunological separation techniques

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin in hochdichtem Lipoprotein (im weiteren Verlauf auch als "HDL" bezeichnet).
  • Stand der Technik
  • Es ist bekannt, dass HDL in Zusammenhang mit der Entfernung von in Zellen gespeichertem Cholesterin steht, da dieses Cholesterin aus verschiedenen Geweben, einschließlich Blutgefäßwänden mit Arteriosklerose, aufnimmt, sodass HDL zum Ermitteln des Risikos für verschiedene Arteriosklerosen, einschließlich Herzarteriosklerose, nützlich ist und dass dessen Blutwert als Risikoindikator für den Beginn einer Arteriosklerose dient.
  • Verfahren zur Messung des Cholesterinwerts im HDL umfassen ein Verfahren, worin HDL von anderen Lipoproteinen durch Ultrazentrifugieren abgetrennt und anschließend gemessen wird, und ein Verfahren, worin das Cholesterin in HDL durch Elektrophorese abgetrennt wird, anschließend das Lipid angefärbt und die Intensität der gebildeten Farbe gemessen wird. Diese Verfahren sind jedoch komplex oder eine Anzahl der Proben kann nicht bewertet werden, sodass diese herkömmlich nicht angewandt werden.
  • Das Verfahren zur Messung des Cholesterinwerts in HDL, das herkömmlich in klinischen Tests eingesetzt wird, ist jenes Verfahren, worin ein Fällungsmittel zur Probe zugesetzt wird, um andere Lipoproteine als HDL zu koagulieren und die koagulierten Lipoproteine durch Zentrifugieren zu entfernen, wonach das Cholesterin im resultierenden Flüssigkeitsüberstand, der HDL enthält, gemessen wird. Obwohl dieses Verfahren einfacher als das Ultrazentrifugationsverfahren und das Elektrophoreseverfahren ist, ist es jedoch nicht ausreichend einfach, da es die Zugabe eines Fällungsmittels, eine anschließende Trennung und eine vergleichsweise große Probenmenge erfordert.
  • Andererseits sind Verfahren vorgeschlagen worden, worin das Cholesterin im HDL unter Verwendung von Enzymen getrennt quantifiziert wurde. Im US-Patent 4.851.335 ist beispielsweise ein Zweischrittverfahren beschrieben, bei dem andere Lipoproteine abgebaut werden, gefolgt von einem Abbau von HDL und einer Messung des auf diese Weise im zweiten Schritt freigesetzten Cholesterins. Es ist ein weiteres Verfahren bekannt, das folgende Schritte umfasst: Vorkoagulieren von anderen Lipoproteinen als HDL mit einem Antikörper und einem Polyanion, enzymatisches Umsetzen des Cholesterins im HDL alleine, Inaktivieren des Enzyms und gleichzeitiges Rücklösen der koagulierten Masse und Messen der Extinktion der resultierenden Lösung (japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 6-242110). Dieses Verfahren ist jedoch problematisch, da es eine zumindest 3-malige Zugabe von Reagenzien erfordert, sodass dieses Verfahren nur mit einer begrenzten Auswahl an Analysegeräten angewandt werden kann. Deshalb ist dieses Verfahren nicht allgemein verbreitet.
  • Andere Verfahren umfassen ein Verfahren, worin eine enzymatische Reaktion in Gegenwart von Gallensalz oder einem nichtionischen Tensid durchgeführt wird (japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 63-126498); ein in jüngerer Zeit entwickeltes Verfahren, worin das Cholesterin im HDL mittels chemisch modifizierter Cholesterinesterase und/oder Cholesterinoxidase in Gegenwart eines Clathrats, wie z.B. Cyclodextrin, spezifisch gefangen wird (japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 7-301636); und ein Verfahren, worin andere Lipoproteine als HDL in Aggregate oder Komplexe übergeführt werden und das Cholesterin im HDL anschließend mittels enzymatischer Reaktion gefangen wird (japanische offengelegte Patentanmeldungen (Kokai) Nr. 8-131197 und 8-201393). Bei diesen Verfahren kommt es jedoch bei bestimmten Proben zu anderen Ergebnissen als beim Fällungsverfahren, sodass deren Spezifitäten problematisch sind.
  • Offenbarung der Erindung
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Quantifizierung von Cholesterin in HDL, das keine komplexen Fragmentierungen und Trennungen erfordert, und wodurch das HDL-Cholesterin in Testproben, die HDL und andere Lipoproteine, wie z.B. Lipoproteine niedriger Dichte (LDL), Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL) und Chylomikron (CM), aufweisen, selektiv, einfach und genau quantifiziert werden kann.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nach intensiven Forschungen festgestellt, dass es Tenside gibt, die auf HDL, jedoch im Wesentlichen nicht auf andere Lipoproteine einwirken. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zudem herausgefunden, dass HDL-Cholesterin in Testproben, die HDL und andere Lipoproteine aufweisen, selektiv, einfach und genau quantifiziert werden kann, indem das Cholesterin in anderen Lipoproteinen als hochdichtem Lipoprotein in der Testprobe selektiv gelöscht wird und anschließend das aus dem HDL stammende Cholesterin in Gegenwart des oben angeführten Tensids enzymatisch quantifiziert wird, wodurch es zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung kommt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin in hochdichtem Lipoprotein bereit, das einen ersten Schritt des Beseitigens von Cholesterin aus anderen Lipoproteinen als hochdichtem Lipoprotein in einer Testprobe und einen zweiten Schritt des Zusetzens eines Tensids, das spezifisch auf hochdichtes Lipoprotein wirkt, zum Produkt aus dem ersten Schritt sowie des enzymatischen Quantifizierens von Cholesterin in hochdichtem Lipoprotein umfasst.
  • Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das Cholesterin in HDL in einer Testprobe, die HDL und andere Lipoproteine, wie z.B. LDL, VLDL und CM enthält, selektiv, einfach und genau ohne komplexe Fragmentierungen und Trennungen quantifiziert werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt die Korrelation zwischen den Mengen an Cholesterin in HDL, die mittels eines Verfahrens eines Beispiels gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen wer den, und den Mengen an Cholesterin in HDL, die gemäß einem herkömmlichen Fällungsverfahren gemessen werden, dar.
  • 2 stellt die Korrelation zwischen den Mengen an Cholesterin in HDL, die mittels eines Verfahrens eines anderen Beispiels gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen werden, und den Mengen an Cholesterin in HDL, die gemäß einem herkömmlichen Fällungsverfahren gemessen werden, dar.
  • 3 stellt die Korrelation zwischen den Mengen an Cholesterin in HDL, die mittels eines Verfahrens eines weiteren Beispiels gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen werden, und den Mengen an Cholesterin in HDL, die gemäß einem herkömmlichen Fällungsverfahren gemessen werden, dar.
  • Beste Art der Durchführung der vorliegenden Erfindung
  • In Lipoproteinen vorliegende Cholesterine umfassen Cholesterine vom Estertyp (Cholesterinester) und freies Cholesterin. In der vorliegenden Beschreibung umfasst die Bezeichnung "Cholesterin", sofern nicht anders angegeben, beide Typen.
  • Die Testprobe, die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wird, kann jede beliebige Probe sein, die Lipoproteine, wie z.B. HDL, LDL, VLDL und CM enthalten kann. Beispiele für Testproben umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Körperflüssigkeiten, wie z.B. Seren, sowie Verdünnungen davon.
  • Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Cholesterin aus anderen Lipoproteinen als HDL in einer Testprobe selektiv beseitigt. Die hierin verwendete Bezeichnung "beseitigen" bedeutet, dass das Cholesterin zersetzt wird und die zersetzten Produkte im anschließenden zweiten Schritt nicht mehr nachweisbar sind. Die Verfahren zur selektiven Beseitigung von Cholesterin in anderen Lipoproteinen als HDL, und zwar in LDL, VLDL, CM und dergleichen, umfassen nachstehend erläuterte Verfahren.
  • Im ersten Verfahren wird Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase auf die Testprobe in Abwesenheit eines Tensids, das auf das HDL einwirkt, wirken gelassen, und das gebildete Wasserstoffperoxid wird entfernt. Durch die Cholesterinesterase wird das Cholesterin vom Estertyp in den Lipoproteinen hydrolysiert, um freies Cholesterin und Fettsäuren zu erhalten. Das so gebildete freie Cholesterin und das inhärent in den Lipoproteinen vorliegende freie Cholesterin werden mittels Cholesterinoxidase oxidiert, um Cholestenon und Wasserstoffperoxid zu erhalten. Das so gebildete Wasserstoffperoxid wird entfernt. Verfahren zur Entfernung von Wasserstoffperoxid umfassen ein Verfahren, worin das Wasserstoffperoxid mittels Katalase zu Wasser und Sauerstoff zersetzt wird; sowie ein Verfahren, worin eine Wasserstoffdonorverbindung auf Phenol- oder Anilinbasis, wie z.B. DAOS (N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin), das mit Wasserstoffperoxid reagiert, was ein farbloses Chinon ergibt, mit dem Wasserstoffperoxid umgesetzt wird, um das Wasserstoffperoxid in das farblose Chinon zu überführen, wobei die Verfahren zur Entfernung von Wasserstoffperoxid nicht auf diese Verfahren eingeschränkt sind.
  • Im oben erläuterten ersten Schritt kommt es zu keiner wesentlichen Umsetzung des Cholesterins in HDL, wenn der Schritt in Abwesenheit eines auf HDL wirkenden Tensids erfolgt, während das Cholesterin in den anderen Lipoproteinen wie z.B. LDL, VLDL und CM umgesetzt und beseitigt wird. Dadurch wird im nachfolgenden zweiten Schritt das Cholesterin in HDL selektiv quantifiziert.
  • Die Konzentration der Cholesterinesterase im Reaktionsgemisch des ersten Schritts kann vorzugsweise etwa 0,2 bis 1,0 U/ml und die Konzentration der Cholesterinoxidase vorzugsweise etwa 0,1 bis 0,7 U/ml betragen. Die Konzentration der Katalase kann vorzugsweise etwa 40 bis 100 U/ml und die Konzentration der Peroxidase vorzugsweise etwa 0,1 bis 1,0 U/ml betragen. Die Konzentration der Verbindung, die nach der Umsetzung mit Wasserstoffperoxid das farblose Chinon ergibt, kann vorzugsweise etwa 0,4 bis 0,8 mmol/l betragen.
  • Die Umsetzung im ersten Schritt kann vorzugsweise in einem Puffer mit einem pH von 5 bis 8 durchgeführt werden, wobei der Puffer vorzugsweise ein Phosphatpuffer, Glycinpuffer, Trispuffer oder Good-Puffer ist. Insbesondere werden Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES und POPSO, die Good-Puffer sind, bevorzugt. Die Pufferkonzentration kann vorzugsweise etwa 10 bis 500 mM betragen.
  • Zur erhöhten Beseitigung von anderen Lipoproteinen als HDL kann im Reaktionsgemisch ein zweiwertiges Metallion enthalten sein. Bevorzugte Beispiele für das zweiwertige Metallion umfassen Kupferionen, Eisenionen und Magnesiumionen. Davon wird Magnesium insbesondere bevorzugt. Die Konzentration der zweiwertigen Metallionen kann vorzugsweise etwa 5 bis 200 mM betragen.
  • Im ersten Schritt kann zum Reaktionsgemisch gegebenenfalls eine Lipoproteinhydrolase zugesetzt werden. Die Zugabe dieses Enzyms wird bevorzugt, da das Cholesterin insbesondere in VLDL rasch reagiert. Die Konzentration dieses Enzyms im Reaktionsgemisch kann vorzugsweise etwa 5,0 bis 10,0 U/ml betragen.
  • Die Reaktionstemperatur im ersten Schritt kann vorzugsweise etwa 25°C bis 4°C betragen, wobei 37°C insbesondere bevorzugt wird. Die Reaktionszeit kann etwa 2 bis 10 Minuten betragen.
  • Im folgenden zweiten Schritt wird zum Reaktionsprodukt aus dem ersten Schritt ein Tensid zugesetzt, dass spezifisch auf HDL wirkt, und das Cholesterin im hochdichten Lipoprotein enzymatisch quantifiziert. Unter der Bezeichnung "spezifisch auf HDL wirkendes Tensid" wird ein Tensid verstanden, durch welches das Cholesterin in HDL aufgrund der Wirkung eines Enzyms, wie z.B. Cholesterinesterase oder Cholesterinoxidase, reagiert (das Reaktionsverhältnis beträgt nicht weniger als 70%, vorzugsweise nicht weniger als 90%), während das Cholesterin in anderen Lipoproteinen als HDL im Wesentlichen nicht reagiert (das Reaktionsverhältnis beträgt nicht mehr als 30%, vorzugsweise nicht mehr als 20%). Beispiele für ein solches Tensid umfassen Tenside mit einem Hydrophilie-Lipophilie-Wert (HLB) von 13 bis 14, insbesondere nichtionische Tenside mit einem HLB von 13 bis 14, insbesondere Polyalkylenoxidderivate. Bevorzugte Beispiele für die hierin verwendeten Derivate umfassen Kondensationsprodukte mit höheren Alkoholen, Kondensationsprodukte mit höheren Fettsäuren, Kondensationsprodukte mit höheren Fettsäureamiden, Kondensationsprodukte mit höheren Alkylaminen, Kondensationsprodukte mit höheren Alkylmercaptanen und Kondensationsprodukte mit Alkylphenolen. Unter den Polyalkylenoxidderivaten werden Polyethylenoxidderivate insbesondere bevorzugt. Der oben für HLB angeführte Bereich kann durch Vermischen einer Vielzahl von Tensiden erhalten werden, wobei ein solches Gemisch einer Vielzahl von Tensiden ebenfalls verwendet werden kann. Das Verfahren zur Ermittlung des HLB von Tensiden ist allgemein bekannt und wird beispielsweise von Hiroshi HORIGUCHI in "New Surfactants", Sankyo Shuppan (1986), beschrieben.
  • Bevorzugte spezifische Beispiele für das Tensid umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylencetylether, Polyoxyethylenoleylether, Polyoxyethylenether mit einem höheren Alkohol (C4-C35), Polyoxyethylenoctylphenylether, Polyoxyethylennonylphenylether und dergleichen.
  • Obwohl die Konzentration des Tensids im zweiten Schritt keinen besonderen Einschränkungen unterliegt, kann diese, bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch, vorzugsweise 0,05 bis 3 Gew.-%, noch bevorzugter 0,1 bis 1,5 Gew.-%, betragen.
  • In Gegenwart des oben angeführten Tensids kann das HDL-Cholesterin in der Testprobe enzymatisch quantifiziert werden. Das bedeutet, dass im ersten Schritt der Hauptanteil des Cholesterins in einem anderen Lipoprotein als HDL beseitigt wird, und mit dem synergistischen Effekt, der zusammen mit der Reaktion im zweiten Schritt eintritt, wird das Cholesterin nur im HDL quantifiziert.
  • Das Verfahren zur enzymatischen Quantifizierung von Cholesterin an sich ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Beispielsweise kann Cholesterin, wie im ersten Schritt, durch die Bildung von Wasserstoffperoxid aus Cholesterinester und freiem Cholesterin durch die Wirkung von Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase quantifiziert werden sowie durch Quantifizieren des gebildeten Wasserstoffperoxids. Die Quantifizierung von Wasserstoffperoxid kann durchgeführt werden, indem beispielsweise das Wasserstoffperoxid mit einer Verbindung umgesetzt wird, die ein Chinonpigment bildet, und die Menge des gebildeten Chinonpigments durch Messung der Extinktion oder dergleichen gemessen wird. Das Chinonpigment kann beispielsweise durch Umsetzung von Wasserstoffperoxid und 4-Aminoantipyrin und DAOS oder HDAOS (N-(2-Hydroxysulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin) gebildet werden. Das dadurch gebildete Chinonpigment weist bei 593 nm unter Verwendung von DAOS und unter Verwendung von HDAOS bei 583 nm eine maximale Extinktion auf. Obwohl die Konzentration der Verbindung, die das Chinonpigment ergibt, keinen besonderen Einschränkungen unterliegt, kann die Konzentration von 4-Aminoantipyrin beispielsweise vorzugsweise 0,1 bis 2,0 mM, noch bevorzugter 0,5 bis 1,5 mM, betragen, und die Konzentration von DAOS oder HDAOS kann vorzugsweise 0,1 bis 1,5 mM, noch bevorzugter 0,4 bis 1,0 mM, betragen. Obwohl die Konzentration der Peroxidase keinen besonderen Einschränkungen unterliegt, kann diese vorzugsweise 0,4 bis 5 U/ml im Gesamtreaktionsgemisch betragen. Die bevorzugten Reaktionsbedingungen (Reaktionstemperatur, Reaktionszeit, Puffer und pH) entsprechen den bevorzugten Reaktionsbedingungen im ersten Schritt.
  • Wenn das gebildete Wasserstoffperoxid mittels Katalase abgebaut wird, wird im zweiten Schritt ein Katalasehemmer, wie z.B. Natriumazid, verwendet, um die Katalase zu verhindern, da es erforderlich ist, die Katalase im zweiten Schritt zu hemmen.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden konkreter anhand von Beispielen davon beschrieben. Es wird angemerkt, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die nachstehend angeführten Beispiele begeschränkt ist. In den nachstehenden Beispielen sind alle Prozentangaben, sofern nicht anders angegeben, gewichtsbezogen.
  • Bezugsbeispiel 1
  • Unter Verwendung von Proben, die jeweils bekannte Mengen an gereinigtem HDL, LDL, VLDL und CM aufweisen, wurde das Cholesterin in jedem der Lipoproteine in Gegenwart der nichtionischen Tenside Emulgen 911 (Polyoxyethylennonylether, HLB 13,7), Emulgen B66 (Polyoxyethylenderivat, HLB 13,2) oder eines Gemischs von Emulgen B66 und Emulgen A90 (Polyoxyethylenderivat, HLB 14,5) enzymatisch quantifiziert. Diese sind alle von der KAO CORPORATION erhältlich. Dieser Vorgang wurde wie folgt ausgeführt:
    Zu einer Lösung, die in einem 50 mM PIPES-Puffer, pH 7,0, 0,5 U/ml Cholesterinesterase, 0,4 U/ml Cholesterinoxidase, 0,5 U/ml Peroxidase, 1,0 mmol/l 4-Aminoantipyrin und 0,5 mmol/l HDAOS enthielt, wurden Emulgen 911 oder Emulgen B66 zu einer Konzentration von 0,1 Gew.-% oder ein Emulgen-B66/Emulgen-A90-Gemisch (9:1) zu einer Konzentration von 1,3 Gew.-% zugesetzt. 20 Mikroliter aus jeder Probe wurden mit 2,0 ml des so hergestellten Gemischs vermischt und das resultierende Gemisch bei 37°C 10 Minuten lang umgesetzt, wonach eine Messung der Extinktion bei 600 nm folgte.
  • Daraus ergab sich, dass das Reaktionsverhältnis (und zwar das Verhältnis des quantifizierten Cholesterins im Gesamtcholesterin) etwa 95% für das Cholesterin im HDL und etwa 18 bis 22% für das Cholesterin in den anderen Lipoproteinen betrug.
  • Daraus ist ersichtlich, dass Emulgen 911, Emulgen B66 und das Emulgen-B66/Emulgen-A90-Gemisch im Umfang der Bezeichnung "spezifisch auf hochdichtes Lipoprotein wirkendes Tensid" enthalten sind.
  • Beispiel 1
  • Es wurden erste und zweite Reagenzien mit jeweils den nachstehenden Zusammensetzungen hergestellt. Erste Reagenzien
    PIPES-Puffer, pH 7,0 100 mmol/l
    HDAOS 0,7 mmol/l
    Cholesterinesterase 0,8 U/ml
    Cholesterinoxidase 0,5 U/ml
    Katalase 80 U/ml
    Magnesiumchlorid 10 mmol/l
    Zweite Reagenzien
    PIPES-Puffer, pH 7,0 100 mmol/l
    4-Aminoantipyrin 4,0 mmol/l
    Peroxidase 2,4 U/ml
    Natriumazid 0,1
    Emulgen B66 (HLB 13,2), von der KAO CORPORATION erhältlich 0,3%
  • Zu jeder dieser 4 Proben, die ein Volumen von 4 μl aufwiesen und gereinigtes HDL, LDL, VLDL und CM jeweils in einer Konzentration von 100 mg/dl enthielten, wurden 300 μl der oben beschriebenen ersten Reagenzien, die zuvor bei 37°C vorgewärmt worden waren, zugesetzt, und jedes der resultierenden Gemische wurde 5 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Danach wurden 100 μl der zweiten Reagenzien zu jedem Gemisch zugesetzt, und jedes der resultierenden Gemische wurde 5 Minuten lang umsetzen gelassen, wonach eine Messung der Extinktion bei 600 nm folgte. Basierend auf den gemessenen Extinktionen wurden die Mengen des Cholesterins sowie auch das Verhältnis zwischen der so ermittelten Menge und der Menge des Cholesterins in der Probe, das als Einfangverhältnis definiert ist, ermittelt.
  • Mit diesem Verfahren wird das im ersten Schritt hergestellte Wasserstoffperoxid mittels Katalase abgebaut. Andererseits bildet das im zweiten Schritt gebildete Wasserstoffperoxid ein Chinonpigment durch Umsetzung von HDAOS mit 4-Aminoantipyrin. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt.
  • Tabelle 1
    Figure 00100001
  • Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wird der Hauptanteil des Cholesterins in HDL mittels oben beschriebenen Verfahrens quantifiziert. Andererseits wird das Cholesterin in anderen Lipoproteinen als HDL im Wesentlichen nicht quantifiziert. Folglich ist klar, dass das Cholesterin in HDL mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens selektiv quantifiziert werden kann.
  • Beispiel 2
  • Es wurde Cholesterin in HDL in den Testproben anhand des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 quantifiziert, mit der Ausnahme, dass die Testproben Seren normaler Individuen waren. Andererseits wurde das HDL-Cholesterin in den gleichen Testproben mittels eines in "Clinical Tests" 23, 121 (1979), beschriebenen Fällungsverfahrens quantifiziert. Die Korrelation zwischen den durch diese Verfahren erhaltenen Ergebnissen ist in 1 dargestellt.
  • Wie in 1 angeführt, stimmten die Ergebnisse der Quantifizierung durch diese Verfahren gut überein, wodurch bewiesen werden konnte, dass das Cholesterin in HDL durch das erfindungsgemäße Verfahren genau quantifiziert werden kann.
  • Beispiel 3
  • Es wurde der gleiche Vorgang wie in Beispiel 1 wiederholt, mit der Ausnahme, dass die ersten und zweiten Reagenzien die jeweils folgenden Zusammensetzungen aufwiesen. Erste Reagenzien
    HEPES-Puffer, pH 7,0 50 mmol/l
    DAOS 1,5 mmol/l
    Cholesterinesterase 0,8 U/ml
    Cholesterinoxidase 0,5 U/ml
    Peroxidase 1,0 U/ml
    Zweite Reagenzien
    HEPES-Puffer, pH 7,0 50 mmol/l
    4-Aminoantipyrin 4,0 mmol/l
    Emulgen 911 (HLB 13,7), von der KAO CORPORATION erhältlich 0,3%
  • Durch dieses Verfahren reagiert das im ersten Schritt hergestellte Wasserstoffperoxid aufgrund der Wirkung der Peroxidase mit DAOS, um ein farbloses Chinon zu bilden. Andererseits reagiert das im zweiten Schritt gebildete Wasserstoffperoxid mit dem restlichen DAOS aus dem ersten Schritt und mit dem im zweiten Schritt zugesetzten 4-Aminoantipyrin durch Wirkung der Peroxidase, um ein Chinonpigment zu bilden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt.
  • Tabelle 2
    Figure 00120001
  • Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, wird der Hauptanteil des Cholesterins in HDL mittels oben beschriebenen Verfahrens quantifiziert. Andererseits wird das Cholesterin in anderen Lipoproteinen als HDL im Wesentlichen nicht quantifiziert. Folglich ist klar, dass das Cholesterin in HDL mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens selektiv quantifiziert werden kann.
  • Beispiel 4
  • Es wurde Cholesterin in HDL in den Testproben anhand des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 3 quantifiziert, mit der Ausnahme, dass die Testproben Seren normaler Individuen waren. Wie in Beispiel 2 wurde das HDL-Cholesterin in den gleichen Testproben mittels eines Fällungsverfahrens quantifiziert. Die Korrelation zwischen den durch diese Verfahren erhaltenen Ergebnissen ist in 2 dargestellt.
  • Wie in 2 angeführt, stimmten die Ergebnisse der Quantifizierung anhand dieser Verfahren gut überein, wodurch bewiesen werden konnte, dass das Cholesterin in HDL durch das erfindungsgemäße Verfahren genau quantifiziert werden kann.
  • Beispiel 5
  • Es wurden erste und zweite Reagenzien mit jeweils den nachstehenden Zusammensetzungen hergestellt. Erste Reagenzien
    BES-Puffer, pH 7,0 100 mmol/l
    HDAOS 0,7 mmol/l
    Cholesterinesterase 0,8 U/ml
    Cholesterinoxidase 0,5 U/ml
    Katalase 100 U/ml
    Magnesiumchlorid 18 mmol/l
    Zweite Reagenzien
    BES-Puffer, pH 7,0 100 mmol/l
    4-Aminoantipyrin 4,0 mmol/l
    Peroxidase 2,4 U/ml
    Natriumazid 0,1%
    Emulgen B66 (HLB 13,2), von der KAO CORPORATION erhältlich 1,17%
    Emulgen A90 (HLB 14,5), von der KAO CORPORATION erhältlich 0,13%
  • Zu jeder dieser 4 Proben, die ein Volumen von 4 μl aufwiesen und gereinigtes HDL, LDL, VLDL und CM jeweils in einer Konzentration von 100 mg/dl enthielten, wurden 300 μl der oben beschriebenen ersten Reagenzien, die zuvor bei 37°C vorgewärmt worden waren, zugesetzt, und jedes der resultierenden Gemische wurde 5 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Danach wurde zu jedem der Gemische 100 μl der zweiten Reagenzien zugesetzt, und jedes der resultierenden Gemische wurde 5 Minuten lang umgesetzt, wonach eine Messung der Extinktion bei 600 nm folgte. Basierend auf den gemessenen Extinktionen wurden die Mengen des Cholesterins sowie auch das Verhältnis zwischen der so ermittelten Menge und der Menge des Cholesterins in der Probe, das als Einfangverhältnis definiert ist, ermittelt.
  • Mit diesem Verfahren wird das im ersten Schritt hergestellte Wasserstoffperoxid mittels Katalase abgebaut. Andererseits bildet das im zweiten Schritt gebildete Wasserstoffperoxid ein Chinonpigment durch Umsetzung von HDAOS mit 4-Aminoantipyrin. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt.
  • Tabelle 3
    Figure 00140001
  • Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, wird der Hauptanteil des Cholesterins in HDL mittels oben beschriebenen Verfahrens quantifiziert. Andererseits wird das Cholesterin in anderen Lipoproteinen als HDL im Wesentlichen nicht quantifiziert. Folglich ist klar, dass das Cholesterin in HDL mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens selektiv quantifiziert werden kann.
  • Beispiel 6
  • Es wurde Cholesterin in HDL in den Testproben anhand des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 5 quantifiziert, mit der Ausnahme, dass die Testproben Seren normaler Individuen waren. Andererseits wurde das HDL-Cholesterin in den gleichen Testproben mittels eines in "Clinical Tests" 23, 121 (1979), beschriebenen Fällungsverfahrens quantifiziert. Die Korrelation zwischen den durch diese Verfahren erhaltenen Ergebnissen ist in 3 dargestellt.
  • Wie in 3 angeführt, stimmten die Ergebnisse der Quantifizierung anhand dieser Verfahren gut überein, wodurch bewiesen werden konnte, dass das Cholesterin in HDL durch das erfindungsgemäße Verfahren genau quantifiziert werden kann.

Claims (6)

  1. Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin in hochdichtem Lipoprotein, umfassend einen ersten Schritt des Beseitigens von Cholesterin aus anderen Lipoproteinen als hochdichtem Lipoprotein in einer Testprobe und einen zweiten Schritt des Zusetzens eines Tensids, das spezifisch auf hochdichtes Lipoprotein wirkt, zum Produkt aus dem ersten Schritt sowie des enzymatischen Quantifizierens von Cholesterin in hochdichtem Lipoprotein.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Schritt das Kontaktieren der Probe mit Cholesterin-Esterase und Cholesterin-Oxidase in Abwesenheit eines Tensids, das spezifisch auf hochdichtes Lipoprotein wirkt, und das Entfernen von gebildetem Wasserstoffperoxid umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der zweite Schritt das Zusetzen des Tensids, das spezifisch auf hochdichtes Lipoprotein wirkt, zum Produkt aus dem ersten Schritt sowie das Quantifizieren des durch die Wirkung von Cholesterin-Esterase und Cholesterin-Oxidase gebildeten Wasserstoffperoxids umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Tensid, das spezifisch auf hochdichtes Lipoprotein wirkt, einen HLB-Wert von 13–14 aufweist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Tensid, das spezifisch auf hochdichtes Lipoprotein wirkt, ein Polyalkylenoxid-Derivat ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der erste Schritt bei einem pH von 5–8 durchgeführt wird.
DE69734194T 1996-12-09 1997-12-04 Verfahren zur bestimmung des cholesteringehalts von high-density-lipoproteinen Expired - Lifetime DE69734194T2 (de)

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