WO1998026090A1

WO1998026090A1 - Procede pour determiner la teneur en cholesterol des lipoproteines de haute densite

Info

Publication number: WO1998026090A1
Application number: PCT/JP1997/004442
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Matsui; Yasuki Ito; Shuichi Ohara; Akira Fujiwara
Original assignee: Denka Seiken Co., Ltd.
Priority date: 1996-12-09
Filing date: 1997-12-04
Publication date: 1998-06-18
Also published as: ATE304608T1; CA2246308C; CA2246308A1; DE69734194T2; ES2248856T3; US20020001819A1; JP3164829B2; DE69734194D1; CA2637805A1; EP0887422A1; EP0887422A4; US6479249B2; EP0887422B1; US20020192732A1; US6893832B2

Description

明細書高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法

技術分野

本発明は、高密度リポ蛋白（以下、「H D L J ということがある）中のコレステロールの定量方法に関する。

背景技術

H D Lは、動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るので細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。

H D L中のコレステロールの測定方法としては、例えば超遠心分離によって H D Lを他のリポ蛋白と分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行なってその発色強度を測定する方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも操作が煩雑であつたり、多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的にはほとんど用いられていない。

H D L中のコレステロールの測定方法として現在臨床検査の領域で一般に用いられている方法は、検体に沈殿剤を加えて H D L以外のリポ蛋白質を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離された H D Lのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法である。この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むため、簡便性で満足できるものでなく、また、比較的多量の検体量を必要とする。

—方、酵素的に H D L中のコレステロールを分別定量する方法も既に検討されている。例えば、 H D L以外のリポ蛋白を抗体とポリア二オンで予め凝集させておき、 H D L中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集体を再溶解して吸光度を測定するという方法（特開平 6— 2 4 2 1 1 0号公報）がある。しかしながら、この方法は少なくとも 3回の試薬を添加する操作が必要なため、限定された分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があった。

また、他の方法としては胆汁酸塩又は非イオン界面活性剤の存在下に、酵素反応を行なう方法（特開昭 63— 1 26498号公報）、さらに近年ではコレステロールエステラーゼゃコレステロールォキシダーゼ酵素を化学修飾し、シクロデキストリン等の包接化合物存在下において H D L中のコレステロールを特異的に捕える方法（特開平 7— 301 636号公報）や H D L以外のリポ蛋白と凝集体や複合体を形成させ、その後に H D L中のコレステロールを酵素的反応で捕える方法（特開平 8— 1 3 1 1 97号公報及び特開平 8— 201 393号公報）が知られているが、いずれも臨床検体の一部のもので沈殿法との乖離が認められる等、特異性の点で問題となっている。

発明の開示

本発明の目的は、煩雑な分画分離操作を必要とせず、 H D L並びに低密度リポ蛋白（L D L) 、超低密度リポ蛋白（V L D L) 及びカイロミクロン（CM) 等の他のリポ蛋白を含む被検試料中の H D Lコレステロールを選択的に、簡便かつ正確に定量することができる、 H D L中のコレステロールの定量方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、 H D Lに作用するが他のリポ蛋白にはほとんど作用しない界面活性剤が存在することを見出した。そして、先ず、被検試料中の高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去した後、上記界面活性剤の存在下で酵素的に H D L由来のコレステロールを定量することにより、 H D L及び他のリポ蛋白を含む被検試料中の H D Lコレステロールを選択的に、簡便かつ正確に定量することができることを見出し本発明を完成した。すなわち、本発明は、被検試料中の高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去する第 1工程と、次いで、前記第 1工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレス亍ロールを酵素的に定量する第 2工程とを含む、高密度リポ蛋白中のコレステロ一ルの定量方法を提供する。

本発明の方法によれば、煩雑な分画分離操作を必要とせず、 ^101_並びに!_ 0 し、 V L D L及び CM等の他のリポ蛋白を含む被検試料中の H D Lを選択的に、簡便かつ正確に定量することができる。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の 1実施例の方法により測定した HD L中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定された HD L中のコレステロール量の関係を示す相関図である。

図 2は、本発明の他の 1実施例の方法により測定した H D L中のコレステロ一ル量と、従来の沈殿法により測定された HD L中のコレステロール量の関係を示す相関図である。

図 3は、本発明のさらに他の 1実施例の方法により測定した H D L中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定された HD L中のコレステロール量の関係を示す相関図である。

発明を実施するための最良の形態

リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。

本発明の方法に供される被検試料としては、 HD L、 L D L、 1_ 01_及び〇 M等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血清等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

本発明の方法における第 1工程では、被検試料中の H D L以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去する。ここで、「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解物が次の第 2工程で検出されないようにすることを意味する。 H D L以外のリポ蛋白、すなわち、 LD L、 V LD L及び CM等に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることがでさる。

すなわち、第 1の方法では、 H D Lに作用する界面活性剤の非存在下において, 被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去する。コレステロールエステラーゼの作用により、リポ蛋白中のエステル型コレステロールが加水分解されて遊離型コレステロールと脂肪酸が生じる。次いで、この生じた遊離型コレステロールと元々リポ蛋白中に存在する遊離型コレステロールがコレステロールォキシダーゼの作用で酸化されてコレステノンと過酸化水素が生じる。この生じた過酸化水素を除去する。過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルォキシダーゼの作用により、例えば D AOS (|\|_ェチルー1\1— (2—ヒドロキシスルホプロピル）一 3， 5—ジメチォキシァニリン）のような、過酸化水素と反応して無色キノンを生じるフエノール系又はァニリン系水素供与体化合物と反応させて過酸化水素を無色キノンに転化する方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

上記第 1工程は、 H D Lに作用する界面活性剤の非存在下において行うことにより、 H D L中のコレステロールはほとんど反応せず、 LD L、 V LD L、 CM 等の他のリポ蛋白中のコレステロールが反応して消去される。これにより、次の第 2工程において HD L中のコレステロールが選択的に定量される。

第 1工程の反応液中のコレステロールエステラーゼの濃度は 0. 2〜1 . 0 U Zm l程度が好ましく、また、コレステロールォキシダーゼの濃度は 0. 1 〜0. 7 U単位 I程度が好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は 40〜 1 00 UZ m I程度が好ましく、ペルォキシダーゼの濃度は 0. 4〜 1 . 0 U I程度が好ましい。また、過酸化水素と反応して無色キノンを生じる化合物の濃度は 0. 4〜 0. 8 mmo I / 1程度が好ましい。

第 1工程の反応は、 p H 5〜8の緩衝液中で行なうことが好ましく、緩衝液としてはリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液が好ましい。特にグッドの緩衝液である B i s -Τ r i s、 P I PES、 MO PSO、 B ES、 H E PES 及び PO P SOが好ましく、緩衝液の濃度は 1 0〜50 OmM程度が好ましい。第 1工程で、 HD L以外のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に 2価の金属イオンを含ませてもよい。 2価の金属イオンとしては銅イオン、鉄ィオン及びマグネシウムイオンを好ましく使用することができるが、特にマグネシ 4442

5 ゥムイオンが好ましい。 2価の金属イオンの濃度は 5〜 20 OmM程度が好ましい。

なお、第 1工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白加水分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特に V L D L中のコレステロールが反応し易くなるので好ましい。この酵素の反応液中の濃度は、 5. 0〜1 0. 0 U/m I程度が好ましい。

第 1工程の反応温度は 25°C〜 40°C程度が適当であり、 37°Cが最も好ましし、。また、反応時間は 2〜1 0分間程度でよい。

続く第 2工程では、前記第 1工程の産物に、 HD Lに特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する。ここで、「HD Lに特異的に作用する界面活性剤」とは、当該界面活性剤の存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼ等の酵素を作用させた場合に、 HDL中のコレステロールは反応する（反応率 70%以上、好ましくは 90%以上）が、 HD L以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど反応しない（反応率 30%以下、好ましくは 20%以下）こととなる界面活性剤を言う。このような界面活性剤としては、親水性親油性バランス（H LB) が 1 3 ~1 4の界面活性剤を挙げることができ、中でも、 H LBが 1 3〜1 4の非ィォン界面活性剤、とりわけ、ポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。ここでいう、誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフ： Lノール縮合物等を挙げることができる。また、ポリアルキレンォキサイド誘導体の中でもポリエチレンォキサイド誘導体が最も好ましい。また、複数の界面活性剤を混合することによリ H L Bを上記の範囲内に調整することもでき、このような複数の界面活性剤の混合物を用いることもできる。なお、界面活性剤の H LBの算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀口博著、昭和 61年、三共出版に記載されている。

好ましい界面活性剤の具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンォレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数 4〜35) エーテル、ポリオキシェチレンォクチルフエ二ルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

第 2工程における界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、 0. 05〜3重量％が好ましく、さらには 0. 1 〜 1. 5重量％が好ましい。

上記界面活性剤の存在下において、被検試料中の H D Lコレステロールを酵素的に定量することができる。すなわち、第 1工程では、 H D L以外のリポ蛋白中のコレステロールが大部分消去されるが第 2工程での反応との相乗効果により H D L中のコレステロールのみが定量される。

コレステロールの酵素的な定量方法自体はこの分野において周知であり、例えば第 1工程と同様、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼの作用によリコレステロールエステル及び遊離型コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素を定量することにより行なうことができる。過酸化水素の定量は、例えば、ペルォキシダーゼの存在下で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等により測定することにより行なうことができる。キノン色素は、例えば過酸化水素と 4一ァミノアンチピリン及び DAOS又は H DAOS (N— （2—ヒドロキシスルホプロピル）一3， 5—ジメチォキシァニリン）を反応させることにより形成される。これにより形成されるキノン色素は、 D AOSを用いた場合には波長 593 nmに最大吸収を有し、 H D A O Sを用いた場合には波長 583 η mに最大吸収を有する。キノン色素を生成する化合物の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、例えば 4一ァミノアンチピリンでは好まし〈は 0· 1 〜2. OmM、さらに好まし〈は 0. 5〜 1 . 5mMであり、 DAOS又は H DAOSでは好ましくは 0. 1 〜 1 . 5mM、さらに好ましくは 0. 4〜 1 . 0 mMである。また、ペルォキシダ一ゼの濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、 0. 4〜5 UZm Iが好ましい。なお、第 2工程の好ましい反応条件（反応温度、反応時間、緩衝液、 p H) は、第 1工程の好ましい反応条件と同じである。

なお、第 1工程において、生じた過酸化水素をカタラーゼで分解する場合には、第 2工程ではこのカタラーゼを阻害する必要があるので、第 2工程において例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を用いてカタラーゼを阻害する。実施例

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記例において、「％」は特に断りがない限り「重量％」を示す。

参考例 1

既知濃度の精製 HD L、 L Dし、 V L D L又は CMを含む試料を用い、花王（株）製非イオン性界面活性剤ェマルゲン 91 1 (ポリオキシエチレンノニルエーテル、 H L B 1 3. 7) 、ェマルゲン B 66 (ポリオキシエチレン誘導体、 H L B 1 3. 2) 、又はエマルゲン B 66とェマルゲン A 90 (ポリオキシエチレン誘導体、 H L B 1 4. 5) の混合物の存在下で各リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量した。この操作は具体的に次のように行なった。

5 OmM P I PES緩衝液p H 7. 0、コレステロールエステラーゼ 0. 5 UZm I、コレステロールォキシダ一ゼ 0. 4 UZm l、ペルォキシダーゼ 0. 5 UZm l、 4—ァミノアンチピリン 1. Ommo l Zし HDAOS 0. 5 mmo I Z Iに、ェマルゲン 91 1若しくはェマルゲン B 66を 0. 1重量⁰ /o、又はエマルゲン B66 エマルゲン A90混合物（9Z1 ) 1 . 3重量％を含む試薬を調整し、試料 20 u lに試薬 2. Om l を混和し、 37°C、 1 0分間反応させた後、 600 nmの吸光度を測定した。

その結果、コレステロールの反応率（コレステロール中の定量されたコレステロールの割合）は、 HD L中のコレステロールが約 95%、その他のリポ蛋白中のコレステロールが約 1 8〜22%であった。

このことから、ェマルゲン 91 1、ェマルゲン B66、及びエマルゲン B66 エマルゲン A 90混合物は、本発明で言う「高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤」に該当する。実施例 1

次の組成から成る第 1及び第 2試薬を調製した。

第 1言式薬

P I P ES緩衝液、 p H 7. 0 100 mmo I / I H D AOS 0. / mmo I/I コレステロールエステラーゼ 0.8 U/ml コレステロールォキシダーゼ 0.5 U/ml カタラーゼ 80 U/ml 塩化マグネシウム 10 mmo I / I 第 2試薬

P I P ES緩衝液、 p H 7. 0 100 mmo I / I 4—ァミノアンチピリン 4.0 mmo I/ 1 ペルォキシダーゼ 2.4 U/ml アジ化ナトリウム 0.1%

花王（株）製ェマルゲン B66 (H LB 1 3. 2) 0.3%

濃度 100 mg/dl の精製した HD L、 L D L、 V L D L又は CMをそれぞれ含む 4種類の試料各 4 Iに、予め 37°Cで加温した上記第 1試薬 300 I を混和し、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬 1 00 I を 37°Cで 5分間反応させ、反応液の 600 nmにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計算して捕捉率とした。

この方法では、第 1工程で生じた過酸化水素がカタラーゼにより分解され、一方、第 2工程で生じた過酸化水素は H D AOS及び 4—ァミノアンチピリンと反応してキノン色素が生じる。結果を下記表 1に示す。

表 1に示されるように、上記方法によれば、 H D L中のコレステロールは大部分定量されるが、それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は全く定量されず、本発明の方法により、 HD L中のコレステロールを選択的に定量できることがわかる。

実施例 2

被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例 1 と同じ方法により、被検試料中の HD Lコレステロールを定量した。一方、「臨床検査」、 23, 121 ( 1979) に記載された沈殿法により同じ被検試料中の HD Lコレステロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図 1に示す。

図 1に示されるように、両方法による定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、正確に HD L中のコレステロールが定量できることが明らかになった。

実施例 3

第 1試薬及び第 2試薬として下記の組成を有するものを用いることを除き、実施例 1 と同じ操作を行った。

第 1試薬

H E P ES緩衝液、 p H 7. 0 50 mmol/l

D AOS 1.5 mmol/l コレステロールエステラーゼ 0, 8 U/ml コレステロールォキシダーゼ 0.5 U/ml ペルォキシダーゼ 1.0 U/ml 第 2試薬

H E PES緩衝液、 p H 7. 0 50 隱 ol/l

4ーァミノアンチピリン 4.0 圍 ol/l 花王（株）製ェマルゲン 91 1 (H L B 1 3. フ） 0.3。/₀ この方法では、第 1工程で生じた過酸化水素がペルォキシダーゼの作用で D A O Sと反応して無色キノンが生じ、第 2工程で発生した過酸化水素は同じくペルォキシダーゼの作用で第 1工程の残存 D A O S及び第 2工程で加えた 4—ァミノアンチピリンと反応してキノン色素を生じる。結果を下記表 2に示す。表 2

表 2に示されるように、上記方法によれば、 H D L中のコレステロールは大部分定量されるが、それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は全く定量されず、本発明の方法により、 H D L中のコレステロールを選択的に定量できることがわかる。

実施例 4

被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例 3と同じ方法によリ、被検試料中の H D Lコレス亍ロールを定量した。実施例 2と同様に、沈殿法によリ同じ被検試料中の H D Lコレステロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図 2に示す。

図 2に示されるように、両方法による定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、正確に H D L中のコレステロールが定量できることが明らかになった。

実施例 5

次の組成から成る第 1及び第 2試薬を調製した。

第 1試薬

B ES緩衝液、 p H 7. 0 100 mmol/l

H D AO S 0.7 mmol/l コレステロールエステラーゼ 0.8 U/ml コレステロールォキシダ一ゼ 0.5 U/ml カタラーゼ 100 U/ml 塩化マグネシウム 18 mmol/l 第 2試薬

BES緩衝液、 p H 7. 0 100 mmol/i 4—ァミノアンチピリン 4.0 隱 ol/l ペルォキシダーゼ 2.4 U/ml アジ化ナトリウム 0.1%

花王（株）製ェマルゲン B 66 (H LB1 3. 2) 1.17%

花王（株）製ェマルゲン A90 (H LB 1 4. 5) 0.13%

濃度 100 mg/dl の精製した HD L、 LD L、 Vし D L又は CMをそれぞれ含む 4種類の試料各 4 Iに、予め 37°Cで加温した上記第 1試薬 300 I を混和し、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬 1 00 I を 5分間反応させ、反応液の 600 nmにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計算して捕捉率とした。この方法では、第 1工程で生じた過酸化水素がカタラーゼにより分解され、一方、第 2工程で生じた過酸化水素は HDAOS及び 4—ァミノアンチピリンと反応してキノン色素が生じる。結果を下記表 3に示す。

表 3

表 3に示されるように、上記方法によれば、 HD L中のコレステロールは大部分定量されるが、それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は全く定量されず、本発明の方法により、 HDL中のコレステロールを選択的に定量できることがわかる。

実施例 6

被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例 5と同じ方法により、被検試料中の HD Lコレステロールを定量した。一方、「臨床検査」、 23, 121 ( 1979) に記載された沈殿法により同じ被検試料中の H D Lコレステロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図 3に示す。

図 3に示されるように、両方法による定量結果は非常によ〈一致しており、本発明の方法により、正確に HD L中のコレステロールが定量できることが明らかになった。

Claims

請求の範囲

1 . 被検試料中の高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第 1工程と、次いで、前記第 1工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する第 2工程とを含む、高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法。

2 . 前記第 1工程は、高密度リポ蛋白に作用する界面活性剤の非存在下において、被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダ一ゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去することから成る請求項 1記載の方法。

3 . 前記第 2工程は、前記第 1工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤を加え、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量する請求項 1又は 2記載の方法。

4. 高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤は、 H L Bが 1 3〜1 4の界面活性剤である請求項 3記載の方法。

5 . 高密度リポ蛋白に特異的に作用する前記界面活性剤は、ポリアルキレンォキサイド誘導体である請求項 4記載の方法。

6 . 前記第 1工程は、 p H 5〜8を維持する緩衝液中で行なわれる請求項 1ないし 5のいずれか 1項記載の方法。