-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Impfstoffen,
die zur Vorbeugung der pathogenen Wirkungen, die mit Retrovirusinfektionen
verknüpft
sind, am Menschen und an Wirbeltieren geeignet sind.
-
Die
mit einer Retrovirusinfektion verbundenen pathogenen Wirkungen sind äußerst schädliche Effekte,
welche onkogene oder immunsuppressive Effekte einschließen, welche
durch Eindringen eines Retrovirus in einen Wirtsorganismus (Säuger, Vogel
oder auch Fisch) ausgelöst
werden, gefolgt von einem Eindringen und der Vermehrung des Retrovirus
in die Zellen des Wirts, welche die Targetzellen oder Zielzellen
des Retrovirus sind, das heißt
Zellen, in welche das Virus eindringen kann.
-
Die
Retroviren werden so bezeichnet, weil sie die Fähigkeit besitzen, aufgrund
eines Enzyms, welches inverse Transkriptase genannt wird, eine Transkription
von RNA in DNA zu bewirken, wobei festzuhalten ist, dass bei den
lebenden Wesen die genetische Information üblicherweise von der DNA der
Chromosomen über die
Messenger-RNA zu Proteinen führt.
-
In
der Familie der Retroviren unterscheidet man drei Unterfamilien:
die Onkoviren, die Lentiviren und die Spumaviren.
-
Die
Onkoviren sind Retroviren, die so bezeichnet werden, da sie mit
Krebserkrankungen und bösartigen
Infektionen assoziiert werden können.
Man kann beispielsweise die leukämogenen
Viren nennen (wie das Geflügelleukämie-Virus
(ALV), das Mausleukämie-Virus
(MULV), welches auch als Moloney-Virus bezeichnet wird, das Katzenleukämie-Virus
(FELV), die menschlichen Leukämieviren,
wie HTLV1 und HTLV2, das Affenleukämie-Virus oder STLV, das Rinderleukämie-Virus (oder BLV),
die Onkoviren des Typs D der Primaten, die Onkoviren des Typs B,
welche Mammatumore induzieren, oder Onkoviren, welche einen schnellen
Krebs verursachen (wie das Rous-Sarkomvirus oder RSV); siehe beispielsweise
STEHELIN et al., J. Mol. Biol., 101 (1976), 349–365).
-
Die
Lentiviren werden so bezeichnet, weil sie für pathologische Zustände mit
langsamer Entwicklung verantwortlich sind, welche sehr häufig zu
immunsuppressiven Phänomenen
Anlass geben, einschließlich AIDS.
-
Die
beigefügte
Tabelle 1 verdeutlicht beispielhaft die Erkrankungen, die mit bestimmten
Lentiviren verknüpft
sind sowie die wesentlichen Targetzellen dieser Lentiviren.
-
Die
Spumaviren zeigen eine sehr geringe Spezifität für einen gegebenen Zelltyp oder
eine gegebene Spezies und sie sind häufig mit immunsuppressiven
Phänomen
verknüpft,
was beispielsweise der Fall ist bei dem Affen-Spumavirus (oder SFV).
-
Eines
der Ziele der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
von Impfverfahren und Impfprodukten, zur wirksamen Vorbeugung der
pathogenen Wirkungen, einschließlich
der onkogenen oder immunsuppressiven Wirkungen, die mit der Infektion
eines Wirtsorganismus durch ein Retrovirus verbunden sind.
-
Die
mit der Infektion verknüpfte
Immunsuppression wurde für
eine sehr große
Vielzahl von Retroviren festgestellt und sie kann als eine pathogene
Konstanz der Retrovirusinfektion angesehen werden; siehe insbesondere
BENDINELLI et al., Advances in Cancer Research, 45 (1985), 125–181. Dies
trifft insbesondere auf Lentivirus-Infektionen zu. Dies ist auch
der Fall bei einer erheblichen Anzahl von Onkovirus-Infektionen,
siehe beispielsweise P. SONIGO in dem Werk "SIDA et infection par HIV", MONTAGNIER et al.
(Médecine
Science Flammarion) (1989), Seiten 113–122.
-
Zur
Vorbeugung der pathogenen Wirkungen von Retrovirus-Infektionen wurden
viele menschliche und tierische Impfstoffe untersucht, wobei sich
als allgemeine Regel diese Impfstoffe als wenig wirksam oder unwirksam
erwiesen haben. Insbesondere im Bereich des menschlichen oder tierischen
AIDS musste 14 Jahre nach der Entdeckung des HIV-Virus (BARRE-SINOUSSI
et al., Science, 220 (1983), 860–871) festgestellt werden,
dass es noch nicht gelungen ist, einen Impfstoff aufzufinden, der
in wirksamer Weise eine postvakzinale HIV- oder SIV-Infektion zu
bekämpfen;
siehe beispielsweise LINHART et al., AIDS Research and Human Retroviruses,
13 (1997), 593–599);
VOGT et al., Vaccine, 13 (1995), 202–208; und LETVIN et al., J.
Virol., 69 (1995), 4569–4571).
-
Die
Mehrzahl der verwendeten Impfpräparate
umfasst Hüllproteine
des Retrovirus in unterschiedlichen Formen, beispielsweise aktivierte
Viren, Hüllproteine,
wie die Proteine gp 120 und gp 160 des HIV-Virus (siehe insbesondere
G. J. GORSE, Vaccine, 10 (1992), 383–388), Virenkerne mit Hüllproteinen
oder Hüllproteine,
die mit verschiedenen Vektoren kombiniert sind (chimäre Viren,
Bakterien); siehe J. A. Levy, Trans. Med. Rev., 2 (1988), 265–271 und
Microbiol. Rev., 57 (1993), 183–289,
insbesondere Seite 247.
-
Andere
Präparate
verwenden Fragmente der Hülle
des Retrovirus oder immunodominierende Peptide, die aus den Hüll-Glykoproteinen
stammen, wobei diese Peptide in unterschiedlichen Formen eingesetzt
werden (Lipopeptide, Peptide, die an einen Proteinträger gebunden
sind), um sie immunogen zu machen; siehe insbe sondere Eriksson et
al., Vaccine, 11 (1993), 859–865.
-
Die
in klassischer Weise beschriebenen Impfstrategien, beispielsweise
im Bereich der AIDS-Erkrankungen beim Menschen, Affen oder Katzen,
sehen vor, dass die konservierten und immunodominierenden Epitope
der Hüllproteine
nicht modifiziert werden, was vollständig logisch zu sein scheint.
In der Tat sind diese konservierten Epitope verschiedenen Virusstämmen gemeinsam,
was im Hinblick auf die Entwicklung eines Impfstoffs günstig ist
und eine Immunantwort auslösen
kann, die gegen eine Vielzahl von Stämmen gerichtet ist. Andererseits
werden diese immunodominierenden Epitope aufgrund des Impf- und
Infektionsprozesses von dem zellulären oder humoralen Immunsystem
gut erkannt und darüber
hinaus stellen sie häufig
Neutralisationsstellen dar; siehe beispielsweise HO et al., J. Virol.,
61 (1987), 2024–2028;
JOHNSON et al., J. Exp. Med., 175 (1992), 961–971; SHAFFERMAN et al., P.N.A.S.
U.S.A., 88 (1991), 7126–7130;
und HAMMOND et al., J. Immunol., 146 (1991), 1470–1477.
-
Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, im Gegensatz
dazu die konservierten und immunodominierenden Epitope bestimmter
Virus-Hüllproteine
zu modifizieren, um in dieser Weise zu einem wirksamen Impfstoff
zu gelangen.
-
In
der Tat haben die Autoren der vorliegenden Erfindung erkannt, dass
konservierte und immunodominierende Bereiche der Hülle des
Retrovirus der Ausgangspunkt für
schädliche
Autoimmun-Phänomene
sein können.
Beispielsweise wurde im Fall des menschlichen AIDS beobachtet, dass
bestimmte konservierte und immunodominierende Bereiche der Hülle des
HIV-Virus in der dreidimensionalen Struktur und/oder bei Kreuzreaktionen
Analogien zeigen mit bestimmten Bereichen mindestens eines Proteins
des menschlichen Immunsystems, derart, dass die Verabreichung eines
Virusproteins, welches diese intakten Bereiche enthält, als
Impfstoff zu einer Immunantwort führt, welche der Ursprung ist
von schädlichen
Autoimmunreaktionen, was zu einem Versagen der Impfung führt.
-
Am
Ursprung der vorliegenden Erfindung findet man einerseits die oben
erwähnte
Beobachtung, dass die konservierten und immunodominierenden Bereiche
bestimmter Retroviren, die üblicherweise
in Impfpräparaten
vorhanden sind, tatsächlich
in einer Vielzahl von Fällen
die Bereiche sind, welche schädliche
Autoimmunreaktionen verursachen, da sie Analogien in ihrer dreidimensionalen
Struktur und/oder bei Kreuzreaktionen zeigen mit bestimmten Proteinen
des Wirts des Virus. Am Ursprung der vorliegenden Erfindung findet
man weiterhin andererseits die Beobachtung, dass die genannten Wirtsproteine
die gleiche Targetzelle oder die gleichen Targetzellen benützen, wie
die genannten Retroviren. Die Gesamtheit dieser von den Autoren
der vorliegenden Erfindung gemachten Beobachtungen hat sie zu der
Erkenntnis geführt,
dass die Hüllproteine
von Retroviren und die Wirtsproteine, welche Analogien in der dreidimensionalen
Struktur und/oder bei Kreuzreaktionen aufweisen, sich bei einer
Vielzahl von Fällen
an die gleichen Targetzellen binden und auf diesen Targetzellen
gemeinsame Membranrezeptoren besitzen.
-
Ein
Protein zeigt eine Kreuzreaktion mit einem anderen Protein, wenn
es möglich
ist, durch Immunisierung in vivo oder in vitro mit Hilfe eines der
genannten Proteine eine Immunantwort auszulösen, welche gegen das andere
Protein gerichtet ist, beispielsweise wenn diese Immunisierung eine
humorale Antwort induziert (die als Typ B bezeichnet wird) und es
ermöglicht,
mindestens einen monoklonalen Antikörper zu selektionieren, der
dazu in der Lage ist, das andere Protein zu erkennen, oder wenn
ein und dieselbe durch eines der Proteine in vitro induzierte zelluläre Immunantwort
(vom Typ T) die beiden Proteine erkennt bei bekannten Tests für den Nachweis
einer Immunantwort des Typs T, wie beispielsweise die in vitro durchgeführten Cytotoxizitätstests.
Es ist bekannt, dass der Begriff "Immunisierung" den Prozess der Induzierung einer Immunantwort
als Folge einer Reizung ist, durch Inkontaktbringen in vivo oder
in vitro von immunokompetenten Zellen eines Wirts mit einem Antigen,
und dass eines der Ziele der Verabreichung eines Impfstoffs genau
die Erzielung einer solchen Immunisierung ist.
-
Die
Erfindung betrifft demzufolge ein Verfahren zur Gewinnung eines
Impfstoffs gegen die pathogenen Wirkungen, die mit der Infektion
eines tierischen oder menschlichen Wirts durch ein HIV-Retrovirus,
das dazu in der Lage ist, in eine Targetzelle des Wirts einzudringen,
verbunden sind, welche Targetzelle einen Membran-Rezeptor für das Wirts-Interleukin-2
(IL-2)-Protein aufweist, gemäß welchem
Verfahren man ein impfendes Mittel bildet auf der Grundlage eines
Polypeptids, das mindestens einen Teil des Hüllproteins gp41 eines pathogenen
Stamms des Retrovirus umfasst, und welches Polypeptid in einer modifizierten
Form hergestellt wird, mit der Maßgabe, dass:
- – der Teil
des Hüllproteins
gp41 aus jenen ausgewählt
wird, die mindestens ein Fragment eines immunodominierenden Bereichs
des Hüllproteins
gp41 umfassen, welches Fragment mindestens eine Aminosäure enthält, die
eine Aminosäure
aus dem immunodominierenden Bereich ist und die in dem pathogenen Stamm
vorhanden ist,
- – das
Polypeptid in nicht-modifiziertem Zustand eine Immunantwort induziert,
die gleichzeitig gegen den immunodominierenden Bereich und gegen
das Wirts-IL-2-Protein
gerichtet ist,
- – und
das modifizierte Polypeptid aus jenen ausgewählt ist, die eine Immunantwort
induzieren, welche gegen den immunodominierenden Bereich, jedoch
nicht gegen das Wirts-IL-2-Protein gerichtet ist.
-
Bei
der oben angegebenen Definition des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert
das impfende Mittel "auf
der Grundlage" eines
modifizierten Polypeptids. Dies bedeutet, dass das impfende Mittel
ein solches modifiziertes Polypeptid umfasst, bedeutet jedoch nicht,
dass das impfende Mittel notwendigerweise ausschließlich polypeptidischer
Natur ist. In der Tat kann das genannte Polypeptid in diesem impfenden
Mittel gegebenenfalls in an sich bekannter Weise mit irgendeinem
biologisch verträglichen
Molekül,
welches beispielsweise aus Polymeren, Lipiden, Peptiden (einschließlich Lipopeptide,
Glykopeptide und Proteine), Nucleinsäuren, Oligosaccharide etc.,
verbunden (insbesondere kovalent gebunden) oder assoziiert sein.
Das biologisch verträgliche
Molekül
kann insbesondere als Träger
eines polypeptidischen immunogenen Mittels dienen. Es kann auch
dazu dienen, die Konformation des Polypeptids zu modifizieren, wobei
in diesem letzteren Fall das Molekül als ein Substituent angesehen
werden muss, der den Aminosäurerest,
an den es gebunden ist, modifiziert, wodurch der Substituent in
dieser und in definitiver Weise die Antigenizität des Polypeptids, dem dieser Aminosäurerest
angehört,
modifiziert.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann mindestens eine vorausgehende Phase der Suche umfassen, eine
Stufe, die darin besteht, die (nicht-modifizierten) Polypeptide
auszuwählen,
welche mindestens einen Teil, wie er oben definiert worden ist,
des Virus-Hüllproteins
gp41 eines pathogenen Stamms des Retrovirus HIV umfassen. Dieser
Teil des Proteins, welcher mindestens ein immunogenes Fragment eines
immunodominierenden Bereichs umfasst, ist derart ausgebildet, dass
das (nicht-modifizierte) Polypeptid dazu in der Lage ist, eine Immunantwort
zu induzieren, die gleichzeitig gegen das Virusprotein (genauer
gegen das Fragment des immunodominierenden Bereichs, der in dem
genannten Teil enthalten ist) und gegen das Wirtsprotein IL-2 gerichtet
ist, und es ist die Existenz einer solchen Immunantwort, die gegen
das Virus-Hüllprotein
gp41 und gegen das Wirtsprotein IL-2 gerichtet ist, welche im Rahmen
der vorliegenden Erfindung den pathogenen Charakter eines Virusstamms
definiert. Man kann in dieser Weise (nicht-modifizierte) Polypeptide,
die ein solches Fragment enthalten, selektionieren.
-
Ein
Polypeptidfragment wird als immunogen bezeichnet, wenn die Immunisierung
eines Wirts in vivo oder in vitro mit dem genannten Fragment, das
gegebenenfalls an einen geeigneten Träger (wie ein Protein, ein Lipid
oder ein Polypeptid) gebunden ist, zu einer Immunantwort vom Typ
B und/oder vom Typ T führt,
die gegen das Polypeptidfragment gerichtet ist.
-
Wenn
im Rahmen der vorliegenden Erfindung von einer Immunantwort die
Rede ist, handelt es sich, wenn nichts anderes angegeben wird, um
eine Immunantwort eines Wirbeltiers als Folge einer in vitro- oder
in vivo-Immunisierung.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann weiterhin mindestens eine Stufe umfassen, die darin besteht, in
der nachfolgend angegebenen Weise ein in dieser Weise ausgewähltes Polypeptid
zu modifizieren und aus dem in dieser Weise modifizierten Polypeptiden
mindestens ein modifiziertes Polypeptid auszuwählen, welches eine Immunantwort
induziert, die gegen das Virus-Hüllprotein
gp41 und nicht gegen das Wirtsprotein IL-2 gerichtet ist.
-
Während somit
der Stand der Technik, wie oben angegeben worden ist, lehrt, die
konservierten und immunodominierenden Bereiche der Retrovirus-Hüllproteine
nicht zu modifizieren, stellt das erfindungsgemäße Verfahren im Gegensatz dazu
darauf ab, die Antigenizität
der Epitope in der Weise zu modifizieren, dass man eine differenzierte
Immunantwort gegenüber
dem Virus-Hüllprotein
und einem Wirtsprotein erhält.
-
Es
ist bekannt, dass es zur Modifizierung der Antigenizität eines
immunogenen Fragments eines Polypeptids möglich ist, das Polypeptid durch
eine Mutation, die auf mindestens eine Aminosäure gerichtet ist, zu modifizieren.
Was in diesem Zusammenhang unter einer "Mutation" zu verstehen ist, wird weiter unten
definiert. Die mutierte Aminosäure
kann in dem immunogenen Fragment angeordnet sein oder in einem äußeren Bereich
des Polypeptids des Fragments. Es ist bekannt, dass die Modifizierung
einer Aminosäure,
die an der Außenseite
eines Fragments vorliegt, die räumliche
Struktur des Fragments und demzufolge seine Antigenizität beeinflussen
kann; insbesondere konnte gezeigt werden, dass die Konformation
eines Aminosäurerests
in einem Peptid durch die Art der Aminosäurereste in den Positionen
von +8 bis –8,
bezogen auf diesen Aminosäurerest,
beeinflusst werden kann; siehe beispielsweise GARNIER et al., J.
Mol. Biol., 120 (1978), 97–120. Darüber hinaus
hat die Art der Aminosäurereste
weiterhin einen Einfluss, welcher Einfluss jedoch weder systematisch
noch quantifizierbar ist ausgehend lediglich von der Kenntnis der
betreffenden Peptidsequenz.
-
Eine
mutierte Aminosäure
kann demzufolge in dem modifizierten Polypeptid im Inneren oder
im Äußeren des
immunogenen Fragments vorliegen. Wenn sie im äußeren Bereich des immunogenen
Fragments angeordnet ist, ist sie im allgemeinen von dem nächsten Ende
des immunogenen Fragments in der Peptidkette um nicht mehr als acht
(insbesondere nicht mehr als sieben) Aminosäurereste getrennt. Insbesondere
ist eine erfindungsgemäß mutierte
Aminosäure,
die im äußeren Bereich
des immunogenen Fragments vorliegt, im allgemeinen um nicht mehr
als acht Aminosäurereste
und insbesondere nicht mehr als sieben Aminosäurereste von der nächsten konservierten
Aminosäure
entfernt, die dem immunodominierenden Bereich angehört, von dem
mindestens ein Fragment in dem nicht-modifizierten Polypeptid enthalten
ist.
-
Das
erfindungsgemäß modifizierte
Polypeptid kann beispielsweise das vollständige Hüllprotein JP61 eines pathogenen
HIV-Virenstamms sein, welches durch mindestens eine Mutation, wie
oben angegeben, modifiziert ist. Das modifi zierte Polypeptid kann
auch ein Teil des Hüllproteins
gp41 eines pathogenen HIV-Virenstamms
sein, das durch mindestens eine in der oben angegebenen Weise beschriebene
Mutation modifiziert ist, wobei der genannte Teil mindestens ein
immunogenes Fragment der oben definierten Art umfasst. Das modifizierte
Polypeptid kann weiterhin ein chimäres Protein sein, welches mindestens
einen Teil des Hüllproteins gp41
des Teils des Hüllproteins,
welches oben definiert worden ist und mindestens eine Mutation aufweist,
umfasst.
-
Die
oben gegebene Definition des erfindungsgemäßen Verfahrens impliziert,
dass das verwendete Polypeptid mindestens einen Teil eines immunodominierenden
und konservierten Bereichs eines Virus-Hüllproteins gp41 umfasst. In
der vorliegenden Beschreibung bezeichnet man mit "konserviertem Bereich" einen Bereich, der
gegebenenfalls auf einen einzigen Aminosäurerest reduziert ist, des
Virusproteins, auf dem man für
eine Vielzahl von gegebenen Virenstämmen (beispielsweise bei mindestens
6 Stämmen
von etwa 10) ein oder mehrere identische oder funktionell analoge
Aminosäuren
findet, die in gleicher Position in den Peptidsequenzanordnungen
des Proteins der verschiedenen Stämme angeordnet ist. Eine solche
identische oder funktionell analoge Aminosäure wird als konservierte Aminosäure bezeichnet.
Die Vorstellung der Konservierung von funktionell analogen Aminosäuren ist
bekannt und es existiert eine Vielzahl von Substitutionsmatrizes,
welche eine Quantifizierung dieser Vorstellung ermöglicht (M.
O. Dayhoff et al., in: Atlas of Protein Sequence and Structure,
Bd. 5, Suppl. 3 (1978), Kapitel 22 und 23).
-
Die
konservierten Bereiche können
in einfacher Weise bestimmt werden nach der Sequenzierung der Proteine
von verschiedenen untersuchten Virusstämmen mit Hilfe von Multiple
Alignment-Methoden der erhaltenen Sequenzen. Man kann hierzu beispielsweise
das Programm Clustal-w (J. D. Thompson et al., Nucleic Acids Research,
22 (1994), 4673–4680)
verwenden. Andererseits sind die Sequenzen der Proteine von verschiedenen
Virusstämmen
häufig über Datenbanken
zugänglich.
Beispielsweise enthält
der Web-Server der Datenbank HIV von Los Alamos die Sequenzen HIV1
und HIV2, die regelmäßig aktualisiert
werden. Die Internetadresse dieses Servers lautet wie folgt:
http://hiv-web.lanl.gov/HTML/sequences.html
-
Die
beigefügten
Tabellen 2a, 2b und 2c zeigen Beispiele von Sequenz-Alignments von Bereichen,
die den homologen Hüll-Glykoproteinen
des Bereichs 545–682
des Transmembran-Glykoproteins des HIV1-Virus (Datenbankeintrag:
SWISSPROT ENV_HV1 BR) für
HIV1 bzw. HIV2. Die letzte Zeile dieser Tabellen resümiert mit
Hilfe von Symbolen den Grad der Homologie und demzufolge den beobachteten
Konservierungsgrad. Das Symbol "*" steht für eine Alignment-Position,
an der der gleiche Rest in sämtlichen
Sequenzen vorhanden ist, das Symbol ":" defi niert
eine Position in dem Alignment, bei dem die in den verschiedenen
Sequenzen vorhandenen Aminosäuren
sehr ähnlich
sind, das Symbol "." bedeutet, dass eine
Position in dem Alignment, in dem die in den verschiedenen Sequenzen
vorhandenen Aminosäuren ähnlich sind,
und die Abwesenheit eines Symbols bedeutet, dass eine Position in
dem Alignment, in dem die in den verschiedenen Sequenzen vorhandenen
Aminosäuren
wenig Ähnlichkeit
aufweisen. Diese Symbolik wird von dem Alignment-Programm Clustal w
(Version 1.7) benutzt.
-
In
der vorliegenden Beschreibung bezeichnet man als immunodominierenden
Bereich des Proteins eine Peptidsequenz, die in einer großen Vielzahl
der Fälle
(beispielsweise in mindestens 7 Fällen von etwa 10) eine humorale
und/oder zellulare Antwort des Immunsystems gegen den genannten
Bereich induziert, nach der Immunisierung mit einem Protein, welches
die genannte Sequenz enthält
oder mit einem Peptid, welches im wesentlichen die genannte Sequenz
bildet.
-
Die
Definition des erfindungsgemäßen Verfahrens
bezieht sich auf Targetzellen oder Zielzellen eines Virus, welches
Zellen sind, in deren Inneres das Virus einzudringen vermag. Die
Targetzellen der Retroviren sind im allgemeinen bekannt. Die Viren
besitzen die Fähigkeit,
sich an die Zellen, die sie zu infizieren vermögen, zu binden. Man kann demzufolge
mit Hilfe von in vitro durchgeführten
Routineuntersuchungen gegebenenfalls die Targetzellen eines untersuchten
Virus suchen.
-
Die
Definition des erfindungsgemäßen Verfahrens
bezieht sich weiterhin auf die Zellen eines Wirts, welche einen
Membranrezeptor für
ein Wirtsprotein IL-2 aufweisen. Die Zellen des Wirts, die einen
Rezeptor für
ein Wirtsprotein IL-2 aufweisen, sind häufig bekannt und wenn dies
nicht der Fall sein sollte, ist es möglich, mit Hilfe von Routineuntersuchungen
festzustellen, ob ein gegebenes Protein sich an einen bestimmten
Zelltyp bindet. Man kann beispielsweise ein radioaktiv markiertes
Protein verwenden und untersuchen, ob es sich an den genannten Zelltyp
bindet. Man kann weiterhin untersuchen, ob das Protein sich an einen
gegebenen Membranrezeptor bindet unter Verwendung einer Zelllinie,
die mit Hilfe eines Gens transfektiert worden ist, welches den genannten
Membranrezeptor exprimiert.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird angenommen, dass eine Immunantwort,
beispielsweise eine Antikörperantwort,
die man durch Immunisierung mit Hilfe eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
modifizierten Polypeptids verursacht hat, gegen das Virus-Hüllprotein
gp41 und nicht gegen das Wirtsprotein IL-2 gerichtet ist, wenn die
erhaltenen Antikörper
Affinitäten
besitzen, die für
das Wirtsprotein und für
das Hüllprotein
des Retrovirus einen deutlichen Unterschied aufweisen, der sich
insbesondere in Unterschieden der Reaktivität manifestiert, die bei den
ELISA-Tests als sehr signifikant angesehen werden, wie beispielsweise
optische Dichten in einem Verhältnis
von etwa 4 (oder mehr), was bedeutet, dass die beobachtete optische
Dichte nach der Bindung der Antikörper an dem Virusprotein gp41
mehr als viermal größer ist
als jene, die man bei der Bindung der Antikörper an das Wirtsprotein IL-2
beobachtet. In analoger Weise wird eine zelluläre Immunantwort als gegen das
Hüllprotein
gp41, jedoch nicht gegen das Wirtsprotein IL-2 gerichtet angesehen,
wenn die in vitro-Immunisierung der immunokompetenten Zellen des
Wirts mit dem Impfstoffkandidat zur Bildung von aktivierten Zellen
führt,
deren Reaktion gegenüber
Zellen (welche transfektierte Zelllinien einschließen), die
das Retrovirus-Hüllprotein
exprimieren, signifikant höher
ist als die Reaktion gegenüber
Zellen, die das Wirtsprotein exprimieren, beispielsweise wenn im
Fall der endgültigen
optischen Messung oder bei dem endgültigen Auszählen der Radioaktivität (insbesondere
die von den Targetzellen ausgestrahlte 51Cr-Radioaktivität) des angewandten
Tests, oder bei der Bewertung mit Hilfe sämtlicher bekannter Methoden
einer Zelllyse, die durch cytotoxische Zellen induziert wird, wobei
das Ausmaß der
Antworten in einem Verhältnis von
etwa 4 (oder mehr) steht. Die angegebenen Kriterien ermöglichen
mindestens eine erste Auswahl unter den untersuchten modifizierten
Peptiden, wobei jedoch definitiv die Abwesenheit oder die Verminderung
der pathogenen Wirkung als Folge der Suppression oder der Abschwächung (welche
mit Hilfe jeglicher geeigneter Methoden nachgewiesen werden kann)
der Immunantwort gegenüber
dem Wirtsprotein das Kriterium der Auswahl der modifizierten Peptide
darstellt, welche dazu geeignete sind, zufriedenstellende Impfmittel
zu bilden.
-
Die
immunodominierenden und konservierten Bereiche, deren Antigenizität erfindungsgemäß modifiziert
werden soll, können
in vitro mit Hilfe einer Kreuzreaktion vom Typ B und/oder vom Typ
T mit dem Wirtsprotein IL-2 ausgewählt werden.
-
Man
kann einen solchen immunodominierenden und konservierten Bereich
auch unter Zellen auswählen,
für die
man zuvor eine Analogie der dreidimensionalen Struktur mit einem
Bereich des Hüllproteins
IL-2 festgestellt hat, welche Strukturanalogie mit Hilfe einer in
vitro- und/oder in vivo-Kreuzreaktion festgestellt werden kann.
Die dreidimensionale Strukturanalogie zwischen bestimmten Bereichen
von zwei Proteinen bezieht sich auf äquivalente räumliche
Anordnungen von Aminosäureresten,
die ähnlich
sind insbesondere im Hinblick auf ihre Seitenkette und/oder ihre
analogen funktionellen chemischen Gruppen. Die dreidimensionalen
Strukturen von Proteinen können
mit Hilfe von kernmagnetischen Resonanzspektren (NMR) und/oder Röntgenbeugungsspektren
bestimmt werden. Beispielsweise wurde die Struktur des Proteins
gp41 von SIV mit Hilfe des NMR-Spektrums bestimmt (M. Caffrey et
al., J. Mol. Biol., 271 (1997), 819–826). Andererseits ist es
in bestimmten Fällen
möglich,
ein gutes Modell mit Hilfe von Molekularmodellisierungstechniken
zu erhalten ausgehend von den Atomkoordinaten eines Proteins bekannter
Struktur. Man kann hierzu beispielsweise das Molekularmodellprogramm X-plor
verwenden (Referenz: "A
system for X-ray crystallography and NMR, Version 3.1", Axel T. Brunger,
Yale University Press (1992)).
-
Zur
Untersuchung einer dreidimensionalen Strukturanalogie kann man beispielsweise
bekannte Methoden der Visualisierung und Überlagerung der dreidimensionalen
Struktur von biologischen Molekülen
auf einem graphischen Bildschirm anwenden. Es existieren Rechenprogramme,
welche die Visualisierung der dreidimensionalen Strukturen von Molekülen mit
unterschiedlichen Wiedergabearten, die Berechnung von geometrischen
Parametern (wie die Abstände,
Winkel, etc.) und die objektive und quantitative Überlagerung mehrerer
Molekülstrukturen
ermöglichen
(insbesondere die Programme RASMOL: R. A. Sayle und E. J. Milner-White,
J. Mol. Biol., 247 (1995), 536–540
und ANTHEPROT: C. Geourjon und G. Deléage, J. Mol. Graph., 13 (1995),
209–212)
sowie die Abschätzung
der Zugängigkeit
von Lösungsmitteln
(siehe das bereits erwähnte Programm
X-plor und CCP4: Collaborative Computational Project Number 4, Acta
Cryst., D50 (1994), 760–763).
-
Für eine feinere
Abschätzung
dieser Strukturanalogien ist es nützlich, im Bereich einer jeden
Aminosäure
die funktionellen Gruppen zu berücksichtigen,
die in analoger Weise an den beiden zu vergleichenden Proteinen
vorhanden sind. Hierzu haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung
Methoden angewandt, welche die Berechnung der Moleküloberflächen ermöglichen
mit dem Ziel, die funktionellen Eigenschaften zwischen zwei dreidimensionalen
Strukturen zu vergleichen, wobei nicht nur die Aminosäuren in
ihrer Globalität berücksichtigt
werden, sondern auch insbesondere die funktionellen chemischen Gruppen
jeder dieser Aminosäuren
(beispielsweise: Amid-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Aminfunktion,
etc.). Man kann in dieser Weise in den zu vergleichenden Strukturen
analoge Aminosäuren
und nicht nur identische Aminosäuren
berücksichtigen.
-
Ein
Bereich eines Retrovirusproteins gp41 besitzt demzufolge eine dreidimensionale
Strukturanalogie zu einem gegebenen Bereich eines Wirtsproteins
IL-2, wenn die erwähnten
Methoden in den zu vergleichenden Bereichen eine ähnliche
räumliche
Struktur bestimmter identischer oder funktionell analoger Aminosäuren nachzuweisen
ermöglichen.
-
Es
ist festzuhalten, dass die funktionell analogen und in ähnlicher
Weise im Raum angeordneten Aminosäuren in ein und derselben Peptidkette
relativ weit voneinander entfernt sein können. Die dreidimensionale Strukturanalogie
zwischen zwei zu vergleichenden Proteinen kann auch die ähnliche
Anordnung von identischen oder funktionell analogen Aminosäuren im
Raum betreffen oder, wenn eines der Proteine oligomerisiert ist,
können
die in Rede stehenden Aminosäurereste
auf verschiedenen Ketten des Oligomers vorliegen, während die
Aminosäurereste
des anderen Proteins, die an dieser Analogie beteiligt sind, auf
ein und derselben Peptidkette dieses anderen Proteins vorliegen
können.
-
Es
ist besonders vorteilhaft, die Analogien der dreidimensionalen Struktur
und/oder der Kreuzreaktionen mit den Bereichen des in Rede stehenden
Wirtsproteins IL-2 im Hinblick auf die Bindung dieses Proteins an
seinen Rezeptor zu untersuchen.
-
Zur
Herstellung des modifizierten Polypeptids, welches das nach der
vorliegenden Erfindung erhaltene impfende Mittel bildet, kann man
bekannte Methoden der Peptidsynthese oder der Gentechnik anwenden.
Man kann eine Polynucleotidsequenz, welche für mindestens einen Teil des
Hüllproteins
gp41 des Virus codiert, isolieren oder herstellen und man kann gewünschtenfalls
in diesem Stadium Mutationen in die Nucleotidsequenz einführen, welche
ein mutiertes Umsetzungsprodukt ergeben, welches das modifizierte
Polypeptid darstellt. Man kann auch direkt eine modifizierte Polynucleotidsequenz
synthetisieren, die eine oder mehrere Mutationen aufweist und für das modifizierte
Polypeptid codiert. Die in dieser Weise erhaltenen mutierten Polynucleotidsequenzen
werden in an sich bekannter Weise in einen geeigneten Vektor eingeführt und
ermöglichen
die Exprimierung des Polypeptids gegebenenfalls in modifizierter
Form. Ein solcher Vektor ist beispielsweise E. coli, ein Baculovirus
oder eine Säugerzelle.
Man kann die Mutation auch an einem nicht-modifizierten Polypeptid
durchführen,
welches man mit Hilfe der oben angegebenen Methoden erhalten hat.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet man mit "Mutation" jede Modifizierung
eines Bereichs (die gegebenenfalls auf einen einzigen Aminosäurerest
reduziert ist) eines Polypeptids, mit Hilfe von physikalischen Methoden,
chemischen Methoden (kovalente oder nicht-kovalente Modifizierung)
und/oder biologische Methoden (Mutationen durch Substitution, Deletion
und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren), die zu einer Modifizierung
des funktionellen Potentials des oder der konstitutiven Aminosäuren des Bereichs,
der als "mutierter
Bereich" bezeichnet
wird, führen.
Beispielsweise kann man Modifikationen durchführen, die zu einer Beseitigung,
Einführung
und/oder Modulierung von Eigenschaften von Disulfidbrücken, Wasserstoffbindungen,
elektrostatischen Wechselwirkungen und/oder hydrophoben Wechselwirkungen,
der Modifizierung der Fähigkeit
eines Proteins einen Heterokomplex zu bilden, oder im Fall eines
oligomeren Proteins zur Modifizierung des Oligomerisierungszustands
oder der Stabilität
des Oligomeren führen.
-
Die
Modifizierung einer Aminosäure
einer Polypeptidkette (einschließlich der Modifizierung einer
endständigen
Aminosäure
des in Rede stehenden Polypeptids) kann die Konformation von in
der Kette vorhandenen benachbarten Aminosäuren beeinflussen, einschließlich, wie
oben erwähnt,
der Konformation einer Aminosäure b, die von a durch eine Anzahl von Aminosäureresten,
die bis zu sieben oder acht betragen kann, getrennt ist, und wenn
die Aminosäure b Teil eines Epi tops bildet,
kann jede Modifizierung der Aminosäure a (insbesondere jede Hinzufügung eines
Substituenten oder eine jede Modifizierung eines Substituenten)
zu einer Modifizierung der Antigenizität des in Rede stehenden Epitops
führen.
-
In
der Phase der Suche von erfindungsgemäßen modifizierten Polypeptiden
kann die Auswahl der zu mutierenden Aminosäuren und/oder die Auswahl der
Mutationsmethoden beliebig begründet
sein. Man kann insbesondere mindestens eine der nachfolgenden Modifizierungsmethoden
anwenden:
- 1) Den Ersatz einer oder mehrerer
Aminosäuren
mit einer hydrophoben Seitenkette (Beispiele: Ala, Leu, Val, Ile,
Phe, Trp, Met, Tyr, Cys) durch eine oder mehrere Aminosäuren mit
einer hydrophilen Seitenkette (Beispiele: Arg, Asp, Asn, Glu, Gln,
Ser, Thr, His, Lys) oder mit einer indifferenten Seitenkette (Beispiele: Gly,
Pro) oder umgekehrt;
- 2) den Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren mit einer positiv geladenen
Seitenkette (Beispiele: Arg, Lys, His) durch eine oder mehrere Aminosäuren mit
einer negativ geladenen Seitenkette (Beispiele: Asp, Glu) oder neutraler
Seitenkette und vice versa;
- 3) die Einführung,
Beseitigung und/oder Modifizierung einer oder mehrerer Disulfidbrücken;
- 4) die Realisierung von Mimotopen, insbesondere durch Retro-Inversion
erhaltene;
- 5) den Ersatz, Beseitigung, Einführung und/oder andere Modifizierungen
mindestens einer Aminosäure,
die potentiell ein Donor oder Akzeptor von Wasserstoffbindungen
ist;
- 6) die Substitution, Beseitigung, Einführung und/oder andere Modifizierungen
mindestens einer Aminosäure,
die potentiell Donor oder Akzeptor von Ionenbindungen ist;
- 7) die Veränderung
der sterischen Hinderung durch Substitution, Beseitigung, Einführung und/oder
andere Modifizierungen einer oder mehrerer Aminosäuren;
- 8) die Verwendung von Aminosäuren,
die nicht-natürlich
in den Proteinen vorhanden sind;
- 9) die Modifizierung der Glykosylierung (Bildung, Beseitigung
oder Modifizierung von Glykosylierungsstellen und/oder deren assoziierten
Zuckern).
-
Es
versteht sich, dass die in dieser Weise erhaltenen modifizierten
Polypeptide in der oben angegebenen Weise geprüft werden zur Selektion von
modifizierten Polypeptiden, die eine Immunantwort induzieren, welche
gegen das Hüllprotein
gp41 und nicht gegen das Wirtsprotein IL-2 gerichtet ist.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann auf die Herstellung von Impfstoffen, insbesondere gegen die folgenden
Viren angewandt werden: HIV.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines modifizierten
Polypeptids der oben definierten Art für die Herstellung einer Impfzubereitung
zur Vorbeugung der pathogenen Wirkungen, die mit der Infektion eines
Wirts durch ein HIV-Retrovirus verbunden sind.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin eine Impfzubereitung, die mit Hilfe
des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten
werden kann und die als Wirkstoff ein modifiziertes Polypeptid der
oben beschriebenen Art enthält. Eine
solche Zubereitung kann bei einem Impfverfahren verwendet werden,
das darauf abzielt, den pathogenen Wirkungen von HIV-Retrovirus-Infektionen
vorzubeugen, wobei dieses Verfahren im wesentlichen darin besteht,
einem Wirbeltier, einschließlich
einem Menschen, ein modifiziertes Polypeptid, wie es oben definiert
ist, in einer ausreichenden Menge zur Erzielung einer solchen Impfwirkung
zu verabreichen. Die Formulierung der Impfzubereitungen und das
Verfahren zu ihrer Verabreichung sind an sich bekannt und werden
hier nicht näher erläutert.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin ein modifiziertes retrovirales Polynucleotid,
welches für
ein modifiziertes Polypeptid, wie es oben definiert worden ist,
codiert. Das modifizierte Polynucleotid kann in der oben angegebenen
Weise erhalten werden. Die Erfindung erstreckt sich auch auf einen
Expressionsvektor, in den das genannte modifizierte Polynucleotid
eingeführt
worden ist, welcher Expressionsvektor damit in der Lage ist, das
modifizierte Polypeptid zu exprimieren.
-
Das
erfindungsgemäß erhaltene
modifizierte Polypeptid kann auch als immunogenes Mittel dienen
dadurch, dass es durch Immunisierung die Bildung von Antikörpern induziert,
die insbesondere bei der Behandlung von Retrovirus-Infektionen geeignet
sind und die Erfindung betrifft demzufolge auch die als Antwort
auf die Immunisierung von Tieren (einschließlich Menschen) in vivo oder
in vitro mit Hilfe eines impfenden Mittels, welches ein modifiziertes
Polypeptid, wie es oben beschrieben worden ist, erhaltenen Antikörper. Die
erfindungsgemäßen Antikörper sind
insbesondere gereinigte polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper, welche
die Eigenschaft besitzen, das Retrovirus-Hüllprotein zu erkennen ohne
das Wirtsprotein zu erkennen. Die Reinigung der polyklonalen Antikörper und
die Selektion der monoklonalen Antikörper kann mit Hilfe des Virusproteins
und des Wirtsproteins erfolgen in der Weise, dass nur die Antikörper gewonnen
werden, welche das Virusprotein und nicht das Wirtsprotein erkennen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können insbesondere
bei der vorbeugenden Behandlung von Infektionen verwendet werden,
die an dem betreffenden Wirt durch das Retrovirus, gegen das sie
gerichtet sind, verursacht werden. Die Dosierung ist die für Antikörper übliche Dosierung.
Die solche Antikörper
enthaltenden pharmazeutischen Zubereitungen sind ebenfalls Gegenstand
der Erfindung.
-
Die
Beispiele verdeutlichen die Erfindung.
-
BEISPIEL 1
-
Im
folgenden sei erläutert,
wie die Autoren der vorliegenden Erfindung die strukturellen und
antigenen Analogien zwischen einem Virus-Hüllprotein, das heißt dem Protein
gp41 des HIV1 und eines Cytokins, das heißt humanes Interleukin-2 (abgekürzt: IL-2)
festgestellt haben.
-
Es
sei bemerkt, dass die Peptidsequenzen von gp41 und menschlichem
IL-2 nicht homolog sind. In der Tat besitzen die beiden Proteine
global untereinander nur eine Sequenzidentität von 16,5%, wobei diese Homologieschwelle
nicht signifikant ist, die man leicht mit Hilfe von in silico durchgeführten Simulationen
an Sequenzen der gleichen Zusammensetzung, bei denen jedoch die
Ordnung der Aminosäuren
willkürlich
modifiziert worden ist, feststellen kann.
-
Frühere Arbeiten
(Bost et al., Immunology 65 (1988), 611–615) haben eine Sequenzhomologie
zwischen dem Protein gp41 und IL-2 (Sequenz LERILL) gezeigt. Es
ist festzuhalten, dass diese Sequenz LERILL von gp41 keinen immunodominierenden
Bereich dieses Proteins darstellt; siehe J. A. LEVY, Microbiol.,
Rev., 57 (1993), 183–289,
insbesondere Seite 232. Die Sequenz LERILL befindet sich andererseits
im Inneren des Virusteilchens; sie entspricht dem C-terminalen Ende
von gp41.
-
Mit
der Feststellung, dass IL-2 und die mit AIDS assoziierten Retroviren
gemeinsame Targetzellen aufzuweisen scheinen, haben die Autoren
der vorliegenden Erfindung die Hypothese aufgestellt, dass der Rezeptor
für menschliches
Interleukin-2 dem IL-2 und dem Protein gp41 des HIV gemeinsam sein
könnte
und haben demzufolge nach dreidimensionalen Strukturanalogien zwischen
diesen beiden letzteren gesucht.
-
In
der vorliegenden Beschreibung sind die Numerierungen der Aminosäurereste
der Peptidsequenz von Interleukin-2 und von gp41 jene, die in der
Datenbank SWISSPROT (Version 34) benutzt werden.
-
Die
Peptidsequenzen von IL-2 und des Proteins gp41 sind bekannt. Im
Rahmen der vorliegenden Anmeldung sei auf die folgenden veröffentlichten
Sequenzen Bezug genommen:
- – Für IL-2: Datenbank SWISSPROT
(Version 34) Code IL2_HUMAN;
- – für gp41:
Datenbank SWISSPROT (Version 34) Code ENV_HV1BR.
-
Die
verwendeten publizierten Strukturen sind die folgenden:
- – Für IL-2:
Datenbank PDB (Brookhaven Databank) 1IRL;
- – für gp41:
Datenbanken PDB (Brookhaven Databank)
- – 1AIK,
- – 1ENV.
-
Weiterhin
ist die durch NMR bestimmte dreidimensionale Struktur von IL-2 bekannt
(P. C. Mott et al., J. Mol. Biol., 248 (1995), 979), ebenso wie
die Struk tur in bestimmten Bereichen des Proteins gp41, welche mit
Hilfe des Röntgenbeugungsspektrums
bestimmt wurde (D. C. Chan et al., Cell, 89 (1997), 263–273; W. Weissenhorn
et al., Nature, 387 (1997), 426–430).
Andererseits wurde ein dreidimensionales Modell eines Teils der
externen Domäne
im Bereich 545–671
des Proteins gp41 (trimere Form) von den Erfindern der vorliegenden
Erfindung durch Molekülmodellisierung
ermittelt. Dieses Molekülmodell
wurde erhalten unter Verwendung des Programms X-plor mit Hilfe einer
Strategie, die ähnlich
jener ist der Molekülmodellisierung
unter den Einschränkungen
des NMR. Die für
die Molekülmodellisierung
der trimeren Form erforderlichen Einschränkungen wurden abgeleitet von
der dreidimensionalen Struktur der Mutante pII der Domäne "Leucine zipper" des Proteins GCN4
(Code PDB: 1GCM), die in Form eines Trimeren des Typs "Coiled coil" kristallisiert wurde.
-
Durch
Untersuchung der erhaltenen Strukturen wurden dreidimensionale Analogien
zwischen bestimmten Bereichen des Proteins gp41 und bestimmten Bereichen
von Interleukin-2, die an der Bindung an seinen Rezeptor teilnimmt,
gefunden. Der Bindungsmodus von IL-2 an seinen Rezeptor sowie die
bei dieser Bindung beteiligten Bereiche von IL-2 sind in der Tat
bekannt; siehe J. F. BAZAN, P.N.A.S. USA 87 (1990), 6934–6938; P.
Bamborough et al., Structure, 2 (1994), 839–851; J. R. Gnarra et al.,
P.N.A.S. USA 87 (1990), 3440–3444;
T. Takeshita et al., Science, 257 (1992), 379–382; und J. M. CAVAILLON,
Les Cytokines (Masson, Paris, 1996), Seiten 119–125.
-
Diese
Ergebnisse wurden durch globale Vergleichsuntersuchungen der Strukturen
von gp41 und von IL-2 und durch lokale Untersuchungen bestätigt, die
sich insbesondere für
die analogen funktionellen Gruppen jeder der Strukturen interessieren,
wie es oben bereits beschrieben worden ist.
-
Es
wurde insbesondere gefunden, dass die Bereiche 53–61 und
88–93
von IL-2, die in Form einer Alpha-Helix organisiert sind, sich in
zufriedenstellender Weise mit zwei der drei Helizes des zentralen
Trimeren von gp41 überlagern.
Dies lehrt, dass bei den beiden Proteinen die von den verschiedenen
Helizes getragenen Gruppierungen relativ vergleichbare Eigenschaften
bezüglich
der Zugänglichkeit
und der Organisation besitzen.
-
Es
wurden weiterhin lokale dreidimensionale Strukturanalogien zwischen
einem stark konservierten immunodominanten Bereich des Glykoproteins
gp41 des HIV (genauer in dem Bereich von 545–682) und menschlichem Interleukin-2
gefunden.
-
Die
Peptidsequenz des Bereichs 545–682
des Proteins gp41 von HIV1 (Datenbank SWISSPROT: ENV_HV1BR) ist
in der beigefügten
Tabelle 3 wiedergegeben.
-
In
der beigefügten
Tabelle 3bis sind die Peptidsequenzen von vier Abschnitten dieses
Bereichs von gp41 (555–577,
572–601,
590–620
und 628–663)
wie dergegeben, in denen man Strukturanalogien und/oder Kreuzreaktionen
mit IL-2 festgestellt hat.
-
Die
Abschnitte von IL-2, welche die erwähnten Strukturanalogien betreffen,
sind die Abschnitte 27–47, 45–69, 99–121 und
131–153
von IL-2. Die Peptidsequenzen dieser Abschnitte sind in der folgenden
Tabelle 4 angegeben.
-
Es
ist wesentlich, dass der Abschnitt 27–47 von IL-2 an der Bindung
von IL-2 an der Betakette seines Rezeptors beteiligt ist. In der
Tat gehören
die Aminosäuren
des Abschnitts 27–47
der Helix A an, die an der Bindung an den Rezeptor IL-2 (RIL-2),
genauer an dem beta-RIL-2, teilnimmt.
-
Die
Aminosäuren
des Abschnitts 45–69
gehören
einem Bereich von IL-2 an, der an der Bindung an alpha-RIL-2 beteiligt
ist.
-
Die
Aminosäuren
in dem Abschnitt 99–121
gehören
der Helix E an, die an der Bindung an beta-RIL-2 beteiligt ist.
-
Die
Aminosäuren
in dem Abschnitt 131–153
von IL-2 gehören
der Helix F an, die an der Bindung an gamma-RIL-2 teilnimmt.
-
Zur
Erläuterung
sind in der beigefügten
Tabelle 4bis die Strukturanalogien dargestellt, welche zwischen
dem Abschnitt 572–601
von gp41 und dem Abschnitt 27–47
von menschlichem IL-2 vorliegen. Die an dieser dreidimensionalen
Strukturanalogie beteiligten externen Aminosäuren sind in der Tabelle 4bis
unterstrichen.
-
Es
sei festgehalten, dass ein und derselbe Abschnitt von gp41 dreidimensionale
Strukturanalogien mit mehreren unterschiedlichen Abschnitt von IL-2
aufweisen kann.
-
Weiterhin
haben die Autoren der Erfindung festgestellt, dass in dem Abschnitt
600–612
von gp41 die drei Lysine (K) in Position 606 an den drei primären Ketten
von gp41 ein Konformationsepitop bilden können und diese Lysine von gp41
im Raum den Lysinen 52, 96 und 55 von IL-2 entsprechen können.
-
Es
wurden weiterhin immunologische Kreuzreaktivitäten zwischen den Proteinen
gp41 und IL-2 festgestellt. Insbesondere konnte unter Anwendung
der Methoden ELISA und PEPSCAN unter Verwendung von durch Immunoreinigung über einer
immobilisiertes menschliches IL-2 enthaltenden Säule gereinigten Antikörpern aus
HIV+-Seren festgestellt werden, dass bestimmte dieser Antikörper die
Abschnitte von IL-2 erkennen, die bei der Bindung von IL-2 an den
alpha-, beta- und
gamma-Ketten seines Rezeptors beteiligt sind und insbesondere an
den Abschnitten, die der Helix A (KTQLQLEHLLLTLQ), der Helix E RPRDLISNINVIVLELK,
der Helix F (TIVEFLNRWITFCQSIISTLT), der Brücke AB und dem Beginn der Helix
B (NNYKNPKLTRMLTFKFYMFKK) beteiligt sind.
-
Unter
Anwendung der Punktabscheidungstechniken auf Filter (oder "Dot") und Immunotransfertechniken
des Typs Western Blot konnte weiterhin ge zeigt werden, dass polyklonale
Antikörper,
die von Seren von HIV+-Kranken stammen und über menschlichem IL-2 immunogereinigt
worden sind, die Oligomeren des Proteins gp41 erkennen.
-
Die
durchgeführten
Untersuchungen haben weiter gezeigt, dass die murinen und menschlichen
monoklonalen Anti-gp41-antikörper,
die gegen die konservierten immunodominierenden Bereiche des Proteins gp41
von HIV gerichtet sind, die Bereiche von IL-2 erkennen, die an der
Bindung dieses letzteren an den alpha-, beta- und gamma-Ketten des
Rezeptors von IL-2 teilnehmen.
-
Man
kann demzufolge erfindungsgemäß Impfstoffe
gegen das HIV-Virus gewinnen insbesondere durch Herstellung der
Polypeptide, die mindestens einen der in der Tabelle 3bis beschriebenen
Abschnitte von gp41 enthalten, welche Polypeptide in modifizierter
Form vorliegen, das heißt,
mindestens eine Mutation aufweisen, wie es oben beschrieben worden
ist. Es ist festzuhalten, dass die Aufspaltung des Bereichs 545–682 in
Abschnitte einen gewissen willkürlichen
Charakter aufweisen können,
was der Grund dafür
ist, dass bestimmte angegebene Abschnitte sich überschneiden können.
-
BEISPIEL 2 = Mutationen
an gp41 von HIV1.
-
Man
bereitet unter Anwendung bekannter Verfahrensweisen mutierte Hüll-Glykoproteine
von gp41. Diese Mutationen sind in der beigefügten Tabelle 5 dargestellt,
welche die betreffende Sequenz von gp41 wiedergibt und unter dieser
Sequenz ausgerichtet die mutierten Sequenzen. Das Ausmaß der Mutationen
ist durch Unterstreichen der betreffenden Aminosäuren hervorgehoben.
-
Man
bereitet Impfstoffzubereitungen, die jeweils in wässriger,
steriler und pyrogenfreier Salzlösung
eines der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen mutierten gp41-Proteine
enthalten.
-
Man
immunisiert Kaninchen oder Mäuse
mit den erhaltenen mutierten Proteinen und untersucht, ob die durch
diese Tiere entwickelten Antikörper
menschliches Interleukin-2 erkennen oder nicht erkennen, beispielsweise
unter Verwendung der ELISA- oder PEPSCAN-Technik. Man selektioniert
die mutierten Proteine, welche die Bildung von Antikörpern induzieren,
die IL-2 nicht erkennen, jedoch das Protein gp41 erkennen.
-
Die
PEPSCAN-Technik ist beschrieben worden von J. WORTHINGTON und K.
MORGAN, "Epitope mapping
using synthetic peptides",
in "PEPTIDE ANTIGENS – A practical
approach" (G. B.
WISDOW Hrgb.), Oxford University Press (1994). TABELLE
1
- EIAV
- steht für das Virus
der infektiösen
Pferdeanämie
- CAEV
- steht für das Virus
der Ziegenenzephalitis
- FIV
- steht für das Katzen-Immunodefizienzvirus
- SIV
- steht für das Affen-Immunodefizienzvirus
- HIV
- steht für das menschliche
Immunodefizienzvirus
TABELLE
2a TABELLE
2a (Fortsetzung) TABELLE
2b TABELLE
2c TABELLE
3 gp41
(Bereich 545–682) TABELLE
3bis Abschnitte
von gp41 | |
Abschnitt
555–577 | QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG |
Abschnitt
572–601 | QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW |
Abschnitt
590–620 | RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Abschnitt
628–663 | WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ |
TABELLE
4 TABELLE
4Bis TABELLE
5 Mutationen
im Bereich des Abschnitts 555–577 Abschnitt
555–577 | QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG |
Mutation
1: | QQQNNLLAAIEAQQHLLQLTVWG |
Mutation
2: | QQQNNLLRAIERQQHLLQLTVWG |
Mutation
3: | QQQNNLLAAIERQQHLLQLTVWG |
Mutation
4: | QQQNNLLRAIEAQQELLQLTVWG |
Mutation
5: | QQQNNLLRAIEAQQQLLQLTVWG |
Mutation
6: | QQQNNLLRAIEAQQHLLRLTVWG |
Mutation
7: | QQQNNLLRAIEAQQHLLKLTVWG |
Mutation
8: | QQQNNLLRAIEAQQQLLKLTVWG |
TABELLE
5 (Fortsetzung) Mutationen
im Bereich des Abschnitts 572–601 Abschnitt
572–601 | QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW |
Mutation
1: | QLTVWGIKQLQARILAVERYLKAQQLLGIW |
Mutation
2: | QLTVWGIKQLQARILAVEAYLKDQQLLGIW |
Mutation
3: | QLTVTWGIKQLQARILAVEAYLKAQQLLGIW |
Mutation
4: | QLTVWGIKQLQARILAVEDYLKRQQLLGIW |
Mutation
5: | QLTVWGIKQLQARITAVERYLKDQQLLGIW |
Mutationen
im Bereich des Abschnitts 590–620 Abschnitt
590–620 | RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
1: | KYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
2: | RYLKDQALLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
3: | RYLKDQQQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
4: | RYLKDQAQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
5: | RYLKDQARLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
6: | RYLKDQQLLNSWGCSGKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
7: | RYLKDQQLLGIWGCSQKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
8: | RYLKDQQLLGIWGCSFKLICTTAVPWNASWS |
Mutation
9: | RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSS |
Mutation
10: | RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNADTL |
Mutation
11: | RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNATNR |
Mutation
12: | RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTR |
Mutation
13: | RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTS |
Mutationen
im Bereich des Abschnitts 628–663 Abschnitt
628–663 | WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ |
Mutation
1: | WNNMTWMEWDREINNYESLIHSLIEESQNQQEKNEQ |
Mutation
2: | WNNMTWMEWDREINNYTSNIHSLIEESQNQQEKNEQ |