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Numero di pubblicazioneEP1129195 A2
Tipo di pubblicazioneRichiesta
Numero domandaEP19990950875
numero PCTPCT/FR1999/002643
Data di pubblicazione5 set 2001
Data di registrazione28 ott 1999
Data di priorità30 ott 1998
Pubblicato anche comeCA2349495A1, DE69941099D1, EP1475441A2, EP1475441A3, EP1475441B1, EP1724352A2, EP1724352A3, EP2100960A2, EP2100960A3, US6835384, US7384768, US7704513, US8309100, US20050032103, US20090155886, US20100184639, WO2000026375A2, WO2000026375A3
Numero di pubblicazione1999950875, 99950875, 99950875.7, EP 1129195 A2, EP 1129195A2, EP-A2-1129195, EP1129195 A2, EP1129195A2, EP19990950875, EP99950875, PCT/1999/2643, PCT/FR/1999/002643, PCT/FR/1999/02643, PCT/FR/99/002643, PCT/FR/99/02643, PCT/FR1999/002643, PCT/FR1999/02643, PCT/FR1999002643, PCT/FR199902643, PCT/FR99/002643, PCT/FR99/02643, PCT/FR99002643, PCT/FR9902643
InventoriLuc Aujame, Annabelle Bouchardon, Xavier Nassif, Agnès PERRIN, Geneviève RENAULD-MONGENIE, Bachra Rokbi, Colin Tinsley
CandidatoAventis Pasteur, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) (E.P.S.T.)
Esporta citazioneBiBTeX, EndNote, RefMan
Link esterni:  Espacenet, Registro dei brevetti europei
Nucleic acids and polypeptides specific of the neisseria genus pathogenic strains
EP 1129195 A2 (testo da WO2000026375A2) 
Estratto  
The invention concerns nucleic acids coding for polypeptides specific of the Neisseria genus pathogenic strains, the corresponding polypeptides, and their diagnostic and therapeutic applications.
Rivendicazioni  tradotto da: francese  (il testo OCR potrebbe contenere errori)

REVENDICATIONS CLAIMS

1. 1. Acide nucléique sous forme isolée, codant pour un polypeptide spécifique des souches pathogènes du genre Neisseria, ou fragment antigénique de celui-ci à l'exclusion des séquences SEQ ID n°70A, 73A, 74A, 77A, 80A, 81 A, 87A, 88A, 89A, 94A, 95A et 98A, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide spécifique étant identique ou homologue d'une séquence choisie parmi les séquences du groupe II, le groupe II étant constitué par les séquences SEQ ID n°2 à SEQ ID n°52 (numéros pairs) et la séquence SEQ ID n°53. In isolated nucleic acid encoding a polypeptide specific to pathogenic strains of the genus Neisseria or antigenic fragment thereof, excluding sequences SEQ ID No. 70A, 73A, 74A, 77A, 80A, 81A, 87A form 88A, 89A, 94A, 95A and 98A, the amino acid sequence of said specific polypeptide is identical with or homologous to a sequence selected from the sequence of the group II, group II consisting of the sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 52 (even numbers) and the sequence SEQ ID No. 53.

2. 2. Acide nucléique selon la revendication 1 dont la séquence nucléotidique est identique ou homologue d'une séquence choisie parmi les séquences du groupe I, le groupe I étant constitué par les séquences SEQ ID n°1 à SEQ ID n°51 (numéros impairs). Nucleic acid according to claim 1 wherein the nucleotide sequence is identical or homologous to a sequence selected from the sequence group I, group I consisting of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 51 (odd numbers).

3. 3. Acide nucléique selon la revendication 1 codant pour un polypeptide spécifique des souches pathogènes du genre Neisseria, ou fragment antigénique de celui-ci, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide spécifique étant choisie parmi les séquences SEQ ID n° 55 à 77 (numéros impairs). Nucleic acid of claim 1 encoding a polypeptide specific to pathogenic strains of the genus Neisseria or antigenic fragment thereof, the amino acid sequence of said specific polypeptide is selected from the sequences SEQ ID NO: 55-77 (odd numbers ).

4. 4. Acide nucléique selon la revendication 3, ayant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID n° 54 à 7£ (numéros pairs). Nucleic acid according to claim 3 having a nucleotide sequence selected from the sequences SEQ ID No. 54-7 E (even numbers).

5. 5. Polypeptide spécifique des souches pathogènes du genre Neisseria, et fragments antigéniques de celui-ci, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide spécifique étant identique ou homologue d'une séquence choisie parmi les séquences du groupe II, constitué par les séquences SEQ ID n°2 à SEQ ID n°52 (numéros pairs) et la séquence SEQ ID n°53. Polypeptide specific for pathogenic strains of the genus Neisseria, and antigenic fragments thereof, the specific amino acid sequence of said polypeptide being identical or homologous to a sequence selected from the group II sequence, consisting of the sequences SEQ ID NO: 2 to SEQ ID No. 52 (even numbers) and the sequence SEQ ID No. 53.

6. 6. Polypeptide selon la revendication 5 spécifique des souches pathogènes du genre Neisseria, et fragments antigéniques de celui-ci, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide spécifique étant choisie parmi les séquences SEQ ID n 5 55 à 77 (numéros pairs). Polypeptide according to claim 5 specific pathogenic strains of the genus Neisseria, and antigenic fragments thereof, the amino acid sequence of said specific polypeptide being chosen from the sequences SEQ ID No. 5 from 55 to 77 (even numbers).

7. 7. Vecteur d'expression comprenant comprenant une cassette d'expression dans laquelle une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 est placée dans des conditions permettant son expression dans une cellule hôte. Comprising an expression vector comprising an expression cassette wherein a nucleotide sequence as defined in any of claims 1 to 4 is placed under conditions allowing its expression in a host cell.

8. 8. Cellule hôte transformée par le vecteur d'expression selon la revendication 7. Host cell transformed with the expression vector of claim 7.

9. 9. Composition pharmaceutique comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, sous forme nue ou en association avec au moins un agent facilitant la transfection ; b) ou un vecteur vaccinal comprenant une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4, tel que notamment un virus ou une bactérie ; c) ou un polypeptide selon l'une des revendications 5 ou 6 ; éventuellement en association avec un véhicule pharmaceuti- quement acceptable. A pharmaceutical composition comprising: a) a nucleic acid according to any one of claims 1 to 4, in naked form or combined with at least one transfection facilitating agent b) or a vaccine vector comprising a nucleotide sequence as defined in the one of claims 1 to 4, in particular as a virus or a bacterium, c) or a polypeptide according to any one of claims 5 or 6, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

10 . 10. Anticorps monospécifique dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 5 ou 6. Monospecific antibody directed against a polypeptide according to one of claims 5 or 6.

il . there. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications Use of a nucleic acid according to one of claims

1 à 4 ou d'un polypeptide spécifique des souches pathogènes de Neisseήa ou de fragments antigéniques de celui-ci selon l'une des revendications 5 ou 6 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à la vaccination contre Neisseήa. 1 to 4 or a polypeptide specific to the pathogenic strains Neisseήa or antigenic fragments thereof according to one of Claims 5 or 6 for the manufacture of a pharmaceutical composition for vaccination against Neisseήa.

Descrizione  tradotto da: francese  (il testo OCR potrebbe contenere errori)

Acides nucléiques et polypeptides spécifiques des souches pathogènes du genre Neisseria . Nucleic acids and polypeptides specific pathogenic strains of the genus Neisseria.

La présente invention a trait à des acides nucléiques codant pour des polypeptides spécifiques des souches pathogènes du genre Neisseria, notamment utiles pour prévenir ou traiter une infection par Neisseria meningitidis. The present invention relates to nucleic acids encoding polypeptides specific pathogenic strains of the genus Neisseria, particularly useful for preventing or treating infection by Neisseria meningitidis. D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne. In general, meningitis is either viral or bacterial origin. Les bactéries principalement responsables sont : Haemophilus influenzae de type b, Neisseria meningitidis et Streptococcus pneumoniae. The bacteria mainly responsible are Haemophilus influenzae type b, Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae. L'espèce Neisseria meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides capsulaires. The species Neisseria meningitidis is subdivided into serogroups according to the nature of the capsular polysaccharides. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90% des cas de méningites sont attribuables à trois sérogroupes : A, B et C. Although there are a dozen serogroups, 90% of cases of meningitis are caused by three serogroups: A, B and C.

Il existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à Neisseria meningitidis sérogroupes A et C. There are effective vaccines based on capsular polysaccharides to prevent meningitis caused by Neisseria meningitidis serogroups A and C. Ces polysaccharides tels quels ne sont que peu ou pas immunogènes chez les enfants de moins de deux ans et n'induisent pas de mémoire immunitaire. These polysaccharides which are such that little or no immunogenic in children less than two years and do not induce immunological memory. Toutefois, ces inconvénients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse. However, these disadvantages can be overcome by conjugating the polysaccharide to a carrier protein.

En revanche, le polysaccharide de Neisseria meningitidis sérogroupe B n'est pas ou peu immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non. In contrast, the polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup B is not or poorly immunogenic in humans, whether or not combined form. Ainsi il apparaît hautement souhaitable de rechercher un vaccin à encontre des méningites causées par Neisseria meningitidis, notamment du sérogroupe B, autre qu'un vaccin à base de polysaccharide. So it is highly desirable to find a vaccine against meningitis caused by Neisseria meningitidis serogroup B in particular, other than polysaccharide vaccine.

A cette fin, différentes protéines de la membrane externe de N. To this end, various proteins of the outer membrane of N. meningitidis ont déjà été proposées, telles que le récepteur membranaire de la transferrine humaine (WO 90/12591 et WO93/06861). meningitidis have been proposed, such as the membrane receptor of human transferrin (WO 90/12591 and WO93/06861).

Neisseria meningitidis est génétiquement très proche de Neissena gonorrhoeae et Neisseria lactamica. Neisseria meningitidis is genetically very close to Neissena gonorrhoeae and Neisseria lactamica. N. N. gonorrhoeae est surtout responsable d'infections localisées dans le tractus urogénital. gonorrhoeae is mainly responsible for localized infections in the urogenital tract. Elle colonise la muqueuse génitale, puis traverse l'épithélium, envahit ensuite le sous-épithéiium où elle se multiplie et est responsable d'une forte réaction inflammatoire. It colonizes the genital mucosa, then crosses the epithelium, then invaded the sub-épithéiium where it multiplies and causes a strong inflammatory reaction. Par contre, N. By cons, N. lactamica est considérée comme une espèce non pathogène. lactamica is considered a non-pathogenic species.

Des séquences présentes chez N. Sequences present in N. gonorrhoeae et N. N. gonorrhoeae and meningitidis, absentes de N. meningitidis, N. absent lactamica ont été divulguées dans la demande de brevet WO 98/02 547, mais cette demande de brevet antérieure ne localise pas et n'identifie pas les séquences codantes. lactamica were disclosed in the patent application WO 98/02547, but the earlier patent application does not locate and does not identify the coding sequences.

Les auteurs de la présente invention sont maintenant parvenus à identifier certains de ces gènes en recherchant dans le génome du méningoccoque, les cadres de lecture ouverts spécifiques des souches pathogènes du genre Neisseria, en mettant en oeuvre la stratégie suivante : The authors of the present invention will now be able to identify some of these genes by searching the genome méningoccoque the ORFs specific pathogenic strains of the genus Neisseria, by implementing the following strategies:

Certaines des séquences divulguées dans la demande de brevet WO98/02547 (désignées dans ladite demande antérieure SEQ ID n° 66, 67, 69, 70, 72 à 96, 98, et 99), ont été positionnées sur la séquence du génome de la souche N. Some of the sequences disclosed in the patent application WO98/02547 (referred to in the said earlier application SEQ ID NO: 66, 67, 69, 70, 72, 96, 98, and 99) were positioned on the genome sequence of the strain N. meningitidis de sérogroupe B (ATCC 13090), disponible à partir de la banque Pathoseq® d'Incyte Pharmaceuticals ainsi que sur la séquence du génome de la souche Neisseria meningitidis Z2491 (Sanger Center). meningitidis serogroup B (ATCC 13090), available from the bank Pathoseq of Incyte Pharmaceuticals ® and the genome sequence of Neisseria meningitidis strain Z2491 (Sanger Center). Ceci a permis d'identifier, dans le génome de N. This identified in the genome of N. meningitidis qui compte 2,3 Méga bases, 19 contigs représentant 220 000 paires de bases. meningitidis has 2.3 Mega bases, 19 contigs representing 220,000 base pairs.

Les auteurs de la présente invention ont ensuite analysé, pour chacun des 19 contigs, la présence de phases de lecture ouvertes (" open reading frames-ORF "), contenant au moins 100 acides aminés (et par définition, bornées par un codon d'initiation et un codon stop), à l'aide du logiciel Gène Jockey II séquence processor (Biosoft). The authors of the present invention were then analyzed for each of the 19 contigs, the presence of open reading frames ("open reading frames, ORF"), containing 100 amino acids (and by definition, bounded by a codon initiation and stop codon) using the Gene Jockey II software sequence processor (Biosoft). Cette analyse a permis de sélectionner environ 400 ORFs candidates. This analysis was used to select approximately 400 ORFs candidates.

Les séquences de chacune de ces ORFs ont ensuite été The sequences of each of these ORFs were then

(R) analysées à l'aide du logiciel Codon Use (Conrad Halling), qui tient compte de la fréquence d'utilisation des codons chez N. (R) analyzed using the software Codon Use (Conrad Halling), which takes into account the frequency of codon usage in N. meningitidis. meningitidis. N'ont été retenues que les ORFs dont les séquences présentent une fréquence d'utilisation maximale de ces codons. Have been identified as the ORFs whose sequences have a maximum frequency of use of these codons. A l'issue de cette analyse, 197 ORFs candidates ont été retenues. Following this analysis, 197 candidates were selected ORFs.

Les ORFs sélectionnées par cette double analyse ont été soumises à une recherche d'homologies sur l'ensemble des banques ORFs selected by this double analysis were subjected to a homology search of all banks

(S) disponibles à l'aide du programme BLASTX depuis l'accès à la banque Pathoseq® d'Incyte Pharmaceuticals. (S) available using the BLASTX program for access to bank Pathoseq ® Incyte Pharmaceuticals. Cette recherche d'homologies a permis d'exclure les ORFs codant a priori pour des protéines cytoplasmiques ou périplasmiques, en particulier des protéines du métabolisme. The homology search allowed to exclude a priori ORFs coding for periplasmic or cytoplasmic proteins, especially protein metabolism. Les ORFs ont également été soumises à une analyse des motifs protéiques éventuels, à The ORFs were also subjected to analysis of protein patterns possible in

(R) l'aide du programme Protean de DNA Star (Lasergene software). (R) using the Protean program of DNA Star (Lasergene software).

Les auteurs de la présente invention ont ensuite recherché si les ORFs retenues à l'issue de l'étape précédente (au nombre de 118) étaient effectivement absentes de N. The authors of the present invention were then investigated whether the ORFs selected at the end of the previous step (numbering 118) were actually absent from N. lactamica, comme le prévoyait la demande de l'art antérieur WO 98/02547. lactamica, as provided in the prior art application WO 98/02547.

A cette fin, une amplification par PCR a été mise en œuvre. To this end, a PCR amplification was implemented. Cette amplification s'est révélée inopérante pour 78 des 118 ORFs testées. This amplification has proved ineffective for 78 of the 118 ORFs tested. Seules les ORFs pour lesquelles l'amplification chez N. Only ORFs for which amplification in N. lactamica était négative (séquences appelées "lactamica " ") ont été retenues. Afin de vérifier que ces résultats négatifs n'étaient pas des " faux-négatifs ", les séquences lactamica " retenues ont été soumises à un contrôle par dot blot. lactamica was negative (sequences called "lactamica" ") were selected. To verify that these negative results were not" false-negative "sequences lactamica" deductions were subject to control by dot blot. A l'issue de cette étape, seules 23 ORFs ont été confirmées N. After this step, only 23 ORFs were confirmed N. meningitidis /N. meningitidis / N. lactamica ' . lactamica '. Enfin, ces 23 ORFs ont été repositionnées dans leur ensemble sur le génome de N. Finally, these 23 ORFs were repositioned in the whole genome of N. meningitidis ATCC13090. ATCC13090 meningitidis. Ceci a permis de mettre en évidence que trois ORFs préalablement éliminées sur la base de leur fonction protéique putative, apparaissaient localisées à proximité ou même encadrées par certaines des 23 ORFs N. This helped highlight three ORFs previously eliminated on the basis of their putative protein function, appeared localized close to or even framed by some of the 23 ORFs N. meningitidis / N. meningitidis / N. lactamica ' . lactamica '. Ces trois ORFs (SEQ ID n° 29, 35 et 37) ont été réintroduites dans l'étude, et il s'est avéré qu'elles étaient elles aussi N. These three ORFs (SEQ ID NO: 29, 35 and 37) were reintroduced into the study, and it turned out they were also N. meningitidis / N. meningitidis / N. lactamica ' . lactamica '.

Les auteurs de la présente invention ont ensuite cherché à savoir si les ORFs identifiées à partir du génome de la souche N. The authors of the present invention were then investigated whether the identified ORFs from the genome of strain N. meningitidis de sérogroupe B ATCC 13090 étaient aussi présentes dans les génomes de N. meningitidis serogroup B ATCC 13090 were also present in the genomes of N. meningitidis Z2491 (Sanger Center) de sérogroupe A et de N. meningitidis Z2491 (Sanger Center) serogroup A and N. gonorrhoeae FA1090 (Advanced Center of Génome Technology, Oklahoma University).Puis ils ont comparé les séquences dérivées de ces différents génomes, par alignement multiple (Clustal, Infobiogen). gonorrhoeae FA1090 (Advanced Center of Genome Technology, Oklahoma University). then they compared the sequences derived from these genomes using multiple alignment (Clustal Infobiogen). Ceci a permis de redéfinir pour certaines des ORFs la position la plus probable des codons d'initiation et de fin de traduction. This helped to redefine some of the ORFs most probable position of codons and translation termination. Les séquences des cadres de lecture ouverts issues de la souche ATCC13090 sont données dans les SEQ ID N° 1 - 51 (numéros impairs) et les séquences d'acides aminés qui en sont déduites, dans les SEQ ID N° 2 - 52 (numéros pairs). The sequences of the open reading frames from the strain ATCC13090 are shown in SEQ ID NO: 1 - 51 (odd numbers) and the amino acid sequences derived therefrom, in SEQ ID No. 2 - 52 (numbers peers). La présente invention a donc pour objet un acide nucléique sous forme isolée codant pour un polypeptide, ou un fragment antigénique de celui- ci à l'exclusion des acides nucléiques divulgués dans les SEQ ID n° 70, 73, 74, 77, 80, 81 , 87, 88, 89, 94, 95 et 98 de la demande WO 98/02547 (séquences annexées à la présente description et numérotées SEQ ID n° 70A, 73A, 74A, 77A, 80A, 81 A, 87A, 88A, 89A, 94A, 95A, 98A pour les distinguer des séquences de l'invention) ; ledit polypeptide ayant une séquence d'acides aminés qui est identique ou homologue à une séquence choisie parmi celles du groupe II ; le groupe II étant constitué par les séquences montrées dans les SEQ ID n° 2 - 52 (numéros pairs) et la séquence SEQ ID n°53. The present invention thus relates to a nucleic acid in isolated form encoding a polypeptide, or an antigenic fragment thereof to the exclusion of the nucleic acids disclosed in SEQ ID Nos 70, 73, 74, 77, 80, 81, 87, 88, 89, 94, 95 and 98 of WO 98/02547 (sequences appended to this description and numbered SEQ ID NO: 70A, 73A, 74A, 77A, 80A, 81A, 87A, 88A, 89A, 94A, 95A, 98A in order to distinguish the sequences of the invention), said polypeptide having an amino acid sequence which is identical or homologous to a sequence selected from those of group II, group II consisting of the sequences shown in SEQ ID No. 2 - 52 (even numbers) and the sequence SEQ ID No. 53.

De manière préférentielle, ledit acide nucléique peut avoir une séquence nucléotidique choisie parmi celles du groupe I, le groupe I étant constitué par les séquences montrées dans les SEQ ID n°1-51 (numéros impairs). Preferably, said nucleic acid can have a nucleotide sequence selected from those of group I, group I consisting of the sequences shown in SEQ ID Nos. 1-51 (odd numbers).

Le terme « acide nucléique » inclut et signifie également ORF, gène, polynucléotide, ADN et ARN. The term "nucleic acid" also means and includes ORF, gene, polynucleotide, DNA and RNA. Le terme « acide nucléique sous forme isolée » signifie un acide nucléique séparé de l'environnement biologique dans lequel il se trouve dans des conditions naturelles. The term "nucleic acid isolated form" means a nucleic acid separated from the biological environment in which it is found in natural conditions. Par exemple, une molécule d'ADN existe dans des conditions naturelles lorsqu'elle se trouve intégrée dans un génome ou bien lorsqu'elle fait partie d'une banque de gènes. Example, a DNA molecule exists in natural conditions when it is integrated into the genome or when part of a gene bank. Dans ce cas là, elle ne peut être sous forme isolée. In this case, it may be in isolated form. Par contre, la même molécule séparée du génome par clonage (par exemple suite à une amplification par PCR) doit être considérée comme étant sous forme isolée. For cons, the same molecule separated by cloning the genome (eg due to amplification by PCR) should be considered as isolated. De manière typique, une molécule d'ADN sous forme isolée, ne contient pas les régions codantes qui lui sont contiguës en 5' et 3' dans le génome dont elle est issue. Typically, a DNA molecule in isolated form, does not contain coding regions which are adjacent 5 'and 3' in the genome from which it originated. Les acides nucléiques sous forme isolée peuvent être intégrés dans des vecteurs (par exemple plasmides or vecteurs viraux ou bactériens) sans pour cela se départir de leur caractéristique d'être séparés de leur environnement naturel. Nucleic acids in isolated form can be incorporated into vectors (eg plasmids or viral or bacterial vectors) without thereby departing from their characteristic of being separated from their natural environment.

Les auteurs de la présente invention ont plus particulièrement trouvé que les ORFs qui, lorsqu'elles étaient issues de la souche ATCC 13090, étaient caractérisées par les séquences telles montrées dans les SEQ ID n° 19, 27, 39, 45, 47 et 49, étaient spécifiques de Neisseria meningitidis dans la mesure où il n'a pas été possible de mettre en évidence des séquences identiques ou homologues dans le génome de N. The authors of the present invention have particularly found that ORFs that when they were derived from strain ATCC 13090 were characterized by the sequences as shown in SEQ ID NO: 19, 27, 39, 45, 47 and 49 , were specific for Neisseria meningitidis in so far as it has not been possible to identify identical or homologous sequences in the genome of N. gonorrhoeae. gonorrhoeae. Ils ont aussi trouvé que l'ORF caractérisée par la séquence de souche telle que montrée dans le SEQ ID n° 39 était spécifique de Neisseria meningitidis de sérogroupe B. They also found that the ORF characterized by the sequence of strain as shown in SEQ ID NO: 39 was specific for Neisseria meningitidis serogroup B.

L'invention a également pour objet un polypeptide sous forme isolée ou un fragment de celui-ci ; ledit polypeptide ayant une séquence d'acides aminés identique ou homologue à une séquence choisie parmi celles du groupe II. The invention also relates to a polypeptide in isolated form or a fragment thereof, said polypeptide having an amino acid sequence identical or homologous to a sequence selected from those of Group II.

Les acides aminés encadrés dans la séquence SEQ ID n° 8 correspondent à la séquence signal, l'acide aminé en gras représente le premier acide aminé de la forme mature. The boxed amino acids in SEQ ID NO: 8 correspond to the signal sequence, the amino acid in bold represents the first amino acid of the mature form. La séquence d'acides aminés de la forme protéique mature est représentée dans le SEQ ID n° 53. The amino acid sequence of the mature protein form is shown in SEQ ID No. 53.

Dans le cadre de la présente invention, les termes de In the context of this invention, the terms of

" polypeptide " et " protéine " sont équivalents et interchangeables entre eux. "Polypeptide" and "protein" are equivalent and interchangeable. Ils désignent n'importe quelle chaîne d'acides aminés, quelle qu'en soit sa longueur et ses modifications post-traductionnelles (par exemple, phosphorylation ou glycosylation). They mean any chain of amino acids, regardless of its length and its post-translational modifications (eg, glycosylation or phosphorylation).

Par " fragments antigéniques des polypeptides spécifiques des souches pathogènes du genre Neisseria ", on entend les polypeptides dérivés des polypeptides de l'invention tels que définis précédemment, par des délétions de parties desdits polypeptides sans destruction de l'antigénicité (par exemple, sans perte notable de l'activité antigénique) desdits polypeptides. By "antigenic fragments of polypeptides specific to pathogenic strains of the genus Neisseria" refers to polypeptides derived from the polypeptides of the invention as defined above, by deletions of portions of said polypeptides without destroying the antigenicity (for example, lossless significant antigenic activity) of said polypeptide. L'antigénicité spécifique peut être déterminée en utilisant diverses méthodes connues de l'homme du métier, comme expliqué plus loin. Specific antigenicity can be determined using a variety of methods known to those skilled in the art, as explained later.

Ces fragments ont de préférence au moins 12 acides aminés de long, de préférence encore au moins 20 acides aminés de long, préférentiellement 50 acides aminés de long, de préférence encore 75 acides aminés de long, préférentiellement 100 acides aminés de long. These fragments are preferably at least 12 amino acids in length, more preferably at least 20 amino acids in length, preferably 50 amino acids in length, more preferably 75 amino acids long, preferably 100 amino acids in length.

Ces fragments peuvent être utilisés pour révéler des épitopes qui peuvent être masqués chez les polypeptides parents. These fragments can be used to reveal epitopes that can be hidden in the parent polypeptide. Ils sont également avantageux pour induire une réponse immune protectrice dépendante des lymphocytes T. They are also advantageous to induce a protective immune response dependent on T lymphocytes Les délétions peuvent en effet permettre d'éliminer des régions immunodominantes de haute variabilité entre différentes souches. Deletions can indeed help eliminate immunodominant regions of high variability between different strains.

De tels fragments peuvent être obtenus en utilisant des techniques standard connues de l'homme du métier (par exemple, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & sons Inc, 1994), par exemple par PCR, RT-PCR, traitement par enzymes de restriction des molécules d'ADN clonées, ou par la méthode de Kunkel et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448). Such fragments may be obtained using standard techniques known in the art (eg, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994), for example by PCR, RT-PCR, treatment with restriction enzymes of cloned DNA molecules, or by the method of Kunkel et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448).

Par " séquence d'acides aminés homologue ", on entend une séquence qui diffère d'une des séquences du groupe II par substitution, délétion, et/ou insertion d'un ou plusieurs acides aminés, à des positions telles que ces modifications ne détruisent pas l'antigénicité spécifique du polypeptide en question. By "homologous amino acid sequence" means a sequence that differs from the sequences of group II by substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids at positions such that these modifications do not destroy not the antigenicity of the specific polypeptide in question. Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe, tels que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la praline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine). Said substitutions are preferably conservative substitutions, that is to say, amino acid substitutions of the same class, such as amino acid substitutions in the uncharged side chains (such as asparagine, glutamine, serine, threonine and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acidic side chains (such as aspartic acid and glutamic acid) amino acid side chains with polar (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine) .

De manière avantageuse, une séquence d'acides aminés homologue possède un degré d'homologie (ie, d'identité) d'au moins 75 % avec une des séquences du groupe II ; de préférence ce degré d'homologie est d'au moins 80 %, de manière tout à fait préférée, d'au moins 90 %. Advantageously, a homologous amino acid sequence has a degree of homology (ie, identity) of at least 75% with the sequences of group II, preferably the degree of homology is at least 80%, very preferably, of at least 90%. Les séquences d'acides aminés homologues incluent en particulier les séquences qui sont substantiellement identiques à une des séquences du groupe II. The amino acid sequences homologous include in particular the sequences which are substantially identical to one of the sequences of the group II. Par " séquence substantiellement identique " on signifie une séquence dont le degré d'homologie (Le., d'identité) avec une des séquences du groupe II est d'au moins 90%, avantageusement d'au moins 95%, de préférence d'au moins 97%, de manière tout à fait préférée d'au moins 99%. By "substantially identical sequence" is meant a sequence having a degree of homology (Le., identity) to one of the sequences of the group II is at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 97%, most preferably entirely of at least 99%. De plus, elle peut ne différer de la séquence de référence que par une majorité de substitutions conservatives. In addition, it may not differ from the reference sequence by the majority of conservative substitutions.

Le degré d'homologie (aussi appelé degré d'identité) est généralement déterminé en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). The degree of homology (also called degree of identity) is generally determined using a sequence analysis software (eg, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison , WI 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (ie identité). Of similar amino acid sequences are aligned for maximum homology (ie, identity). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces (" gaps ") dans la séquence. To this end, it may be necessary to introduce an artificial spaces ("gaps") in the sequence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie (ie identité) est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions. Once the optimum alignment achieved, the degree of homology (ie identity) is established by recording all the positions for which the amino acids of the two compared sequences are identical, relative to the total number of positions.

Par " séquences nucléotidiques homologues ", on entend des séquences qui diffèrent des séquences du groupe I par substitution d'un nucléotide ou plusieurs nucléotides, ou par délétion et/ou insertion d'un ou plusieurs codons, à des positions telles que ces séquences codent (i) toujours pour des polypeptides ayant les séquences du groupe II, par effet de la dégénérescence du code génétique ; ou bien (ii) pour des polypeptides possédant des séquences homologues tels que définies précédemment. By "homologous nucleotide sequences" refers to sequences that differ from the sequences of group I by substitution of one nucleotide or more nucleotides, or by deletion and / or insertion of one or more codons, at positions such that these sequences encode (i) always for polypeptides having the sequences of the group II, by effect of the degeneracy of the genetic code, or (ii), to polypeptides having homologous sequences as defined above.

De manière avantageuse, une séquence nucléotidique homologue possède un degré d'homologie d'au moins 60 % avec une des séquences du groupe I ; de préférence ce degré d'homologie est d'au moins 80 %, de manière tout à fait préférée d'au moins 90 %. Advantageously, a homologous nucleotide sequence has a degree of homology of at least 60% with the sequences of group I, preferably the degree of homology is at least 80%, most preferably entirely of at least 90%.

De manière typique, une séquence nucléotidique homologue s'hybride spécifiquement aux séquences complémentaires des séquences du groupe I dans des conditions stringentes. Typically, a nucleotide sequence homologous to the sequences specifically hybridizes complementary sequences of the group I in stringent conditions. La température à laquelle le test d'hybridation est mis en œuvre constitue un facteur important influençant la stringence. The temperature at which the hybridization assay is implemented is an important factor influencing the stringency. De manière conventionnelle, cette température, dite température d'hybridation (Th), est choisie de 5 à 40°C, de préférence de 20 à 25°C au dessous de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Conventionally, this temperature, said hybridization temperature (Th) is selected from 5 to 40 ° C, preferably 20 to 25 ° C below the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm) . De manière générale, on considère que des conditions de forte stringence sont remplies lorsque Th est inférieure à Tm de 5 à 25°C approximativement, par exemple de 5 à 10°C ou le plus souvent, de 20 à 25°C approximativement. In general, it is considered that under high stringency conditions is satisfied where Th is lower than Tm of 5 to 25 ° C approximately, for example 5 to 10 ° C or, more often, from 20 to 25 ° C approximately. Une stringence modérée s'établit lorsque Th est inférieure à Tm de 30 à 40°C. A moderate stringency is established when Th is lower than Tm of 30 to 40 ° C. Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, la température For sequences with more than 30 bases, the temperature

Tm est définie par la relation : Tm = 81 ,5 + 0,41 (%G+C) + 16,6Log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) - (600/nombre de bases). Tm is defined by the equation: Tm = 81 5 + 0.41 (% G+ C) + 16.6 log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - (600/number bases). Ainsi, la force ionique a un impact majeur sur la valeur de Tm. La température Tm augmente de 16,6°C chaque fois que la concentration en cation monovalent augmente d'un facteur 10. Thus, ionic strength has a major impact on the value of Tm Tm increases of temperature 16.6 ° C when the concentration of monovalent cation is increased by a factor of 10. L'addition de formamide dans le tampon d'hybridation fait par contre baisser la valeur de Tm. (Pour une référence complète voir Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62). The addition of formamide in the hybridization buffer against that by lowering the value of Tm (For a complete reference see Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62) .

De manière conventionnelle, les expériences d'hybridation sont conduites à une température de 60 à 68°C, par exemple à 65°C. Conventionally, hybridization experiments are conducted at a temperature of 60 to 68 ° C, for example at 65 ° C. A cette température, des conditions d'hybridation stringentes peuvent être par exemple mises en œuvre en 6xSSC, avantageusement en 2xSSC ou 1xSSC, de préférence, en 0,5xSSC, 0,3xSSC ou 0,1xSSC (en absence de formamide). At this temperature, stringent hybridization conditions can for example be implemented in 6 × SSC, 2 × SSC advantageously 1xSSC or, preferably, in 0.5 × SSC, 0.3 × SSC and 0.1 × SSC (in the absence of formamide). Une solution de 1xSSC contient 0,15 M de NaCI et 0,015 de citrate de sodium. 1xSSC solution containing 0.15 M NaCl and 0.015 sodium citrate.

C'est pourquoi, en d'autres termes, l'invention a pour objet un polynucléotide sous forme isoiée, qui est capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une molécule d'ADN ayant une des séquences nucléotidiques telles que montrées dans les SEQ ID N° 1 - 51 (numéros impairs) ou leurs complémentaires. Therefore, in other words, the invention relates to a polynucleotide as isoiée, which is capable of hybridizing under stringent conditions with a DNA molecule having one of the nucleotide sequences as shown in the SEQ ID NO: 1 - 51 (odd numbers) or the complements thereof.

Une classe particulière de séquences homologues est constituée par celles que l'on rencontre dans la nature en vertu du phénomène extrêmement fréquent de la variation allelique. A particular class of homologous sequences consists of those that are found in nature under extremely common phenomenon of allelic variation. Une espèce bactérienne par exemple, N. Bacterial species such as N. meningitidis ou N. or N. meningitidis gonorrhoeae, est constituée par une grande variété de souches qui diffèrent entre elles par des variations mineures, dites variations alléliques. gonorrhoeae, is constituted by a wide variety of strains that differ in minor variations called allelic variations. Ainsi, un polypeptide qui est présent dans différentes souches et qui bien évidemment remplit dans chacune d'entre elles, la même fonction biologique, peut posséder une séquence d'acides aminés qui n'est pas identique d'une souche à l'autre. Thus, a polypeptide which is present in different strains and which clearly meet in each, the same biological function, may have a sequence of amino acids that are not identical from one strain to another. En d'autres termes, les séquences issues de la variation allelique sont purement des séquences équivalentes ou alternatives à celles du groupe II. In other words, the sequences from the allelic variation are purely equivalent sequences or alternatives to those of group II. La classe de séquences variantes alléliques de l'une des séquences du groupe II est constituée par les séquences du polypeptide tel qu'il se trouve dans une espèce pathogène du genre Neisseria (par exemple N. meningitidis ou de N. gonorrhoeae) autre que la souche de N. Class sequences allelic variants of one of the sequences of group II consists of the sequence of the polypeptide as found in a pathogenic species of the genus Neisseria (for example N. meningitidis or N. gonorrhoeae) other than the strain of N. meningitidis ATCC 13090. meningitidis ATCC 13090. La fonction biologique qui est associée aux séquences variantes alléliques est la même que celle qui est associée à la séquence de référence. The biological function that is associated with allelic variants sequences is the same as that which is associated with the reference sequence. Les différences (substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs acides aminés) qu'elles présentent entre elles (y compris la séquence de référence) n'altèrent pas la fonction biologique du polypeptide. The differences (substitution, deletion or addition of one or more amino acids) that have between them (including the reference sequence) do not alter the biological function of the polypeptide. Par " fonction biologique ", on entend la fonction exercée par le polypeptide dans les cellules qui le produisent de manière naturelle. By "biological function" means the function performed by the polypeptide in the cells that produce it naturally. La variation allelique s'exprime également au niveau des séquences codantes. Allelic variation is also reflected in the coding sequences. Un polynucleotide codant pour un polypeptide possédant une séquence qui est une variante allelique de l'une des séquences du groupe I peut être facilement clone par amplification de l'ADN génomique des souches d'espèces pathogènes du genre Neisseria , par exemple par PCR (réaction en chaîne par la polymérase), en utilisant des amorces oiigonucléotidiques synthétiques capables de s'hybrider au niveau des extrémités 5' et 3' de la région codante. A polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence which is an allelic variant of one of the sequences of group I can be easily cloned by amplifying the genomic DNA of strains of pathogenic species of the genus Neisseria, for example by reaction (PCR polymerase chain), using synthetic primers oiigonucléotidiques capable of hybridizing at the 5 'and 3' of the coding region. Les séquences de telles amorces peuvent facilement être établies par un homme du métier à partir des séquences nucléotidiques données dans les SEQ ID N° 1 - 51 (numéros impairs). Sequences of such primers can be easily determined by the skilled artisan from the nucleotide sequences given in SEQ ID NO: 1 - 51 (odd numbers). Les amorces ont en général de 10 à 40 nucléotides, de préférence de 15 à 25 nucléotides. The primers are generally 10 to 40 nucleotides, preferably 15 to 25 nucleotides.

C'est pourquoi, en d'autres termes, l'invention a pour objet une molécule d'ADN sous forme isolée qui peut être amplifiée et/ou clonée par PCR à partir du génome d'une souche de Neisseria pathogène en utilisant un couple d'amorces PCR 5' et 3' ; les séquences de ces amorces étant établies à partir d'une des séquences nucléotidiques telles que montrées dans les SEQ ID N° 1 - 51 (numéros impairs). This is why, in other words, the invention relates to a DNA molecule in an isolated form, which can be amplified and / or cloned by PCR from the genome of a strain of pathogenic Neisseria using a couple PCR primer 5 'and 3' sequences of these primers being derived from one of the nucleotide sequences as shown in SEQ ID NO: 1 - 51 (odd numbers). Un exemple est donné pour chaque couple d'amorces dans l'exemple 1.1 ci-après. An example is given for each pair of primers in Example 1.1 below.

La présente invention a plus particulièrement pour objet les variants alléliques ayant les séquences nucléotidiques SEQ ID n° 54 à 76 (numéros pairs) et les produits codés par ces séquences nucléotidiques, ayant les séquences d'acides aminés SEQ ID n° 55 à 77 (numéros impairs). The present invention more particularly relates to allelic variants having the nucleotide sequences SEQ ID Nos. 54-76 (even numbers) and the products encoded by these nucleotide sequences with the amino acid sequence SEQ ID No. 55 to 77 ( odd numbers). Les polypeptides de l'invention peuvent être fusionnés à d'autres polypeptides, par exemple par traduction d'un gène hybride. The polypeptides of the invention can be fused to other polypeptides, for example, by translation of a hybrid gene. Des vecteurs pour l'expression de polypeptides de fusion sont disponibles dans le commerce, comme les vecteurs pMal-c2 ou pMal-p2 de New England Biolabs, dans lesquels la protéine à laquelle peuvent être fusionnés les polypeptides de l'invention est une protéine de liaison au maltose, ou le système glutathion-S- transférase de Pharmacia, ou le système His-Tag de Novagen. Vectors for the expression of fusion polypeptides are commercially available, such as vectors or pMal pMal-c2-p2 New England Biolabs, in which the protein which can be fused to the polypeptides of the invention is a protein maltose binding or system glutathione S-transferase Pharmacia, or His-Tag system from Novagen. De tels systèmes sont en particulier utiles pour une purification des polypeptides de l'invention. Such systems are particularly useful for purification of polypeptides of the invention. Les polypeptides de l'invention peuvent être fusionnés à des polypeptides présentant une activité d'adjuvant, comme par exemple la sous- unité B de la toxine cholérique ou de la toxine thermosensible de E. The polypeptides of the invention can be fused to polypeptides having adjuvant activity, such as the B subunit of cholera toxin or toxin of E. thermosensitive coli. coli.

Les acides nucléiques de la présente invention peuvent être utilisés (i) dans un procédé de production des polypeptides codés par lesdits acides nucléiques dans un système hôte recombinant, (ii) pour la construction de vecteurs vaccinaux tels que des poxvirus, destinés à être utilisés dans des méthodes et des compositions de prévention et/ou de traitement d'une infection par les souches pathogènes de Neisseria, en particulier par Neisseria meningitidis, (iii) comme agent vaccinal sous une forme nue ou en association avec un véhicule favorisant le transfert aux cellules cible et, (iv) dans la construction de souches de Neisseria atténuées qui peuvent surexprimer un acide nucléique de l'invention ou l'exprimer sous une forme non toxique, mutée. The nucleic acids of the present invention may be used (i) in a method for producing the polypeptides encoded by said nucleic acids in a recombinant host system, (ii) for the construction of vaccine vectors such as poxviruses, for use in methods and compositions for prevention and / or treatment of infection by pathogenic strains of Neisseria, particularly Neisseria meningitidis, and (iii) as a vaccine in a naked form or in combination with an effective vehicle for the transfer to cells target, and (iv) in the construction of attenuated strains of Neisseria which can overexpress a nucleic acid of the invention or express it in a non-toxic mutant.

La présente invention fournit également (i) une cassette d'expression contenant un polynucleotide de l'invention placée sous le contrôle d'éléments permettant son expression, en particulier sous le contrôle d'un promoteur approprié ; (ii) un vecteur d'expression contenant ladite cassette d'expression ; (iii) une cellule hôte (procaryote ou eucaryote) transformée avec une cassette d'expression et/ou un vecteur d'expression tels que définis ci- dessus, ainsi que (iv) une méthode pour obtenir un polypeptide codé par ledit polynucleotide de l'invention, comprenant la culture de ladite cellule transformée, dans des conditions permettant l'expression du polynucleotide de l'invention, et la récupération du polypeptide de la culture cellulaire. The present invention also provides (i) an expression cassette containing a polynucleotide of the invention under the control of elements allowing its expression, in particular under the control of a suitable promoter, (ii) an expression vector containing said expression cassette, and (iii) a host cell (prokaryotic or eukaryotic) transformed with an expression cassette and / or an expression vector as defined above, and (iv) a method for obtaining a polypeptide encoded by said polynucleotide of the invention comprising culturing said transformed cell under conditions permitting expression of the polynucleotide of the invention and recovering the polypeptide from the cell culture.

Parmi les hôtes eucaryotes pouvant être utilisés, on peut notamment citer les cellules de levure (par exemple, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia Pastoris), les cellules de mammifères (par exemple, COS1 , NIH3T3, ou JEG3), des cellules d'arthropodes (par exemple, Spodoptera frugiperda (SF9)), et des cellules végétales. Among the eukaryotic hosts can be used, mention may be made yeast cells (eg, Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris), mammalian cells (eg, COS1, NIH3T3, or JEG3), cells of arthropods (by example, Spodoptera frugiperda (SF9)), and plant cells. Parmi les hôtes procaryotes pouvant être utilisés, on peut notamment citer E. Among prokaryotic hosts may be used, mention may be made E. coli. coli.

Le choix de la cassette d'expression dépend du système hôte choisi ainsi que des caractéristiques désirées pour le polypeptide exprimé. The choice of the expression cassette depends on the selected host system and the characteristics desired for the expressed polypeptide. De manière générale, les cassettes d'expression incluent un promoteur qui est fonctionnel dans le système hôte sélectionné et qui peut être constitutif ou inductible ; un site de liaison au ribosome ; un codon d'initiation (ATG) ; si nécessaire une région codant pour un peptide signal ; une séquence nucléotidique de l'invention ; un codon stop ; éventuellement une région 3' terminale (terminateur de traduction et/ou de transcription). Generally, the expression cassette includes a promoter that is functional in the selected host system and can be constitutive or inducible, a ribosome binding site and a start codon (ATG), if necessary coding region a signal peptide, a nucleotide sequence of the invention, a stop codon, optionally a 3 'terminal (terminal for translation and / or transcription). Le cadre de lecture ouverte ("open reading frame ORF") constitué par la séquence nucléotidique de l'invention, seule ou associée à la région codant pour le peptide signal, est placé sous le contrôle du promoteur de telle sorte que la traduction et la transcription aient lieu dans le système hôte. The open reading frame ("ORF open reading frame") consisting of the nucleotide sequence of the invention, alone or associated with the region encoding the signal peptide, is placed under the control of the promoter such that the translation and transcription take place in the host system. Les promoteurs et les régions codant pour les peptides signal sont connus de l'homme du métier. Promoters and coding regions for the signal peptides are known to the skilled person. Parmi ceux- ci, on peut notamment citer le promoteur de Salmonella typhimurium inductible par l'arabinose (promoteur araB) et qui est fonctionnel dans les bactéries Gram " tel que E. coli (US 5,028,530 et Cagnon et al., Protein Engineering (1991 ) 4(7) : 843), le promoteur du gène du bactériophage T7 codant pour l'ARN polymérase, (US 4,952,496) ; le peptide signal OspA et RIpB (Takase et al, J. Bact. (1987) 169:5692). Le polypeptide exprimé peut être recueilli sous une forme pratiquement purifiée à partir de l'extrait cellulaire ou du surnageant après centrifugation de la culture de cellules recombinantes. Le polypeptide recombinant peut être notamment purifié par des méthodes de purification par affinité à l'aide d'anticorps ou par toute autre méthode connue de l'homme du métier, telle que par fusion génétique avec un petit domaine de liaison. Among these, mention may be made ​​of the Salmonella typhimurium promoter inducible by arabinose (araB promoter) and is functional in Gram "as E. coli (U.S. 5,028,530 and Cagnon et al., Protein Engineering (1991 ) 4 (7): 843), the promoter of the gene encoding bacteriophage T7 RNA polymerase (U.S. 4,952,496) and the signal peptide OspA RIpB (Takase et al, J. Bact. (1987) 169:5692) . The expressed polypeptide can be recovered in a substantially purified form from the cell extract or supernatant after centrifugation of the culture of recombinant cells. The recombinant polypeptide can be purified by methods including affinity purification with the aid of antibody or by any other method known in the art, such as by genetic fusion with a small binding domain.

Les acides nucléiques de l'invention peuvent également être utiles dans le domaine de la vaccination, soit en utilisant un hôte viral ou bactérien comme véhicule de libération de l'ADN, soit en administrant l'acide nucléique d'intérêt sous une forme libre. The nucleic acids of the invention may also be useful in the field of vaccination, using either a viral or bacterial host as delivery vehicle for the DNA or by administering the nucleic acid of interest in a free form.

La présente invention a également pour objet (i) un vecteur vaccinal contenant un acide nucléique de l'invention, placé sous le contrôle d'éléments permettant son expression ; (ii) une composition pharmaceutique contenant une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace dudit vecteur vaccinal ; (iii) une méthode pour induire une réponse immune contre Neisseria chez un vertébré, en particulier un mammifère, de préférence un humain, ladite méthode comprenant l'administration audit vertébré d'une quantité immunologiquement efficace dudit vecteur vaccinal pour provoquer une réponse immune, en particulier une réponse protectrice ou thérapeutique à Neisseria meningitidis ; (iv) une méthode pour prévenir et/ou traiter une infection par les souches pathogènes de Neisseria, en particulier par Neisseria meningitidis, qui comprend l'administration d'une quantité prophylactique ou thérapeutique dudit vecteur vaccinal de l'invention à un individu nécessitant un tel traitement. The present invention also relates to (i) a vaccine vector comprising a nucleic acid of the invention, under the control elements for expression, (ii) a pharmaceutical composition containing a therapeutically or prophylactically effective amount of said vector vaccine; (iii) a method for inducing an immune response in a vertebrate against Neisseria, particularly a mammal, preferably a human, said method comprising administering to said vertebrate an immunologically effective amount of said vaccine vector to induce an immune response in particularly a protective or therapeutic response to Neisseria meningitidis, (iv) a method for preventing and / or treating infection by pathogenic strains of Neisseria, particularly Neisseria meningitidis, which comprises administering a prophylactic or therapeutic amount of said vector vaccine of the invention to an individual in need of such treatment. En association avec les polypeptides de l'invention, le vecteur vaccinal tel que défini ci-dessus peut également comprendre des séquences nucléotidiques dont l'expression permet la stimulation de la réponse immune, telles que les séquences codant pour des cytokines. In combination with the polypeptides of the invention, the vaccine vector as defined above may also comprise nucleotide sequences whose expression allows the stimulation of the immune response, such as sequences coding for cytokines.

Ledit vecteur vaccinal de l'invention peut être administré par n'importe quelle voie conventionnelle dans le domaine de la vaccination, en particulier par la voie parentérale (par exemple, sous-cutanée, intra-dermique, intra-musculaire, intraveineuse ou intra-péritonéale). Said vaccine vector of the invention may be administered by any conventional route in the field of vaccination, particularly parenteral (eg, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous or intra- peritoneal). Le dosage dépend de nombreux paramètres connus de l'homme du métier, tels que le vecteur lui- même, la voie d'administration, le poids, l'âge ou le sexe de l'animal ou de l'homme à vacciner. The dosage depends on many parameters known in the art, such as the vector itself, the route of administration, weight, age or sex of the animal or human to be vaccinated.

La présente invention a également pour objet (i) une composition pharmaceutique contenant une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'un polynucleotide de l'invention ; (ii) une méthode pour induire une réponse immune contre les souches pathogènes de Neisseria, en particulier par Neisseria meningitidis chez un vertébré par administration audit vertébré d'une quantité immunologiquement efficace dudit polynucleotide pour provoquer une réponse immune, en particulier une réponse immune protectrice envers les souches pathogènes de Neisseria, en particulier par Neisseria meningitidis ; et (iii) une méthode de prévention et de traitement à une infection par les souches pathogènes de Neisseria, en particulier par Neisseria meningitidis, par administration d'une quantité thérapeutique ou prophylactique dudit polynucleotide à un individu nécessitant un tel traitement. The present invention also relates to (i) a pharmaceutical composition containing a therapeutically or prophylactically effective amount of a polynucleotide of the invention, (ii) a method for inducing an immune response against pathogenic strains of Neisseria, particularly Neisseria meningitidis in a vertebrate by administering to the vertebrate an immunologically effective amount of said polynucleotide to elicit an immune response, particularly a protective immune response against pathogenic strains of Neisseria, particularly Neisseria meningitidis, and (iii) a method of preventing and treatment to infection by pathogenic strains of Neisseria, particularly Neisseria meningitidis, by administering a therapeutic or prophylactic amount of said polynucleotide to an individual in need of such treatment. Les polynucléotides de l'invention (ADN ou ARN) peuvent être administrés en tant que tels à un vertébré. The polynucleotides of the invention (DNA or RNA) can be administered as such in a vertebrate. Lorsqu'une molécule d'ADN de l'invention est utilisée, elle peut être sous la forme d'un plasmide incapable de se répliquer dans une cellule de vertébré et incapable d'intégrer le génome dudit vertébré. When DNA molecule of the invention is used, it may be in the form of a plasmid unable to replicate in a vertebrate cell and unable to integrate the genome of said vertebrate. Ladite molécule d'ADN est typiquement placée sous le contrôle d'un promoteur adapté pour l'expression dans une cellule de vertébré. Said DNA molecule is typically placed under the control of a suitable promoter for expression in a vertebrate cell. Ledit polynucleotide utilisé comme vaccin peut être formulé selon diverses méthodes connues de l'homme du métier. Said polynucleotide used as a vaccine can be formulated using various methods known in the art. Ledit polynucleotide peut en particulier être utilisé sous une forme nue, exempt de tout véhicule favorisant le transfert à la cellule cible, tels que des liposomes anioniques, des lipides cationiques, des microparticules, par exemple des microparticules d'or, des agents de précipitation, par exemple du phosphate de calcium, ou tout autre agent facilitant la transfection. Said polynucleotide may in particular be used in a naked form, free of any vehicle which promotes the transfer to the target cell, such as anionic liposomes, cationic lipids, microparticles, such as gold microparticles, precipitating agents, for example calcium phosphate, or any other transfection-facilitating agent. Dans ce cas, le polynucleotide peut être simplement dilué dans une solution physiologiquement acceptable, telle qu'une solution stérile ou une solution stérile tampon, en présence ou en l'absence d'un véhicule. In this case, the polynucleotide can be simply diluted in a physiologically acceptable solution, such as a sterile solution or a sterile buffer solution, in the presence or absence of a vehicle. Lorsqu'il est présent, ce véhicule peut être de préférence isotonique, hypotonique, ou faiblement hypertonique, et a une force ionique relativement faible. When present, this vehicle may preferably be isotonic, hypotonic or weakly hypertonic and has a relatively low ionic strength. Il peut par exemple s'agir d'une solution de saccharose (par exemple une solution contenant 20 % de saccharose). It can for example be a sucrose solution (eg a solution containing 20% ​​sucrose). De manière alternative, un polynucleotide de l'invention peut être associé à des agents qui facilitent la transfection. Alternatively, a polynucleotide of the invention can be combined with agents that facilitate transfection. Il peut être, entre autres , (i) associé à un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la bupivacaïne (WO 94/16737) ; (ii) encapsulé dans des liposomes, éventuellement en présence de substances supplémentaires facilitant la transfection (WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 et WO 95/2397, WO 93/18759 et WO 93/19768) ; ou (iii) associé à des lipides cationiques ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène. It may be, inter alia, (i) associated with a chemical agent that modifies cellular permeability, such as bupivacaine (WO 94/16737), (ii) encapsulated in liposomes, optionally in the presence of additional substances that facilitate transfection (WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 and WO 95/2397, WO 93/18759 and WO 93/19768), or (iii) associated with cationic lipids or microparticles of silica, gold or tungsten.

Lorsque les polynucléotides de l'invention recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes, "gène gun" (US 4,945,050, US No. 5,015,580 et WO 94/24263). When polynucleotides of the invention coat microparticles, they can be injected intradermally or by the technique of intraepidermal gene gun, "gene gun" (U.S. 4945050, U.S. 5015580 and No. WO 94/24263).

La quantité d'ADN à utiliser comme vaccin dépend notamment de la force du promoteur utilisé dans la construction de l'ADN, de l'immunogénicité du produit exprimé, de l'individu auquel cet ADN est administré, du mode d'administration et du type de formulation. The amount of DNA for use as a vaccine depends especially on the strength of the promoter used in the construction of the DNA, the immunogenicity of the expressed product, the individual to which the DNA is administered, the mode of administration and type of formulation. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 1 μg à environ 1 mg, de préférence d'environ 10 μg à environ 800 μg et, de manière préférentielle d'environ 25 μg à environ 250 μg, peut être administrée à des adultes humains. In general, a therapeutically or prophylactically effective amount ranging from about 1 mcg to about 1 mg, preferably from about 10 micrograms to about 800 micrograms and, more preferably from about 25 micrograms to about 250 micrograms can be administered in human adults.

Le polynucleotide de l'invention peut être administré par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment par voie parentérale. The polynucleotide of the invention can be administered by any conventional route of administration such as parenteral. Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie. The choice of route of administration depends in particular on the chosen formulation. Un polynucleotide formulé en association avec la bupivacaïne est avantageusement administré au muscle. A polynucleotide formulated in association with bupivacaine is advantageously administered to the muscle. Lorsque des liposomes neutres ou anioniques ou un lipide cationique tel que DOTMA (chlorure de N-[1-(2,3- dioléyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium) ou DC-Chol (3 beta-(N-(N',N'- dimethyl aminomethane)-carbamoyl) cholestérol), sont utilisés, la formulation peut être avantageusement injectée par voie intraveineuse, intramusculaire, intradermique ou sous-cutanée. When neutral or anionic liposomes or cationic lipid such as DOTMA (chloride of N-[1 - (2,3 - dioleyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium) or DC-Chol (3 beta-(N- (N ', N'-dimethyl aminomethane)-carbamoyl) cholesterol), are used, the formulation may advantageously be injected intravenously, intramuscularly, intradermally or subcutaneously. Un polynucleotide sous une forme nue peut de manière avantageuse être administré par voie intramusculaire, intradermique ou sous-cutanée. A polynucleotide in a naked form can advantageously be administered by intramuscular, intradermal or subcutaneous. Les séquences nucléotidiques de l'invention permettent la construction de sondes et d'amorces nucléotidiques spécifiques utiles en diagnostic. The nucleotide sequences of the invention allow the construction of probes and primers specific nucleotide useful in diagnosis. Lesdites sondes ou amorces sont des acides nucléiques ayant des séquences identiques ou homologues à des portions des séquences du groupe I ou à leurs séquences complémentaires. Said primers or probes are nucleic acids having sequences identical or homologous to portions of the sequences of group I or their complementary sequences.

De manière préférentielle, lesdites sondes contiennent d'environ 5 à environ 100, de préférence d'environ 10 à environ 80 nucléotides. Preferably, said probes contain from about 5 to about 100, preferably about 10 to about 80 nucleotides. Elles peuvent contenir des bases modifiées, les résidus sucre et phosphate pouvant être également modifiés ou substitués. They may contain modified bases, sugar and phosphate residues may also be modified or substituted. Les sondes de l'invention peuvent être utilisées dans des tests de diagnostic, pour capturer ou détecter des polynucléotides spécifiques des souches pathogènes de Neisseria. The probes of the invention can be used in diagnostic tests to capture or detect polynucleotides specific pathogenic strains of Neisseria. De telles sondes de capture peuvent être de manière conventionnelle immobilisées sur un support solide directement ou indirectement, par liaison covalente ou par adsorption passive. Such capture probes can be conventionally immobilized on a solid support directly or indirectly, covalently or by passive adsorption. Une sonde de détection peut être marquée notamment par un isotope radioactif, une enzyme telle que la peroxidase ou la phosphatase alcaline, ou des enzymes capables d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorogène ou luminescent, ou encore par des composés eux-mêmes homogènes, fluorogènes ou luminescents, des analogues nucléotidiques ; ou la biotine. A detection probe may be labeled with a radioactive isotope such, an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase, or enzymes capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorogenic or luminescent compounds, or by themselves homogeneous, fluorogenic or luminescent, nucleotide analogs, or biotin. Une amorce contient généralement d'environ 10 à environ 40 nucléotides, et peut être utilisée pour initier une polymérisation enzymatique de l'ADN dans un processus d'amplification (par exemple la PCR), dans un processus d'élongation ou dans une méthode de transcription inverse. A primer generally contains from about 10 to about 40 nucleotides, and can be used to initiate polymerization of the DNA enzyme in an amplification process (eg, PCR), a process of elongation or in a method of reverse transcription. Une amorce de l'invention peut être notamment une amorce telle que décrite dans l'exemple 11.1 ci-après. A primer of the invention may especially be a primer as described in Example 11.1 below.

La présente invention a également pour objet : (i) un réactif contenant une sonde de l'invention pour la détection et/ou l'identification de la présence des souches pathogènes de Neisseria dans un échantillon biologique ; The present invention also relates to: (i) a reagent containing a probe of the invention for detecting and / or identifying the presence of pathogenic strains of Neisseria in a biological sample;

(ii) un procédé de détection et/ou d'identification de la présence des souches pathogènes de Neisseria dans un échantillon biologique ; ladite méthode comprenant les étapes consistant à a) extraire l'ADN ou l'ARN d'un échantillon biologique et le dénaturer ; b) exposer ledit ADN ou ledit ARN à une sonde de l'invention, dans des conditions d'hybridation stringentes, de manière à détecter l'hybridation ; et (Ii) a method for detecting and / or identifying the presence of pathogenic strains of Neisseria in a biological sample, said method comprising the steps of a) extracting DNA or RNA from a biological sample and the denatured; b) exposing said DNA or said RNA to a probe of the invention under conditions of stringent hybridization, so as to detect the hybridization, and

(iii) une méthode de détection et/ou d'identification des souches pathogènes de Neisseria dans un échantillon biologique dans lequel l'ADN est extrait d'un échantillon biologique et est mis en présence d'au moins une et de préférence de deux amorces de l'invention et est amplifié par exemple par PCR. (Iii) a method for detection and / or identification of pathogenic strains of Neisseria in a biological sample wherein the DNA is extracted from a biological sample and is placed in the presence of at least one and preferably two primers of the invention and is amplified for example by PCR.

Comme mentionné précédemment, les polypeptides produits par l'expression des séquences ORF identifiées sont utiles comme agents vaccinaux. As mentioned above, the polypeptides produced by the expression of ORF sequences identified are useful as vaccines. L'antigénicité spécifique des polypeptides homologues des polypeptides de séquences du groupe II peut être évaluée en testant la réactivité croisée avec un antisérum dirigé contre les polypeptides de séquences du groupe II. Specific antigenicity of polypeptides homologous sequences of the polypeptides of Group II can be evaluated by testing the cross-reactivity with an antiserum directed against the polypeptides of Group II sequences. Un antisérum hyper-immun monospécifique peut être produit contre un polypeptide de séquence du groupe II purifié ou un polypeptide de fusion, par exemple un produit d'expression des systèmes MBP, GST, ou His-tag. Hyper-immune antiserum monospecific can be produced against a polypeptide sequence of the group II purified or a fusion polypeptide, such as a product of expression systems MBP, GST, or His-tag.

L'antigénicité spécifique peut être déterminée en utilisant diverses méthodes connues de l'homme du métier, en particulier les techniques de Western-Blot, Dot-Blot, et ELISA, décrites ci-dessous. Specific antigenicity can be determined using a variety of methods known to those skilled in the art, especially Western blot techniques, Dot-Blot and ELISA, as described below.

Dans la technique de Western-Blot, la préparation protéique à tester est soumise à une électrophorèse sur gel SDS-PAGE. In the Western blot technique, the protein preparation to be tested is subjected to electrophoresis on SDS-PAGE gel. Après transfert sur une membrane de nitrocellulose, le matériel est incubé avec un antisérum hyper-immmun monospécifique obtenu après avoir immunisé un animal avec le matériel réfèrent ; c'est-à-dire dans le cas présent, avec un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés du groupe II. After transfer to a nitrocellulose membrane, the material is incubated with a monospecific antiserum hyper-immmun obtained after an animal immunized with the hardware refer, that is to say, in this case, with a polypeptide having a sequence of amino acids in group II. Cet antisérum est au préalable dilué dans un domaine de dilution allant d'environ 1 :50 à 1 :5000, de préférence d'environ 1 :100 à 1 :500. This antiserum is diluted beforehand in a range of dilution of from about 1: 50 to 1: 5000, preferably about 1: 100 to 1: 500. L'antigénicité spécifique est révélée lorsqu'une bande correspondant au produit présente une réactivité à l'une des dilutions ci- dessus. Specific antigenicity is revealed when a product band is reactive with one of the above dilutions.

Dans le test ELISA, on utilise de préférence une préparation protéique purifiée, bien qu'un extrait cellulaire entier puisse être également utilisé. In ELISA, using preferably a purified protein preparation, although a whole cell extract can also be used. Environ 100 μl d'une préparation à environ 10 μg/ml sont distribués dans les puits d'une plaque. About 100 mu.l of preparation about 10 ug / ml were distributed into the wells of a plate. La plaque est incubée pendant deux heures à 37°C puis une nuit à 4°C. The plate is incubated for two hours at 37 ° C and then overnight at 4 ° C. La plaque est ensuite lavée avec une solution saline de tampon phosphate (PBS) comprenant 0,05 % de Tween 20. The plate is then washed with phosphate buffered saline (PBS) including 0.05% Tween 20. Les puits sont saturés avec 250 μl de PBS contenant 1 % d'albumine de sérum bovin (BSA) pour empêcher la liaison non spécifique d'anticorps. The wells were saturated with 250 mu.l of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) to prevent nonspecific binding of antibodies. Après une heure d'incubation à 37°C, la plaque est lavée avec le tampon PBS/Tween. After one hour of incubation at 37 ° C, the plate was washed with PBS / Tween. L'antisérum est dilué en série dans du tampon PBS/Tween contenant 0,5 % BSA. The antiserum was serially diluted in PBS / Tween containing 0.5% BSA. 100 μl de cette dilution sont ajoutés par puits. 100 mu.l of this dilution were added per well. La plaque est incubée pendant 90 minutes à 37°C, lavée et évaluée selon les procédures standard. The plate is incubated for 90 minutes at 37 ° C, washed and evaluated according to standard procedures. Par exemple, lorsque des anticorps spécifiques sont produits chez des lapins, un conjugué peroxydase de chèvre anti-lapin est ajouté au puits. For example, when specific antibodies are produced in rabbits, a peroxidase-conjugated goat anti-rabbit was added to the wells. L'incubation est réalisée pendant 90 minutes à 37°C et la plaque est ensuite lavée. Incubation is carried out for 90 minutes at 37 ° C and the plate is then washed. La réaction est mesurée par colorimétrie (une réaction est positive lorsque la valeur de densité optique est de 1 si la dilution est d'au moins 1 :50, de préférence d'au moins 1 :500). The reaction is measured by colorimetry (reaction is positive when the optical density value is 1 if the dilution is at least 1: 50, preferably at least 1: 500).

Dans le test Dot-Blot, on utilise de préférence une protéine purifiée, étant entendu qu'il est également possible d'utiliser un extrait cellulaire entier. In the Dot-Blot test is used preferably a purified protein, it being understood that it is also possible to use a whole cell extract. Une solution protéique à environ 100 μg/ml est diluée deux fois en série dans un tampon Tris-HCI 50mM, pH : 7,5. A protein solution to about 100 g / ml is diluted twofold serially in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5. 100 μl de chaque dilution sont appliqués à une membrane de nitrocellulose (appareil BioRad). 100 ml of each dilution were applied to a nitrocellulose membrane (BioRad apparatus). Le tampon est enlevé en appliquant du vide au système. The buffer was removed by applying vacuum to the system. Les puits sont lavés par addition de 50 mM de tampon Tris-HCI (pH : 7,5) et la membrane est séchée à l'air. The wells are washed by addition of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and the membrane was dried in air. La membrane est ensuite saturée dans un tampon bloquant (50 mM Tris-HCI (pH : 7,5) 0,15M NaCI, 10 g/l de lait écrémé) et incubée avec une dilution d'antisérum allant d'environ 1 :50 à 1 :5000, de préférence à environ 1 :500. The membrane is then saturated in blocking buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 0.15 M NaCl, 10 g / l skim milk) and incubated with antiserum dilution of from about 1: 50 to 1: 5000, preferably about 1: 500. La réaction est révélée conformément aux procédures standard. The reaction is disclosed in accordance with standard procedures. Par exemple, lorsque des anticorps spécifiques sont produits chez des lapins, un conjugué peroxydase de chèvre anti-lapin est ajouté aux puits. For example, when specific antibodies are produced in rabbits, a peroxidase-conjugated goat anti-rabbit was added to the wells. L'incubation est réalisée pendant 90 minutes à 37°C. Incubation is carried out for 90 minutes at 37 ° C. La réaction est développée avec le substrat approprié et mesurée, par exemple par colorimétrie, par l'apparition d'une tache colorée (une réaction est positive lorsqu'une tache colorée apparaît en association avec une dilution d'au moins 1 :50, de préférence d'au moins 1 :500). The reaction was developed with the appropriate substrate and measured by colorimetry for example, by the appearance of a colored spot (a positive reaction when a colored spot appears in association with a dilution of at least 1: 50, preferably at least 1: 500). La présente invention a également pour objet (i) une composition pharmaceutique contenant une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'un polypeptide de l'invention ; (ii) une méthode pour induire une réponse immune contre les souches pathogènes de Neisseria chez un vertébré, par administration audit vertébré d'une quantité immunogéniquement efficace d'un polypeptide de l'invention pour provoquer une réponse immune, en particulier une réponse immune protectrice contre les souches pathogènes de Neisseria ; et (iii) une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection par les souches pathogènes de Neisseria, par administration d'une quantité thérapeutique ou prophylactique d'un polypeptide de l'invention à un individu nécessitant un tel traitement. The present invention also relates to (i) a pharmaceutical composition containing a therapeutically or prophylactically effective amount of a polypeptide of the invention, (ii) a method for inducing an immune response against pathogenic strains of Neisseria in a vertebrate, by administering to said vertebrate an immunogenically effective amount of a polypeptide of the invention to elicit an immune response, particularly a protective immune response against pathogenic strains of Neisseria, and (iii) a method for preventing and / or treating infection by pathogenic strains of Neisseria, by administering a therapeutic or prophylactic amount of a polypeptide of the invention to an individual in need of such treatment.

Les compositions immunogènes de l'invention peuvent être administrées par n'importe quelle voie conventionnelle dans le domaine de la vaccination, en particulier par la voie parentérale (par exemple, sous-cutanée, intra-dermique, intra-musculaire, intraveineuse ou intra-péritonéale). The immunogenic compositions of the invention can be administered by any conventional route in the field of vaccination, particularly parenteral (eg, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous or intra- peritoneal). Le choix de la voie d'administration dépend d'un certain nombre de paramètres tel que l'adjuvant associé au polypeptide. The choice of the route of administration depends on a number of parameters such as the adjuvant associated with the polypeptide.

Une composition de l'invention contient au moins un polypeptide tel que défini précédemment. A composition of the invention contains at least one polypeptide as defined above. Il peut également contenir au moins un antigène supplémentaire de Neisseria meningitidis et/ou Neisseria gonorrhoeae. It may also contain at least one additional antigen of Neisseria meningitidis and / or Neisseria gonorrhoeae.

Les polypeptides de l'invention peuvent être formulés avec des liposomes, de préférence des liposomes neutres ou anioniques, des microsphères, des ISCOMS, des particules "virus-like" pour faciliter le transfert du polypeptide et/ou augmenter la réponse immune. The polypeptides of the invention can be formulated with liposomes, preferably neutral or anionic liposomes, microspheres, ISCOMs particles "virus-like" to facilitate the transfer of the polypeptide and / or enhance the immune response. L'administration peut être réalisée par une dose unique ou par des doses répétées si nécessaire à des intervalles qui peuvent être déterminés par l'homme du métier. The administration may be performed by a single dose or repeated doses if necessary at intervals as may be determined by the skilled artisan.

Par exemple, une dose initiale peut être suivie de trois doses de rappel à des intervalles d'une ou plusieurs semaines ou d'un ou plusieurs mois. For example, an initial dose may be followed by three booster doses at intervals of one or more weeks or a month or more. La dose appropriée dépend de nombreux paramètres incluant l'individu traité (adulte ou enfant), l'antigène vaccinal particulier, la voie d'administration et la fréquence d'administration, la présence ou l'absence ou encore le type d'adjuvant, et l'effet désiré (par exemple, protection et/ou traitement) et peut être déterminée par l'homme du métier. The appropriate dose depends on many parameters including the treated individual (adult or child), the particular vaccine antigen, the route of administration and frequency of administration, the presence or absence or the type of adjuvant, and the desired effect (eg, protection and / or treatment) may be determined by the skilled artisan. Si la voie d'administration est parentérale, la dose est préférentiellement inférieure à 1 mg, de préférence d'environ 100 μg. If the route of administration is parenteral, the dose is preferably less than 1 mg, preferably from about 100 mg. Les polypeptides et polynucléotides de l'invention utilisés en tant qu'agents vaccinaux, peuvent être utilisés de manière séquentielle, dans un procédé d'immunisation en plusieurs étapes. The polypeptides and polynucleotides of the invention used as vaccine agents, may be used sequentially, in a method of immunization in several stages. Par exemple, un vertébré peut être initialement sensibilisé avec un vecteur vaccinal de l'invention, tel qu'un poxvirus, par exemple par la voie parentérale, puis être stimulé deux fois avec le polypeptide codé par le vecteur vaccinal. For example, a vertebrate may be initially primed with a vaccine vector of the invention, such as a poxvirus, for example, by the parenteral route, and then be stimulated twice with the polypeptide encoded by the vaccine vector.

Un polypeptide de l'invention peut également être utile comme agent de diagnostic pour détecter la présence d'anticorps anti-Λ/e/sseπa meningitidis et/ou anti-Λ/e/sser/a gonorrhoeae dans un échantillon biologique tel qu'un échantillon de sang. A polypeptide of the invention may also be useful as a diagnostic agent for detecting the presence of antibodies anti-Λ/e/sseπa meningitidis and / or anti-Λ/e/sser/a gonorrhoeae in a biological sample such as a blood sample.

La présente invention a également pour objet des anticorps monospécifiques dirigés contre les polypeptides de l'invention. The present invention also relates to monospecific antibodies directed against the polypeptides of the invention. Par "anticorps monospécifique" on entend un anticorps capable de réagir de manière spécifique avec un polypeptide de Neisseria de l'invention. By "monospecific antibody" means an antibody capable of reacting specifically with a polypeptide of the invention Neisseria. De tels anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux, et peuvent être des anticorps recombinants par exemple chimériques (par exemple, constitués par une région variable d'origine murine associée à une région constante d'origine humaine), humanisés et/ou à chaîne unique. Such antibodies may be polyclonal or monoclonal and recombinant antibodies can be, for example, chimeric (eg, consisting of a murine variable region associated with a constant region of human origin), humanized and / or single chain. Lesdits anticorps peuvent être également sous la forme de fragments d'immunoglobuiine par exemple de fragments F(ab)'2 ou Fab. Said antibodies can also be in the form of fragments immunoglobuiine eg F (ab) '2 or Fab. Les anticorps de l'invention peuvent être de n'importe quel isotype par exemple IgA ou IgG, les anticorps polyclonaux pouvant être d'un isotype unique ou pouvant contenir un mélange de plusieurs isotypes. The antibodies of the invention can be of any isotype IgA or IgG example, polyclonal antibodies may be of a single isotype or may contain a mixture of several isotypes.

Les anticorps de l'invention dirigés contre les polypeptides de l'invention, peuvent être produits et identifiés en utilisant des méthodes immunologiques standard, par exemple l'analyse de Western-Blot, un essai Dot-Blot, un test ELISA (Coligan et al, Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). The antibodies of the invention directed against the polypeptides of the invention can be produced and identified using standard immunological methods, such as Western blot analysis, a test-Dot Blot, ELISA (Coligan et al , Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Lesdits anticorps peuvent être utilisés dans des procédés de diagnostic pour détecter la présence d'un antigène de Neisseria meningitidis dans un échantillon tel que notamment un échantillon biologique (par exemple du sang). Said antibodies can be used in diagnostic methods for detecting the presence of a Neisseria meningitidis antigen in a sample such as in particular a biological sample (eg blood). Les anticorps de l'invention peuvent également être utilisés dans des procédés de chromatographie par affinité pour purifier un polypeptide de l'invention. The antibodies of the invention may also be used in methods of affinity chromatography to purify a polypeptide of the invention. Enfin, de tels anticorps peuvent également être utilisés dans des méthodes d'immunisation passive prophylactique ou thérapeutique. Finally, these antibodies can also be used in methods of passive immunization or prophylaxis. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic pour la détection de la présence de souches pathogènes de Neisseria dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact dudit échantillon biologique avec un anticorps, ou un polypeptide de l'invention, de telle sorte qu'un complexe immun soit formé, et la détection dudit complexe indicatrice de souches pathogènes de Neisseria dans l'organisme dont provient l'échantillon. The present invention also relates to a diagnostic method for detecting the presence of pathogenic strains of Neisseria in a biological sample comprising contacting said biological sample with an antibody or a polypeptide of the invention, so that an immune complex is formed, and detecting said complex indicative of pathogenic strains of Neisseria in the organism from which the sample. L'homme du métier comprend que le complexe immun est formé entre un composant de l'échantillon et l'anticorps ou le polypeptide de l'invention, toute substance non liée pouvant être éliminée préalablement à la détection du complexe. The skilled artisan understands that the immune complex is formed between a component of the sample and the antibody or polypeptide of the invention, any unbound material can be removed prior to the detection of the complex. Ainsi, un réactif de type polypeptide peut être utilisé pour la détection de la présence d'anticorps anti-Λ/e/sser/a meningitidis et/ou Neisseria gonorrhoeae dans un échantillon, tandis qu'un anticorps de l'invention peut être utilisé comme réactif pour tester la présence de polypeptide de Neisseria meningitidis et/ou Neisseria gonorrhoeae dans un échantillon. Thus, a polypeptide reagent can be used for detecting the presence of antibodies anti-Λ/e/sser/a meningitidis and / or Neisseria gonorrhoeae in a sample, while antibodies of the invention can be used as reagents for assaying for the presence of polypeptide from Neisseria meningitidis and / or Neisseria gonorrhoeae in a sample. Pour une utilisation dans des applications de diagnostic, le réactif For use in diagnostic applications, the reagent

(par exemple l'anticorps ou le polypeptide de l'invention) peut être à l'état libre ou immobilisé sur un support solide, par des moyens directs ou indirects. (Eg, the antibody or polypeptide of the invention) may be in the free state or immobilized on a solid support, by direct or indirect means.

Les moyens directs incluent l'adsorption passive ou la liaison covalente entre le support et le réactif. The direct means include passive adsorption or covalent bond between the support and the reagent. Par moyen indirect, on entend qu'une substance qui interagit avec ledit réactif est fixée au support solide. By indirect means, means that a substance which interacts with said reagent is attached to the solid support. Par exemple, si un réactif de type polypeptide est utilisé, un anticorps qui se lie à celui-ci peut servir de substance anti-réactif, étant entendu que celle-ci se lie à un anticorps qui n'est pas impliqué dans la reconnaissance des anticorps dans les échantillons biologiques. For example, if a polypeptide reagent is used, an antibody that binds thereto can be used as anti-reactive substance, provided that it binds to an antibody which is not involved in the recognition of antibodies in biological samples.

Parmi les moyens indirects pouvant être utilisés, on peut également citer le système ligand récepteur, une molécule telle qu'une vitamine pouvant être greffée sur le réactif de type polypeptide et le récepteur correspondant pouvant être immobilisé sur la phase solide. Among the indirect methods can be used, we can also mention the ligand-receptor system, a molecule such as a vitamin that can be grafted onto the reagent and the corresponding receptor polypeptide can be immobilized on the solid phase. Ceci est illustré par le système biotine-streptavidine. This is illustrated by the biotin-streptavidin system. On peut également ajouter au réactif une queue peptidique par génie chimique ou génie génétique, et immobiliser le produit greffé ou fusionné par adsorption passive ou liaison covalente avec la queue peptidique. You can also add the reagent tail peptide by genetic engineering or chemical engineering, and immobilize the grafted product or merged by passive adsorption or covalent bond with the peptide tail.

La présente invention a également pour objet un procédé de purification, à partir d'un échantillon biologique, d'un polypeptide de Neisseria de l'invention, par chromatographie d'affinité avec un anticorps monospécifique de l'invention. The present invention also relates to a method of purification from a biological sample, a polypeptide of the invention of Neisseria, by affinity chromatography with a monospecific antibody of the invention. Ledit anticorps est de préférence d'isotype IgG. Said antibody is preferably IgG isotype. Selon un exemple de réalisation, un échantillon biologique, de préférence dans une solution tampon, est appliqué à un matériel chromatographique, de préférence équilibré avec le tampon utilisé pour diluer l'échantillon biologique, de telle sorte que le polypeptide de l'invention (c'est-à- dire l'antigène) puisse adsorber sur le matériel. According to one embodiment, a biological sample, preferably in a buffer solution, is applied to a chromatographic material, preferably equilibrated with the buffer used to dilute the biological sample, such that the polypeptide of the invention (c that is to say the antigen) can adsorb onto the material. Les composants non liés sont lavés et l'antigène est ensuite élue avec un tampon d'élution approprié, tel qu'un tampon Glycine ou un tampon contenant un agent chaotropique, par exemple la guanidine HCI, ou une forte concentration en sel (par exemple, 3 M MgCl2). Unbound components are washed and the antigen is then eluted with an appropriate elution buffer, such as a buffer or a glycine buffer containing a chaotropic agent, for example guanidine HCl, or a high salt concentration (for example , 3 M MgCl2). Les fractions éluées sont recueillies et la présence d'antigène est détectée par exemple par mesure de l'absorbance à 280 nm. The eluted fractions are collected and the presence of antigen is detected, for example by measuring the absorbance at 280 nm. La présente invention a également pour objet (i) une composition pharmaceutique contenant une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'un anticorps monospécifique de l'invention ; et (ii) une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection par les souches pathogènes de Neisseria, par administration d'une quantité thérapeutique ou prophylactique d'un anticorps monospécifique de l'invention à un individu nécessitant un tel traitement. The present invention also relates to (i) a pharmaceutical composition containing a therapeutically or prophylactically effective amount of a monospecific antibody of the invention and (ii) a method of prevention and / or treatment of infection by strains pathogenic Neisseria, by administering a therapeutic or prophylactic amount of a monospecific antibody of the invention to an individual in need of such treatment.

A cette fin, l'anticorps monospécifique de l'invention est de préférence d'isotype IgG, et de préférence fixe le complément. To this end, the monospecific antibody of the invention is preferably IgG isotype, and preferably fixed complement. Ledit anticorps monospécifique selon l'invention peut être administré seul ou en mélange avec au moins un autre anticorps monospécifique, spécifique d'un polypeptide de Neisseria meningitidis et/ou Neisseria gonorrhoeae différent, selon l'invention. Said monospecific antibody of the invention may be administered alone or in admixture with at least one other monospecific antibody, specific for a polypeptide of Neisseria meningitidis and / or Neisseria gonorrhoeae different, according to the invention. La quantité d'anticorps peut être déterminée facilement par l'homme du métier. The amount of antibody can be readily determined by the skilled artisan. Par exemple, une administration quotidienne d'environ 100 à 1000 mg d'anticorps sur une semaine ou trois doses quotidiennes d'environ 100 à 1000 mg d'anticorps sur deux ou trois jours, peut être une posologie efficace. For example, a daily administration of from about 100 to 1,000 mg of antibodies over a week or three daily doses of about 100 to 1000 mg of antibodies to two or three days, may be an effective dose.

L'efficacité thérapeutique ou prophylactique peut être évaluée en utilisant des méthodes standard connues de l'homme du métier, par exemple en mesurant l'induction d'une réponse immune ou l'induction d'une immunité protectrice et/ou thérapeutique (chez des souris ou des rats nouveau-nés), par évaluation de la charge bactérienne dans le liquide céphalo-rachidien). The therapeutic or prophylactic efficacy can be evaluated using standard methods known in the art, for example by measuring the induction of an immune response or induction of protective immunity and / or therapeutic (among mice or newborn rats) by assessing the bacterial load in the cerebrospinal fluid). La protection peut être déterminée en comparant le degré d'infection de Neisseria à un groupe contrôle. Protection can be determined by comparing the degree of infection of Neisseria to a control group. La protection est mise en évidence lorsque l'infection est réduite par comparaison au groupe contrôle. Protection is highlighted when the infection is reduced compared to the control group. Une telle évaluation peut être faite avec les polynucléotides, les vecteurs vaccinaux, les polypeptides ainsi que les anticorps selon l'invention. Such an assessment can be made with polynucleotides, vaccine vectors, polypeptides and antibodies of the invention. L'efficacité thérapeutique ou prophylactique d'un produit selon l'invention (polynucleotide ou polypeptide) peut être aussi évaluée en test de bactéricidie tel que décrit par Danve et al., Vaccine (1993) 1 1 (12) :1214, à rencontre de la souche méningoccoque d'origine du polynucleotide ou polypeptide utilisé. The effectiveness of a therapeutic or prophylactic product according to the invention (polynucleotide or polypeptide) can also be evaluated bactericidal test as described by Danve et al., Vaccine (1993) 1 1 (12): 1214, against strain méningoccoque original polynucleotide or polypeptide used. Dans le domaine des vaccins méningoccoques, le test de bactéricidie est en effet reconnu comme étant le test de référence à partir duquel on peut valablement prédire l'intérêt vaccinal d'un produit. In the field of vaccines méningoccoques the bactericidal test is indeed recognized as the gold standard from which one can validly predict the value of a vaccine product. En bref, on administre un produit selon l'invention à des animaux tels que le lapin afin d'obtenir un antisérum à encontre de ce produit. In short, it administers a product according to the invention animals such as rabbits to obtain antiserum against this product. Puis cet antisérum est testé pour sa capacité de lyse. This antiserum was then tested for its ability to lyse. Le titre de bactéricidie d'un antisérum représente l'inverse de la dilution de cet antisérum pour lequel 50 % de la charge en méningoccoques est lysée. The title of a bactericidal antiserum represents the inverse of the dilution of this antiserum at which 50% of the load méningoccoques is lysed. On considère que l'antisérum est bactéricide lorsque le titre est supérieur à 4 vis à vis de la souche méningoccoque d'origine du polynucleotide ou polypeptide utilisé. We consider that the antiserum is bactericidal when the title is more than 4 against strain méningoccoque original polynucleotide or polypeptide used. Dans ce cas- là, il est démontré que le produit à encontre duquel l'antisérum a été généré, est potentiellement intéressant d'un point de vue pharmaceutique. In this case, it is shown that the product against which the antiserum was generated is potentially interesting from a pharmaceutical point of view.

Les exemples suivant illustrent l'invention sans en limiter la portée. The following examples illustrate the invention without limiting its scope. Légende de la figure Figure Legend

La figure en annexe représente le vecteur pCAMyc-His utilisé comme vecteur de clonage. The annexed is the vector-His pCAMyc used as a cloning vector.

Détails de la stratégie d'identification des ORF : Details of the identification strategy of ORF:

Afin de sélectionner les séquences ORF spécifiques des souches pathogènes du genre Neisseria, une amplification par PCR est menée sur les séquences des 1 18 ORFs retenues après analyse par le logiciel Gène Jocke , Codon Use , et la recherche d'homologies. To select the ORF sequences specific pathogenic strains of the genus Neisseria, PCR amplification is carried out on the sequences of January 18 ORFs selected after analysis software Jocke Gene, Codon Use and homology search. Seules les séquences pour lesquelles l'amplification chez N. Only sequences for which the amplification in N. lactamica est négative (séquences appelées " lactamica " ") sont retenues. Afin de vérifier que ces résultats négatifs ne sont pas des " faux-négatifs ", les séquences lactamica " retenues sont soumises à un dot blot. lactamica is negative (sequences called "lactamica" ") are retained. To verify that these negative results are not" false-negative "sequences lactamica" deductions are subject to a dot blot.

A - Amplification par PCR : A - PCR amplification:

A.1. A.1. Extraction des ADN qénomiques : DNA extraction qénomiques:

Les ADN génomiques de l'ensemble des souches de Neisseria utilisées dans cette étude ont été préparés selon un protocole identique. Genomic DNA of all strains of Neisseria used in this study were prepared according to an identical protocol. Les souches de N. Strains of N. meningitidis, N. meningitidis, N. lactamica, N. lactamica, N. flava, N. flava, N. subflava et N. subflava and N. mucosa ont été cultivées sur boite de milieu MHA (Muller Hinton Agar, Difco), les N. mucosa were grown on MHA middle box (Muller Hinton Agar, Difco), the N. gonorrhoeae ont été cultivées sur boite de milieu MHA supplémenté par 10% de sang cuit de cheval (Biomérieux) et 1 % d'Isovitalex (Biomérieux). gonorrhoeae were grown on middle box MHA supplemented with 10% horse blood cooked (Biomerieux) and 1% Isovitalex (Biomerieux). La culture se fait à 37°C pendant 18 h sous une atmosphère contenant 10% C02 une nuit à 37°C. Culture is at 37 ° C for 18 h under an atmosphere containing 10% C02 overnight at 37 ° C. Puis les cellules sont récoltées, lavées dans du tampon phosphate PBS (pH 7.2) et l'ADN est extrait selon le protocole D du Kit " Rapid Prep genomic DNA isolation kit for cells and tissue " (Pharmacia Biotech). Then the cells were harvested, washed in phosphate buffer PBS (pH 7.2) and DNA was extracted according to the protocol D Kit "Rapid Prep Genomic DNA isolation kit for cells and tissue" (Pharmacia Biotech).

Les ADN génomiques ont alors été contrôlés sur gel d'agarose pour leur intégrité et par réaction PCR pour leur pureté. Genomic DNA was then checked on agarose gel for integrity and purity for PCR.

A.2. A.2. Réaction de PCR pour cribler les ORFs absentes dans N. PCR for screening ORFs absent in N. lactamica 2314 : Une amplification PCR a été réalisée sur les ADN génomiques de la souche N. lactamica 2314: A PCR amplification was performed on genomic DNA of the strain N. meningitidis ATCC 13090 et N. N. meningitidis ATCC 13090 and lactamica 2314 (ATCC 23970) selon le protocole suivant : lactamica 2314 (ATCC 23970) according to the following protocol:

La réaction de PCR a été réalisée sur un volume de 50 μl avec 10 ng d'ADN génomique, 250 μM de chacun des dNTPs, 300 nM de chacune des amorces, Tampon Taq DNA polymerase 1X, et 2 u de Taq DNA Polymerase (Appligène). The PCR reaction was performed in a volume of 50 mu.l with 10 ng of genomic DNA, 250 mM of each dNTP, 300 nM of each primer, 1X Taq DNA polymerase buffer, and 2 U of Taq DNA Polymerase (Appligene ).

Les cycles d'amplification sont : The amplification cycles are:

97°C 45 secondes 25 cycles 97 ° C 45 seconds 25 cycles

56°C 1 minute 25 cycles 56 ° C 1 minute 25 cycles

72°C 2.30 minutes 25 cycles 72 ° C 2.30 minutes 25 cycles

Pour chacune des ORFs analysées, des contrôles positifs et négatifs de la réaction PCR ont été réalisés. For each of the ORFs analyzed, positive and negative controls for the PCR reaction were performed. A ce stade, seules les ORFs N. At this stage, only ORFs N. meningitidis + et N. N. meningitidis and + lactamica - sont retenues. lactamica - are retained.

B - Sélection des ORFs N. B - Selection of ORFs N. meningitidis N. N. meningitidis lactamica ' par dot blot sur ADN génomique : lactamica 'by dot blot on genomic DNA:

L'absence d'un produit d'amplification par PCR d'une ORF avec de l'ADN génomique de N. The absence of a PCR amplification product of an ORF with genomic DNA from N. lactamica 2314 comme matrice, ne certifie pas l'absence de cette ORF dans le génome de N. lactamica in 2314 as a template, does not certify the absence of this ORF in the genome of N. lactamica 2314. lactamica 2314. En effet, une certaine variabilité dans la région où devraient s'hybrider les oligonucléotides peut être responsable de l'absence de produit amplifié pour une ORF donnée. Indeed, some variability in the region should hybridize the oligonucleotides may be responsible for the absence of amplified product for a given ORF.

Dans ce contexte, une vérification supplémentaire est mise en oeuvre par dot blot sur ADN génomique en utilisant comme sonde les produits d'amplification génomique sur la souche de N. In this context, an additional check is implemented by dot blot on genomic DNA using as probe amplification products of genomic strain N. meningitidis correspondant à chacune des phases de lecture identifiées. meningitidis corresponding to each of the reading frames identified. Les filtres du dot blot contiennent de l'ADN génomique des souches suivantes : 2 souches de N. The filters of dot blot containing genomic DNA from the following strains: two strains of N. lactamica 8064, 2314, une souche de N. lactamica 8064, 2314, a strain of N. flava ATCC 30008, une souche de N. flava ATCC 30008, a strain of N. mucosa ATCC 9297, 3 souches de N. mucosa ATCC 9297, three strains of N. meningitidis de sérogroupe B ATCC13090, M982, B16B6, une souche de N. meningitidis serogroup B ATCC13090, M982, B16B6, a strain of N. meningitidis de sérogroupe A Z2491 , une souche de N. meningitidis serogroup A Z2491 a strain of N. meningitidis de sérogroupe C (souche Z4182), 2 souches de N. meningitidis serogroup C (strain Z4182), 2 strains of N. gonorrhoeae MS11 et FA1090. gonorrhoeae MS11 and FA1090. Cette analyse en dot blot permet de valider l'absence de l'ORF dans N. This dot blot analysis to validate the absence of the ORF in N. lactamica 2314 et 8064 et elle est aussi indicatrice du degré de variabilité d'une ORF au sein des souches de Neisseria. lactamica 2314 and 8064 and is also indicative of the degree of variability of an ORF in strains of Neisseria. La technique de dot blot utilisée est la suivante. Dot blot technique used is as follows. Environ 50ng d'ADN génomique dénaturé 5 min à 100°C des différentes souches de Neisseria sont déposés sous vide sur une membrane de nitrocellulose Hybond N+ (Amersham) placée entre les mâchoires d'un appareil à dot blot (Bio-Rad). Approximately 50 ng of genomic DNA denatured for 5 min at 100 ° C for different strains of Neisseria are vacuum deposited onto a nitrocellulose membrane Hybond N + (Amersham) placed between the jaws of a dot blot apparatus (Bio-Rad). Puis l'ADN est fixé sur les membranes 5 min à un rayonnement UV 315nm. The DNA is then fixed to the membranes 5 min 315nm UV radiation. Les membranes sont incubées dans un tampon de préhybridation (contenant de l'ADN de sperme de saumon dénaturé). The membranes were incubated in prehybridization buffer (containing DNA denatured salmon sperm). Elles sont ensuite hybridées avec une sonde correspondant au produit d'amplification de l'ORF d'intérêt, marquée selon un protocole de marquage froid, comme le système 'DIG DNA labelling and détection kit' (Boehringer Mannheim). They are then hybridized with a probe corresponding to the amplification product of the ORF of interest, marked by a cold staining protocol, as the system 'DIG DNA labeling and detection kit' (Boehringer Mannheim). L'ORF qui ne s'hybride pas sur l'ADN génomique de N. ORF that does not hybridize to the genomic DNA of N. lactamica lactamica

2314 et 8064 est retenue définitivement comme candidat vaccinal potentiel. 2314 and 8064 is retained permanently as potential vaccine candidate.

Exemple I : Clonage Example I: Cloning

1. 1. Amplification par PCR PCR amplification

Chacune des ORFs a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de N. Each of the ORFs was amplified by PCR from genomic DNA of N. meningitidis sérogroupe B (souche ATCC 13090), selon un protocole standard. meningitidis serogroup B (strain ATCC 13090) according to a standard protocol.

Deux oligonucléotides, amorces du côté N-terminal et du côté C- Terminal ont été définis pour chacune des séquences ORF de l'invention. Two oligonucleotides primers on the N-terminal and C-terminal side have been defined for each ORF sequences of the invention.

L'amorce du côté N-Terminal comprend un site de restriction enzymatique pour le clonage, une séquence Kozak CCACC pour l'initiation de la traduction (M. Kozak, J. Mol. Biol. 196 : 947-950), l'ATG de l'ORF potentielle et environ 17 bases spécifiques de la partie 5' de l'ORF. The primer at the N-terminal comprises a restriction enzyme site for cloning, a Kozak sequence CCACC for translation initiation (Kozak, J. Mol. Biol. 196: 947-950), the ATG potential of the ORF and about 17 bases specific for the 5 'portion of the ORF.

L'amorce du côté C-Terminal a été définie de manière à ce que l'ORF clonée soit en fusion dans sa partie 3' avec une répétition de 8 histidines et un codon stop présents dans le vecteur derrière le site multiple de clonage, d'où l'insertion d'une base " A " pour garder la bonne phase de lecture après le clonage et la disparition du codon stop de l'ORF. The primer at the C-terminal has been set so that the cloned ORF is molten in its 3 'part with a repetition of 8 histidines and a stop codon present in the vector behind the multiple cloning site, to Where the insertion of a base "A" to keep the correct reading frame after cloning and the disappearance of the stop codon of the ORF. L'amorce du côté C-Terminal comprend ainsi un site de restriction enzymatique pour le clonage, une base " A ", puis environ 20 bases spécifiques de la partie 3' du gène à partir du codon précédent le codon stop. The primer at the C-terminal thus includes a restriction enzyme site for cloning, a base "A" and about 20 bases specific for the 3 'portion of the gene from the codon preceding the stop codon.

Après recherche des sites de restriction absents chez chacune des ORFs à l'aide du sous-programme MapDraw de DNASTAR (Lasergene Software), les sites de restriction Xbal en 5' et Bglll en 3' sont utilisés pour l'ORF SEQ ID n°19. After searching restriction sites absent in each of the ORFs using the subroutine MAPDRAW DNASTAR (Lasergene Software), XbaI restriction sites at the 5 'BglII and 3' are used for ORF SEQ ID No. 19. Pour l'ORF SEQ ID n°41 , les sites Spel en 5' et Bglll en 3' sont utilisés. ORF for SEQ ID No. 41, SpeI sites at the 5 'and BglII 3' are used. Les sites de restriction Xbal en 5' et BamHl en 3' sont utilisés pour cloner les ORFs restantes. The XbaI restriction sites 5 'BamHI and 3' are used to clone the remaining ORFs.

Le mélange de PCR comprend pour un volume final de 100 μl, 10-50 ng ADN génomique, les amorces N-Terminale et C-Terminale à 200 nM chacun, les dNTPs à 250 μM chacun, le tampon PCR 1 X (Composition du tampon PCR 10X : 200 mM Tris-HCI (pH8.8), 20 mM MgS04, 100 mM KCI, 100 mM (NH4)2S04, 1 % TritonX-100, 1 mg/ml de sérumalbumine de bœuf exempte de nucléase) et 2,5 U de Polymerase. The PCR mixture contains in a final volume of 100 mu.l, 10-50 ng genomic DNA, primers N-terminal and C-terminal 200 nM each, dNTPs at 250 microM each, 1 X PCR buffer (buffer composition 10X PCR: 200 mM Tris-HCl (pH8.8), 20 mM MgS04, 100 mM KCl, 100 mM (NH4) 2S04, 1% TritonX-100, 1 mg / ml bovine serum albumin nuclease-free) and 2, 5 U polymerase.

L'amplification se fait comme suit : The amplification is as follows:

Etape Température (°C) Temps (min.) Nombre de cycles Step Temperature (° C) Time (min.) Number of cycles

Dénaturation 97 0.45 25 Denaturation 97 0.45 25

Hybridation cf tableau 1 25 See Table hybridization January 25

Elongation 72 1/kb ADN 25 Elongation 72 25 1/kb DNA

Les amorces utilisées et les conditions de PCR présentées dans le tableau ci-dessous, dans lequel "variant allelique N. g" signifie qu'un variant allelique est présent chez Neisseria gonorrhoeae et "variant allelique N. m A" signifie qu'un variant allelique est présent chez Neisseria meningitidis de sérogroupe A. The primers used and the PCR conditions shown in the table below, in which "allelic variant N. g" means that an allelic variant is present in Neisseria gonorrhoeae and "allelic variant N m" means a variant allelic is present in Neisseria meningitidis serogroup A.

Figure imgf000029_0002

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Figure imgf000030_0001

Figure imgf000031_0001

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2 - Clonage, transformation et sélection des recombinants 2 - Cloning, transformation and selection of recombinant

Le vecteur de clonage utilisé est le vecteur pCA/Myc-His ou pM1070 de 6.357 kb (cf figure), issu du plasmide pCDNA 3.1 (Invitrogen). The cloning vector used is the vector pCA / Myc-His or pM1070 of 6357 kb (see figure), derived from plasmid pcDNA 3.1 (Invitrogen). Le pCA/Myc-His comprend notamment le promoteur ie1 de CMV (bases 249-902), l'intron A du gène ie1 de CMV (Chapman et al., 1991 Nucleic Acids Research, 19, 3979-3986), un site multiple de clonage (bases 1792-1852) avec les sites Pmll, EcoRV, Notl , Xbal, BamHl, Kpnl et Hindlll, une séquence codant pour une polyhistidine et un codon stop (bases 1908-1928), une séquence de terminaison 3'bgh (bases 1853-2197) et le gène de résistance à l'ampiciiline pour la sélection des clones recombinants dans E. The pCA / Myc-His ie1 promoter includes the CMV (bases 249-902), the intron of the gene of CMV ie1 (Chapman et al., 1991 Nucleic Acids Research, 19, 3979-3986), a multi-site clone (bases 1792-1852) with PmlI sites, EcoRV, NotI, XbaI, BamHI, KpnI and HindIII, a sequence coding for a polyhistidine and a stop codon (bases 1908-1928), a termination sequence 3'bgh ( bases 1853-2197) and the gene for resistance to ampicillin for selection of recombinant clones in E. coli. coli.

Après purification (Kit GeneClean Bio101 ), les produits d'amplification PCR sont digérés 2 heures à 37°C par les enzymes adéquates (Xbal-BamHI, Xbal-Bglll, ou Spel-Bglll) dans un volume réactionnel final de 20 μl. After purification Kit (Bio101 GeneClean), the PCR amplification products were digested for 2 hours at 37 ° C by appropriate enzymes (XbaI-BamHI, BglII-XbaI or SpeI-BglII) in a final reaction volume of 20 mu.l. Les produits de digestion sont alors ligués avec le vecteur pCA/Myc-His préalablement digéré par Xbal et BamHl selon le protocole de "Rapid DNA Ligation Kit" (Boehringer Mannheim). The digestion products were then ligated with the vector pCA / Myc-His previously digested with XbaI and BamHI according to the protocol "Rapid DNA Ligation Kit" (Boehringer Mannheim). 15 μl de la ligature est utilisé pour transformer 100 μl de cellules compétentes E. 15 l of the ligation was used to transform competent cells mu.l of 100 E. coli XLI-blue (Novagen). coli XLI-Blue (Novagen). Les cellules sont incubées 30 minutes dans la glace, 30 secondes à 42°C et 2 minutes dans la glace. Cells were incubated for 30 minutes on ice, 30 seconds at 42 ° C and 2 minutes in ice. Puis on ajoute 500 μl de milieu LB sans antibiotique et on incube 1 heure à 37°C. Then 500 mu.l of LB medium without antibiotics and incubated for 1 hour at 37 ° C. Ensuite 50 et 550 μl de la culture sont étalés sur des boites de milieu LB plus ampicilline (50 μg/ml concentration finale) et incubés une nuit à 37°C. Then 50 and 550 mu.l of culture were spread on plates of LB medium plus ampicillin (50 mg / ml final concentration) and incubated overnight at 37 ° C.

Le lendemain 36 colonies sont mises en culture dans 2 ml de LB plus ampicilline (50 μg/mi) et incubées une nuit à 37°C. The next 36 colonies were grown in 2 ml of LB plus ampicillin (50 mg / ml) and incubated overnight at 37 ° C.

Le lendemain l'ADN plasmidique est extrait selon le protocole Qiagen mini-prep (Qiagen) et les recombinants sont identifiés par restriction enzymatique suivi d'une électrophorèse sur gel d'agarose. The following day plasmid DNA is extracted according to the protocol Qiagen mini-prep (Qiagen) and recombinants were identified by restriction enzyme followed by electrophoresis on agarose gel. Les jonctions de clonage sont ensuite vérifiées par séquençage. The cloning junctions were then verified by sequencing. Exemple II : Evaluation de l'activité protectrice des ORF de l'invention Example II: Evaluation of the protective activity of the ORF of the invention

A. A. Préparation de l'ADN destiné aux expériences d'immunisations : Preparation of DNA for experiments immunizations:

Une colonie isolée d'un clone recombinant est utilisée pour inoculer une préculture en milieu LB+ ampicilline et 5 ml de cette préculture représente l'inoculât d'une culture de 2,5 litres en milieu LB+ ampicilline. A single colony of a recombinant clone was used to inoculate a preculture in LB medium + ampicillin and 5 ml of this preculture inoculum represents a 2.5-liter culture in LB medium + ampicillin. Le protocole de purification pour préparer l'ADN plasmidique est celui décrit dans le Kit EndoFree Giga (Qiagen). The purification protocol for preparing plasmid DNA is described in the Endofree Giga Kit (Qiagen). L'ADN purifié est élue de la colonne de purification avec un tampon Tris-HCI 10 mM EDTA 1 mM pH 8 et conservé à - 20°C. The purified DNA was eluted from the purification column with a buffer 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8 and stored at - 20 ° C. Avant l'injection, le plasmide recombinant purifié est dilué à raison de 100 μg/ml avec de l'eau (de qualité pour préparation injectable) et la concentration en NaCI est amenée à 150 mM. Prior to injection, the purified recombinant plasmid is diluted at a rate of 100 g / ml with water (for injection quality) and the NaCl concentration is brought to 150 mM.

B. B. Production d'un sérum polyclonal spécifique : Production of a polyclonal serum specific:

B. B. 1 . 1. Hyperimunisation dans un modèle animal : Hyperimunisation in an animal model:

Le modèle animal utilisé est la souris ou le lapin. The animal model used is the mouse or rabbit. La voie d'administration de l'ADN injecté est la voie intramusculaire ou la voie intradermique. The route of administration of the injected DNA is intramuscularly or intradermally. Les plasmides recombinants à injecter sont éventuellement appliqués sur des billes s'ils sont injectés chez l'animal avec un appareil gène gun (BioRad). The recombinant plasmids injected are optionally applied on beads if they are injected in animals with a gene gun device (BioRad). Le protocole d'immunisation suit un schéma comportant deux injections à 3 semaines d'intervalles. The immunization protocol follows a regimen of two injections at 3-week intervals.

B.2. B.2. Analyse de l'activité bactéricide des anticorps induits : Analysis of the bactericidal activity of antibodies induced:

Dix jours après la dernière injection, les animaux sont saignés et les sera sont analysés avec le test de bactéricidie selon le protocole de Danve et al., Vaccine (1993) 1 1 (12) :1214. Ten days after the last injection, the animals are bled and the sera were analyzed with the bactericidal test according to the protocol Danve et al., Vaccine (1993) 1 1 (12): 1214. Brièvement, les sera sont incubés à différentes dilutions (raison 2) en présence de complément de lapin et de méningococoques cultivés en présence ou en absence d'un agent chélatant du fer. Briefly, sera were incubated at different dilutions (reason 2) in the presence of rabbit complement and méningococoques cultured in the presence or absence of a chelating agent for iron. Le titre de bactéricidie d'un sérum représente l'inverse de la dilution de cet antisérum pour lequel 50% des bactéries sont lysées. The title of a serum bactericidal represents the inverse of the dilution of this antiserum at which 50% of bacteria are lysed.

On considère que l'antisérum n'est pas bactéricide lorsque son titre est inférieur à 4 contre la souche homologue. We consider that the antiserum is not bactericidal when the title is less than 4 against the homologous strain.

Quand le titre de bactéricidie correspond à une séroconversion d'un facteur 4 contre la souche homologue, l'activité bactéricide de l'antisérum est analysée vis-à-vis des autres souches de Neisseria pour mesurer l'étendue de la réactivité croisée de l'antisérum d'intérêt. When the title is bactericidal seroconversion factor of 4 against the homologous strain, the bactericidal activity of the antiserum is analyzed vis-à-vis other Neisseria strains to measure the extent of cross-reactivity of antiserum of interest.

Exemple III : Production de protéines recombinantes purifiées Example III: Production of purified recombinant proteins

Production recombinante de protéines Recombinant production of proteins

a. a. Préparation des transformants : Preparation of transformants:

Le produit de PCR obtenu est ensuite digéré à 37°C pendant deux heures avec des enzymes de restriction dans 20 μl de volume réactionnel. The obtained PCR product is then digested at 37 ° C for two hours with restriction enzymes in 20 mu.l reaction volume. Le produit de digestion est ligaturé dans un plasmide pET28a (Novagen), clivé de manière similaire, qui est déphosphorylé avant la ligature par traitement avec la phosphatase alcaline intestinale de veau. The digestion product was ligated into plasmid pET28a (Novagen) cleaved similarly, which is dephosphorylated prior to ligation by treatment with calf intestinal alkaline phosphatase. Le gène de fusion construit de cette manière permet la purification par affinité en une étape de la protéine de fusion résultante en raison de la présence de résidus histidine à l'extrémité N-terminale de la protéine de fusion qui sont codés par ce vecteur. The fusion gene constructed in this manner allows the affinity purification step of the resulting fusion protein due to the presence of histidine residues at the N-terminus of the fusion protein which is encoded by this vector. La réaction de ligature (20 μl) est effectuée à 14°C une nuit, avant transformation de 100 μl de cellules compétentes fraîches E. The ligation reaction (20 uL) is carried out at 14 ° C overnight, before conversion of 100 mu.l of competent cells E. Fresh coli XL1-blue (Novagen). coli XL1-blue (Novagen). Les cellules sont incubées sur de la glace pendant deux heures puis soumises à un choc thermique à 42°C pendant 30 secondes avant d'être remises dans la glace pendant 90 secondes. The cells were incubated on ice for two hours and then subjected to a heat shock at 42 ° C for 30 seconds before being returned to the ice for 90 seconds. Les échantillons sont ensuite ajoutés à 1 ml de bouillon LB en l'absence de sélection et cultivés à 37°C pendant deux heures. The samples are then added to 1 ml of LB broth in the absence of selection and cultured at 37 ° C for two hours. Les cellules sont ensuite étalées sur du milieu gélose LB additionné de kanamycine (50 μg/ml de concentration finale) à une dilution 10x, et sont incubées une nuit à 37°C. The cells were then plated on LB agar supplemented with kanamycin (50 mg / ml final concentration) at a dilution 10x, and incubated overnight at 37 ° C. Le jour suivant, 50 colonies sont repiquées sur des boîtes secondaires et sont incubées à 37°C une nuit. The next day, 50 colonies were subcultured on plates and side were incubated at 37 ° C overnight.

b. b. Production de la protéine : Les transformants stockés (10 μl) sont étalés sur des boîtes de sélection et cultivés une nuit à 37°C. Protein production: The stored transformants (10 mu.l) were plated on selection and grown overnight at 37 ° C. Quelques cellules sont recueillies à partir de la boîte utilisée comme inoculum pour une culture starter une nuit (3 ml) à 37°C. Some cells are collected from the box used as a starter culture inoculum for one night (3 ml) at 37 ° C. Le jour suivant, un échantillon (temps T=0) est recueilli et centrifugé à 14 000 tpm pendant 3 minutes. The next day, a sample (time T = 0) was collected and centrifuged at 14,000 rpm for 3 minutes. La culture starter est ensuite utilisée pour inoculer un milieu LB contenant de la kanamycine (100 μg/ml) à une dilution de 1 :50 (densité optique de départ DO600 = 0,05-0,1 ). The starter culture was then used to inoculate LB medium containing kanamycin (100 mg / ml) at a dilution of 1: 50 (starting optical density OD600 = 0.05 to 0.1). Les cellules sont cultivées à une DO600 de 1 ,0, un échantillon est recueilli pour une SDS-PAGE (échantillon de pré-induction) et la culture restante est induite avec 1 mM d'IPTG. The cells were cultured at an OD600 of 1, 0, a sample is collected for SDS-PAGE (pre-induction sample) and the remaining culture was induced with 1 mM IPTG. Les cultures sont cultivées pendant quatre heures et des échantillons sont prélevés toutes les heures. Crops are grown for four hours and samples were taken every hour. La culture est centrifugée à 600 xg pendant 20 minutes à 4°C. The culture is centrifuged at 600 xg for 20 minutes at 4 ° C. Le surnageant est écarté et les culots sont resuspendus dans 50 mM de Tris-HCI (pH : 8,0), 2 mM EDTA, et recentrifugé. The supernatant was discarded and the pellets were resuspended in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM EDTA, and recentrifuged. Le surnageant est écarté et les cellules sont stockées à -70°C. The supernatant is discarded and the cells were stored at -70 ° C.

2. 2. Purification des protéines Protein Purification

Les culots obtenus à partir d'un litre de culture préparé selon l'exemple 1.4 précédent sont séchés et resuspendus dans 20 ml de 20 mM Tris- HCI (pH 8.0), 0.5 M NaCI, 5 mM Imidazole, refroidis dans la glace. The pellets obtained from one liter of culture prepared according to Example 1.4 above are dried and resuspended in 20 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, cooled in ice. Du lysozyme est ajoutée à une concentration de 0,1 mg/ml et la suspension est homogénéisée en utilisant un homogénéiseur à haute vitesse (Turrax) puis traitée avec un sonicateur (Branson, Sonofier 450). Lysozyme is added at a concentration of 0.1 mg / ml and the suspension was homogenized using a high speed homogenizer (Turrax) and then treated with a sonicator (Branson, Sonofier 450). De la Benzonase (Merck) est utilisée à une concentration finale de 1 U/ml pour éliminer l'ADN. Of Benzonase (Merck) is used at a final concentration of 1 U / ml to remove DNA. La suspension est centrifugée à 40 000 xg pendant 20 minutes et le surnageant est filtré à travers une membrane de 0,45 μm. The suspension was centrifuged at 40,000 xg for 20 minutes and the supernatant is filtered through a membrane of 0.45 microns. Le surnageant est chargé sur une colonne IMAC (12 ml de résine) qui a été préparée en immobilisant des cations Ni selon les recommandations du fabricant (Pharmacia). The supernatant was loaded onto an IMAC column (12 ml resin) was prepared by immobilizing Ni cations according to the manufacturer's recommendations (Pharmacia). La colonne est lavée avec 10 volumes de colonnes de 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 0.5 M NaCI, 60 mM Imidazole. The column was washed with 10 column volumes of 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 60 mM imidazole. La protéine recombinante est éluée avec six volumes de 20 mM Tris-HCI (pH : 7.9), 0.5 M NaCI, 500 mM Imidazole, 0.1 % Zwittergent 3-14. The recombinant protein was eluted with six volumes of 20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, 0.1% Zwittergent 3-14.

Le profil d'élution est contrôlé en mesurant l'absorbance des fractions à une densité optique de 280 nm. The elution profile is monitored by measuring the absorbance of the fractions at an optical density of 280 nm. Une fraction aliquote est analysée sur un gel SDS-PAGE et colorée avec du bleu de Coomassie (Phast System - Pharmacia), et les fractions correspondant au pic de protéine sont ensuite regroupées et concentrées. An aliquot was analyzed on a SDS-PAGE gel and stained with Coomassie blue (Phast System - Pharmacia), and fractions corresponding to the protein peak were then pooled and concentrated. Pour éliminer le tampon d'élution, la fraction est passée sur une colonne G24 Sephadex (Pharmacia), équilibrée dans du tampon PBS (pH : 7,4). To remove the elution buffer, the fraction is passed over a Sephadex G24 column (Pharmacia) equilibrated in PBS buffer (pH 7.4). La solution protéique est stérilisée par filtration à travers une membrane de 0,45 μm, et la concentration protéique est déterminée par la microméthode BCA (Pierce). The protein solution is sterilized by filtration through a 0.45 mm membrane, and the protein concentration was determined by the BCA micromethod (Pierce). La solution protéique est stockée à -70°C. The protein solution was stored at -70 ° C.

Exemple IV : Production d'anticorps polyclonaux monospécifiques Example IV: Production of monospecific polyclonal antibodies

1. 1. Antisérum hyperimmun de lapin Hyperimmune rabbit antiserum

On injecte à des lapins de Nouvelle Zélande à la fois par voie cutanée et par voie intraveineuse 100 μg (au total) du polypeptide purifié à l'exemple III, en présence d'adjuvant complet de Freund dans un volume total d'approximativement 2 ml. Injected into rabbits of New Zealand both dermal and intravenous 100 mg (total) of the purified polypeptide in Example III in the presence of Freund's complete adjuvant in a total volume of approximately 2 ml . 21 et 42 jours après l'injection initiale, les doses de rappel qui sont identiques aux doses initiales, sont administrées de la même manière, à l'exception du fait que de l'adjuvant incomplet de Freund est utilisé. 21 and 42 days after the initial injection, booster doses which are identical to the initial doses are administered in the same manner, except that the incomplete Freund's adjuvant is used. 15 jours après la dernière injection, le sérum de l'animal est recueilli, décomplémenté, et filtré à travers une membrane de 0,45 μm. 15 days after the last injection, the serum of the animal is collected, decomplemented and filtered through a 0.45 mm membrane.

2. 2. Liquide d'ascites hyperimmun de souris Ascites hyperimmune mouse

On injecte à 10 souris par voie sous-cutanée 10-50 μg du polypeptide de fusion purifié obtenu à l'exemple II, en présence d'adjuvant complet de Freund, dans un volume d'approximativement 200 μl. 10 mice were injected subcutaneously with 10-50 mg of purified fusion polypeptide obtained in Example II, in the presence of Freund's complete adjuvant in a volume of approximately 200 mu.l. 7 et 14 jours après l'injection initiale, des doses de rappel, qui sont identiques aux doses initiales, sont administrées de la même manière, à l'exception du fait que de l'adjuvant incomplet de Freund est utilisé. 7 and 14 days after the initial injection, booster doses, which are identical to the initial doses are administered in the same manner, except that the incomplete Freund's adjuvant is used. 21 et 28 jours après l'injection initiale, les souris reçoivent 50 μg de l'antigène seul par voie intrapéritonéale. 21 and 28 days after the initial injection, the mice received 50 micrograms of antigen alone intraperitoneally. Au 21 jour, on injecte également aux souris par voie intrapéritonéale, les cellules 180/TG CM26684 de sarcome (Lennette & Schmidt, Diagnostic procédures for viral, rickettsial, and chlamydial infections, (1979) 5th Ed. Washington DC, American Public Health Association). At 21 days, the mice also injected intraperitoneally cells 180/TG CM26684 sarcoma (Lennette & Schmidt, Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlamydial infections, (1979) 5th Ed Washington DC, American Public Health Association ). Les liquides d'ascites sont recueillis 10 à 13 jours après la première injection. The ascites fluids were collected from 10 to 13 days after the first injection.

Exemple V : Purification des polypeptides de l'invention par immunoaffinité Example V: Purification of the polypeptides of the invention by immunoaffinity

1. 1. Purification d'IgG spécifique Purification of specific IgG

Un sérum immun tel que préparé à l'exemple IV est appliqué à une colonne de protéine A Sépharose 4 Fast Flow (Pharmacia) équilibrée avec 100 mM Tris-HCI (pH: 8,0). Immune serum as prepared in Example IV was applied to a column of protein A Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia) equilibrated with 100 mM Tris-HCl (pH 8.0). La résine est lavée en appliquant 10 volumes de colonnes de 100 mM Tris-HCI et 10 volumes de 10 mM Tris-HCi (pH : 8,0) à la colonne. The resin was washed using 10 column volumes of 100 mM Tris-HCl and 10 volumes of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to the column. Les IgG sont éluées avec un tampon glycine de 0,1 M (pH : 3,0) et sont recueillies par fraction de 5 ml auxquelles on ajoute 0,25 ml de Tris-HCI 1 M (pH : 8,0). IgG were eluted with a 0.1 M glycine buffer (pH 3.0) and are collected in fractions of 5 ml which 0.25 ml of 1 M Tris-HCl (pH 8.0). La densité optique de l'éluat est mesurée à 280 nm et les fractions contenant les IgG sont regroupées et si nécessaire stockées à -70°C. The optical density of the eluate was measured at 280 nm and fractions containing IgG were pooled and if necessary stored at -70 ° C.

2. 2. Préparation de la colonne Preparation of the column

Une quantité appropriée de gel Sépharose 4B activé par CNBr (1 g de gel séché fournissant approximativement 3,5 ml de gel hydraté, et la capacité du gel allant de 5 à 10 mg d'IgG couplée par ml de gel) fabriqué par Pharmacia (17-0430-01 ) et suspendue dans un tampon HCI de 1 mM et lavée avec un buchner par addition de petites quantités de tampon HCI 1 mM. An appropriate amount of gel CNBr activated Sepharose 4B (1 g dry gel providing approximately 3.5 ml of hydrated gel and the ability of the gel of from 5 to 10 mg of IgG per ml of gel coupled) manufactured by Pharmacia ( 17-0430-01) and suspended in a buffer of 1 mM HCl and washed with a Buchner funnel by addition of small amounts of HCl 1 mM buffer. Le volume total du tampon est de 200 ml par gramme de gel. The total volume is 200 ml buffer per gram of gel. Les IgG purifiées sont dialysées pendant quatre heures à 20±5°C contre 5 volumes de tampon PBS de 500 mM (pH : 7,5). The purified IgG were dialyzed for four hours at 20 ± 5 ° C against 5 volumes of 500 mM PBS buffer (pH 7.5). Puis elles sont diluées dans 500 mM de PBS (pH : 7,5) pour une concentration finale de 3 mg/ml. Then they are diluted in 500 mM PBS (pH 7.5) to a final concentration of 3 mg / ml.

Les IgG sont incubées avec le gel une nuit à 5±3°C, sous agitation. IgG were incubated with the gel overnight at 5 ± 3 ° C with stirring. Le gel est tassé dans une colonne de chromatographie et lavé avec 2 volumes de colonne de tampon phosphate, 500 mM (pH : 7,5) puis un volume de tampon sodium 50 mM NaCI (pH : 7,5). The gel was packed into a chromatography column and washed with 2 column volumes of phosphate buffer, 500 mM (pH 7.5) and then a volume of buffer 50 mM sodium NaCl (pH 7.5). Le gel est ensuite transféré dans un tube puis incubé avec 100 mM d'éthanolamine, (pH : 7,5) pendant 4 heures à température ambiante sous agitation, puis lavé deux fois avec deux volumes de colonnes de PBS. The gel was then transferred into a tube and then incubated with 100 mM ethanolamine (pH 7.5) for 4 hours at room temperature with stirring and then washed twice with two column volumes of PBS. Le gel est ensuite stocké dans du PBS merthiolate à 1/10 000. The gel is then stored in PBS merthiolate 1/10 000. La quantité d'IgG couplé au gel est déterminée en mesurant la densité optique à 280 nm de la solution d'IgG et de l'éluat direct. The amount of IgG coupled to the gel is determined by measuring the optical density at 280 nm of the IgG solution and the eluate directly.

3. 3. Adsorption et élution de l'antigène. Adsorption and elution of the antigen. Une solution d'antigène dans 50 mM Tris-HCI (pH : 8,0), 2 mM Antigen solution in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM

EDTA, par exemple, le surnageant obtenu à l'exemple III.5 après traitement par la Benzonase, centrifugation et filtration à travers une membrane de 0,45 μm, est appliquée à une colonne équilibrée avec 50 mM Tris-HCI (pH :8,0), 2 mM EDTA à une vitesse de flux d'environ 10 ml/heure. EDTA, for example, the supernatant obtained in Example III.5 after Benzonase treatment, centrifugation and filtration through a membrane of 0.45 mm is applied to a column equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8 , 0), 2 mM EDTA at a flow rate of approximately 10 ml / hour. Puis, la colonne est lavée avec 20 volumes de 50 mM Tris-HCI (pH : 8,0), 2 mM EDTA. Then the column was washed with 20 volumes of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM EDTA. De manière alternative, l'adsorption peut être réalisée en " batch " qui est laissé une nuit à 5 ±3°C, sous agitation. Alternatively, the adsorption can be achieved by "batch" is left overnight at 5 ± 3 ° C with stirring.

Le gel est lavé avec 2 à 6 volumes de tampon PBS 10 mM (pH : 6,8). The gel is washed with 2-6 volumes of buffer 10 mM PBS (pH 6.8). L'antigène est élue avec un tampon glycine 100 mM (pH : 2,5). The antigen was eluted with 100 mM glycine buffer (pH 2.5). L'éluat est recueilli dans des fractions de 3 ml auquel on ajoute 150 μl de tampon PBS 1 mM (pH : 8,0). The eluate was collected in 3 ml fractions which were added 150 mu.l of 1 mM PBS buffer (pH 8.0). La densité optique est mesurée à 280 nm pour chaque fraction ; celles contenant l'antigène sont recueillies et stockées à -20°C. The optical density was measured at 280 nm for each fraction, and those containing the antigen is collected and stored at -20 ° C. Fragments du génome de N. Fragments of the genome of N. meningitidis Z2491 décrits dans la demande de brevet meningitidis Z2491 described in patent application

WO98/02 547 WO98/02 547

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 70A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 70A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 243 paires de bases (A) LENGTH: 243 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

( l) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (L) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 70A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 70A:

GATCAGACCC ATTTTCAGCG CACCGTAAGC GCGGATTTTC TCGAATTTTT CCAAAGCTGC 60 GATCAGACCC ATTTTCAGCG CACCGTAAGC GCGGATTTTC TCGAATTTTT CCAAAGCTGC 60

GGCATCGTTG TTGATGTCGT CTTGCAACTC TTTGCCCGTG TAGCCCAAGT CGGCGGCATT 120 GGCATCGTTG TTGATGTCGT CTTGCAACTC TTTGCCCGTG TAGCCCAAGT CGGCGGCATT 120

CAGGAAAACG GTCGGAATGC CCGCGTTGAT GAGCGTGGCT TTCAAACGGC CTATATTCGG 180 CAGGAAAACG GTCGGAATGC CCGCGTTGAT GAGCGTGGCT TTCAAACGGC CTATATTCGG 180

CACATCAATT TCATCGACCA AATTGCCGGT TGGGAACATA CTGCCTTCGC CGTCGGCTGG 240 CACATCAATT TCATCGACCA AATTGCCGGT TGGGAACATA CTGCCTTCGC CGTCGGCTGG 240

ATC 243 ATC 243

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 73A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 73A:

(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (L) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 120 paires de bases (A) LENGTH: 120 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (M) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 73A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 73A:

CGGTCAGAAA CAGGCAAGGT AATGAAAATG CCTGAGGCAC GGACTGTGCT GCGAACGAAA 60 CGGTCAGAAA CAGGCAAGGT AATGAAAATG CCTGAGGCAC GGACTGTGCT GCGAACGAAA 60

ACTCCTTACC GAAGTCTTCT ATACCCAGGC TCAATAGCCG CTCAAGGAGA GAGCTATCAT 120 ACTCCTTACC GAAGTCTTCT ATACCCAGGC TCAATAGCCG CTCAAGGAGA GAGCTATCAT 120

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 74A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 74A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 120 paires de bases (A) LENGTH: 120 base pairs

(B) TYPE, nucléotide (B) TYPE nucleotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (N) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 74A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 74A:

CGGTCAGAAA CAGGCAAGGT AATGAAAATG CCTGAGGCAC GGACTGTGCT GCGAACGAAA 60 CGGTCAGAAA CAGGCAAGGT AATGAAAATG CCTGAGGCAC GGACTGTGCT GCGAACGAAA 60

ACTCCTTACC GAAGTCTTCT ATACCCAGGC TCAATAGCCG CTCAAGGAGA GAGCTATCAT 120 ACTCCTTACC GAAGTCTTCT ATACCCAGGC TCAATAGCCG CTCAAGGAGA GAGCTATCAT 120

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 77A (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 77A

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 269 paires de bases (A) LENGTH: 269 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (N) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 77A: (Iv) ANTI-SENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 77A:

CGGAGCATAA AATCGTTATT AAAGATAATG GTATAGGAAC GAGCTTCGAT GAAATCAATG 60 CGGAGCATAA AATCGTTATT AAAGATAATG GTATAGGAAC GAGCTTCGAT GAAATCAATG 60

ATTTTTATTT GAGAATCGGT CGGAACAGAA GGGAAGAAAA ACAAGCCTCC CCGTGCGGAA 120 ATTTTTATTT GAGAATCGGT CGGAACAGAA GGGAAGAAAA ACAAGCCTCC CCGTGCGGAA 120

GAATTCCAAC GGGTAAAAAA GGCCTTGGTA AATTGGCATT ATTCGGGCTT GGCAACAAAA 180 GAATTCCAAC GGGTAAAAAA GGCCTTGGTA AATTGGCATT ATTCGGGCTT GGCAACAAAA 180

TTGAAATTTC TACTATCCAG GGAAACGAAA GGGTTACTTT TACTTTGGAT TATGCAGAGA 240 TTGAAATTTC TACTATCCAG GGAAACGAAA GGGTTACTTT TACTTTGGAT TATGCAGAGA 240

TTCGAAGAAG CAAGGGTATT TATCAACCG 269 TTCGAAGAAG CAAGGGTATT TATCAACCG 269

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 80A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 80A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 207 paires de bases (A) LENGTH: 207 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETIQUE: NON (Iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 80A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 80A:

CGGGTCGCTT TATTTTGTGC AGGCATTATT TTTCATTTTT GGCTTGACAG TTTGGAAATA 60 CGGGTCGCTT TATTTTGTGC AGGCATTATT TTTCATTTTT GGCTTGACAG TTTGGAAATA 60

TTGTGTATCG GGGGGGGGTA TTTGCTGACG TAAAAAACTA TAAACGCCGC GCAAAATATG 120 TTGTGTATCG GGGGGGGGTA TTTGCTGACG TAAAAAACTA TAAACGCCGC GCAAAATATG 120

GCTGACTATA TTATTGACTT TGATTTTGTC CTGCGCGGTG ATGGATAAAA TCGCCAGCGA 180 GCTGACTATA TTATTGACTT TGATTTTGTC CTGCGCGGTG ATGGATAAAA TCGCCAGCGA 180

TAAAGAATTT GCGAGAACCT GATGCCG 207 TAAAGAATTT GCGAGAACCT GATGCCG 207

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 81A : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 81A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 224 paires de bases (A) LENGTH: 224 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(1 1 ) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (1 1) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 81A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 81A:

CGGCAACGAT TTGAGCTATC GCGGTTACGA CATTCTGGAT TTGGCACAAA AATGCGAGTT 60 CGGCAACGAT TTGAGCTATC GCGGTTACGA CATTCTGGAT TTGGCACAAA AATGCGAGTT 60

TGAAGAAGTC GCCCACCTGC TGATTCACGG CCATCTGCCC AACAAATTCG AGCTGGCCGC 120 TGAAGAAGTC GCCCACCTGC TGATTCACGG CCATCTGCCC AACAAATTCG AGCTGGCCGC 120

TTATAAAACC AAGCTCAAAT CCATGCGCGG CCTGCCTATC CGTGTGATTA AAGTTTTGGA 180 TTATAAAACC AAGCTCAAAT CCATGCGCGG CCTGCCTATC CGTGTGATTA AAGTTTTGGA 180

AAGCCTGCCT GCACATACCC ATCCGATGGA CGTAATGCGT ACCG 224 AAGCCTGCCT GCACATACCC ATCCGATGGA CGTAATGCGT CAGS 224

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 87A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 87A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 273 paires de bases (A) LENGTH: 273 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

( l) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (L) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(ni) HYPOTHETIQUE: NON (Ni) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(x ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 87A: (X) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 87A:

AATTTCCACC TATGCCCTAC GCAGCGATTA TCCGTGGTTT ACCCAAAGGG TGATTATGGC 60 AATTTCCACC TATGCCCTAC GCAGCGATTA TCCGTGGTTT ACCCAAAGGG TGATTATGGC 60

AAAAGCGCGG GGTTGAGCGA CCGCCTTTTG TTGCCGGCGT TCAAACGGGT TTTGATAGGA 120 AAAAGCGCGG GGTTGAGCGA CCGCCTTTTG TTGCCGGCGT TCAAACGGGT TTTGATAGGA 120

AATGCAGGCA CGAAGCCTCG GCTGATTGTG ATGCACCTGA TGGGTTCGCA CAGTGATTTT 180 AATGCAGGCA CGAAGCCTCG GCTGATTGTG ATGCACCTGA TGGGTTCGCA CAGTGATTTT 180

TGCACACGTT TGGATAAGGA TGCGCGGCGG TTTCAGTATC AAACTGAAAA AATATCCTGC 240 TATGTTTCCA TCAATCGCGC AAACCGATAA ATT 273 TGCACACGTT TGGATAAGGA TGCGCGGCGG TTTCAGTATC AAACTGAAAA AATATCCTGC TATGTTTCCA TCAATCGCGC AAACCGATAA ATT 240 273

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 88A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 88A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 270 paires de bases (A) LENGTH: 270 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (N) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(ni) HYPOTHETIQUE- NON (Ni) HYPOTHETICAL NON-

(iv) ANTI-SENS. (Iv) ANTI-SENSE. NON NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 88A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 88A:

AATTCTTCCG CACGGGGAGG CTTGTTTTTC TTCCCTTCTG TTCCGACCGA TTCTCAAATA 60 AATTCTTCCG CACGGGGAGG CTTGTTTTTC TTCCCTTCTG TTCCGACCGA TTCTCAAATA 60

AAAATCATTG ATTTCATCGA AGTTCATTCC TATACCATTA TCTTTAATAA CGATTTTATG 120 AAAATCATTG ATTTCATCGA AGTTCATTCC TATACCATTA TCTTTAATAA CGATTTTATG 120

CTCCGGTTTA TCGAATAACC TAACTTCCAC TTCCGTAGCA CATGCATCGT AGGCATTCGC 180 CTCCGGTTTA TCGAATAACC TAACTTCCAC TTCCGTAGCA CATGCATCGT AGGCATTCGC 180

TATCAACTCG GCAATCGCAG GAACAGTGTG CGAATACAAT CTTTACACCC AAATGTTCGA 240 TATCAACTCG GCAATCGCAG GAACAGTGTG CGAATACAAT CTTTACACCC AAATGTTCGA 240

TTACGGTTGG CTCGAAACTC AATTTCAATT 270 TTACGGTTGG CTCGAAACTC AATTTCAATT 270

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 89A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 89A:

( ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: () SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 267 paires de bases (A) LENGTH: 267 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (N) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

Figure imgf000044_0001
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 89A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 89A:

AATTATGAAC ACACGCATCA TCGTTTCGGC TGCGTTCGTT GCGTTGGCAT TAGCAGGTTG 60 AATTATGAAC ACACGCATCA TCGTTTCGGC TGCGTTCGTT GCGTTGGCAT TAGCAGGTTG 60

CGGCTCAATC AATAATGTAA CCGTTTCCGA CCAGAAACTT CAGGAACGTG CCGCGTTTGC 120 CGGCTCAATC AATAATGTAA CCGTTTCCGA CCAGAAACTT CAGGAACGTG CCGCGTTTGC 120

CTTGGGCGTC ACCAATGCCG TAAAAATCAG CAACCGCAGC AATGAAGGCA TACGCATCAA 180 CTTGGGCGTC ACCAATGCCG TAAAAATCAG CAACCGCAGC AATGAAGGCA TACGCATCAA 180

CTTTACCGCA ACTGTGGGTA AGCGCGTGAC CAATGCTATG TTACCAGTGT AATCAGCACA 240 CTTTACCGCA ACTGTGGGTA AGCGCGTGAC CAATGCTATG TTACCAGTGT AATCAGCACA 240

ATCGGCGTTA CCACTTCCGA TGCAATT 267 ATCGGCGTTA CCACTTCCGA TGCAATT 267

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 94A: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 94A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 308 paires de bases (A) LENGTH: 308 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (N) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 94A: (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 94A:

AATTTGTTGG GCAGATGGCC GTGAATCAGC AGGTGGGCGA CTTCTTCAAA CTCGCATTTT 60 AATTTGTTGG GCAGATGGCC GTGAATCAGC AGGTGGGCGA CTTCTTCAAA CTCGCATTTT 60

TGTGCCAAAT CCAGAATGTC GTAACCGCGA TACGTCAAAT CGTTGCCGGT ACGCAACGGT 120 TGTGCCAAAT CCAGAATGTC GTAACCGCGA TACGTCAAAT CGTTGCCGGT ACGCAACGGT 120

ACACAAAGCG GTATTACCGG CCGCAACGCC AGAAAGCGCA ACGGATTTTT AGGTTTGAGG 180 ACACAAAGCG GTATTACCGG CCGCAACGCC AGAAAGCGCA ACGGATTTTT AGGTTTGAGG 180

GTCGGGGTTT GAGTAGTTTC AGTCATGGTA TTTCTCCTTT GTGTTTTTAT GGGTTTCGGG 240 GTCGGGGTTT GAGTAGTTTC AGTCATGGTA TTTCTCCTTT GTGTTTTTAT GGGTTTCGGG 240

TTTTCAGACG ACCGATGCGG ATTTGTTGAA AGGCAGTCTG AAAGCGGTAA ATCATTTTTG 300 TTTTCAGACG ACCGATGCGG ATTTGTTGAA AGGCAGTCTG AAAGCGGTAA ATCATTTTTG 300

AAACAATT 30Î AAACAATT 30i

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 95A: (l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 95A (l) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 286 paires de bases (A) LENGTH: 286 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (N) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 95A : (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 95A:

AATTCGGAGG AGCAGTACCG CCAAGCGTTG CTCGCCTATT CCGGCGGTGA TAAAACAGAC 60 AATTCGGAGG AGCAGTACCG CCAAGCGTTG CTCGCCTATT CCGGCGGTGA TAAAACAGAC 60

GAGGGTATCC GCCTGATGCA ACAGAGCGAT TACGGCAACT TGTCCTACCA CATCCGTAAT 120 GAGGGTATCC GCCTGATGCA ACAGAGCGAT TACGGCAACT TGTCCTACCA CATCCGTAAT 120

AAAAACATGC TTTTCATTTT TTCGGCAAGC AATGACGCAC AAGCTCAGCC CAACACAACT 180 AAAAACATGC TTTTCATTTT TTCGGCAAGC AATGACGCAC AAGCTCAGCC CAACACAACT 180

GACCCTATTG CCATTTTATG AAAAAGACGC TCAAAAAGGC ATTATCACAG TTGCAGGCGT 240 GACCCTATTG CCATTTTATG AAAAAGACGC TCAAAAAGGC ATTATCACAG TTGCAGGCGT 240

AGACCGCAGT GGAGAAAAGT TCAATGGCTC CAACCATTGC GGAATT 286 AGACCGCAGT GGAGAAAAGT TCAATGGCTC CAACCATTGC GGAATT 286

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 98A : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 98A:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGUEUR: 316 paires de bases (A) LENGTH: 316 base pairs

(B) TYPE: nucléotide (B) TYPE: nucleic acid

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (C) STRANDEDNESS: single

(D) CONFIGURATION: linéaire (D) TOPOLOGY: linear

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (N) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(m) HYPOTHETIQUE: NON (M) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENS: NON (Iv) ANTI-SENSE: NO

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 98A (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 98A

AATTTGTCGG CAATCTTCCC GGGTCGCTTT ATTTTGTGCA GGCATTATTT TTCATTTTTG 60 GCTTGACAGT TTGGAGATAT TGTGTATCGG GGGGGGGTAT TTGCTGACGT AAAAAACTAT 120 AATTTGTCGG CAATCTTCCC GGGTCGCTTT ATTTTGTGCA GGCATTATTT TTCATTTTTG 60 GCTTGACAGT TTGGAGATAT TGTGTATCGG GGGGGGGTAT TTGCTGACGT AAAAAACTAT 120

AAACGCCGCA GCAAAATATG GCTGACTATA TTATTGACTT TGATTTTGTC CTGCGCGGTG 180 AAACGCCGCA GCAAAATATG GCTGACTATA TTATTGACTT TGATTTTGTC CTGCGCGGTG 180

ATGGATAAAA TCGCCAGCGA TAAAGATTTG CGAGAACCTG ATGCCGGCCT GTTGTTGAAT 240 ATGGATAAAA TCGCCAGCGA TAAAGATTTG CGAGAACCTG ATGCCGGCCT GTTGTTGAAT 240

ATTTTCGACC TGTAATTACG ATTTGGCTTC CGCGCCGGCA CAATATGCCG CCAAGCGGCG 300 ATTTTCGACC TGTAATTACG ATTTGGCTTC CGCGCCGGCA CAATATGCCG CCAAGCGGCG 300

CCCACATTTT GGAAGC 316 CCCACATTTT GGAAGC 316

Citazioni diverse da brevetti
Riferimento
1 *See references of WO0026375A2
Classificazioni
Classificazione internazionaleA61K39/095, C12N15/31, C12N1/21, C07K14/22, C07K16/12, A61K39/00
Classificazione cooperativaA61K2039/51, C07K16/1217, A61K39/095, C07K14/22, A61K39/00
Classificazione EuropeaA61K39/095, C07K14/22, C07K16/12A18
Eventi legali
DataCodiceEventoDescrizione
9 feb 200518DDeemed to be withdrawn
Effective date: 20040730
6 mag 200417QFirst examination report
Effective date: 20040319
17 ott 2001RIN1Inventor (correction)
Inventor name: AUJAME, LUC
Inventor name: BOUCHARDON, ANNABELLE
Inventor name: NASSIF, XAVIER
Inventor name: PERRIN, AGNES
Inventor name: RENAULD-MONGENIE, GENEVIEVE
Inventor name: ROKBI, BACHRA
Inventor name: TINSLEY, COLIN
5 set 2001AKDesignated contracting states:
Kind code of ref document: A2
Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE
5 set 2001AXExtension or validation of the european patent to
Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI
5 set 200117PRequest for examination filed
Effective date: 20010425