WO2000078986A1 - Regulation system of expression using nuclear ppar receptors - Google Patents

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Joël Crouzet
Bart Staels
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    • C12N2840/20Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology. It relates in particular to the field of regulation of gene expression and, more particularly, it describes the development and development of a new system for pharmacological regulation of the expression of transgenes.
  • the invention is based in particular on the use of constructs of human origin to activate the transcription of the transgene.
  • the invention thus describes new compositions, constructions and methods allowing the efficient regulation of the expression of a nucleic acid in vitro, ex vivo or in vivo, for example in muscle cells.
  • the applications which flow from the present invention are numerous, in the experimental, clinical, therapeutic or diagnostic fields, for example.
  • control of the level and duration of expression of the transgenes is necessary for many applications.
  • the success of the therapy may require a specific assay of the protein synthesized from the transgene.
  • the production of recombinant proteins in vitro can be improved by using inducible expression systems, making it possible for example to decouple the growth and production phases. Building transgenic animals, studying the effects of a gene or the bioavailability of a protein, etc. are all situations in which appropriate control of gene expression can be implemented and make improvements.
  • a first illustration of these regulators was constructed by fusion of the Lac repressor of E. coli with the transactivating domain of VP16 of the herpes simplex virus (HSV).
  • IPTG isopropyl bD-thiogalactoside
  • Another system was constructed by fusing the Tet repressor from E. coli with the VP16 transactivator domain from HSV.
  • Another system was built by fusion of the DNA binding domain of the GAL4 protein of S. cerevisiae with the ligand binding domain of the human progesterone receptor and the transactivating domain of HSV VP16, this version is activated. by a progesterone analog such as RU486 (Wang Y. et al., Proc NatI Acad Sci USA, 91 (1994) 8180-8184).
  • RU486 Wang Y. et al., Proc NatI Acad Sci USA, 91 (1994) 8180-8184.
  • a fusion of the Drosophila ecdysone receptor with the HS16 VP16 transactivating domain has also been described, activated by ecdysone and analogues of this steroid hormone (No D. et al., Proc NatI Acad Sci USA, 93 (1996) 3346-3351).
  • a transcriptional regulator then consists of two protein subunits, the first can be formed by the fusion of a binding domain to chimeric DNA and three copies of the human protein FKBP and the second by the fusion of the domain of binding to rapamycin of the human protein FRAP and of the transactivating domain of the p65 subunit of human NFkB.
  • This transcriptional regulator is activated by rapamycin which allows the dimerization of the two subunits (Rivera V. et al., Nat. Med., 2 (1996) 1028-1032).
  • these transcription regulators are xenogenic proteins in humans. They are in fact made up of protein fragments originating from bacteria, viruses, yeasts or insects or, when the protein domains are of human origin, their junction creates sequences foreign to man.
  • the present invention provides a solution to these problems.
  • the present invention indeed relates to a regulatory system using an activator of human origin. This should make it possible to avoid repeated administrations of the therapeutic gene.
  • the present invention describes in particular an improved system of expression mductible using nuclear receptors PPAR (Peroxisome proiiferator-activated receptors) as transc ⁇ ptional regulators.
  • PPAR Peroxisome proiiferator-activated receptors
  • the use of PPRE in a hepatospecific expression system was described in application WO 98/21349
  • the improved system according to the invention now makes it possible to produce the transcriptional regulator (a PPAR protein of human origin, and therefore essentially not xenogenic in humans), and the mductible promoter, which controls the expression of the transgene, is composed on the one hand of a minimum promoter and on the other hand of a PPAR response element (PPRE).
  • PPRE PPAR response element
  • the system of the invention can be activated, in vitro and also in vivo, in particular in muscle, by the specific ligands of PPARs.
  • the level of expression of the transgene, obtained after activation is comparable to that of a strong promoter such as the hCMV-IE promoter.
  • the system according to the present invention therefore has many advantages, both in terms of significant induction, tolerance (especially for use in vivo), strength and conditions of use
  • the invention therefore describes new constructs for the production and implementation of this system, in particular promoter regions, expression cassettes and plasmids.
  • the invention also describes new constructs of PPAR allowing improved control of the expression of genes, as well as combinations of these different constructs.
  • the invention further shows that these methods and compositions allow significant control and regulation of expression in vitro and in vivo
  • the invention also relates to cells comprising constructs of the invention, as well as methods for screening for PPAR ligand compounds, for example.
  • a first subject of the invention resides in a composition comprising:
  • a first element comprising a nucleic acid of interest under the control of a mductible promoter comprising a response element to a PPAR and a minimal transcriptional promoter
  • a second element comprising a nucleic acid encoding a PPAR under the control of a transcriptional promoter, with a view to their simultaneous, separate or spaced-apart use over time.
  • compositions of the invention further comprise (c) a PPAR gand, also for simultaneous, separate or time-spaced use.
  • elements (d) comprising a nucleic acid encoding a retmoide X receptor (RXR) under the control of a transcriptional promoter
  • RXR retmoide X receptor
  • elements (a), (b), if appropriate (c), and / or (d) can be prepared separately, packaged separately , and used sequentially, to allow control of the expression of the nucleic acid of interest
  • elements (a) and (b), and optionally (d) are prepared and packaged together, while compound c) is packaged separately and used spaced over time with (a) and (b), and possibly (d), the combination of these different elements in a cell, tissue, organ, etc. leading to the regulatory effect expression sought
  • the elements (a) and (b) and possibly (d) are carried by separate genetic constructions.
  • the elements (a) and (b) and optionally (d) are assembled in the same genetic construction.
  • the present invention thus describes complex genetic constructions allowing the expression of a product of interest and a PPAR. These constructions are particularly advantageous since they alone contain all of the genetic elements necessary for the regulated expression of the nucleic acid of interest.
  • the genetic construct (s) may be of varied nature and / or origin, in particular plasmid, episomal, chromosomal, viral, phage, etc.
  • the genetic construct is a plasmid or viral vector
  • plasmids carrying the elements separately ( a) or (b) mention may be made, for example, of the plasmids JxnS-TK-pGL3, JxnAS-TK-pGL3, DRI xnS- TK-pGL3, DR1xnAS-TK-pGL3, JxnAS-CMV-pGL3, pSG5-hPPARg2g2, or Jx10AS -CMV-EF-pGL3, which will be described in detail later.
  • plasmids in which the elements (a) and (b) have been assembled mention may, for example, be made of the plasmids Jx5AS-TK-Luc-hPPARg2, SV-g2-J10-C-pGL3. hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 or hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3, which will be described in detail later.
  • a viral vector there may be mentioned in particular a recombinant adenovirus, a recombinant retrovirus, an AAV, a herpes virus, a vaccinia virus, etc., the preparation of which can be carried out according to methods known to those skilled in the art. .
  • element (a) comprises an inducible promoter comprising at least:
  • a PPAR response element (PPRE, "Peroxysome Proliferator Response Element”) is a region of nucleic acid capable of binding a PPAR, the binding of PPAR can then mediate a signal to neighboring nucleic regions.
  • a response element to a PPAR is therefore a region of nucleic acid capable of binding PPARs.
  • the response element to a PPAR more particularly comprises one or more binding sites of the PPAR. Such binding sites have been described in the prior art, such as, for example, in various human promoters (apolipoprotein Ail gene, for example). Such sites can also be constructed artificially, and tested for their PPRE properties, as described below.
  • the response element to a PPAR comprises one or more sites of sequence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID NO: 1) or of functional variants of this sequence.
  • the sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the J region of the human apoAII promoter (nucleotides -734 to -716).
  • the response element to a PPAR comprises one or more sites of sequence AGGTCAAAGGTCA (SEQ ID NO: 5) or functional variants of this sequence.
  • the sequence SEQ ID NO: 5 corresponds to the consensus region DR1.
  • the term functional variant designates any modified sequence retaining the properties of PPRE as mentioned above, that is to say in particular the capacity to bind a PPAR.
  • the modifications may include one or more additions, mutations, deletions and / or substitutions of nucleotides in the sequence considered. These modifications can be introduced by conventional methods of molecular biology, such as in particular site-directed mutagenesis or, more practically, by artificial synthesis of the sequence in a synthesizer.
  • the variants retain at least 50% of the residues of the initial sequence indicated. More preferably, the variants have modifications affecting less than 5 nucleotides in the sequence considered.
  • the variants thus obtained are then tested for their PPRE activity. This property can be checked in different ways, including:
  • a variant is considered to be functional within the meaning of the present invention when the activity measured, for example in (ii) above, is preferably at least 50% equal to that measured with a site of sequence SEQ ID NO: 1 or 5, more preferably at least equal to 75%.
  • Functional variants of PPAR binding sites within the meaning of the invention are described for example in Juge-Aubry et al (J Biol. Chem 272 (1997) 25252) and in Nakshat ⁇ et al. (NAR 26 (1998) 2491), incorporated herein by reference
  • Retmoid X receptors are coded by three genes RXR ⁇ , RXR ⁇ , and RXR ⁇ , whose isolation and sequence have been described (Mangelsdorf DJ et al (1990) Nature 345, 224-229, Mangelsdorf DJ et al. ( 1992), Genes Dev 6, 329-344)
  • element (d) codes for human RXR ⁇
  • the PPAR response element can comprise several sites for binding to a PPAR. It can be a repetition of the same site, or combinations of different sites, the repetition of identical sites being preferred. More particularly, the response element comprises up to 30 binding sites, preferably from 3 to 20, more preferably from 5 to 15.
  • a preferred embodiment of the invention is a construction comprising from 10 to 15 binding sites , the results present in the examples indeed show the advantageous properties of such constructions in terms of induction and expression levels, in particular in muscle cells
  • the PPAR response element is associated with a minimal transcriptional promoter.
  • the minimal promoter is a transcriptional promoter having a weak or nonexistent basal activity, and capable of being increased in the presence of a transcriptional activator (the interaction of an active PPAR with the element PPRE).
  • a minimal promoter can therefore be a naturally weak promoter in mammalian cells, i.e. producing a non-toxic and / or insufficient expression to obtain a pronounced biological effect.
  • a minimal promoter is a construct prepared from a native promoter, by deletion of region (s) not essential (s) to transcriptional activity.
  • it is preferably a promoter essentially comprising a TATA box, generally of a size less than 160 nucleotides, centered around the codon for initiating transcription.
  • a minimal promoter can thus be prepared from viral, cellular, strong or weak promoters, such as for example the promoter of the thymidine kinase (TK) gene of the herpes virus, the immediate CMV promoter, the PGK promoter.
  • TK thymidine kinase
  • the promoter of the muscle creatine kinase (MCK) gene the promoters of the genes of the various actin isoforms of skeletal muscle, the promoter of the desmin gene, the promoter of the vimentin gene, the promoters of the chain genes light or heavy chain of myosin, etc.
  • MCK muscle creatine kinase
  • Specific examples of minimum promoters are represented by nucleotides -54 to +48 of CMV or
  • the minimal promoter (Pmin), the PPAR response element (PPRE) and the nucleic acid of interest (AN) are functionally arranged in element (a), that is to say so that the minimal promoter controls the expression of the nucleic acid of interest and that its activity is regulated by the element PPRE.
  • element (a) Generally, these regions are therefore arranged in the following order, in the 5 '-> 3' orientation: PPRE-Pmin-AN.
  • any other functional arrangement can be envisaged by a person skilled in the art without departing from the present invention.
  • the different functional domains above can be linked directly to each other, or separated by nucleotides which do not significantly affect the regulated nature of the promoter of element (a).
  • nucleotides can be functionally neutral residues, resulting for example from cloning steps (PCR ends, restriction sites, etc.).
  • These nucleotides can also have biological properties, making it possible to confer improved characteristics or performances to the system of the invention (amplifier of household genes, amplifier of specific tissues, silencer, intron, splicing site, etc.).
  • the inducible promoter further comprises an amplifying region.
  • Such a region advantageously makes it possible to increase the expression levels of the nucleic acid of interest.
  • an amplifying region (E) is preferably positioned 3 'to the minimum promoter, between the latter and the nucleic acid of interest, according to the following scheme (5'-> 3 '): PPRE-Pmin-E-AN.
  • the minimal promoter and the response element to a PPAR can be present either in the same orientation (that is to say in the direction of transcription), or in reverse orientation (that is to say that the response element to a PPAR is in the antisense orientation with respect to transcription by the Pmin promoter).
  • these two embodiments allow effective control of the regulation of expression in vitro as well as in vivo.
  • element (b) of the compositions according to the invention comprises at least: - a nucleic acid encoding a PPAR,
  • PPARs belong to the nuclear hormone receptor superfamily, and are grouped into three distinct groups, PPAR ⁇ , PPAR ⁇ (also called NUC-1 or PPAR ⁇ ) and PPAR ⁇ .
  • PPAR ⁇ also called NUC-1 or PPAR ⁇
  • PPAR ⁇ also called NUC-1 or PPAR ⁇
  • PPAR ⁇ nuclear hormone receptor superfamily
  • the isolation and sequence of many human PPARs have been described in the literature (see especially Sher T. et al., Biochemistry, 32 (1993) 5598-5604; Mukherjee R. et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51 (1994) 157-166; Fajas L. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789; Mukherjee R. et al., J. Biol.
  • the nucleic acid encoding a PPAR encodes a human PPAR, in particular a PPAR ⁇ or a PPAR ⁇ .
  • it is a PPAR ⁇ or a PPAR ⁇ in its native form, that is to say without modification of primary structure with respect to the natural molecule.
  • it is a modified PPAR comprising several ligand binding sites.
  • the present invention describes and also relates to any modified PPAR comprising several ligand binding sites. More particularly, it is a PPAR ⁇ or a PPAR ⁇ , even more preferably a PPAR ⁇ .
  • the PPARs modified according to the invention comprise from 2 to 5 ligand binding sites, more preferably from 2 to 4 binding sites. It is more particularly PPAR comprising 2 to 5 copies of the E and F domains involved in ligand binding.
  • the PPAR proteins contain different domains: the N-terminal A / B domain which contains a non-ligand-dependent transactivating region, the C domain which is the DNA binding domain (DBD), the D domain which is a hinge region , and the E / F domains which contain a ligand-dependent transactivating region.
  • the E / F domains are also called ligand binding domain (LBD) (see in particular Schoonjans K. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1302 (1996) 93-109).
  • LBD ligand binding domain
  • the boundaries of the E / F domains vary from one PPAR to another.
  • the E / F domain extends from amino acid 284 to amino acid 505.
  • modified PPARs comprising several repeating E and F domains, and that these modified PPARs are functional and have improved properties of inducibility by the ligands of the PPARs.
  • Such constructions therefore represent an embodiment and a particular object of the present invention.
  • a typical example of PPAR modified according to the invention is a PPAR ⁇ comprising 2 ligand binding sites (that is to say two domains E and F).
  • the protein sequence of PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 is represented in the sequence SEQ ID NO: 24.
  • the invention also relates to any variant of the sequence SEQ ID NO: 24 retaining a PPAR type activity (the ability to activate, in the presence of a PPAR ligand such as BRL49653, a promoter comprising a PPRE sequence).
  • the variants are understood to mean any mutant, dei réelle, and / or polypeptide comprising one or more additional residues.
  • the invention also relates to any nucleic acid coding for such a modified PPAR.
  • It may be a DNA (in particular a cDNA or a synthetic or semi-synthetic DNA) or an RNA.
  • This DNA can be constructed according to conventional molecular biology methods known to those skilled in the art (synthesis, ligations, screening of libraries, etc.). It is advantageously any nucleic acid comprising a sequence encoding a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 24, or hybridizing with a sequence encoding a polypeptide of SEQ ID NO: 24, and encoding a polypeptide with activity of PPAR type.
  • this DNA may include a promoter and / or a transcriptional terminator, for example.
  • the second transcriptional promoter controlling the expression of the nucleic acid encoding PPAR, may be any strong or weak, ubiquitous or selective, constitutive or regulative promoter, functional in mammalian cells, in particular in human cells. It can be a domestic cellular promoter (ie, a mammalian gene, in particular a human gene), a viral, bacterial, insect, plant promoter, natural or synthetic, simple or complex, etc.
  • suitable promoters for this element (b) are in particular viral promoters (immediate promoter of the SV40 virus, immediate promoter of the CMV virus, retrovirus LTR, promoter TK of the herpes virus) or cellular (PGK promoter, albumin, EF1 ⁇ , or of genes strongly expressed in the muscle as: promoter of the muscle creatin kinase (MCK) gene, promoters of the genes of the various actin isoforms of skeletal muscle, promoter of the desmin gene, promoter of the vimentme gene , promoters of the light chain or heavy chain genes of myosin).
  • viral promoters immediate promoter of the SV40 virus, immediate promoter of the CMV virus, retrovirus LTR, promoter TK of the herpes virus
  • PGK promoter cellular
  • albumin albumin
  • EF1 ⁇ EF1 ⁇
  • genes strongly expressed in the muscle as: promoter of the muscle creatin kinase (MCK) gene, promoters of the genes
  • the promoter can be modified by the introduction of one or more enhancer regions, such as the enhancer region of intron 2 of the beta globule gene, enhancer of the very early gene of the CMV virus, enhancer of EF1 ⁇ , of region (s) silencer, of regions conferring tissue specificity (for example regions isolated from specific tissue promoters such as: promoter of the muscle creatin kinase (MCK) gene, promoters of the genes of the various actin isoforms of skeletal muscle, promoter of the desmin gene, promoter of the vimentin gene, promoters of the light chain or heavy chain genes of myosin) or a controllable character, or by deletion of regions not essential to activity, for example.
  • tissue specificity for example regions isolated from specific tissue promoters such as: promoter of the muscle creatin kinase (MCK) gene, promoters of the genes of the various actin isoforms of skeletal muscle, promoter of the desmin gene, promoter of the vimentin gene, promoter
  • the second promoter are the viral promoters, in particular the early promoter of the SV40 virus and the immediate promoter of the CMV, or derivatives thereof. Furthermore, in a particular mode of implementation, when the elements (a) and (b), and possibly (d), are assembled in the same genetic construct, the second transcriptional promoter (of element (b)) and the inducible promoter of element (a), and optionally the promoter of element (d) can be grouped to form only one promoter region common, in particular bidirectional, as will be explained in detail later in the text.
  • Another object of the present invention resides in a vector comprising an element (a) and an element (b), and optionally an element (d), as defined above.
  • the elements (a) and (b), and possibly (d), are in the same orientation in the vector.
  • Such a variant is illustrated for example by the plasmid SV-g2-J10-C-pGL3 (FIG. 17).
  • the elements (a) and (b), and possibly (d), are in opposite orientation in the vector.
  • Such a variant is illustrated for example by the plasmids represented in FIGS. 16, 18 and 19.
  • the inducible promoter of element (a) and the transcriptional promoter of element (b) are assembled into the vector to form a regulatable bidirectional promoter.
  • Such a mode of implementation is illustrated for example by the plasmids represented in FIGS. 18 and 19.
  • a particular object of the invention resides in a vector characterized in that it comprises, in the 5 ′ direction -> 3 ', a first nucleic acid encoding a PPAR, a first minimal transcriptional promoter controlling the expression of said first nucleic acid, one or more response element (s) to a PPAR, a second minimal transcriptional promoter and, under the control said second minimal transcriptional promoter, a second nucleic acid encoding a product of interest.
  • This type of construction is advantageous since it allows the co-expression of the two nucleic acids in the same plasmid, and the amplification of this expression by the regulation of the two nucleic acids by the PPARs and their ligands.
  • the expression of the nucleic acid of interest in the compositions of the invention is generally activated in the presence of a PPAR ligand (element (c)).
  • a PPAR ligand (element (c)
  • different types of ligands can be used, natural or synthetic.
  • the activating ligands of PPAR ⁇ are for example fibrates such as fibric acid and its analogs.
  • gemfibrozyl As analogs of fibric acid, mention may be made in particular of gemfibrozyl (Atherosclerosis 114 (1) (1995) 61), bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025), ciprofibrate (BCE & M 9 (4) (1995) 825), clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301), fenofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), ciinofibrate (Kidney International. 44 (6) (1993) 1352), pirinixic acid (Wy-14,643) or 5,8,11,14-eicosatetranoic acid (ETYA). These different compounds are compatible with biological and / or pharmacological use in vitro or in vivo.
  • the PPAR ⁇ activating ligands can be chosen from natural and synthetic ligands.
  • natural ligands there may be mentioned fatty acids and eicosanoids (for example linoleic acid, linolenic acid, 9-HODE, 5-HODE) and as synthetic ligands there may be mentioned thiazolidinediones, such as especially rosiglitazone (BRL49653), pioglitazone or troglitazone (see for example Krey G. et al., Mol. Endochnol., 11 (1997) 779-791 or Kliewer S. and Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev 8 (1998) 576-581) or the compound RG12525.
  • compositions according to the invention may comprise several activators of PPAR in combination, and in particular a fibrate or a fibrate analog associated with a retinoid.
  • a subject of the invention is also the use of a composition or a vector as defined above for expressing a nucleic acid of interest in a cell ex vivo or in vitro.
  • the nucleic acid can be any nucleic acid (DNA, RNA) coding for a product of interest (RNA, protein, polypeptide, peptide, etc.). It can be a product of agrifood, therapeutic, vaccine interest, a marker, etc.
  • the invention also relates to the use of a composition or a vector as defined above for the preparation of a product intended for expressing a nucleic acid of interest in a cell in vivo
  • the invention also relates to a method for the regulated expression of a nucleic acid in a cell, comprising bringing said cell into contact with a composition or a vector as defined above.
  • the cells can be brought into contact with the compositions or vectors of the invention according to different protocols.
  • the cells in culture can be incubated directly with the elements (a), (b) and (c), and optionally (d), of the invention, for example with a vector comprising the elements (a) and (b ) and in the presence of ligand (c).
  • the cells can be incubated first with elements (a) and (b), and optionally (d) (in particular assembled in the same vector) then, secondly (after culture and possibly selection of modified cells), item (c) can be added.
  • This latter type of protocol makes it possible, for example, to decouple the culture (or cell expansion) phase from the expression phase of the nucleic acid.
  • the cells are brought into contact by administration of elements (a), (b) and (c), and optionally (d), vivo, simultaneously, separately or spaced over time.
  • elements (a) and (b), and optionally (d), possibly in the form of a single genetic construction are generally administered parenterally, in particular intramuscular, intravenous, subcutaneous, intradermal, intratumoral or stereotaxic
  • the compositions of the invention may include any agent promoting cell transfection (cationic polymer, lipid, etc.).
  • the compositions are administered intramuscularly, and the genetic constructs are used in the form of "naked" nucleic acid, that is to say without added transfection agent.
  • the ligand (c) can be administered before, simultaneously, or after elements (a) and (b), and optionally (d).
  • the administration of the ligand can be carried out by oral, anal, intravenous, intraperitoneal or intramuscular route, for example.
  • typical doses of ligand such as BRL 49653 are between 5 and 50 mg / kg, for example 30 mg / kg, making it possible to obtain a plasma concentration close to 15 ⁇ g. / ml at least.
  • typical doses are lower, generally less than 5 mg / kg, for example from 0.01 to 1 mg / kg.
  • the results presented in the examples advantageously show that the compositions of the invention make it possible to obtain in vivo a strong and regulated expression, at doses of ligand lower than those usually used.
  • the results presented also show that the expression is strong after a single intake of ligand.
  • the vector doses used can vary between
  • the invention can be used to express a gene in different types of cells, tissues or organs, in vitro, ex vivo or in vivo.
  • it may be a cell, a tissue or a mammalian organ, preferably a human.
  • muscle or a muscle
  • hepatic or liver
  • cardiac or heart, arterial or vascular wall
  • nerve or brain, marrow, etc.
  • tumor cells or a tumor).
  • the constructs, compositions and method of the invention are used for the regulated expression of a nucleic acid in a muscle cell (or a muscle) in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the results presented in the examples illustrate more particularly the advantages of the invention in vivo or in vitro in this type of cells.
  • the invention also relates to any cell modified by contacting with a composition or a vector as defined above.
  • the invention also relates to the use of a composition, a vector or a cell as defined above, in which the nucleic acid of interest is a reporter gene (such as, for example, luciferase or secreted alkaline phosphatase) for screening in vitro, ex vivo or in vivo (in particular in muscle cells or a muscle) of PPAR ligands.
  • the invention also describes a method for identifying PPAR ligands comprising bringing a cell as defined above into contact with a test molecule (or composition), and demonstrating a expression of the nucleic acid of interest (this preferably being a reporter gene). The expression can also be compared with that observed in the absence of test compound or in the presence of a reference ligand, in order to evaluate the activity of the test compound.
  • the invention also relates to the use of a composition or a vector as defined above, for the construction of transgenic animals, in particular of non-human mammals, useful for preclinical studies, or for studies of bioavailability, labeling, etc.
  • a composition or a vector as defined above for the construction of transgenic animals, in particular of non-human mammals, useful for preclinical studies, or for studies of bioavailability, labeling, etc.
  • the present invention will be described in more detail with the aid of the following examples which should be considered as illustrative and not limiting.
  • Figure 1 Schematic representation of the plasmid FTKpGL3.
  • Figure 2 Schematic representation of the plasmid Jx3S-TK-pGL3.
  • Figure 3 Schematic representation of the plasmid Jx3AS-TK-pGL3.
  • Figure 4 Schematic representation of the DR1x3S-TK-pGL3 plasmid.
  • Figure 5 Schematic representation of the DR1x3AS-TK-pGL3 plasmid.
  • Figure 6 Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12).
  • the cells are cotransfected with: (i) 10 ng of plasmid FTKpGL3 (a), or Jx3S-TK-pGL3 (b), or Jx3AS-TK-pGL3 (c), or DR1x3S-TK-pGL3 (d), or DR1x3AS -TK-pGL3 (e), (ii) increasing amounts of plasmid pSG5-hPPARg2, and (iii) 20 ng of plasmid pRL-null.
  • the activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the luciferase activity of Renilla reniformis.
  • Figure 7 Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12).
  • the cells are cotransfected with: (i) 10 ng of plasmid FTKpGL3 (a), or Jx3S-TK-pGL3 (b), or Jx3AS-TK-pGL3 (c), or DR1x3S-TK-pGL3 (d), or DR1x3AS -TK-pGL3 (e), (ii) increasing amounts of plasmid pSG ⁇ -hPPARa (Koz), and (iii) 20 ng of plasmid pRL-null.
  • each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the luciferase activity of Renilla reniformis.
  • Figure 8 Schematic representation of the plasmid Jx5AS-CMV-pGL3
  • Figure 9 Activities of inducible promoters evaluated in transient m vitro transfections in mouse myoblasts (C2C12)
  • the cells are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid Jx5AS-TK-pGL3 (a), or Jx5AS- CMV-pGL3 (b) , (u) increasing amounts of plasmid pSG5-hPPARg2, and (m) 20 ng of plasmid pRL-null
  • the activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of the luciferase of Renilla reniformis
  • FIG. 10 Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12).
  • the cells are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid JxnAS-TK-pGL3, (n) 10 ng of plasmid pSG5-hPPARg2, and (m) 20 ng of plasmid pRL-null
  • the activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of renilla reniformis luciferase
  • FIG. 11 Activities of inducible promoters evaluated in transient m vitro transfections in mouse myoblasts (C2C12)
  • the cells are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid JxnAS-CMV-pGL3, (M) 10 ng (a) or 50 ng ( b) of plasmid pSG5-hPPARg2, and (ni) 20 ng of plasmid pRL-null
  • the activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of the luciferase of Renilla reniformis
  • FIG. 12 Schematic representation of the plasmid pSG5-hPPARg2g2
  • FIG. 13 Comparison of hPPARg2 and hPPARg2g2 transcriptional regulators.
  • Mouse myoblasts (C2C12) are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid Jx10AS-CMV-pGL3, (n) increasing amounts of plasmid pSG5-hPPARg2 (a) or pSG5-hPPARg2g2 (b), and (m) 20 ng of plasmid pRL-null
  • the activity of the mductible promoter represents, the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of Renilla reniformis luciferase.
  • Figure 14 Schematic representation of the plasmid Jx10AS-CMV-EF-pGL3.
  • Figure 15 Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12).
  • the cells are cotransfected with: (i) 10 ng of plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 (a), or JxIOAS- CMV-EF-pGL3 (b), (ii) increasing amounts of plasmid pSG5- hPPARg2g2, and (iii) 20 ng of plasmid pRL-null.
  • the activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the luciferase activity of Renilla reniformis.
  • Figure 16 Schematic representation of the plasmid Jx5AS-TK-luc-hPPARg2.
  • Figure 17 Schematic representation of the plasmid SV-g2-J10-C-pGL3.
  • Figure 18 Schematic representation of the plasmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3.
  • Figure 19 Schematic representation of the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3.
  • Figure 20 Comparison of the different versions of the inducible system in vitro.
  • Mouse myoblast of (C2C12) are transfected with, for each version of the system, the same number of moles of expression cassettes inducible. The results are expressed as a percentage of the activity of the hCMV-IE promoter, obtained using the plasmid pCMV-leadTK.
  • Induction factors by BRL49653 are calculated by dividing the activity in the presence of BRL49653 by the activity in the presence of DMSO.
  • Figure 21 In vitro comparison of ligands BRL49653 and RG12525.
  • Mouse myoblasts C2C12 are transfected with: (i) 10 ng of plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3, the expression cassette of which is presented in (a) and (ii) 10 ng of plasmid pRL-null .
  • the activity of the inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of the luciferase of Renilla reniformis.
  • Figure 22 Comparison of different versions of the inducible system in vivo.
  • C57BI / 6 mice (6 mice per group) are injected bilaterally into the cranial tibial with, for each version of the system, the same number of moles of inducible expression cassettes.
  • An electrotransfer is then applied to each muscle.
  • the treated animals receive, daily, by gavage, 30 mg / kg of BRL49653.
  • Four days after the DNA injection the animals are sacrificed and the muscles are removed to measure the luciferase activity.
  • Figure 23 Comparison, in vivo, of different induction protocols with BRL49653.
  • C57BI / 6 mice (6 mice per group) are injected bilaterally into the cranial tibial with 10 ⁇ g of DNA containing 1 ⁇ g of the plasmid hPPARg2- CMV-Jx10AS-CMV-pGL3, the expression cassette of which is presented in (at).
  • the activities obtained with the different induction protocols are collated in panel (b).
  • Figure 24 Schematic representation of the plasmid pRDA02.
  • Figure 25 Induction kinetics obtained in vivo with the inducible system.
  • mice Ten C57BI / 6 mice are injected bilaterally into the cranial tibial with a DNA mixture containing 3 mg of plasmid pRDA02 and 3 mg of piasmid pSG5-hPPARg2. An electrotransfer is then applied to each muscle. Four days, then 39 days after the DNA injection, the animals are treated, by gavage, with 30 mg / kg of BRL49653. At different times, blood samples are taken on heparin, and the enzymatic activity of secreted alkaline phosphatase (hSeAP) is measured in the plasma, using the Phospha-Light TM Kit (Tropix, PE Biosystems, Foster City, CA ).
  • hSeAP secreted alkaline phosphatase
  • mice C57BI / 6 mice (2 groups of 10 mice) are injected bilaterally, into the cranial tibial, with a DNA mixture containing 3 mg of plasmid pRDA02 and 3 mg of plasmid pSG5-hPPARg2.
  • An electrotransfer is then applied to each muscle.
  • the animals receive, by gavage, either a single dose of BRL49653 (30 mg / kg), or one dose per day (30 mg / kg) for 5 days.
  • blood tests on heparin are carried out, and the enzymatic activity of hSeAP is measured in the plasma, using the "Phospha-Light" Kit (Tropix).
  • the results presented correspond to the ratio between the activity of hSeAP measured on the day of interest and that obtained on D4.
  • Figure 26 Comparison, in vivo, of different PPARg ligands, and study of the dose effect of one of them.
  • C57BI / 6 mice (5 mice per group) are injected bilaterally into the cranial tibial with a DNA mixture containing 5 mg of plasmid pRDA02 and 5 mg of plasmid pSG5-hPPARg2.
  • An electrotransfer is then applied to each muscle.
  • Figure 27 Schematic representation of the plasmid Jx10AS-CMV-VEGF A 165.
  • the plasmid pGL3-Basic, used for cloning the different promoter regions, as well as the plasmid pRL-null, are of commercial origin (Promega Corporation).
  • the plasmids pSG5 (Stratagene), pBluescript II SK + (Stratagene) and pSL301 (Invitrogen Corporation) are also of commercial origin.
  • the construction of the plasmid pCMV-leadTK was also described previously in the patent application FR 98/120000 of 25/1598 and in the patent application US SN 60 / 123,298 (provisional application). It is recalled that this plasmid is constructed in the following manner.
  • the expression vector pCGN previously described by Tanaka and coli contains the CMV promoter (-522 / + 72) merges with " leader ”of the HSV tk gene (+ 51 / + 101) upstream of a sequence coding for the hemagglutinin epitope
  • the plasmid pGCN (10ng) was used as template for PCR amplification
  • the primers which have been used are the following
  • Primer 6718 (5 'CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG 3') (SEQ ID NO 26), this primer is hybridized with the CMV promoter in position - 522 (8 nucleotides downstream of the EcoRI site of pCGN) - Primer 6719 (5 'GGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGA )
  • this primer hybridizes to position 101 of the "leader" tk
  • the first nucleotide G in bold is intended to restore the Ncol site of pGL3-Bas ⁇ c as will be explained below
  • the PCR fragment thus obtained is purified and then phosphorylated using the phage T4 polynucleotide kinase (New Engiands Biolabs).
  • the vector pGL3-Bas ⁇ c (Promega) was linearized by Ncol, purified and then treated with Klenow DNA.
  • the guanosine (G) of the primer 6719 restores the Ncol site only when the CMV-leader tk fragment is oriented with the 5 ′ part (primer 6718, position -522 of CMV) downstream of the HindIII site of pGL3-Bas ⁇ c and its 3 ′ end (primer 6719, leader tk) is ligated to the Ncol site of pGL3-Basic (first luciferase ATG)
  • the plasmid obtained is designated pCMV-leadTK
  • the enzymatic amplification of DNA fragments by the PCR technique can be carried out using a DNA thermal cycler TM (Perkm Elmer Cetus) according to the manufacturer's recommendations
  • the electroporation of plasmid DNA in Escherichia coli cells can be carried out using an electroporator (Bio-Rad) according to the manufacturer's recommendations.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. (Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) using the kit distributed by Applied Biosystems according to the manufacturer's recommendations.
  • the C2C12 murine myoblasts are cultured in DMEM TM medium (Life Technologies Inc.) supplemented with 10% fetal calf serum (SVF).
  • DMEM TM medium Life Technologies Inc.
  • SVF fetal calf serum
  • the transfections are carried out in 24-well plates and each transfection is carried out three times. Twenty four hours before transfection, the cells are seeded at 3 ⁇ 10 4 cells per well in DMEM TM medium.
  • 500 ng of plasmid DNA (plasmids of interest and pBluescript II SK + to make up to 500 ng) are mixed with the cationic lipid RPR120535 B (W097 / 18185) at the rate of 6 nmol of lipid per ⁇ g of DNA in DMEM TM medium (20 ⁇ l final) comprising 150 mM NaCl and 50 mM bicarbonate.
  • the 20 ⁇ l of the DNA / lipid mixture are brought into contact with the cells, in the absence of FCS, for 2 hours.
  • the culture medium is then supplemented with SVF or ULTROSER TM (BioSepra Inc.) so as to obtain a final concentration of 10% or 2% respectively.
  • the PPAR ligands, dissolved in DMSO, are added to the culture medium at the same time as the SVF or ULTROSER TM. Forty-eight hours after transfection, the culture medium is removed and the cells are rinsed twice with PBS (Life Technologies Inc.).
  • the activity of Photinus pyralis luciferase and the activity of Renilla reniformis luciferase are then determined using the Dual-Luciferase Reporter Assay System TM kit (Promega Corporation) according to the supplier's recommendations.
  • the in vivo gene transfer experiments are carried out on 6 week old female C57BI / 6 mice. Animals are anesthetized with 250 ⁇ l of a ketamine (Rhône Mérieux, 10 mg / ml final) / Xylazine (Bayer Pharma, 0.3 mg / ml final) mixture intraperitoneally. An injection of a total amount of 10 ⁇ g of DNA is then performed in each cranial tibial muscle.
  • Each leg is then subjected to an electric field (frequency of 1 Hz; 4 20 ms dots at 250 V / cm).
  • the animals receive each morning, by gavage, either 30 mg / kg of BRL49653 (SmithKIine Beecham) in 1% carboxycellulose (weight / volume), or 1% carboxycellulose alone.
  • BRL49653 SmithKIine Beecham
  • the animals are sacrificed and the muscles removed in PLB TM lysis buffer (Promega Corporation) in Lysing Matrix TM tubes (BIO 101, Inc.).
  • the crushing of the muscles, which makes it possible to extract the luciferase, is carried out using the FastPrep TM device (BIO 101, Inc.) for 25 seconds at 6.5 m / s.
  • the activity of Photinus pyralis luciferase is then determined using the Luciferase Assay System TM kit (Promega Corporation) according to the supplier's recommendations.
  • EXAMPLE 1 Construction of promoters inducible by PPARs and expression plasmids containing them.
  • the JxnAS-TK-pGL3 plasmids differ from the JxnS-TK-pGL3 plasmids by the orientation of the J sites present in the inducible promoter.
  • a schematic representation of the plasmid Jx3AS-TK-pGL3 is presented in Figure
  • AS antisense orientation
  • plasmids contain, as an element of response to PPAR (PPRE), a consensus sequence (AGGTCA A AGGTCA, SEQ ID NO: 5) called DR1 consensus.
  • the DR1xnAS-TK-pGL3 plasmids differ from the DR1xnS-TK-pGL3 plasmids in the orientation of the consensus DR1 sites present in the inducible promoter.
  • a DNA fragment, containing one or more consensus DR1 sequences, was amplified by PCR using the oligonucleotides 1 RDA69 and 2RDA64 as primers.
  • This fragment was digested with Sali and Nhel and then was cloned, in the antisense orientation, into the plasmid FTKpGL3 previously digested with Xhol and Nhel to obtain the plasmids DR1x2AS-TK-pGL3 and DR1x3AS-TK-pGL3 DR1 consensus sites present.
  • a schematic representation of the plasmid DR1x3AS-TK-pGL3 is presented in FIG. 5.
  • EXAMPLE 2 Specificity of PPARs for different response elements.
  • EXAMPLE 3 Construction of promoters inducible by PPARs containing a minimum promoter other than that of HSV1 -TK such as for example the minimum promoter of hCMV-IE.
  • Plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 was digested with Sphl and Nhel to isolate the Sphl-Nhel fragment of 982 bp containing 5 copies of site J, the minimum promoter hCMV-IE and the 5 'part of the gene coding for luciferase. This fragment was inserted into the plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 previously digested with Sphl and Spel to give the plasmid Jx10AS-CMV-pGL3. The plasmids Jx15AS-CMV-pGL3 and Jx20AS-CMV-pGL3 were also obtained by following the same strategy.
  • EXAMPLE 5 Construction of a transcriptional regulator highly inducible by PPAR ligands.
  • the fragment A, digested with Sacl and Mlul and fragment B, digested with Mlul and Xbal were cloned together in the plasmid pSG5-hPPARg2 previously digested with Sacl and Xbal to obtain the plasmid pSG5-hPPARg2g2.
  • This plasmid contains complementary DNA which codes for a transcriptional regulator (denoted hPPARg2g2) comprising two copies of the E and F domains, ie two ligand binding domains.
  • PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 The complete sequence of PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 is shown below (SEQ ID NO: 24): MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPWADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQ YN KPHEEPSNS MAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS RNKCQYCRFQKCLAVGMSH AIRFGRMPQAEKEKLI_AEISSDIDQLNPESADLRAAKHLYD SYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSI ⁇ VIMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIF QGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHE1IYTMLASLMNKDGVLISEG QGF TREFLKS
  • sequence of the C-terminal part of PPAR ⁇ 2 ⁇ 2, comprising the domains E and F, is the following sequence SEQ ID NO: 25 -
  • hPPARg2g2 The presence of a second ligand-binding domain (hPPARg2g2) therefore gives the transcriptional regulator greater inducibility by the ligand.
  • EXAMPLE 6 Increase in the final activity of inducible promoters.
  • EXAMPLE 7 Construction of plasmids comprising both an expression cassette for the transcriptional regulator and an inducible expression cassette.
  • the plasmid pSG5-hPPARa (Koz) was digested with Mlul and Seal to isolate the Mlul-Scal fragment of 1229 bp containing the 3 'region of the DNA complementary to hPPARa. This fragment was inserted into the plasmid pSL301 previously digested with Mlul and SmaI to give the plasmid pSL-
  • the plasmid pSG5-hPPARa (Koz) was digested with SalI and Mlul to isolate the Sall-MIul fragment of 1406 bp containing the SV40 virus early promoter and the 5 'region of the DNA complementary to hPPARa. This fragment was inserted into the plasmid pSL-3'hPPARa previously digested with Xhol and Mlul to give the plasmid pSL-hPPARa.
  • the plasmid pSL-hPPARa was digested with Spel and SalI to isolate the Spel-SalI fragment of 2664 bp containing the early promoter of the SV40 virus and the complementary DNA of hPPARa. This fragment was inserted into the plasmid pBluescript II SK + previously digested with Spel and SalI to give the plasmid pBS-hPPARa.
  • the plasmid pSG5-hPPARg2 was digested with Ayril and SacI to isolate the Ayrll-SacI fragment of 2070 bp, noted C, containing the 5 ′ region of the DNA complementary to hPPARg2.
  • Fragment C and fragment D digested with Sac1 and SalI, were cloned together in the plasmid pBS-hPPARa previously digested with Ayril and Sali to obtain the plasmid pBS-hPPARg2.
  • Plasmid Jx5AS-TK-pGL3 was digested with Kpnl and SalI to isolate the Kpnl-SalI fragment of 2324 bp containing the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid pBS-hPPARg2 previously digested with Kpnl and SaN to give the plasmid Jx5AS-TK-luc-hPPARg2.
  • a schematic representation of the plasmid Jx5AS-TK-luc-hPPARg2 is presented in FIG. 16.
  • the plasmid pBS-hPPARg2 was digested with NotI and SalI to isolate the NotI-SalI fragment of 2622 bp, noted E, containing the complementary DNA of hPPARg2 under the control of the SV40 early promoter.
  • HPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 plasmid A DNA fragment, denoted G, containing the DNA complementary to hPPARg2, was amplified by PCR using the plasmid Jx5AS-TK-luc- hPPARg2 as template and the oligonucleotides 12RDA50 (5 'GTC AGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3 '; SEQ ID NO: 20) and 13RDA42 (5' TAC GGG GTA CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TGG 3 '; SEQ ID NO: 21) as primers.
  • G A DNA fragment, denoted Jx5AS-TK-luc- hPPARg2
  • 12RDA50 5 'GTC AGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3
  • Plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 was digested with Nhel and Sphl to isolate the Nhel-SphI fragment of 982 bp containing the 5 'region of the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 previously digested with Spel and Sphl to give the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3.
  • a schematic representation of the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 is presented in Figure 19.
  • Plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 was digested with Nhel and Sphl to isolate the Nhel-SphI fragment of 982 bp containing the 5 'region of the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid hPPARg2- CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 previously digested with Spel and Sphl to give the plasmid hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3.
  • the plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 was digested with Nhel and Sphl to isolate the Nhel-SphI fragment of 1151 bp containing the 5 'region of the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 previously digested with Spel and Sphl to give the plasmid hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.
  • Figure 20 combines the results obtained in vitro with several versions of the inducible system. These results show that the systems using two plasmids (Figure 20 lines 1, 3 and 4) like the systems with a single plasmid ( Figure 20 lines 2 and 5 to 9) are functional; that is to say that the presence of a PPARg ligand (here BRL49653) greatly increases the expression of the gene placed under the control of the inducible promoter.
  • a PPARg ligand here BRL49653
  • the factor of induction by the ligand is greater than 30, and that for the system presented on figure 20 line 4, the activity after induction is equal to that of a strong promoter like that of the hCMV-IE promoter.
  • ligands of hPPARg other than BRL49653, here RG12525 ligand RPR of hPPARg
  • RG12525 ligand RPR of hPPARg
  • treatment with RG12525 even leads to a stronger induction • than that obtained with BRL49653.
  • Any other PPARg ligand can therefore be used as a system inducer.
  • a system using hPPARa as a transcriptional regulator can be activated with the fibrates or WY-14,643 for example or any other ligand of hPPARa.
  • the inducible system can be activated in vivo, in the muscle.
  • FIG. 22 brings together the results obtained in vivo, in the muscle, with different versions of the inducible system.
  • the results show that for the three versions tested (FIG. 22 lines 2 to 4), a treatment by gavage with a ligand of hPPARg is capable of strongly increasing, in the muscle, the activity of the inducible promoters.
  • the induction factors are: x14 for the version figure 22 line 2, x8 for the version figure 22 line 3, and x24 for the version figure 22 line 4.
  • the activity obtained in animals treated with BRL49653 is of the order of that of a strong promoter such as the hCMV-IE promoter.
  • results, presented in FIG. 23, also show that a single take of ligand can induce the system, whether this take place before or after the gene transfer. This experience also shows that a dose twice less than that usually used, allows to obtain the same induction factor.
  • the system, using a PPAR nuclear receptor as a transcriptional regulator, is therefore functional in vivo and can be induced by the oral intake of a PPAR ligand.
  • EXAMPLE 11 Construction of a plasmid allowing the inducible expression of a gene whose product is secreted.
  • Plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 was digested with HindIII and Mlul to isolate the HindIII-Mlul fragment of 459 bp. This fragment was inserted into the plasmid pXL3010 (Bettan M. et al., Anal. Biochem., 271 (1999) 187-189) previously digested with HindIII and Mlul to give the plasmid pRDA02.
  • This plasmid contains DNA complementary to the gene coding for the secreted form of human placental alkaline phosphatase (hSeAP), the expression of which is under the control of a promoter inducible by the system using PPARs as transcriptional regulator.
  • hSeAP human placental alkaline phosphatase
  • EXAMPLE 12 The inducible system makes it possible to regulate, in vivo, the plasma concentration of a secreted protein.
  • FIG. 25 show that by using the inducible system, it is possible to regulate over time the plasma concentration of a protein secreted from the muscle, and this with a simple oral intake of a ligand of PPAR .
  • the plasma concentration of hSeAP is increased by a factor of 18 (Figure 25A) two days after taking the ligand, then returns to its basic level a week later. Between 2 and 39 ⁇ eme ee day, an immune response directed against the hSeAP of human origin is observed and results in a decrease in plasma concentration this protein. Despite this immune response, it is possible to perform a second induction cycle (FIG. 25A).
  • the inducible system also makes it possible, by taking daily ligands, to maintain the plasma level of hSeAP at a high level, for a period equal to the duration of the treatment.
  • EXAMPLE 13 Different ligands of PPARs can activate the inducible system in vivo, and this in a dose-dependent manner.
  • BRL49653 in its form marketed for the treatment of type II diabetes (Avandia TM, SmithKiine Beecham) and pioglitazone, in its form marketed for the same treatment (Actos TM, Takeda Pharmaceuticals) can also activate the inducible system (Figure 26A ).
  • Figure 26B also shows that the induction factor is directly correlated to the dose of ligand used.
  • the system using a nuclear PPAR receptor as a transcriptional regulator, therefore makes it possible to very precisely control the plasma level of a secreted protein.
  • this regulation can be achieved by using various PPAR ligands.
  • EXAMPLE 14 Construction of a plasmid allowing the inducible expression of a gene whose product is an angiogenic factor.
  • the human VEGF165 reading frame was cloned by reverse transcription and PCR from total RNA of human placenta (Clontech) (Houck et al. Mol. Endocrinol. 12 (1991) 1806-1814) and then inserted into a plasmid pBluescript
  • plasmid pXL3218 (Stratagene) containing the CMV E / P promoter from position -522 to +72 and the SV40 late polyA, to give the plasmid pXL3218.
  • the latter was then digested with HindIII and BsrGI to isolate the HindIII-BsrGI fragment A of 482 bp.
  • the plasmid pXL3218 was also digested with BsrGI and BamHI to isolate the B fragment BsrGI-BamHI of 390 bp. Fragments A and B were inserted into the plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 previously digested with HindIII and BamHI to give the plasmid Jx10AS-CMV-VEGF A 165.
  • This plasmid contains the DNA complementary to the gene coding for VEGF A 165 of which expression is under the control of a promoter inducible by the system using PPARs as a transcriptional regulator.
  • a schematic representation of the plasmid Jx10AS-CMV-VEGF A 165 is presented in FIG. 27.
  • This piasmid can be used, for example, to control over time the angiogenic activity of VEGF for therapeutic purposes.

Abstract

The invention concerns novel methods and compositions for the pharmacological regulation of the expression of transgenes. More particularly, it concerns a composition comprising: (a) a first element comprising a nucleic acid of interest under the control of an inducible promoter comprising an element containing a response element to a PPAR and a minimal transcriptional receptor; and (b) a second element comprising a nucleic acid coding for a PPAR under the control of a transcriptional promoter, for simultaneous, separate or prolonged use. The invention concerns the use of said compositions and methods in the experimental, clinical, therapeutic or diagnostic fields.

Description

SYSTEME DE REGULATION DE L 'EXPRESSION UTILISANT LES RECEPTEURS NUCLEAIRES PPAREXPRESSION REGULATION SYSTEM USING PPAR NUCLEAR RECEPTORS
La présente invention concerne le domaine de la biologie. Elle concerne notamment le domaine de la régulation de l'expression de gènes et, plus particulièrement, elle décrit la mise au point et le développement d'un nouveau système de régulation pharmacologique de l'expression de transgènes. L'invention repose notamment sur l'utilisation de constructions d'origine humaine pour activer la transcription du transgène. L'invention décrit ainsi de nouvelles compositions, constructions et méthodes permettant la régulation efficace de l'expression d'un acide nucléique in vitro, ex vivo ou in vivo, par exemple dans les cellules musculaires. Les applications qui découlent de la présente invention sont nombreuses, dans les domaines expérimentaux, cliniques, thérapeutiques ou diagnostiques, par exemple.The present invention relates to the field of biology. It relates in particular to the field of regulation of gene expression and, more particularly, it describes the development and development of a new system for pharmacological regulation of the expression of transgenes. The invention is based in particular on the use of constructs of human origin to activate the transcription of the transgene. The invention thus describes new compositions, constructions and methods allowing the efficient regulation of the expression of a nucleic acid in vitro, ex vivo or in vivo, for example in muscle cells. The applications which flow from the present invention are numerous, in the experimental, clinical, therapeutic or diagnostic fields, for example.
Le contrôle du niveau et de la durée de l'expression des transgènes est nécessaire pour de nombreuses applications. Ainsi, en thérapie génique, le succès de la thérapie peut requérir un dosage spécifique de la protéine synthétisée à partir du transgène. De même, la production de protéines recombinantes in vitro peut être améliorée en utilisant des systèmes d'expression inductibles, permettant par exemple de découpler les phases de croissance et de production. La construction d'animaux transgéniques, l'étude des effets d'un gène ou de la biodisponibilité d'une protéine, etc. sont autant de situations dans lesquelles un contrôle approprié de l'expression génétique peut être mis en œuvre et apporter des améliorations.Control of the level and duration of expression of the transgenes is necessary for many applications. Thus, in gene therapy, the success of the therapy may require a specific assay of the protein synthesized from the transgene. Likewise, the production of recombinant proteins in vitro can be improved by using inducible expression systems, making it possible for example to decouple the growth and production phases. Building transgenic animals, studying the effects of a gene or the bioavailability of a protein, etc. are all situations in which appropriate control of gene expression can be implemented and make improvements.
Différents régulateurs de transcription artificiels ont été conçus dans l'art antérieurs, activés par une molécule xénobiotique qui se lient sur les séquences promotrices de la transcription du transgène.Various artificial transcription regulators have been designed in the prior art, activated by a xenobiotic molecule which bind to the transcription promoter sequences of the transgene.
Une première illustration de ces régulateurs a été construite par fusion du répresseur Lac de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 du virus herpès simplex (HSV). Deux versions de ces régulateurs existent, l'une pouvant être activée par l'isopropyl b-D-thiogalactoside (IPTG) et l'autre inactivée par , l'IPTG (Baim S. et coll., Proc Natl Acad Sci U S A, BS (1991 ) 5072-5076 ; Labow M. et coll., Mol. Cell. Biol., 10 (1990) 3343-3356). Un autre système a été construit par fusion du répresseur Tet de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 de HSV. Il existe également deux versions de ces régulateurs, l'une pouvant être activée par la tétracycline ou ses dérivés et l'autre inactivée par ces mêmes molécules (Gossen M. et Bujard H., Proc NatI Acad Sci U S A, 89 (1992) 5547-5551 ; Gossen M. et coll., Science, 268 (1995) 1766-1769).A first illustration of these regulators was constructed by fusion of the Lac repressor of E. coli with the transactivating domain of VP16 of the herpes simplex virus (HSV). Two versions of these regulators exist, one that can be activated by isopropyl bD-thiogalactoside (IPTG) and the other inactivated by, IPTG (Baim S. et al., Proc Natl Acad Sci USA, BS (1991) ) 5072-5076; Labow M. et al., Mol. Cell. Biol., 10 (1990) 3343-3356). Another system was constructed by fusing the Tet repressor from E. coli with the VP16 transactivator domain from HSV. There are also two versions of these regulators, one that can be activated by tetracycline or its derivatives and the other inactivated by these same molecules (Gossen M. and Bujard H., Proc NatI Acad Sci USA, 89 (1992) 5547 -5551; Gossen M. et al., Science, 268 (1995) 1766-1769).
Un autre système a été construit par fusion du domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4 de S. cerevisiae avec le domaine de liaison au ligand du récepteur humain à la progestérone et le domaine transactivateur de VP16 de HSV, cette version est activée par un analogue de la progestérone tel que le RU486 (Wang Y. et coll., Proc NatI Acad Sci U S A, 91 (1994) 8180-8184). Une fusion du récepteur à l'ecdysone de drosophile avec le domaine transactivateur de VP16 de HSV a également été décrite, activée par l'ecdysone et les analogues de cette hormone steroïdienne (No D. et coll., Proc NatI Acad Sci U S A, 93 (1996) 3346-3351 ). Un autre système tire parti de la capacité de certaines molécules immunosuppressives (cyclosporine A, rapamycine et ses dérivés) de promouvoir l'association de certaines protéines cellulaires. Un régulateur transcriptionnel est alors constitué de deux sous-unités protéiques, la première peut être formée par la fusion d'un domaine de liaison à l'ADN chimérique et de trois copies de la protéine humaine FKBP et la deuxième par la fusion du domaine de liaison à la rapamycine de la protéine humaine FRAP et du domaine transactivateur de la sous-unité p65 de NFkB humain. Ce régulateur transcriptionnel est activé par la rapamycine qui permet la dimérisation des deux sous-unités (Rivera V. et coll., Nat. Med., 2 (1996) 1028-1032). Même si ces systèmes permettent d'obtenir des niveaux de régulation satisfaisants dans certains tissus, ils présentent néanmoins certains inconvénients qui limitent leurs conditions d'utilisation. Ainsi, ces régulateurs transcriptionneis sont des protéines xénogéniques chez l'homme. Elles sont en effet constituées de fragments protéiques provenant de bactérie, de virus, de levure ou d'insecte ou, lorsque les domaines protéiques sont d'origine humaine, leur jonction crée des séquences étrangères à l'homme. Ces domaines protéiques peuvent donc induire une réaction immunitaire cytotoxique, entraînant la destruction des cellules qui expriment le gène d'intérêt sous contrôle du régulateur transcriptionnel xenogénique, et ainsi l'arrêt de l'expression du transgène Cette situation peut imposer le recours à des administrations répétées du gène thérapeutique, ce qui constitue un inconvénient important, notamment lorsque cela implique un acte chirurgical traumatique, et qui n'est pas toujours efficace, notamment lorsque le vecteur du gène thérapeutique est un virus dont la première injection provoque une réaction immunitaire. En outre, les niveaux d'expression observes avec les systèmes de régulation de l'art antérieur ne sont pas toujours satisfaisants.Another system was built by fusion of the DNA binding domain of the GAL4 protein of S. cerevisiae with the ligand binding domain of the human progesterone receptor and the transactivating domain of HSV VP16, this version is activated. by a progesterone analog such as RU486 (Wang Y. et al., Proc NatI Acad Sci USA, 91 (1994) 8180-8184). A fusion of the Drosophila ecdysone receptor with the HS16 VP16 transactivating domain has also been described, activated by ecdysone and analogues of this steroid hormone (No D. et al., Proc NatI Acad Sci USA, 93 (1996) 3346-3351). Another system takes advantage of the ability of certain immunosuppressive molecules (cyclosporin A, rapamycin and its derivatives) to promote the association of certain cellular proteins. A transcriptional regulator then consists of two protein subunits, the first can be formed by the fusion of a binding domain to chimeric DNA and three copies of the human protein FKBP and the second by the fusion of the domain of binding to rapamycin of the human protein FRAP and of the transactivating domain of the p65 subunit of human NFkB. This transcriptional regulator is activated by rapamycin which allows the dimerization of the two subunits (Rivera V. et al., Nat. Med., 2 (1996) 1028-1032). Even if these systems make it possible to obtain satisfactory levels of regulation in certain fabrics, they nevertheless have certain drawbacks which limit their conditions of use. Thus, these transcription regulators are xenogenic proteins in humans. They are in fact made up of protein fragments originating from bacteria, viruses, yeasts or insects or, when the protein domains are of human origin, their junction creates sequences foreign to man. These areas proteins can therefore induce a cytotoxic immune reaction, leading to the destruction of cells which express the gene of interest under the control of the xenogenic transcriptional regulator, and thus the stopping of expression of the transgene This situation may require recourse to repeated administrations of the therapeutic gene, which constitutes an important drawback, in particular when it involves a traumatic surgical act, and which is not always effective, in particular when the vector of the therapeutic gene is a virus whose first injection causes an immune reaction. In addition, the levels of expression observed with the regulatory systems of the prior art are not always satisfactory.
Il existe donc un besoin d'un système de régulation de l'expression amélioré, compatible avec un usage in vivo, utilisable dans différents tissus, et assurant des niveaux d'expression importants à l'état activé. La présente invention apporte une solution à ces problèmes. La présente invention concerne en effet un système de régulation utilisant un activateur d'origine humaine. Ceci doit permettre d'éviter les administrations répétées du gène thérapeutique.There is therefore a need for an improved expression regulation system, compatible with use in vivo, usable in different tissues, and ensuring high levels of expression in the activated state. The present invention provides a solution to these problems. The present invention indeed relates to a regulatory system using an activator of human origin. This should make it possible to avoid repeated administrations of the therapeutic gene.
La présente invention décrit en particulier un système amélioré d'expression mductible utilisant les récepteurs nucléaires PPAR (Peroxisome proiiferator-activated receptors) comme régulateurs transcπptionnels. L'utilisation de PPRE dans un système d'expression hépatospécifique a été décrit dans la demande WO 98/21349 Le système amélioré selon l'invention permet à présent de produire le régulateur transcriptionnel (une protéine PPAR d'origine humaine, et donc essentiellement non xénogenique chez l'homme), et le promoteur mductible, qui contrôle l'expression du transgène, est composé d'une part d'un promoteur minimum et d'autre part d'un élément de réponse aux PPAR (PPRE). Le système de l'invention est activable, in vitro et également m vivo, en particulier dans le muscle, par les ligands spécifiques des PPAR. De plus, le niveau d'expression du transgène, obtenu après activation, est comparable à celui d'un promoteur fort comme le promoteur hCMV-IE. Le système selon la présente invention présente donc de nombreux avantages, a la fois en termes d'induction importante, de tolérance (notamment pour un usage in vivo), de force et de conditions d'utilisationThe present invention describes in particular an improved system of expression mductible using nuclear receptors PPAR (Peroxisome proiiferator-activated receptors) as transcπptional regulators. The use of PPRE in a hepatospecific expression system was described in application WO 98/21349 The improved system according to the invention now makes it possible to produce the transcriptional regulator (a PPAR protein of human origin, and therefore essentially not xenogenic in humans), and the mductible promoter, which controls the expression of the transgene, is composed on the one hand of a minimum promoter and on the other hand of a PPAR response element (PPRE). The system of the invention can be activated, in vitro and also in vivo, in particular in muscle, by the specific ligands of PPARs. In addition, the level of expression of the transgene, obtained after activation, is comparable to that of a strong promoter such as the hCMV-IE promoter. The system according to the present invention therefore has many advantages, both in terms of significant induction, tolerance (especially for use in vivo), strength and conditions of use
L'invention décrit donc de nouvelles constructions pour la réalisation et la mise en œuvre de ce système, notamment des régions promotrices, des cassettes d'expression et des plasmides L'invention décrit aussi des constructions nouvelles de PPAR permettant un contrôle amélioré de l'expression de gènes, ainsi que des combinaisons de ces différentes constructions L'invention montre en outre que ces méthodes et compositions permettent un contrôle et une régulation importants de l'expression in vitro et in vivo L'invention concerne aussi des cellules comprenant des constructions de l'invention, ainsi que des méthodes de criblage de composés ligands des PPAR, par exemple.The invention therefore describes new constructs for the production and implementation of this system, in particular promoter regions, expression cassettes and plasmids. The invention also describes new constructs of PPAR allowing improved control of the expression of genes, as well as combinations of these different constructs The invention further shows that these methods and compositions allow significant control and regulation of expression in vitro and in vivo The invention also relates to cells comprising constructs of the invention, as well as methods for screening for PPAR ligand compounds, for example.
Plus particulièrement, un premier objet de l'invention réside dans une composition comprenant:More particularly, a first subject of the invention resides in a composition comprising:
(a) un premier élément comprenant un acide nucléique d'intérêt sous contrôle d'un promoteur mductible comprenant un élément de réponse à un PPAR et un promoteur transcriptionnel minimal, et(a) a first element comprising a nucleic acid of interest under the control of a mductible promoter comprising a response element to a PPAR and a minimal transcriptional promoter, and
(b) un deuxième élément comprenant un acide nucléique codant un PPAR sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel, en vue de leur utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps.(b) a second element comprising a nucleic acid encoding a PPAR under the control of a transcriptional promoter, with a view to their simultaneous, separate or spaced-apart use over time.
Dans un mode plus particulier, les compositions de l'invention comprennent en outre- (c) un gand de PPAR, également en vue d'une utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps.In a more particular embodiment, the compositions of the invention further comprise (c) a PPAR gand, also for simultaneous, separate or time-spaced use.
Avantageusement elles comprennent en outre un élément (d) comprenant un acide nucléique codant un récepteur rétmoide X (RXR) sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel L'expression en vue d'une utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps indique que les éléments (a), (b), le cas échéant (c), et/ou (d), peuvent être prépares séparément, conditionnes séparément, et utilises séquentiellement, pour permettre le contrôle de l'expression de l'acide nucléique d'intérêt Typiquement, les éléments (a) et (b), et éventuellement (d) sont préparés et conditionnes ensemble, alors que le composé c) est conditionne séparément et utilisé de manière espacée dans le temps avec (a) et (b), et éventuellement (d), la combinaison de ces différents éléments dans une cellule, un tissu, un organe, etc conduisant a l'effet de régulation d'expression recherchéAdvantageously, they also comprise an element (d) comprising a nucleic acid encoding a retmoide X receptor (RXR) under the control of a transcriptional promoter The expression with a view to simultaneous, separate or spaced-apart use indicates that elements (a), (b), if appropriate (c), and / or (d), can be prepared separately, packaged separately , and used sequentially, to allow control of the expression of the nucleic acid of interest Typically, elements (a) and (b), and optionally (d) are prepared and packaged together, while compound c) is packaged separately and used spaced over time with (a) and (b), and possibly (d), the combination of these different elements in a cell, tissue, organ, etc. leading to the regulatory effect expression sought
A cet égard, dans un mode particulier de réalisation d'une composition de l'invention, les éléments (a) et (b) et éventuellement (d) sont portés par des constructions génétiques distinctes.In this regard, in a particular embodiment of a composition of the invention, the elements (a) and (b) and possibly (d) are carried by separate genetic constructions.
Dans un autre mode particulier et préféré de réalisation d'une composition de l'invention, les éléments (a) et (b) et éventuellement (d) sont assemblés dans une même construction génétique La présente invention décrit ainsi des constructions génétiques complexes permettant l'expression d'un produit d'intérêt et d'un PPAR. Ces constructions sont particulièrement avantageuses puisqu'elles comportent, à elles seules, l'ensemble des éléments génétiques nécessaires a l'expression régulée de l'acide nucléique d'intérêtIn another particular and preferred embodiment of a composition of the invention, the elements (a) and (b) and optionally (d) are assembled in the same genetic construction. The present invention thus describes complex genetic constructions allowing the expression of a product of interest and a PPAR. These constructions are particularly advantageous since they alone contain all of the genetic elements necessary for the regulated expression of the nucleic acid of interest.
La ou les constructions génétiques peuvent être de nature et/ou d'origine variées, notamment plasmidique, episomique, chromosomique, virale, phagique, etc Préférentiellement, la construction génétique est un vecteur plasmidique ou viral A titre illustratif de plasmides portant séparément les éléments (a) ou (b) on peut citer par exemple les plasmides JxnS-TK-pGL3, JxnAS-TK-pGL3, DRI xnS- TK-pGL3, DR1xnAS-TK-pGL3, JxnAS-CMV-pGL3, pSG5-hPPARg2g2, ou Jx10AS-CMV-EF-pGL3, qui seront décrits en détails plus loin.The genetic construct (s) may be of varied nature and / or origin, in particular plasmid, episomal, chromosomal, viral, phage, etc. Preferably, the genetic construct is a plasmid or viral vector As an illustration of plasmids carrying the elements separately ( a) or (b) mention may be made, for example, of the plasmids JxnS-TK-pGL3, JxnAS-TK-pGL3, DRI xnS- TK-pGL3, DR1xnAS-TK-pGL3, JxnAS-CMV-pGL3, pSG5-hPPARg2g2, or Jx10AS -CMV-EF-pGL3, which will be described in detail later.
A titre illustratif de plasmides dans lesquels les éléments (a) et (b) ont été assemblés, on peut citer par exemple les plasmides Jx5AS-TK-Luc-hPPARg2, SV-g2-J10-C-pGL3. hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 ou hPPARg2-CMV- Jx10AS-CMV-pGL3, qui seront décrits en détails plus loin.By way of illustration of plasmids in which the elements (a) and (b) have been assembled, mention may, for example, be made of the plasmids Jx5AS-TK-Luc-hPPARg2, SV-g2-J10-C-pGL3. hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 or hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3, which will be described in detail later.
Comme exemple de vecteur viral, on peut citer notamment un adénovirus recombinant, un rétrovirus recombinant, un AAV, un herpès virus, un virus de la vaccine, etc., dont la préparation peut être réalisée selon les méthodes connues de l'homme du métier.As an example of a viral vector, there may be mentioned in particular a recombinant adenovirus, a recombinant retrovirus, an AAV, a herpes virus, a vaccinia virus, etc., the preparation of which can be carried out according to methods known to those skilled in the art. .
L'agencement et la structure des constructions génétiques seront décrits plus en détail dans la suite du texte.The arrangement and structure of the genetic constructs will be described in more detail later in the text.
A cet égard, comme indiqué ci-avant, l'élément (a) comprend un promoteur inductible comprenant au moins:In this regard, as indicated above, element (a) comprises an inducible promoter comprising at least:
- un élément de réponse à un PPAR, et- an element of response to a PPAR, and
- un promoteur transcriptionnel minimal.- a minimal transcriptional promoter.
Un élément de réponse à un PPAR (PPRE, "Peroxysome Proliferator Response Elément") est une région d'acide nucléique capable de fixer un PPAR, la liaison du PPAR pouvant ensuite médier un signal vers des régions nucléiques voisines. Un élément de réponse à un PPAR est donc une région d'acide nucléique capable de lier les PPAR. Pour la mise en œuvre de l'invention, l'élément de réponse à un PPAR comprend plus particulièrement un ou plusieurs sites de liaison du PPAR. De tels sites de liaison ont été décrits dans l'art antérieur, comme par exemple dans différents promoteurs humains (gène de l'apolipoprotéine Ail, par exemple). De tels sites peuvent également être construits artificiellement, et testés pour leurs propriétés de PPRE, comme il est décrit ci-après.A PPAR response element (PPRE, "Peroxysome Proliferator Response Element") is a region of nucleic acid capable of binding a PPAR, the binding of PPAR can then mediate a signal to neighboring nucleic regions. A response element to a PPAR is therefore a region of nucleic acid capable of binding PPARs. For the implementation of the invention, the response element to a PPAR more particularly comprises one or more binding sites of the PPAR. Such binding sites have been described in the prior art, such as, for example, in various human promoters (apolipoprotein Ail gene, for example). Such sites can also be constructed artificially, and tested for their PPRE properties, as described below.
Dans un mode particulier de réalisation, l'élément de réponse à un PPAR comprend un ou plusieurs sites de séquence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID NO:1 ) ou de variants fonctionnels de cette séquence. La séquence SEQ ID NO:1 correspond à la région J du promoteur de l'apoAII humain (nucléotides -734 à -716).In a particular embodiment, the response element to a PPAR comprises one or more sites of sequence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID NO: 1) or of functional variants of this sequence. The sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the J region of the human apoAII promoter (nucleotides -734 to -716).
Dans un autre mode particulier de réalisation, l'élément de réponse à un PPAR comprend un ou plusieurs sites de séquence AGGTCAAAGGTCA (SEQ ID NO:5) ou de variants fonctionnels de cette séquence. La séquence SEQ ID NO: 5 correspond à la région consensus DR1.In another particular embodiment, the response element to a PPAR comprises one or more sites of sequence AGGTCAAAGGTCA (SEQ ID NO: 5) or functional variants of this sequence. The sequence SEQ ID NO: 5 corresponds to the consensus region DR1.
Le terme variant fonctionnel désigne toute séquence modifiée conservant les propriétés de PPRE telles que mentionnées ci-dessus, c'est-à-dire notamment la capacité de lier un PPAR. Les modifications peuvent comprendre une ou plusieurs additions, mutations, délétions et/ou substitutions de nucléotides dans la séquence considérée. Ces modifications peuvent être introduites par les méthodes classiques de la biologie moléculaire, telles que notamment la mutagénèse dirigée ou, plus pratiquement, par synthèse artificielle de la séquence dans un synthétiseur. Généralement, les variants conservent au moins 50% des résidus de la séquence initiale indiquée. Plus préférentiellement, les variants possèdent des modifications affectant moins de 5 nucléotides dans la séquence considérée. Les variants ainsi obtenus sont ensuite testés pour leur activité de PPRE. Cette propriété peut être vérifiée de différentes façons, et notamment:The term functional variant designates any modified sequence retaining the properties of PPRE as mentioned above, that is to say in particular the capacity to bind a PPAR. The modifications may include one or more additions, mutations, deletions and / or substitutions of nucleotides in the sequence considered. These modifications can be introduced by conventional methods of molecular biology, such as in particular site-directed mutagenesis or, more practically, by artificial synthesis of the sequence in a synthesizer. Generally, the variants retain at least 50% of the residues of the initial sequence indicated. More preferably, the variants have modifications affecting less than 5 nucleotides in the sequence considered. The variants thus obtained are then tested for their PPRE activity. This property can be checked in different ways, including:
(i) par mise en contact de la séquence test avec un PPAR, et un récepteur rétinoïde X (RXR), préférentiellement dans un test acellulaire, et la détection de la formation d'un complexe (par exemple par retard de migration sur gel);(i) by bringing the test sequence into contact with a PPAR, and a retinoid receptor X (RXR), preferably in an acellular test, and the detection of the formation of a complex (for example by delay in migration on gel) ;
(ii) par insertion de la séquence test dans une cassette d'expression comprenant un promoteur minimal et un gène reporter, introduction de la cassette dans une cellule, et détection (le cas échéant dosage) de l'expression du gène reporter en présence et en l'absence d'un PPAR et d'un ligand d'un PPAR;(ii) by insertion of the test sequence into an expression cassette comprising a minimal promoter and a reporter gene, introduction of the cassette into a cell, and detection (if necessary assay) of the expression of the reporter gene in the presence and in the absence of a PPAR and a ligand of a PPAR;
(iii) par toute autre technique connue de l'homme du métier, permettant de mettre en évidence l'interaction entre un acide nucléique et une protéine, par exemple.(iii) by any other technique known to a person skilled in the art, making it possible to demonstrate the interaction between a nucleic acid and a protein, for example.
Un variant est considéré comme fonctionnel au sens de la présente invention lorsque l'activité mesurée, par exemple en (ii) ci-dessus, est préférentiellement au moins égaie à 50% de celle mesurée avec un site de séquence SEQ ID NO:1 ou 5, plus préférentiellement au moins égale à 75%. Des variants fonctionnels de sites de liaison de PPAR au sens de l'invention sont décrits par exemple dans Juge-Aubry et al (J Biol. Chem 272 (1997) 25252) et dans Nakshatπ et al. (NAR 26 (1998) 2491 ), incorpores à la présente par référenceA variant is considered to be functional within the meaning of the present invention when the activity measured, for example in (ii) above, is preferably at least 50% equal to that measured with a site of sequence SEQ ID NO: 1 or 5, more preferably at least equal to 75%. Functional variants of PPAR binding sites within the meaning of the invention are described for example in Juge-Aubry et al (J Biol. Chem 272 (1997) 25252) and in Nakshatπ et al. (NAR 26 (1998) 2491), incorporated herein by reference
Les récepteurs rétmoides X (RXR) sont codes par trois gènes RXRα, RXRβ, et RXRγ, dont l'isolement et la séquence ont été décrits (Mangelsdorf DJ et al (1990) Nature 345, 224-229 , Mangelsdorf DJ et al. (1992), Gènes Dev 6, 329-344) Préférentiellement, l'élément (d) code pour le RXRα humainRetmoid X receptors (RXR) are coded by three genes RXRα, RXRβ, and RXRγ, whose isolation and sequence have been described (Mangelsdorf DJ et al (1990) Nature 345, 224-229, Mangelsdorf DJ et al. ( 1992), Genes Dev 6, 329-344) Preferably, element (d) codes for human RXRα
En ce qui concerne l'hétérodimérisation PPAR/RXR, deux revues peuvent être consultées Mangelsdorf DJ and Evans RM (1995), Cell 83, 841-850 et Wilson TM and Wahh W (1997), Current Opinion in Chemical Biology 1 , 235- 241. L'article de Schuiman IG et al. (1998), Molecular and Cellular Biology 18, 3483-3494 décrit la transactivation par l'hétérodimère PPARγ/RXRα.Regarding PPAR / RXR heterodimerization, two journals can be consulted Mangelsdorf DJ and Evans RM (1995), Cell 83, 841-850 and Wilson TM and Wahh W (1997), Current Opinion in Chemical Biology 1, 235- 241. The article by Schuiman IG et al. (1998), Molecular and Cellular Biology 18, 3483-3494 describes transactivation by the PPARγ / RXRα heterodimer.
L'utilisation de l'élément (d) est susceptible de synergiser l'activité de l'élément (b). Comme indiqué ci-avant, dans les compositions selon l'invention, l'élément de réponse au PPAR peut comprendre plusieurs sites de liaison à un PPAR. Il peut s'agir d'une répétition d'un même site, ou de combinaisons de sites différents, la répétition de sites identiques étant préférée. Plus particulièrement, l'élément de réponse comprend jusqu'à 30 sites de liaison, de préférence de 3 à 20, plus préférentiellement de 5 à 15 Un mode de réalisation préféré de l'invention est une construction comprenant de 10 à 15 sites de liaison, les résultats présentes dans les exemples montrent en effet les propriétés avantageuses de telles constructions en termes d'induction et de niveaux d'expression, notamment dans les cellules musculaires Pour la réalisation d'un promoteur mductible selon l'élément (a) des compositions de l'invention, l'élément de réponse au PPAR est associé à un promoteur minimal transcriptionnel. Le promoteur minimal est un promoteur transcriptionnel ayant une activité basale faible ou inexistante, et susceptible d'être augmentée en présence d'un activateur transcriptionnel (l'interaction d'un PPAR active avec l'élément PPRE). Un promoteur minimal peut donc être un promoteur naturellement faible dans les cellules mammifère, c'est-à-dire produisant une expression non toxique et/ou non suffisante pour obtenir un effet biologique prononcé. Avantageusement, un promoteur minimal est une construction préparée à partir d'un promoteur natif, par délétion de région(s) non essentielle(s) à l'activité transcriptionnelle. Ainsi, il s'agit de préférence d'un promoteur comprenant essentiellement une boîte TATA, généralement d'une taille inférieure à 160 nucléotides, centrée autour du codon d'initiation de la transcription. Un promoteur minimal peut ainsi être préparé à partir de promoteurs viraux, cellulaires, forts ou faibles, tels que par exemple le promoteur du gène de la thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès, le promoteur immédiat du CMV, le promoteur PGK, le promoteur du gène de la créatine kinase musculaire (MCK), les promoteurs des gènes des différentes isoformes d'actine du muscle squelettique, le promoteur du gène de la desmine, le promoteur du gène de la vimentine, les promoteurs des gènes de chaîne légère ou chaîne lourde de la myosine, etc. Des exemples particuliers de promoteurs minimum sont représentés par les nucléotides -54 à +48 du CMV ouThe use of element (d) is likely to synergize the activity of element (b). As indicated above, in the compositions according to the invention, the PPAR response element can comprise several sites for binding to a PPAR. It can be a repetition of the same site, or combinations of different sites, the repetition of identical sites being preferred. More particularly, the response element comprises up to 30 binding sites, preferably from 3 to 20, more preferably from 5 to 15. A preferred embodiment of the invention is a construction comprising from 10 to 15 binding sites , the results present in the examples indeed show the advantageous properties of such constructions in terms of induction and expression levels, in particular in muscle cells For the production of a promoter which can be reduced according to element (a) of the compositions of the invention, the PPAR response element is associated with a minimal transcriptional promoter. The minimal promoter is a transcriptional promoter having a weak or nonexistent basal activity, and capable of being increased in the presence of a transcriptional activator (the interaction of an active PPAR with the element PPRE). A minimal promoter can therefore be a naturally weak promoter in mammalian cells, i.e. producing a non-toxic and / or insufficient expression to obtain a pronounced biological effect. Advantageously, a minimal promoter is a construct prepared from a native promoter, by deletion of region (s) not essential (s) to transcriptional activity. Thus, it is preferably a promoter essentially comprising a TATA box, generally of a size less than 160 nucleotides, centered around the codon for initiating transcription. A minimal promoter can thus be prepared from viral, cellular, strong or weak promoters, such as for example the promoter of the thymidine kinase (TK) gene of the herpes virus, the immediate CMV promoter, the PGK promoter. , the promoter of the muscle creatine kinase (MCK) gene, the promoters of the genes of the various actin isoforms of skeletal muscle, the promoter of the desmin gene, the promoter of the vimentin gene, the promoters of the chain genes light or heavy chain of myosin, etc. Specific examples of minimum promoters are represented by nucleotides -54 to +48 of CMV or
-105 à +56 du promoteur TK, par exemple. Il est entendu que tout variant de ces promoteurs ou construction similaire à partir d'autres promoteurs peut être construit par l'homme du métier et utilisé dans le cadre de la présente invention.-105 to +56 of the TK promoter, for example. It is understood that any variant of these promoters or similar construction from other promoters can be constructed by a person skilled in the art and used in the context of the present invention.
Le promoteur minimal (Pmin), l'élément de réponse au PPAR (PPRE) et l'acide nucléique d'intérêt (AN) sont agencés de manière fonctionnelle dans l'élément (a), c'est-à-dire de sorte que le promoteur minimal contrôle l'expression de l'acide nucléique d'intérêt et que son activité soit régulée par l'élément PPRE. Généralement, ces régions sont donc disposées dans l'ordre suivant, dans l'orientation 5'->3' : PPRE-Pmin-AN. Toutefois, tout autre agencement fonctionnel peut être envisagé par l'homme du métier sans départir de la présente invention.The minimal promoter (Pmin), the PPAR response element (PPRE) and the nucleic acid of interest (AN) are functionally arranged in element (a), that is to say so that the minimal promoter controls the expression of the nucleic acid of interest and that its activity is regulated by the element PPRE. Generally, these regions are therefore arranged in the following order, in the 5 '-> 3' orientation: PPRE-Pmin-AN. However, any other functional arrangement can be envisaged by a person skilled in the art without departing from the present invention.
En outre, les différents domaines fonctionnels ci-dessus peuvent être liés directement les uns aux autres, ou séparés par des nucléotides n'affectant pas significativement le caractère régulé du promoteur de l'élément (a). De tels nucléotides peuvent être des résidus neutres sur le plan fonctionnel, résultant par exemple d'étapes de clonage (extrémités PCR, sites de restriction, etc.). Ces nucléotides peuvent aussi posséder des propriétés biologiques, permettant de conférer des caractéristiques ou performances améliorées au système de l'invention (amplificateur de gènes de ménage, amplificateur tissus spécifiques, silenceur, intron, site d'épissage, etc.). A cet égard, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le promoteur inductible comprend en outre une région amplificatrice. Une telle région permet avantageusement d'augmenter les niveaux d'expression de l'acide nucléique d'intérêt. Une telle région amplificatrice (E) est préférentiellement positionnée en 3' du promoteur minimal, entre ce dernier et l'acide nucléique d'intérêt, selon le schéma suivant (5'->3'): PPRE-Pmin-E-AN.In addition, the different functional domains above can be linked directly to each other, or separated by nucleotides which do not significantly affect the regulated nature of the promoter of element (a). Such nucleotides can be functionally neutral residues, resulting for example from cloning steps (PCR ends, restriction sites, etc.). These nucleotides can also have biological properties, making it possible to confer improved characteristics or performances to the system of the invention (amplifier of household genes, amplifier of specific tissues, silencer, intron, splicing site, etc.). In this regard, in a particular embodiment of the invention, the inducible promoter further comprises an amplifying region. Such a region advantageously makes it possible to increase the expression levels of the nucleic acid of interest. Such an amplifying region (E) is preferably positioned 3 'to the minimum promoter, between the latter and the nucleic acid of interest, according to the following scheme (5'-> 3 '): PPRE-Pmin-E-AN.
D'autre part, dans les constructions de l'invention, le promoteur minimal et l'élément de réponse à un PPAR peuvent être présents soit dans la même orientation (c'est-à-dire dans le sens de la transcription), soit en orientation inverse (c'est-à-dire que l'élément de réponse à un PPAR est dans l'orientation antisens par rapport à la transcription par le promoteur Pmin). Comme illustré dans les exemples, ces deux modes de réalisation permettent un contrôle efficace de la régulation de l'expression in vitro comme in vivo.On the other hand, in the constructions of the invention, the minimal promoter and the response element to a PPAR can be present either in the same orientation (that is to say in the direction of transcription), or in reverse orientation (that is to say that the response element to a PPAR is in the antisense orientation with respect to transcription by the Pmin promoter). As illustrated in the examples, these two embodiments allow effective control of the regulation of expression in vitro as well as in vivo.
Comme indiqué ci-avant, l'élément (b) des compositions selon l'invention comprend au moins: - un acide nucléique codant un PPAR,As indicated above, element (b) of the compositions according to the invention comprises at least: - a nucleic acid encoding a PPAR,
- sous contrôle d'un second promoteur transcriptionnel.- under the control of a second transcriptional promoter.
Les PPAR appartiennent à la superfamille des récepteurs hormonaux nucléaires, et sont regroupés dans trois groupes distincts, les PPARα, PPARδ (également appelé NUC-1 ou PPARβ) et PPARγ. L'isolement et la séquence de nombreux PPAR humains ont été décrits dans la littérature (voir notamment Sher T. et coll., Biochemistry, 32 (1993) 5598-5604 ; Mukherjee R. et coll., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51 (1994) 157-166 ; Fajas L. et coll., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789 ; Mukherjee R. et coll., J. Biol. Chem., 272 (1997) 8071-8076; Schmidt A. et coll., Mol. Endocrinol. 6 (1992) 1634-1641. Le promoteur du PPARγ a en outre été récemment clone, comme le décrit la demande WO99/05161. Dans un mode préféré de l'invention, l'acide nucléique codant un PPAR code un PPAR humain, en particulier un PPARα ou un PPARγ. Les résultats présentés dans les exemples montrent en effet que l'utilisation de ces molécules assure au système de l'invention des niveaux de régulation et d'expression importants, notamment dans les cellules musculaires.PPARs belong to the nuclear hormone receptor superfamily, and are grouped into three distinct groups, PPARα, PPARδ (also called NUC-1 or PPARβ) and PPARγ. The isolation and sequence of many human PPARs have been described in the literature (see especially Sher T. et al., Biochemistry, 32 (1993) 5598-5604; Mukherjee R. et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51 (1994) 157-166; Fajas L. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789; Mukherjee R. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997 ) 8071-8076; Schmidt A. et al., Mol. Endocrinol. 6 (1992) 1634-1641. The promoter of PPARγ has also been recently cloned, as described in application WO99 / 05161. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid encoding a PPAR encodes a human PPAR, in particular a PPARα or a PPARγ. The results presented in the examples indeed show that the use of these molecules provides the system of the invention with significant levels of regulation and expression, in particular in muscle cells.
Selon un premier mode de mise en œuvre, il s'agit d'un PPARα ou un PPARγ dans sa forme native, c'est-à-dire sans modification de structure primaire par rapport à la molécule naturelle.According to a first mode of implementation, it is a PPARα or a PPARγ in its native form, that is to say without modification of primary structure with respect to the natural molecule.
Selon un autre mode de réalisation, il s'agit d'un PPAR modifié comprenant plusieurs sites de liaison au ligand.According to another embodiment, it is a modified PPAR comprising several ligand binding sites.
A cet égard, la présente invention décrit et a également pour objet tout PPAR modifié comprenant plusieurs sites de liaison au ligand. Plus particulièrement, il s'agit d'un PPARα ou un PPARγ, encore plus préférentiellement d'un PPARγ. De préférence, les PPAR modifiés selon l'invention comprennent de 2 à 5 sites de liaison au ligand, plus préférentiellement de 2 à 4 sites de liaison. Il s'agit plus particulièrement de PPAR comportant 2 à 5 copies des domaines E et F impliqués dans la liaison au ligand. Les protéines PPAR renferment différents domaines : le domaine N- terminal A/B qui contient une région transactivatrice non dépendante du ligand, le domaine C qui est le domaine de liaison à l'ADN (DBD), le domaine D qui est une région charnière, et les domaines E/F qui contiennent une région transactivatrice dépendante du ligand. Les domaines E/F sont également appelés domaine de liaison du ligand (LBD) (voir notamment Schoonjans K. et coll., Biochim. Biophys. Acta, 1302 (1996) 93-109). Les limites des domaines E/F varient d'un PPAR à l'autre. A titre d'exemple, pour l'isoforme PPARγ2 humaine utilisée, le domaine E/F s'étend de l'acide aminé 284 à l'acide aminé 505. La présente invention montre maintenant qu'il est possible de construire des PPAR modifiés comprenant plusieurs domaines E et F répétés, et que ces PPAR modifiés sont fonctionnels et possèdent des propriétés améliorées d'inductibilite par les ligands des PPAR. De telles constructions représentent donc un mode de réalisation et un objet particulier de la présente invention. Un exemple typique de PPAR modifié selon l'invention est un PPARγ comportant 2 sites de liaison au ligand (c'est-à-dire deux domaines E et F). La séquence protéique de PPARγ2γ2 est représentée sur la séquence SEQ ID NO: 24.In this regard, the present invention describes and also relates to any modified PPAR comprising several ligand binding sites. More particularly, it is a PPARα or a PPARγ, even more preferably a PPARγ. Preferably, the PPARs modified according to the invention comprise from 2 to 5 ligand binding sites, more preferably from 2 to 4 binding sites. It is more particularly PPAR comprising 2 to 5 copies of the E and F domains involved in ligand binding. The PPAR proteins contain different domains: the N-terminal A / B domain which contains a non-ligand-dependent transactivating region, the C domain which is the DNA binding domain (DBD), the D domain which is a hinge region , and the E / F domains which contain a ligand-dependent transactivating region. The E / F domains are also called ligand binding domain (LBD) (see in particular Schoonjans K. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1302 (1996) 93-109). The boundaries of the E / F domains vary from one PPAR to another. By way of example, for the human PPARγ2 isoform used, the E / F domain extends from amino acid 284 to amino acid 505. The present invention now shows that it is possible to construct modified PPARs comprising several repeating E and F domains, and that these modified PPARs are functional and have improved properties of inducibility by the ligands of the PPARs. Such constructions therefore represent an embodiment and a particular object of the present invention. A typical example of PPAR modified according to the invention is a PPARγ comprising 2 ligand binding sites (that is to say two domains E and F). The protein sequence of PPARγ2γ2 is represented in the sequence SEQ ID NO: 24.
SEQ ID NO :24SEQ ID NO: 24
MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTTVDFSS ISTPHYEDIPFTRTDPWADYKYD KLQEYQSAI VEPASPPYYSEKTQLY KPHEEPSNSIJ AIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS RNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRI _PQAEKEK__I_AEISSDIDQI_NPESADLRAI_AKHLYDMGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTTVDFSS ISTPHYEDIPFTRTDPWADYKYD KLQEYQSAI VEPASPPYYSEKTQLY KPHEEPSNSIJ AIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS RNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRI _PQAEKEK__I_AEISSDIDQI_NPESADLRAI_AKHLYD
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L'invention concerne aussi tout variant de la séquence SEQ ID NO: 24 conservant une activité de type PPAR (la capacité d'activer, en présence d'un ligand de PPAR tel que BRL49653, un promoteur comportant une séquence PPRE). Les variants s'entendent de tout mutant, déiétant, et/ou polypeptide comportant un ou plusieurs résidus supplémentaires. Préférentiellement, un variant conservant 80% au moins des résidus de la séquence ID NO: 24.The invention also relates to any variant of the sequence SEQ ID NO: 24 retaining a PPAR type activity (the ability to activate, in the presence of a PPAR ligand such as BRL49653, a promoter comprising a PPRE sequence). The variants are understood to mean any mutant, deiétant, and / or polypeptide comprising one or more additional residues. Preferably, a variant retaining at least 80% of the residues of the sequence ID NO: 24.
En outre, l'invention concerne aussi tout acide nucléique codant pour un tel PPAR modifié. Il peut s'agir d'un ADN (notamment un ADNc ou un ADN synthétique ou semi-synthétique) ou d'un ARN. Cet ADN peut être construit selon les méthodes conventionnelles de biologie moléculaire connues de l'homme du métier (synthèse, ligations, criblage de banques, etc.). Il s'agit avantageusement de tout acide nucléique comprenant une séquence codant un polypeptide de séquence SEQ ID NO:24, ou hybridant avec une séquence codant un polypeptide de SEQ ID NO: 24, et codant un polypeptide à activité de type PPAR. En outre, cet ADN peut comprendre un promoteur et/ou un terminateur transcriptionnel, par exemple. Le second promoteur transcriptionnel, contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant le PPAR, peut être tout promoteur fort ou faible, ubiquitaire ou sélectif, constitutif ou régule, fonctionnel dans les cellules mammifères, en particulier dans les cellules humaines. Il peut s'agir d'un promoteur cellulaire domestique (i.e., d'un gène mammifère, en particulier humain), d'un promoteur viral, bactérien, d'insecte, de plante, naturel ou synthétique, simple ou complexe, etc. Des exemples de promoteurs appropriés pour cet élément (b) sont notamment des promoteurs viraux (promoteur immédiat du virus SV40, promoteur immédiat du virus CMV, LTR de rétrovirus, promoteur TK du virus de l'herpès) ou cellulaires (promoteur PGK, albumine, EF1α, ou de gènes fortement exprimés dans le muscle comme : promoteur du gène de la créatme kinase musculaire (MCK), promoteurs des gènes des différentes isoformes d'actine du muscle squelettique, promoteur du gène de la desmine, promoteur du gène de la vimentme, promoteurs des gènes de chaîne légère ou chaîne lourde de la myosine). Par ailleurs, le promoteur peut être modifié par introduction d'une ou plusieurs régions enhanceur, telle que la région enhanceur de l'intron 2 du gène de la globme béta, enhancer du gène très précoce du virus CMV, enhancer de EF1α, de régιon(s) silencer, de régions conférant une spécificité tissulaire (par exemple des régions isolées à partir des promoteurs tissus spécifiques comme : promoteur du gène de la créatme kinase musculaire (MCK), promoteurs des gènes des différentes isoformes d'actine du muscle squelettique, promoteur du gène de la desmine, promoteur du gène de la vimentine, promoteurs des gènes de chaîne légère ou chaîne lourde de la myosine) ou un caractère regulable, ou par délétion de régions non essentielles à l'activité, par exemple. De tels promoteurs peuvent être utilisés pour exprimer le RXR, compris dans l'élément (d).In addition, the invention also relates to any nucleic acid coding for such a modified PPAR. It may be a DNA (in particular a cDNA or a synthetic or semi-synthetic DNA) or an RNA. This DNA can be constructed according to conventional molecular biology methods known to those skilled in the art (synthesis, ligations, screening of libraries, etc.). It is advantageously any nucleic acid comprising a sequence encoding a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 24, or hybridizing with a sequence encoding a polypeptide of SEQ ID NO: 24, and encoding a polypeptide with activity of PPAR type. In addition, this DNA may include a promoter and / or a transcriptional terminator, for example. The second transcriptional promoter, controlling the expression of the nucleic acid encoding PPAR, may be any strong or weak, ubiquitous or selective, constitutive or regulative promoter, functional in mammalian cells, in particular in human cells. It can be a domestic cellular promoter (ie, a mammalian gene, in particular a human gene), a viral, bacterial, insect, plant promoter, natural or synthetic, simple or complex, etc. Examples of suitable promoters for this element (b) are in particular viral promoters (immediate promoter of the SV40 virus, immediate promoter of the CMV virus, retrovirus LTR, promoter TK of the herpes virus) or cellular (PGK promoter, albumin, EF1α, or of genes strongly expressed in the muscle as: promoter of the muscle creatin kinase (MCK) gene, promoters of the genes of the various actin isoforms of skeletal muscle, promoter of the desmin gene, promoter of the vimentme gene , promoters of the light chain or heavy chain genes of myosin). Furthermore, the promoter can be modified by the introduction of one or more enhancer regions, such as the enhancer region of intron 2 of the beta globule gene, enhancer of the very early gene of the CMV virus, enhancer of EF1α, of region (s) silencer, of regions conferring tissue specificity (for example regions isolated from specific tissue promoters such as: promoter of the muscle creatin kinase (MCK) gene, promoters of the genes of the various actin isoforms of skeletal muscle, promoter of the desmin gene, promoter of the vimentin gene, promoters of the light chain or heavy chain genes of myosin) or a controllable character, or by deletion of regions not essential to activity, for example. Such promoters can be used to express the RXR, included in element (d).
Des exemples préférés de second promoteur sont les promoteurs viraux, notamment le promoteur précoce du virus SV40 et le promoteur immédiat du CMV, ou des dérivés de ceux-ci. Par ailleurs, dans un mode particulier de mise en œuvre, lorsque les éléments (a) et (b), et éventuellement (d), sont assemblés dans une même construction génétique, le second promoteur transcriptionnel (de l'élément (b)) et le promoteur inductible de l'élément (a), et éventuellement le promoteur de l'élément (d) peuvent être groupés pour ne former qu'une région promotrice commune, notamment bidirectionnelle, comme il sera expliqué en détail dans la suite du texte.Preferred examples of the second promoter are the viral promoters, in particular the early promoter of the SV40 virus and the immediate promoter of the CMV, or derivatives thereof. Furthermore, in a particular mode of implementation, when the elements (a) and (b), and possibly (d), are assembled in the same genetic construct, the second transcriptional promoter (of element (b)) and the inducible promoter of element (a), and optionally the promoter of element (d) can be grouped to form only one promoter region common, in particular bidirectional, as will be explained in detail later in the text.
A cet effet, un autre objet de la présente invention réside dans un vecteur comprenant un élément (a) et un élément (b), et éventuellement un élément (d), tels que définis ci-avant.To this end, another object of the present invention resides in a vector comprising an element (a) and an element (b), and optionally an element (d), as defined above.
Selon une première variante de l'invention, les éléments (a) et (b), et éventuellement (d), sont dans la même orientation dans le vecteur. Une telle variante est illustrée par exemple par le plasmide SV-g2-J10-C-pGL3 (figure 17).According to a first variant of the invention, the elements (a) and (b), and possibly (d), are in the same orientation in the vector. Such a variant is illustrated for example by the plasmid SV-g2-J10-C-pGL3 (FIG. 17).
Selon une autre variante de l'invention, les éléments (a) et (b), et éventuellement (d), sont en orientation opposée dans le vecteur. Une telle variante est illustrée par exemple par les plasmides représentés sur les figures 16, 18 et 19. Plus préférentiellement, dans cette variante de réalisation, le promoteur inductible de l'élément (a) et le promoteur transcriptionnel de l'élément (b) sont assemblés dans le vecteur pour former un promoteur bidirectionnel regulable. Un tel mode de mise en œuvre est illustré par exemple par les plasmides représentés sur les figures 18 et 19. A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans un vecteur caractérisé en ce qu'il comprend, dans le sens 5'->3', un premier acide nucléique codant un PPAR, un premier promoteur transcriptionnel minimal contrôlant l'expression dudit premier acide nucléique, un ou plusieurs éiément(s) de réponse à un PPAR, un deuxième promoteur transcriptionnel minimal et, sous le contrôle dudit deuxième promoteur transcriptionnel minimal, un deuxième acide nucléique codant un produit d'intérêt.According to another variant of the invention, the elements (a) and (b), and possibly (d), are in opposite orientation in the vector. Such a variant is illustrated for example by the plasmids represented in FIGS. 16, 18 and 19. More preferably, in this variant embodiment, the inducible promoter of element (a) and the transcriptional promoter of element (b) are assembled into the vector to form a regulatable bidirectional promoter. Such a mode of implementation is illustrated for example by the plasmids represented in FIGS. 18 and 19. In this regard, a particular object of the invention resides in a vector characterized in that it comprises, in the 5 ′ direction -> 3 ', a first nucleic acid encoding a PPAR, a first minimal transcriptional promoter controlling the expression of said first nucleic acid, one or more response element (s) to a PPAR, a second minimal transcriptional promoter and, under the control said second minimal transcriptional promoter, a second nucleic acid encoding a product of interest.
Ce type de construction est avantageux puisqu'il permet la co-expression des deux acides nucléiques dans le même plasmide, et l'amplification de cette expression par la régulation des deux acides nucléiques par les PPAR et leurs ligands. L'expression de l'acide nucléique d'intérêt dans les compositions de l'invention est activée généralement en présence d'un ligand de PPAR (élément (c)). A cet égard, selon le PPAR utilisé, différents types de ligands peuvent être utilisés, naturels ou synthétiques. Ainsi, les ligands activateurs des PPARα sont par exemple les fibrates tels que l'acide fibrique et ses analogues. Comme analogues de l'acide fibrique on peut mentionner notamment le gemfibrozyl (Atherosclerosis 114(1 ) (1995) 61 ), le bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025), le ciprofibrate (BCE&M 9(4) (1995) 825), le clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301 ), le fénofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), le ciinofibrate (Kidney International. 44(6) (1993) 1352), l'acide pirinixique (Wy-14,643) ou l'acide 5,8,11 ,14-eicosatetranoique (ETYA). Ces différents composés sont compatibles avec une utilisation biologique et/ou pharmacologique in vitro ou in vivo.This type of construction is advantageous since it allows the co-expression of the two nucleic acids in the same plasmid, and the amplification of this expression by the regulation of the two nucleic acids by the PPARs and their ligands. The expression of the nucleic acid of interest in the compositions of the invention is generally activated in the presence of a PPAR ligand (element (c)). In this regard, depending on the PPAR used, different types of ligands can be used, natural or synthetic. Thus, the activating ligands of PPARα are for example fibrates such as fibric acid and its analogs. As analogs of fibric acid, mention may be made in particular of gemfibrozyl (Atherosclerosis 114 (1) (1995) 61), bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025), ciprofibrate (BCE & M 9 (4) (1995) 825), clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301), fenofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), ciinofibrate (Kidney International. 44 (6) (1993) 1352), pirinixic acid (Wy-14,643) or 5,8,11,14-eicosatetranoic acid (ETYA). These different compounds are compatible with biological and / or pharmacological use in vitro or in vivo.
Les ligands activateurs des PPARγ peuvent être choisis parmi les ligands naturels et synthétiques. Comme ligands naturels, on peut mentionner les acides gras et les eicosanoïdes (par exemple l'acide linoléique, l'acide linolénique, le 9-HODE, le 5-HODE) et comme ligands synthétiques on peut mentionner les thiazolidinediones, telles que notamment la rosiglitazone (BRL49653), la pioglitazone ou la troglitazone (voir par exemple Krey G. et coll., Mol. Endochnol., 11 (1997) 779-791 ou Kliewer S. et Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev. 8 (1998) 576-581 ) ou le composé RG12525.The PPARγ activating ligands can be chosen from natural and synthetic ligands. As natural ligands, there may be mentioned fatty acids and eicosanoids (for example linoleic acid, linolenic acid, 9-HODE, 5-HODE) and as synthetic ligands there may be mentioned thiazolidinediones, such as especially rosiglitazone (BRL49653), pioglitazone or troglitazone (see for example Krey G. et al., Mol. Endochnol., 11 (1997) 779-791 or Kliewer S. and Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev 8 (1998) 576-581) or the compound RG12525.
Par ailleurs, les compositions selon l'invention peuvent comporter plusieurs activateurs de PPAR en association, et en particulier un fibrate ou un analogue de fibrate associé à un rétinoïde. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition ou d'un vecteur tels que définis ci-avant pour exprimer un acide nucléique d'intérêt dans une cellule ex vivo ou in vitro.Furthermore, the compositions according to the invention may comprise several activators of PPAR in combination, and in particular a fibrate or a fibrate analog associated with a retinoid. A subject of the invention is also the use of a composition or a vector as defined above for expressing a nucleic acid of interest in a cell ex vivo or in vitro.
A cet égard, l'acide nucléique peut être tout acide nucléique (ADN, ARN) codant pour un produit d'intérêt (ARN, protéine, polypeptide, peptide, etc.). Il peut s'agir d'un produit d'intérêt agroalimentaire, thérapeutique, vaccinal, d'un marqueur, etc. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une composition ou d'un vecteur tels que définis ci-avant pour la préparation d'un produit destiné à exprimer un acide nucléique d'intérêt dans une cellule in vivoIn this regard, the nucleic acid can be any nucleic acid (DNA, RNA) coding for a product of interest (RNA, protein, polypeptide, peptide, etc.). It can be a product of agrifood, therapeutic, vaccine interest, a marker, etc. The invention also relates to the use of a composition or a vector as defined above for the preparation of a product intended for expressing a nucleic acid of interest in a cell in vivo
L'invention a encore pour objet un procédé pour l'expression régulée d'un acide nucléique dans une cellule, comprenant la mise en contact de ladite cellule avec une composition ou un vecteur tels que définis ci-avant.The invention also relates to a method for the regulated expression of a nucleic acid in a cell, comprising bringing said cell into contact with a composition or a vector as defined above.
Pour un usage m vitro ou ex vivo, les cellules peuvent être mises en contact avec les compositions ou vecteurs de l'invention selon différents protocoles. Ainsi, les cellules en culture peuvent être incubées directement avec les éléments (a), (b) et (c), et éventuellement (d), de l'invention, par exemple avec un vecteur comportant les éléments (a) et (b) et en présence du ligand (c). De manière alternative, les cellules peuvent être incubées dans un premier temps avec les éléments (a) et (b), et éventuellement (d) (notamment assemblés dans un même vecteur) puis, dans un deuxième temps (après culture et éventuellement sélection des cellules modifiées), l'élément (c) peut être ajouté. Ce dernier type de protocole permet par exemple de découpler la phase de culture (ou d'expansion des cellules) de la phase d'expression de l'acide nucléique. Ces expériences peuvent être réalisées dans tout dispositif et milieu approprié, de préférence en plaque, boîte, flasque, en condition stérile. Les quantités de cellules, vecteur et ligand peuvent être aisément adaptées par l'homme du métier, sur la base des informations fournies dans les exemples et de ses connaissances générales.For in vitro or ex vivo use, the cells can be brought into contact with the compositions or vectors of the invention according to different protocols. Thus, the cells in culture can be incubated directly with the elements (a), (b) and (c), and optionally (d), of the invention, for example with a vector comprising the elements (a) and (b ) and in the presence of ligand (c). Alternatively, the cells can be incubated first with elements (a) and (b), and optionally (d) (in particular assembled in the same vector) then, secondly (after culture and possibly selection of modified cells), item (c) can be added. This latter type of protocol makes it possible, for example, to decouple the culture (or cell expansion) phase from the expression phase of the nucleic acid. These experiments can be carried out in any suitable device and medium, preferably in a plate, box, flask, in sterile condition. The quantities of cells, vector and ligand can be easily adapted by a person skilled in the art, on the basis of the information provided in the examples and of his general knowledge.
Pour une utilisation m vivo, les cellules (ou organes, tissu, etc.) sont mises en contact par administration des éléments (a), (b) et (c), et éventuellement (d), vivo, de manière simultanée, séparée ou espacée dans le temps. A cet effet, les éléments (a) et (b), et éventuellement (d), éventuellement sous forme d'une construction génétique unique, sont généralement administrés par voie parentérale, en particulier intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, intratumorale ou stéréotaxique Le choix du mode d'administration peut être guidé par l'application envisagée, le tissu ciblé et/ou le type de produit d'intérêt codé par le transgène Pour cette administration, les compositions de l'invention peuvent comprendre tout agent favorisant la transfection cellulaire (polymère cationique, lipide, etc.). Dans un mode particulier, les compositions sont administrées par voie intramusculaire, et les constructions génétiques sont utilisées sous forme d'acide nucléique "nu", c'est- à-dire sans agent de transfection ajouté.For use in vivo, the cells (or organs, tissue, etc.) are brought into contact by administration of elements (a), (b) and (c), and optionally (d), vivo, simultaneously, separately or spaced over time. For this purpose, elements (a) and (b), and optionally (d), possibly in the form of a single genetic construction, are generally administered parenterally, in particular intramuscular, intravenous, subcutaneous, intradermal, intratumoral or stereotaxic The choice of the mode of administration can be guided by the envisaged application, the targeted tissue and / or the type of product of interest coded by the transgene For this administration, the compositions of the invention may include any agent promoting cell transfection (cationic polymer, lipid, etc.). In a particular mode, the compositions are administered intramuscularly, and the genetic constructs are used in the form of "naked" nucleic acid, that is to say without added transfection agent.
De même, lorsque les éléments (a) et (b), et éventuellement (d) sont introduits au moyen de vecteurs viraux, aucun agent de transfection supplémentaire n'est nécessaire.Likewise, when elements (a) and (b), and possibly (d) are introduced by means of viral vectors, no additional transfection agent is necessary.
Comme il est illustré dans les exemples, le ligand (c) peut être administré avant, simultanément, ou après les éléments (a) et (b), et éventuellement (d).As illustrated in the examples, the ligand (c) can be administered before, simultaneously, or after elements (a) and (b), and optionally (d).
A cet égard, l'administration du ligand peut être réalisée par voie orale, anale, intraveineuse, intrapéritonéale ou intramusculaire, par exemple.In this regard, the administration of the ligand can be carried out by oral, anal, intravenous, intraperitoneal or intramuscular route, for example.
Les doses utilisées peuvent être adaptées par l'homme du métier, sur la base des données in vivo publiées dans la littérature. Ainsi par exemple, pour une forme non soluble dans l'eau, des doses typiques de ligand tel que BRL 49653 sont comprises entre 5 et 50 mg/kg, par exemple 30 mg/kg, permettant d'obtenir une concentration plasmatique proche de 15μg/ml environ, au moins. Pour une forme hydrosoiuble de ligand, dont la biodisponibilité est plus grande (par exemple un sel de maleate du BRL49653) les doses typiques sont plus faibles, généralement inférieures à 5 mg/kg, par exemple de 0,01 à 1 mg/kg. Ces doses peuvent bien évidemment être adaptées par l'homme du métier en fonction des constructions utilisées, des ligands utilisés, et des applications et effets recherchés. D'une manière générale, les résultats présentés dans les exemples montrent avantageusement que les compositions de l'invention permettent d'obtenir in vivo une expression forte et régulée, à des doses de ligand inférieures à celles utilisées habituellement. En outre, bien que des administrations répétées de ligand peuvent être réalisées, les résultats présentés montrent aussi que l'expression est forte après une prise unique de ligand. De manière générale, les doses de vecteur utilisées peuvent varier entreThe doses used can be adapted by a person skilled in the art, on the basis of in vivo data published in the literature. Thus, for example, for a form which is not soluble in water, typical doses of ligand such as BRL 49653 are between 5 and 50 mg / kg, for example 30 mg / kg, making it possible to obtain a plasma concentration close to 15 μg. / ml at least. For a water-soluble form of ligand, whose bioavailability is greater (for example a maleate salt of BRL49653) the typical doses are lower, generally less than 5 mg / kg, for example from 0.01 to 1 mg / kg. These doses can obviously be adapted by a person skilled in the art depending on the constructions used, the ligands used, and the applications and effects sought. In general, the results presented in the examples advantageously show that the compositions of the invention make it possible to obtain in vivo a strong and regulated expression, at doses of ligand lower than those usually used. In addition, although repeated administrations of ligand can be carried out, the results presented also show that the expression is strong after a single intake of ligand. In general, the vector doses used can vary between
0,01 et 1000 μg, ou plus, selon les applications recherchées. L'invention peut être utilisée pour exprimer un gène dans différents types de cellules, de tissus ou d'organes, in vitro, ex vivo ou in vivo. En particulier, il peut s'agir d'une cellule, d'un tissu ou d'un organe mammifère, de préférence humain. A titre illustratif, on peut citer les cellules musculaires (ou un muscle), hépatiques (ou le foie), cardiaques (ou le cœur, la paroi artérielle ou vasculaire), nerveuses (ou le cerveau, la moelle, etc) ou tumorales (ou une tumeur).0.01 and 1000 μg, or more, depending on the applications sought. The invention can be used to express a gene in different types of cells, tissues or organs, in vitro, ex vivo or in vivo. In particular, it may be a cell, a tissue or a mammalian organ, preferably a human. By way of illustration, mention may be made of muscle (or a muscle), hepatic (or liver), cardiac (or heart, arterial or vascular wall), nerve (or brain, marrow, etc.) or tumor cells ( or a tumor).
Préférentiellement, les constructions, compositions et procédé de l'invention sont utilisés pour l'expression régulée d'un acide nucléique dans une cellule musculaire (ou un muscle) in vitro, ex vivo ou in vivo. Les résultats présentés dans les exemples illustrent plus particulièrement les avantages de l'invention in vivo ou in vitro dans ce type de cellules.Preferably, the constructs, compositions and method of the invention are used for the regulated expression of a nucleic acid in a muscle cell (or a muscle) in vitro, ex vivo or in vivo. The results presented in the examples illustrate more particularly the advantages of the invention in vivo or in vitro in this type of cells.
L'invention concerne aussi toute cellule modifiée par mise en contact avec une composition ou un vecteur tels que définis ci-avant.The invention also relates to any cell modified by contacting with a composition or a vector as defined above.
L'invention concerne également l'utilisation d'une composition, d'un vecteur ou d'une cellule tels que définis ci-avant, dans lesquels l'acide nucléique d'intérêt est un gène reporter (tel que par exemple la luciférase ou la phosphatase alcaline sécrétée) pour le criblage in vitro, ex vivo ou in vivo (en particulier dans les cellules musculaires ou un muscle) de ligands des PPAR. A cet égard, l'invention décrit aussi un procédé d'identification de ligands des PPAR comprenant la mise en contact d'une cellule telle que définie ci-avant avec une molécule (ou composition) test, et la mise en évidence d'une expression de l'acide nucléique d'intérêt (celui-ci étant préférentiellement un gène reporter). L'expression peut en outre être comparée à celle observée en l'absence de composé test ou en présence d'un ligand de référence, afin d'évaluer l'activité du composé testé.The invention also relates to the use of a composition, a vector or a cell as defined above, in which the nucleic acid of interest is a reporter gene (such as, for example, luciferase or secreted alkaline phosphatase) for screening in vitro, ex vivo or in vivo (in particular in muscle cells or a muscle) of PPAR ligands. In this regard, the invention also describes a method for identifying PPAR ligands comprising bringing a cell as defined above into contact with a test molecule (or composition), and demonstrating a expression of the nucleic acid of interest (this preferably being a reporter gene). The expression can also be compared with that observed in the absence of test compound or in the presence of a reference ligand, in order to evaluate the activity of the test compound.
L'invention concerne également l'utilisation d'une composition ou d'un vecteur tels que définis ci-avant, pour la construction d'animaux transgéniques, notamment de mammifères non-humains, utiles pour des études précliniques, ou pour des études de biodisponibilité, de marquage, etc. La présente invention sera décrite plus en détails à l'aide des exemples qui suivent qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURESThe invention also relates to the use of a composition or a vector as defined above, for the construction of transgenic animals, in particular of non-human mammals, useful for preclinical studies, or for studies of bioavailability, labeling, etc. The present invention will be described in more detail with the aid of the following examples which should be considered as illustrative and not limiting. LEGEND OF FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique du plasmide FTKpGL3.Figure 1: Schematic representation of the plasmid FTKpGL3.
Figure 2 : Représentation schématique du plasmide Jx3S-TK-pGL3.Figure 2: Schematic representation of the plasmid Jx3S-TK-pGL3.
Figure 3 : Représentation schématique du plasmide Jx3AS-TK-pGL3.Figure 3: Schematic representation of the plasmid Jx3AS-TK-pGL3.
Figure 4 : Représentation schématique du plasmide DR1x3S-TK-pGL3.Figure 4: Schematic representation of the DR1x3S-TK-pGL3 plasmid.
Figure 5 : Représentation schématique du plasmide DR1x3AS-TK-pGL3.Figure 5: Schematic representation of the DR1x3AS-TK-pGL3 plasmid.
Figure 6 : Activités des promoteurs inductibles évaluées en transfections transitoires in vitro dans des myoblastes de souris (C2C12). Les cellules sont cotransfectées avec : (i) 10 ng de plasmide FTKpGL3 (a), ou Jx3S-TK-pGL3 (b), ou Jx3AS-TK-pGL3 (c), ou DR1x3S-TK-pGL3 (d), ou DR1x3AS-TK-pGL3 (e), (ii) des quantités croissantes de plasmide pSG5-hPPARg2, et (iii) 20 ng de plasmide pRL-null. L'activité de chaque promoteur inductible représente l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformis.Figure 6: Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12). The cells are cotransfected with: (i) 10 ng of plasmid FTKpGL3 (a), or Jx3S-TK-pGL3 (b), or Jx3AS-TK-pGL3 (c), or DR1x3S-TK-pGL3 (d), or DR1x3AS -TK-pGL3 (e), (ii) increasing amounts of plasmid pSG5-hPPARg2, and (iii) 20 ng of plasmid pRL-null. The activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the luciferase activity of Renilla reniformis.
Figure 7 : Activités des promoteurs inductibles évaluées en transfections transitoires in vitro dans des myoblastes de souris (C2C12). Les cellules sont cotransfectées avec : (i) 10 ng de plasmide FTKpGL3 (a), ou Jx3S-TK-pGL3 (b), ou Jx3AS-TK-pGL3 (c), ou DR1x3S-TK-pGL3 (d), ou DR1x3AS-TK-pGL3 (e), (ii) des quantités croissantes de plasmide pSGδ-hPPARa(Koz), et (iii) 20 ng de plasmide pRL-null. L'activité de chaque promoteur inductible représente l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformis. Figure 8 Représentation schématique du plasmide Jx5AS-CMV-pGL3Figure 7: Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12). The cells are cotransfected with: (i) 10 ng of plasmid FTKpGL3 (a), or Jx3S-TK-pGL3 (b), or Jx3AS-TK-pGL3 (c), or DR1x3S-TK-pGL3 (d), or DR1x3AS -TK-pGL3 (e), (ii) increasing amounts of plasmid pSGδ-hPPARa (Koz), and (iii) 20 ng of plasmid pRL-null. The activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the luciferase activity of Renilla reniformis. Figure 8 Schematic representation of the plasmid Jx5AS-CMV-pGL3
Figure 9 Activités des promoteurs inductibles évaluées en transfections transitoires m vitro dans des myoblastes de souris (C2C12) Les cellules sont cotransfectées avec (i) 10 ng de plasmide Jx5AS-TK-pGL3 (a), ou Jx5AS- CMV-pGL3 (b), (u) des quantités croissantes de plasmide pSG5-hPPARg2, et (m) 20 ng de plasmide pRL-null L'activité de chaque promoteur inductible représente l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformisFigure 9 Activities of inducible promoters evaluated in transient m vitro transfections in mouse myoblasts (C2C12) The cells are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid Jx5AS-TK-pGL3 (a), or Jx5AS- CMV-pGL3 (b) , (u) increasing amounts of plasmid pSG5-hPPARg2, and (m) 20 ng of plasmid pRL-null The activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of the luciferase of Renilla reniformis
Figure 10 Activités des promoteurs inductibles évaluées en transfections transitoires in vitro dans des myoblastes de souris (C2C12). Les cellules sont cotransfectées avec (i) 10 ng de plasmide JxnAS-TK-pGL3, (n) 10 ng de plasmide pSG5-hPPARg2, et (m) 20 ng de plasmide pRL-null L'activité de chaque promoteur inductible représente l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformisFigure 10 Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12). The cells are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid JxnAS-TK-pGL3, (n) 10 ng of plasmid pSG5-hPPARg2, and (m) 20 ng of plasmid pRL-null The activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of renilla reniformis luciferase
Figure 11 Activités des promoteurs inductibles évaluées en transfections transitoires m vitro dans des myoblastes de souris (C2C12) Les cellules sont cotransfectées avec (i) 10 ng de plasmide JxnAS-CMV-pGL3, (M) 10 ng (a) ou 50 ng (b) de plasmide pSG5-hPPARg2, et (ni) 20 ng de plasmide pRL-null L'activité de chaque promoteur inductible représente l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformisFigure 11 Activities of inducible promoters evaluated in transient m vitro transfections in mouse myoblasts (C2C12) The cells are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid JxnAS-CMV-pGL3, (M) 10 ng (a) or 50 ng ( b) of plasmid pSG5-hPPARg2, and (ni) 20 ng of plasmid pRL-null The activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of the luciferase of Renilla reniformis
Figure 12 Représentation schématique du plasmide pSG5-hPPARg2g2Figure 12 Schematic representation of the plasmid pSG5-hPPARg2g2
Figure 13 Comparaison des régulateurs transcriptionnels hPPARg2 et hPPARg2g2. Des myoblastes de souris (C2C12) sont cotransfectes avec (i) 10 ng de plasmide Jx10AS-CMV-pGL3, (n) des quantités croissantes de plasmide pSG5-hPPARg2 (a) ou pSG5-hPPARg2g2 (b), et (m) 20 ng de plasmide pRL- null L'activité du promoteur mductible représente, l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformis. (c) : facteurs d'induction par le BRL49653 obtenus avec le plasmide pSG5- hPPARg2 ou le plasmide pSG5-hPPARg2g2. Ce facteur d'induction est calculé en divisant l'activité en présence de BRL49653 par l'activité en présence de DMSO.Figure 13 Comparison of hPPARg2 and hPPARg2g2 transcriptional regulators. Mouse myoblasts (C2C12) are cotransfected with (i) 10 ng of plasmid Jx10AS-CMV-pGL3, (n) increasing amounts of plasmid pSG5-hPPARg2 (a) or pSG5-hPPARg2g2 (b), and (m) 20 ng of plasmid pRL-null The activity of the mductible promoter represents, the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of Renilla reniformis luciferase. (c): induction factors with BRL49653 obtained with the plasmid pSG5-hPPARg2 or the plasmid pSG5-hPPARg2g2. This induction factor is calculated by dividing the activity in the presence of BRL49653 by the activity in the presence of DMSO.
Figure 14 : Représentation schématique du plasmide Jx10AS-CMV-EF-pGL3.Figure 14: Schematic representation of the plasmid Jx10AS-CMV-EF-pGL3.
Figure 15 : Activités des promoteurs inductibles évaluées en transfections transitoires in vitro dans des myoblastes de souris (C2C12). Les cellules sont cotransfectées avec : (i) 10 ng de plasmide Jx10AS-CMV-pGL3 (a), ou JxIOAS- CMV-EF-pGL3 (b), (ii) des quantités croissantes de plasmide pSG5- hPPARg2g2, et (iii) 20 ng de plasmide pRL-null. L'activité de chaque promoteur inductible représente l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformis.Figure 15: Activities of inducible promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse myoblasts (C2C12). The cells are cotransfected with: (i) 10 ng of plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 (a), or JxIOAS- CMV-EF-pGL3 (b), (ii) increasing amounts of plasmid pSG5- hPPARg2g2, and (iii) 20 ng of plasmid pRL-null. The activity of each inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the luciferase activity of Renilla reniformis.
Figure 16 : Représentation schématique du plasmide Jx5AS-TK-luc-hPPARg2.Figure 16: Schematic representation of the plasmid Jx5AS-TK-luc-hPPARg2.
Figure 17 : Représentation schématique du plasmide SV-g2-J10-C-pGL3.Figure 17: Schematic representation of the plasmid SV-g2-J10-C-pGL3.
Figure 18 : Représentation schématique du plasmide hPPARg2-CMV-Jx5AS- TK-pGL3.Figure 18: Schematic representation of the plasmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3.
Figure 19 : Représentation schématique du plasmide hPPARg2-CMV-Jx10AS- CMV-pGL3.Figure 19: Schematic representation of the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3.
Figure 20 : Comparaison des différentes versions du système inductible in vitro. Des myoblastes de souris (C2C12) sont transfectés avec, pour chaque version du système, le même nombre de moles de cassettes d'expression inductible. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l'activité du promoteur hCMV-IE, obtenue en utilisant le plasmide pCMV-leadTK. Les facteurs d'induction par le BRL49653 sont calculés en divisant l'activité en présence de BRL49653 par l'activité en présence de DMSO. 1 = pSG5-hPPARg2 + Jx5AS-TK-pGL3 ; 2 = Jx5AS-TK-luc-hPPARg2 ; 3 = pSG5-hPPARg2g2 + Jx10AS-CMV-pGL3 ; 4 = pSG5-hPPARg2 + Jx10AS-CMV-pGL3 ; 5 = SV-g2-J10-C-pGL3 ; 6 = hPPARg2- CMV-Jx5AS-TK-pGL3 ; 7 = hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 ; 8 = hPPARg2- CMV-Jx15AS-CMV-pGL3 ; 9 = hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.Figure 20: Comparison of the different versions of the inducible system in vitro. Mouse myoblast of (C2C12) are transfected with, for each version of the system, the same number of moles of expression cassettes inducible. The results are expressed as a percentage of the activity of the hCMV-IE promoter, obtained using the plasmid pCMV-leadTK. Induction factors by BRL49653 are calculated by dividing the activity in the presence of BRL49653 by the activity in the presence of DMSO. 1 = pSG5-hPPARg2 + Jx5AS-TK-pGL3; 2 = Jx5AS-TK-luc-hPPARg2; 3 = pSG5-hPPARg2g2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 4 = pSG5-hPPARg2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 5 = SV-g2-J10-C-pGL3; 6 = hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3; 7 = hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3; 8 = hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3; 9 = hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.
Figure 21 : Comparaison in vitro des ligands BRL49653 et RG12525. Des myoblastes de souris (C2C12) sont transfectés avec : (i) 10 ng de plasmide hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 dont la cassette d'expression est présentée en (a) et (ii) 10 ng de plasmide pRL-null. (b) L'activité du promoteur inductible représente l'activité luciférase de Photinus pyralis normalisée par l'activité de la luciférase de Renilla reniformis.Figure 21: In vitro comparison of ligands BRL49653 and RG12525. Mouse myoblasts (C2C12) are transfected with: (i) 10 ng of plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3, the expression cassette of which is presented in (a) and (ii) 10 ng of plasmid pRL-null . (b) The activity of the inducible promoter represents the luciferase activity of Photinus pyralis normalized by the activity of the luciferase of Renilla reniformis.
Figure 22 : Comparaison de différentes versions du système inductible in vivo. Des souris C57BI/6 (6 souris par groupe) sont injectées en bilatéral, dans le tibial cranial, avec, pour chaque version du système, le même nombre de moles de cassettes d'expression inductible. Un électrotransfert est alors appliqué sur chaque muscle. Les animaux traités reçoivent chaque jour, par gavage, 30 mg / kg de BRL49653. Quatre jours après l'injection d'ADN, les animaux sont sacrifiés et les muscles sont prélevés pour mesurer l'activité luciférase. 1 = pCMV-leadTK ; 2 = pSG5-hPPARg2 + Jx10AS-CMV-pGL3 ; 3 = pSG5- hPPARg2g2 + Jx10AS-CMV-pGL3 ; 4 = hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3.Figure 22: Comparison of different versions of the inducible system in vivo. C57BI / 6 mice (6 mice per group) are injected bilaterally into the cranial tibial with, for each version of the system, the same number of moles of inducible expression cassettes. An electrotransfer is then applied to each muscle. The treated animals receive, daily, by gavage, 30 mg / kg of BRL49653. Four days after the DNA injection, the animals are sacrificed and the muscles are removed to measure the luciferase activity. 1 = pCMV-leadTK; 2 = pSG5-hPPARg2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 3 = pSG5- hPPARg2g2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 4 = hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3.
Figure 23 : Comparaison, in vivo, de différents protocoles d'induction au BRL49653. Des souris C57BI/6 (6 souris par groupe) sont injectées en bilatéral, dans le tibial cranial, avec 10 μg d'ADN contenant 1 μg du plasmide hPPARg2- CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 dont la cassette d'expression est présentée en (a). Las activités obtenues avec les différents protocoles d'induction sont rassemblées dans le panneau (b). Figure 24 : Représentation schématique du plasmide pRDA02.Figure 23: Comparison, in vivo, of different induction protocols with BRL49653. C57BI / 6 mice (6 mice per group) are injected bilaterally into the cranial tibial with 10 μg of DNA containing 1 μg of the plasmid hPPARg2- CMV-Jx10AS-CMV-pGL3, the expression cassette of which is presented in (at). The activities obtained with the different induction protocols are collated in panel (b). Figure 24: Schematic representation of the plasmid pRDA02.
Figure 25 : Cinétiques d'induction obtenues in vivo avec le système inductible.Figure 25: Induction kinetics obtained in vivo with the inducible system.
(A) Dix souris C57BI/6 sont injectées en bilatéral, dans le tibial cranial, avec un mélange d'ADN contenant 3 mg de plasmide pRDA02 et 3 mg de piasmide pSG5-hPPARg2. Un électrotransfert est alors appliqué sur chaque muscle. Quatre jours, puis 39 jours après l'injection d'ADN, les animaux sont traités, par gavage, avec 30 mg/kg de BRL49653. A différents temps, des prises de sang sur héparine sont réalisées, et l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline sécrété (hSeAP) est mesurée dans le plasma, en utilisant le Kit Phospha-Light™ (Tropix, PE Biosystems, Foster City, CA). (B) Des souris C57BI/6 (2 groupes de 10 souris) sont injectées en bilatéral, dans le tibial cranial, avec un mélange d'ADN contenant 3 mg de plasmide pRDA02 et 3 mg de plasmide pSG5- hPPARg2. Un électrotransfert est alors appliqué sur chaque muscle. Quatre jours après l'injection d'ADN, les animaux reçoivent, par gavage, soit une seule dose de BRL49653 (30 mg/kg), soit une dose par jour (30 mg/kg) durant 5 jours. A différents temps, des prises de sang sur héparine sont réalisées, et l'activité enzymatique de la hSeAP est mesurée dans le plasma, en utilisant le Kit "Phospha-Light" (Tropix). Les résultats présentés (facteurs d'induction) correspondent au rapport entre l'activité de la hSeAP mesurée au jour d'intérêt et celle obtenue a J4.(A) Ten C57BI / 6 mice are injected bilaterally into the cranial tibial with a DNA mixture containing 3 mg of plasmid pRDA02 and 3 mg of piasmid pSG5-hPPARg2. An electrotransfer is then applied to each muscle. Four days, then 39 days after the DNA injection, the animals are treated, by gavage, with 30 mg / kg of BRL49653. At different times, blood samples are taken on heparin, and the enzymatic activity of secreted alkaline phosphatase (hSeAP) is measured in the plasma, using the Phospha-Light ™ Kit (Tropix, PE Biosystems, Foster City, CA ). (B) C57BI / 6 mice (2 groups of 10 mice) are injected bilaterally, into the cranial tibial, with a DNA mixture containing 3 mg of plasmid pRDA02 and 3 mg of plasmid pSG5-hPPARg2. An electrotransfer is then applied to each muscle. Four days after the DNA injection, the animals receive, by gavage, either a single dose of BRL49653 (30 mg / kg), or one dose per day (30 mg / kg) for 5 days. At different times, blood tests on heparin are carried out, and the enzymatic activity of hSeAP is measured in the plasma, using the "Phospha-Light" Kit (Tropix). The results presented (induction factors) correspond to the ratio between the activity of hSeAP measured on the day of interest and that obtained on D4.
Figure 26 : Comparaison, in vivo, de différents ligands de PPARg, et étude de l'effet dose de l'un d'eux. Des souris C57BI/6 (5 souris par groupe) sont injectées en bilatéral, dans le tibial cranial, avec un mélange d'ADN contenant 5 mg de plasmide pRDA02 et 5 mg de plasmide pSG5-hPPARg2. Un électrotransfert est alors appliqué sur chaque muscle. Six jours (A) ou 10 joursFigure 26: Comparison, in vivo, of different PPARg ligands, and study of the dose effect of one of them. C57BI / 6 mice (5 mice per group) are injected bilaterally into the cranial tibial with a DNA mixture containing 5 mg of plasmid pRDA02 and 5 mg of plasmid pSG5-hPPARg2. An electrotransfer is then applied to each muscle. Six days (A) or 10 days
(B) après l'injection d'ADN, les animaux sont traités, par gavage, soit avec différents ligands de PPARg (A ; BRL49653, Actos™ (Takeda Pharmaceuticals) et Avandia™ (SmithKIine Beecham)), soit avec différentes doses de BRL49653 (B). A différents temps, des prises de sang sur héparine sont réalisées, et l'activité enzymatique de la hSeAP est mesurée dans le plasma, en utilisant le Kit "Phospha-Light" (Tropix). Les résultats présentés (facteurs d'induction) correspondent au rapport entre l'activité de la hSeAP mesurée au jour d'intérêt et celle obtenue a J6 (A) ou J10 (B).(B) after the injection of DNA, the animals are treated, by gavage, either with different ligands of PPARg (A; BRL49653, Actos ™ (Takeda Pharmaceuticals) and Avandia ™ (SmithKIine Beecham)), or with different doses of BRL49653 (B). At different times, blood tests on heparin are carried out, and the enzymatic activity of hSeAP is measured in the plasma, using the "Phospha-Light" Kit (Tropix). The results presented (induction factors) correspond to the ratio between the activity of hSeAP measured on the day of interest and that obtained on D6 (A) or D10 (B).
Figure 27 : Représentation schématique du plasmide Jx10AS-CMV-VEGFA165.Figure 27: Schematic representation of the plasmid Jx10AS-CMV-VEGF A 165.
MATERIELS ET METHODESMATERIALS AND METHODS
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose, la purification de fragments d'ADN par électroélution, la précipitation d'ADN plasmidique en milieu salin par l'éthanol ou l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli sont bien connues de l'homme de l'art et sont abondamment décrites dans la littérature (Sambrook et coll., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).The methods conventionally used in molecular biology such as preparative extractions of plasmid DNA, centrifugation of plasmid DNA in cesium chloride gradient, electrophoresis on agarose gels, purification of DNA fragments by electroelution, precipitation of plasmid DNA in a saline medium with ethanol or isopropanol, the transformation in Escherichia coli are well known to those skilled in the art and are abundantly described in the literature (Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual ", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Le plasmide pGL3-Basic, utilisé pour les clonages des différentes régions promotrices, ainsi que le plasmide pRL-null, sont d'origine commerciale (Promega Corporation). Les plasmides pSG5 (Stratagene), pBluescript II SK+ (Stratagene) et pSL301 (Invitrogen Corporation) sont également d'origine commerciale. Les constructions des plasmides d'expression pSG5-hPPARg2 (Fajas L. et coll., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789) et pSG5- hPPARa(Koz) (Gervois P. et coll. Mol. Endocrinol., 13 (1999) 400-409) ont été précédemment décrites.The plasmid pGL3-Basic, used for cloning the different promoter regions, as well as the plasmid pRL-null, are of commercial origin (Promega Corporation). The plasmids pSG5 (Stratagene), pBluescript II SK + (Stratagene) and pSL301 (Invitrogen Corporation) are also of commercial origin. The constructs of the expression plasmids pSG5-hPPARg2 (Fajas L. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789) and pSG5-hPPARa (Koz) (Gervois P. et al. Mol. Endocrinol ., 13 (1999) 400-409) have been previously described.
La construction du plasmide pCMV-leadTK a également été décrite précédemment dans la demande de brevet FR 98/ 120000 du 25/09/98 et dans la demande de brevet US SN 60/123,298 (provisional application). Il est rappelé que ce plasmide est construit de la manière suivante Le vecteur d expression pCGN précédemment décrit par Tanaka et coli (Ce//, 60 (1990) 375-386) contient le promoteur CMV (-522/+72) fusionne au « leader » du gène tk de HSV (+51/+101 ) en amont d'une séquence codant pour l'epitope de l'hemagglutinine Le plasmide pGCN (10ng) a ete utilise comme matrice pour une amplification ACP Les amorces qui ont ete utilisées sont les suivantesThe construction of the plasmid pCMV-leadTK was also described previously in the patent application FR 98/120000 of 25/09/98 and in the patent application US SN 60 / 123,298 (provisional application). It is recalled that this plasmid is constructed in the following manner. The expression vector pCGN previously described by Tanaka and coli (Ce //, 60 (1990) 375-386) contains the CMV promoter (-522 / + 72) merges with " leader ”of the HSV tk gene (+ 51 / + 101) upstream of a sequence coding for the hemagglutinin epitope The plasmid pGCN (10ng) was used as template for PCR amplification The primers which have been used are the following
- Amorce 6718 (5' CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG 3') (SEQ ID NO 26), cette amorce s'hybnde avec le promoteur CMV en position - 522 ( 8 nucléotides en aval du site EcoRI de pCGN) - Amorce 6719 (5' GGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGGCCGAA 3')- Primer 6718 (5 'CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG 3') (SEQ ID NO 26), this primer is hybridized with the CMV promoter in position - 522 (8 nucleotides downstream of the EcoRI site of pCGN) - Primer 6719 (5 'GGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGA )
(SEQ ID NO 27), cette amorce s'hybnde jusqu en position 101 du « leader » tk Le premier nucléotide G en gras est destine à restaurer le site Ncol de pGL3-Basιc comme sera explicité ci-dessous(SEQ ID NO 27), this primer hybridizes to position 101 of the "leader" tk The first nucleotide G in bold is intended to restore the Ncol site of pGL3-Basιc as will be explained below
Le fragment d'ACP ainsi obtenu est purifie puis phosphorylé à l'aide de la polynucleotide kinase du phage T4 (New Engiands Biolabs) Parallèlement, le vecteur pGL3-Basιc (Promega) a été linéarise par Ncol, purifie puis traité par la Klenow ADN polymerase (Boehnnger Manheim) afin de remplir le site Ncol Ce vecteur est ensuite déphosphoryle à l'aide de la phosphatase alcaline (Boehnnger Manheim) puis utilisé pour l'insertion du fragment ACP phosphorylé Ainsi, la guanosine (G) de l'amorce 6719 permet de restaurer le site Ncol uniquement lorsque le fragment CMV-leader tk est oriente avec la partie 5' (amorce 6718, position -522 du CMV) en aval du site HindIII de pGL3-Basιc et son extrémité 3' (amorce 6719, leader tk) est ligaturée au site Ncol de pGL3- Basic (premier ATG de la luciférase) Le plasmide obtenu est désigne pCMV- leadTKThe PCR fragment thus obtained is purified and then phosphorylated using the phage T4 polynucleotide kinase (New Engiands Biolabs). In parallel, the vector pGL3-Basιc (Promega) was linearized by Ncol, purified and then treated with Klenow DNA. polymerase (Boehnnger Manheim) in order to fill the Ncol site This vector is then dephosphorylated using alkaline phosphatase (Boehnnger Manheim) then used for the insertion of the phosphorylated ACP fragment Thus, the guanosine (G) of the primer 6719 restores the Ncol site only when the CMV-leader tk fragment is oriented with the 5 ′ part (primer 6718, position -522 of CMV) downstream of the HindIII site of pGL3-Basιc and its 3 ′ end (primer 6719, leader tk) is ligated to the Ncol site of pGL3-Basic (first luciferase ATG) The plasmid obtained is designated pCMV-leadTK
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique d'ACP (Amplification en Chaîne par la Polymerase) peut être effectuée en utilisant un DNA thermal cycler™ (Perkm Elmer Cetus) selon les recommandations du fabricant L'électroporation d'ADN plasmidique dans des cellules d'Escherichia coli peut être réalisée à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad) selon les recommandations du fabricant.The enzymatic amplification of DNA fragments by the PCR technique (Polymerase Chain Amplification) can be carried out using a DNA thermal cycler ™ (Perkm Elmer Cetus) according to the manufacturer's recommendations The electroporation of plasmid DNA in Escherichia coli cells can be carried out using an electroporator (Bio-Rad) according to the manufacturer's recommendations.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par le méthode développée par Sanger et coll. (Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) en utilisant le kit distribué par Applied Biosystems selon les recommandations du fabricant.Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. (Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) using the kit distributed by Applied Biosystems according to the manufacturer's recommendations.
Les myoblastes murins C2C12 sont cultivés en milieu DMEM™ (Life Technologies Inc.) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Les cultures sont réalisées dans une étuve à 37°C, en atmosphère humide et sous une pression partielle en C02 de 5%.The C2C12 murine myoblasts are cultured in DMEM ™ medium (Life Technologies Inc.) supplemented with 10% fetal calf serum (SVF). The cultures are carried out in an oven at 37 ° C., in a humid atmosphere and under a partial pressure of CO 2 of 5%.
Les transfections sont réalisées en plaques 24 puits et chaque transfection est effectuée trois fois. Vingt quatre heures avant la transfection, les cellules sont ensemencées à 3x104 cellules par puits en milieu DMEM™. Pour chaque puits, 500 ng d'ADN plasmidique (plasmides d'intérêt et pBluescript II SK+ pour compléter à 500 ng) sont mélangés au lipide cationique RPR120535 B (W097/18185) à raison de 6 nmoles de lipide par μg d'ADN dans du milieu DMEM™ (20 μl final) comprenant 150 mM de NaCI et 50 mM de bicarbonate. Après 20 minutes à température ambiante, les 20 μl du mélange ADN/lipide sont mis en contact avec les cellules, en absence de SVF, durant 2 heures. Le milieu de culture est alors supplémenté en SVF ou en ULTROSER™ (BioSepra Inc.) de manière à obtenir une concentration finale de respectivement 10% ou 2%. Les ligands des PPAR, dissous dans du DMSO, sont ajoutés dans le milieu de culture en même temps que le SVF ou l'ULTROSER™. Quarante huit heures après la transfection, le milieu de culture est retiré et les cellules sont rincées deux fois avec du PBS (Life Technologies Inc.). L'activité de la luciférase de Photinus pyralis et l'activité de la luciférase de Renilla reniformis sont alors déterminées à l'aide du kit Dual-Luciferase Reporter Assay System™ (Promega Corporation) selon les recommandations du fournisseur. Les expériences de transfert de gène in vivo sont réalisées sur des souris femelles C57BI/6 âgées de 6 semaines. Les animaux sont anesthésiés avec 250 μl d'un mélange kétamine (Rhône Mérieux, 10 mg/ml final) / Xylazine (Bayer Pharma, 0,3 mg/ml final) par voie intrapéritonéale. Une injection d'une quantité totale de 10 μg d'ADN est alors réalisée dans chaque muscle tibial cranial. Chaque patte est ensuite soumise à un champ électrique (fréquence de 1 Hz; 4 puises de 20 ms à 250 V/cm). Durant toute la durée de l'expérience, les animaux reçoivent chaque matin, par gavage, soit 30 mg/kg de BRL49653 (SmithKIine Beecham) en carboxycellulose 1% (poids/volume), soit la carboxycellulose 1% seule. Quatre jours après le transfert de gène, les animaux sont sacrifiés et les muscles prélevés en tampon de lyse PLB™ (Promega Corporation) dans des tubes Lysing Matrix™ (BIO 101 , Inc.). Le broyage des muscles, qui permet d'extraire la luciférase, est réalisé à l'aide de l'appareil FastPrep™ (BIO 101, Inc.) durant 25 secondes à 6,5 m/s. L'activité de la luciférase de Photinus pyralis est alors déterminée à l'aide du kit Luciférase Assay System™ (Promega Corporation) selon les recommandations du fournisseur.The transfections are carried out in 24-well plates and each transfection is carried out three times. Twenty four hours before transfection, the cells are seeded at 3 × 10 4 cells per well in DMEM ™ medium. For each well, 500 ng of plasmid DNA (plasmids of interest and pBluescript II SK + to make up to 500 ng) are mixed with the cationic lipid RPR120535 B (W097 / 18185) at the rate of 6 nmol of lipid per μg of DNA in DMEM ™ medium (20 μl final) comprising 150 mM NaCl and 50 mM bicarbonate. After 20 minutes at room temperature, the 20 μl of the DNA / lipid mixture are brought into contact with the cells, in the absence of FCS, for 2 hours. The culture medium is then supplemented with SVF or ULTROSER ™ (BioSepra Inc.) so as to obtain a final concentration of 10% or 2% respectively. The PPAR ligands, dissolved in DMSO, are added to the culture medium at the same time as the SVF or ULTROSER ™. Forty-eight hours after transfection, the culture medium is removed and the cells are rinsed twice with PBS (Life Technologies Inc.). The activity of Photinus pyralis luciferase and the activity of Renilla reniformis luciferase are then determined using the Dual-Luciferase Reporter Assay System ™ kit (Promega Corporation) according to the supplier's recommendations. The in vivo gene transfer experiments are carried out on 6 week old female C57BI / 6 mice. Animals are anesthetized with 250 μl of a ketamine (Rhône Mérieux, 10 mg / ml final) / Xylazine (Bayer Pharma, 0.3 mg / ml final) mixture intraperitoneally. An injection of a total amount of 10 μg of DNA is then performed in each cranial tibial muscle. Each leg is then subjected to an electric field (frequency of 1 Hz; 4 20 ms dots at 250 V / cm). Throughout the duration of the experiment, the animals receive each morning, by gavage, either 30 mg / kg of BRL49653 (SmithKIine Beecham) in 1% carboxycellulose (weight / volume), or 1% carboxycellulose alone. Four days after the gene transfer, the animals are sacrificed and the muscles removed in PLB ™ lysis buffer (Promega Corporation) in Lysing Matrix ™ tubes (BIO 101, Inc.). The crushing of the muscles, which makes it possible to extract the luciferase, is carried out using the FastPrep ™ device (BIO 101, Inc.) for 25 seconds at 6.5 m / s. The activity of Photinus pyralis luciferase is then determined using the Luciferase Assay System ™ kit (Promega Corporation) according to the supplier's recommendations.
EXEMPLESEXAMPLES
EXEMPLE 1 : Construction de promoteurs inductibles par les PPAR et de plasmides d'expression les contenant.EXAMPLE 1 Construction of promoters inducible by PPARs and expression plasmids containing them.
1.1. Plasmide FTKpGL3.1.1. FTKpGL3 plasmid.
Un fragment d'ADN, correspondant à une partie du promoteur du gène TK du virus herpès simplex de type 1 (HSV-1 ), compris entre les positions -105 et +56 par rapport au site d'initiation de la transcription, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pBLCAT2 (Luckow B. et Schutz G., Nucleic Acids Res., 15 (1987) 5490) comme matrice et les oligonucléotides 5' CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGC CCA GCG 3' (SEQ ID NO: 28) et 5' TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA 3' (SEQ ID NO: 2) comme amorces. Ce fragment a été digéré par Bqlll et HindIII puis a été clone dans le plasmide pGL3-Basic préalablement digéré par Bqlll et HindIII pour obtenir le plasmide FTKpGL3. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée dans la figure 1.A DNA fragment, corresponding to a part of the promoter of the TK gene of the herpes simplex virus type 1 (HSV-1), lying between the positions -105 and +56 relative to the site of initiation of transcription, was amplified by PCR using the plasmid pBLCAT2 (Luckow B. and Schutz G., Nucleic Acids Res., 15 (1987) 5490) as template and the 5 'oligonucleotides CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGC CCA GCG 3' (SEQ ID NO: 28) and 5 'TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA 3' (SEQ ID NO: 2) as primers. This fragment was digested with Bqll1 and HindIII and was then cloned into the plasmid pGL3-Basic previously digested with Bqlll and HindIII to obtain the plasmid FTKpGL3. A schematic representation of this plasmid is presented in Figure 1.
1.2. Plasmides JxnS-TK-pGL3.1.2. JxnS-TK-pGL3 plasmids.
Un fragment d'ADN, contenant un ou plusieurs (n) sites J du promoteur du gène de l'ApoA-ll humaine, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide J3TKpGL3 (Vu-Dac N. et coll., J. Clin. Invest., 96 (1995) 741-750) comme matrice et les oligonucléotides 3RDA37 (5' ACG TGT CGA CAC TAG TGG CTA GAG GAT CTC TAC CAG G 3' ; SEQ ID NO: 3) et 4RDA48 (5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CGA GAT CCT TCA ACC TTT ACC 3' ; SEQ ID NO: 4) comme amorces. Ce fragment a été digéré par Xhol et Spel puis a été clone dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digéré par Xhol et Nhel, dans le sens de la transcription du promoteur minimal TK (S), pour obtenir les plasmides Jx1S-TK-pGL3, Jx2S-TK-pGL3 et Jx3S-TK-pGL3, selon le nombre de sites J présents. Une représentation schématique du plasmide Jx3S-TK-pGL3 est présentée dans la figure 2.A DNA fragment, containing one or more (n) J sites of the human ApoA-ll gene promoter, was amplified by PCR using the plasmid J3TKpGL3 (Vu-Dac N. et al., J. Clin Invest., 96 (1995) 741-750) as matrix and the oligonucleotides 3RDA37 (5 'ACG TGT CGA CAC TAG TGG CTA GAG GAT CTC TAC CAG G 3'; SEQ ID NO: 3) and 4RDA48 (5 'CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CGA GAT CCT TCA ACC TTT ACC 3 '; SEQ ID NO: 4) as primers. This fragment was digested with Xhol and Spel and then was cloned into the plasmid FTKpGL3 previously digested with Xhol and Nhel, in the direction of transcription of the minimal promoter TK (S), to obtain the plasmids Jx1S-TK-pGL3, Jx2S- TK-pGL3 and Jx3S-TK-pGL3, depending on the number of J sites present. A schematic representation of the plasmid Jx3S-TK-pGL3 is presented in Figure 2.
Le fragment d'ADN, amplifié par ACP en utilisant le plasmide J3TKpGL3 et les oligonucléotides 3RDA37 et 4RDA48 comme amorces, digéré par Xhol et Spel, a également été clone dans le plasmide Jx3S-TK-pGL3 préalablement digéré par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides Jx4S-TK-pGL3, Jx5S-TK- pGL3 et Jx6S-TK-pGL3, selon le nombre de sites J présents.The DNA fragment, amplified by PCR using the plasmid J3TKpGL3 and the oligonucleotides 3RDA37 and 4RDA48 as primers, digested with Xhol and Spel, was also cloned in the plasmid Jx3S-TK-pGL3 previously digested with Xhol and Nhel to obtain them. plasmids Jx4S-TK-pGL3, Jx5S-TK-pGL3 and Jx6S-TK-pGL3, depending on the number of J sites present.
1.3. Plasmides JxnAS-TK-pGL3.1.3. JxnAS-TK-pGL3 plasmids.
Les plasmides JxnAS-TK-pGL3 diffèrent des plasmides JxnS-TK-pGL3 par l'orientation des sites J présents dans le promoteur inductible. Un fragment d'ADN, contenant un ou plusieurs sites J du promoteur du gène de l'ApoA-ll humaine, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide J3TKpGL3 comme matrice et les oligonucléotides 3RDA37 et 4RDA48 comme amorces Ce fragment a été digère par Sali et Nhel puis a été clone, dans le sens inverse de la transcription du promoteur minimal TK (AS), dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digère par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides Jx1AS-TK- pGL3, Jx2AS-TK-pGL3 et Jx3AS-TK-pGL3, selon le nombre de sites J présents. Une représentation schématique du plasmide Jx3AS-TK-pGL3 est présentée dans la figure 3The JxnAS-TK-pGL3 plasmids differ from the JxnS-TK-pGL3 plasmids by the orientation of the J sites present in the inducible promoter. A DNA fragment, containing one or more J sites of the promoter of the human ApoA-ll gene, was amplified by PCR using the plasmid J3TKpGL3 as matrix and the oligonucleotides 3RDA37 and 4RDA48 as primers This fragment was digested with Sali and Nhel and then was cloned, in the opposite direction from the transcription of the minimal promoter TK (AS), into the plasmid FTKpGL3 previously digested with Xhol and Nhel to obtain the plasmids Jx1AS-TK-pGL3, Jx2AS-TK-pGL3 and Jx3AS-TK-pGL3, depending on the number of J sites present. A schematic representation of the plasmid Jx3AS-TK-pGL3 is presented in Figure 3
Le fragment d'ADN, amplifié par ACP en utilisant le plasmide J3TKpGL3 et les oligonucléotides 3RDA37 et 4RDA48 comme amorces, digère par Kpnl et Spel, a également été clone dans l'orientation antisens (AS) dans le plasmide Jx3AS-TK-pGL3 préalablement digéré par Kpnl et Nhel pour obtenir les plasmides Jx4AS-TK-pGL3 et Jx5AS-TK-pGL3 selon le nombre de sites J présents.The DNA fragment, amplified by PCR using the plasmid J3TKpGL3 and the oligonucleotides 3RDA37 and 4RDA48 as primers, digested with Kpnl and Spel, was also cloned in the antisense orientation (AS) in the plasmid Jx3AS-TK-pGL3 digested with Kpnl and Nhel to obtain the plasmids Jx4AS-TK-pGL3 and Jx5AS-TK-pGL3 according to the number of J sites present.
1.4. Plasmides DR1xnS-TK-pGL3.1.4. DR1xnS-TK-pGL3 plasmids.
Ces plasmides contiennent, comme élément de réponse aux PPAR (PPRE), une séquence consensus (AGGTCA A AGGTCA , SEQ ID NO: 5) appelée DR1 consensus. Un fragment d'ADN, contenant un ou plusieurs sites DR1 consensus, a été amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotides 1 RDA69 (5' ACG TGT CGA CAC TAG TCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA AAG GTC ACG GAA AAC TAG 3' , SEQ ID NO 6) et 2RDA64 (5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCG TGA CCT TTG ACC TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3' , SEQ ID NO. 7) comme amorces. Ce fragment a été digéré par Xhol et Spel puis a été clone, dans l'orientation sens, dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digère par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides DR1x2S-TK-pGL3 et DR1x3S-TK-pGL3, selon le nombre de sites DR1 consensus présents. Une représentation schématique du plasmide DR1x3S-TK-pGL3 est présentée dans la figure 4 Le fragment d'ADN, amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotidesThese plasmids contain, as an element of response to PPAR (PPRE), a consensus sequence (AGGTCA A AGGTCA, SEQ ID NO: 5) called DR1 consensus. A DNA fragment, containing one or more consensus DR1 sites, was amplified by PCR using the oligonucleotides 1 RDA69 (5 ′ ACG TGT CGA CAC TAG TCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA AAG GTC ACG GAA AAC TAG 3 ', SEQ ID NO 6) and 2RDA64 (5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCG TGA CCT TTG ACC TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3 ', SEQ ID NO. 7) as primers. This fragment was digested with Xhol and Spel and then was cloned, in the sense orientation, into the plasmid FTKpGL3 previously digested with Xhol and Nhel to obtain the plasmids DR1x2S-TK-pGL3 and DR1x3S-TK-pGL3, according to the number of DR1 consensus sites present. A schematic representation of the plasmid DR1x3S-TK-pGL3 is presented in Figure 4 The DNA fragment, amplified by PCR using oligonucleotides
1 RDA69 et 2RDA64 comme amorces, digéré par Xhol et Spel, a également été clone dans le plasmide DR1x3S-TK-pGL3 préalablement digéré par Xhol et1 RDA69 and 2RDA64 as primers, digested with Xhol and Spel, was also cloned into the plasmid DR1x3S-TK-pGL3 previously digested with Xhol and
Nhel pour obtenir les plasmides DR1x5S-TK-pGL3, DR1x6S-TK-pGL3 et DR1x7S-TK-pGL3, selon le nombre de sites DR1 consensus présents.Nhel to obtain the plasmids DR1x5S-TK-pGL3, DR1x6S-TK-pGL3 and DR1x7S-TK-pGL3, according to the number of DR1 consensus sites present.
1.5. Plasmides DRlxnAS-TK-pGL3.1.5. DRlxnAS-TK-pGL3 plasmids.
Les plasmides DR1xnAS-TK-pGL3 diffèrent des plasmides DR1xnS-TK- pGL3 par l'orientation des sites DR1 consensus présents dans le promoteur inductible. Un fragment d'ADN, contenant une ou plusieurs séquences DR1 consensus, a été amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotides 1 RDA69 et 2RDA64 comme amorces. Ce fragment a été digéré par Sali et Nhel puis a été clone, dans l'orientation antisens, dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digéré par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides DR1x2AS-TK-pGL3 et DR1x3AS-TK-pGL3, selon le nombre de sites DR1 consensus présents. Une représentation schématique du plasmide DR1x3AS-TK-pGL3 est présentée dans la figure 5. Le fragment d'ADN, amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotidesThe DR1xnAS-TK-pGL3 plasmids differ from the DR1xnS-TK-pGL3 plasmids in the orientation of the consensus DR1 sites present in the inducible promoter. A DNA fragment, containing one or more consensus DR1 sequences, was amplified by PCR using the oligonucleotides 1 RDA69 and 2RDA64 as primers. This fragment was digested with Sali and Nhel and then was cloned, in the antisense orientation, into the plasmid FTKpGL3 previously digested with Xhol and Nhel to obtain the plasmids DR1x2AS-TK-pGL3 and DR1x3AS-TK-pGL3 DR1 consensus sites present. A schematic representation of the plasmid DR1x3AS-TK-pGL3 is presented in FIG. 5. The DNA fragment, amplified by PCR using the oligonucleotides
1 RDA69 et 2RDA64 comme amorces, digéré par Kpnl et Spel, a également été clone dans le plasmide DR1x3AS-TK-pGL3 préalablement digéré par Kpnl et Nhel pour obtenir les plasmides DR1x5AS-TK-pGL3 et DR1x6AS-TK-pGL3 selon le nombre de sites DR1 consensus présents.1 RDA69 and 2RDA64 as primers, digested with Kpnl and Spel, was also cloned into the plasmid DR1x3AS-TK-pGL3 previously digested with Kpnl and Nhel to obtain the plasmids DR1x5AS-TK-pGL3 and DR1x6AS-TK-pGL3 according to the number of DR1 consensus sites present.
EXEMPLE 2 : Spécificité des PPAR pour différents éléments de réponse.EXAMPLE 2: Specificity of PPARs for different response elements.
2.1. Système utilisant hPPARg2. L'activité des promoteurs inductibles, en utilisant hPPARg2 comme régulateur transcriptionnel, a été évaluée en transfection transitoire dans des myoblastes de souris (figure 6). Les résultats montrent que, selon l'élément de réponse utilisé (PPRE), l'induction par le ligand de hPPARg2 (BRL49653) et l'activité finale après activation varient. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant des sites J comme PPRE. De plus, l'orientation du PPRE est également importante. Dans le cas du site J, l'orientation AS est plus favorable (Panneau c).2.1. System using hPPARg2. The activity of inducible promoters, using hPPARg2 as a transcriptional regulator, was evaluated by transient transfection in mouse myoblasts (Figure 6). The results show that, depending on the response element used (PPRE), the induction by the ligand of hPPARg2 (BRL49653) and the final activity after activation vary. The best results have been obtained using J sites such as PPRE. In addition, the orientation of the PPRE is also important. In the case of site J, the orientation AS is more favorable (Panel c).
2.2. Système utilisant hPPARa.2.2. System using hPPARa.
Les résultats obtenus avec hPPARa comme régulateur transcriptionnel, sont rassemblés dans la figure 7. Contrairement au hPPARg2, c'est le DR1 consensus qui est le meilleur PPRE pour hPPARa (Panneaux d et e)The results obtained with hPPARa as a transcriptional regulator, are gathered in figure 7. Unlike hPPARg2, it is the DR1 consensus which is the best PPRE for hPPARa (Panels d and e)
Ces résultats montrent donc (1 ) la fonctionnalité des plasmides de l'invention et (2) que selon le PPAR choisi dans le système inductible, il est important de sélectionner le PPRE le plus adapté au régulateur transcriptionnel. Ce choix peut influencer le facteur d'induction dû à la présence du ligand mais également le niveau d'activité atteint après induction. Il est bien entendu que d'autres PPRE peuvent être utilisés dans le système de l'invention.These results therefore show (1) the functionality of the plasmids of the invention and (2) that according to the PPAR chosen in the inducible system, it is important to select the PPRE most suited to the transcriptional regulator. This choice can influence the induction factor due to the presence of the ligand but also the level of activity achieved after induction. It is understood that other PPREs can be used in the system of the invention.
EXEMPLE 3 : Construction de promoteurs inductibles par les PPAR contenant un promoteur minimum autre que celui de HSV1 -TK comme par exemple le promoteur minimum de hCMV-IE.EXAMPLE 3 Construction of promoters inducible by PPARs containing a minimum promoter other than that of HSV1 -TK such as for example the minimum promoter of hCMV-IE.
3.1. Construction des plasmides contenant le promoteur minimum de hCMV-IE. Un fragment d'ADN, contenant le promoteur minimum de hCMV-IE (de la position -54 à la position +48 par rapport au site d'initiation de la transcription), a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pCMVβ (Clontech) comme matrice et les oligonucléotides 5RDA32 (5' ACG TAG ATC TCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG 3' ; SEQ. ID NO: 8) et 6RDA29 (5' ACG TAA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GC 3' ; SEQ ID NO: 9) comme amorces. Ce fragment a été digéré par HindIII et Bqlll puis a été clone dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digéré par HindIII et Bqlll pour obtenir le plasmide FCMVpGL3. Le plasmide Jx5AS-TK-pGL3 a été digéré par Bqlll et Nhel pour isoler le fragment Bqlll-Nhel de 179 pb contenant 5 copies du site J. Ce fragment a été inséré dans le plasmide FCMVpGL3 préalablement digéré par Bqlll et Nhel pour donner le plasmide Jx5AS-CMV-pGL3. Une représentation schématique du plasmide Jx5AS-CMV-pGL3 est présentée dans la figure 8.3.1. Construction of the plasmids containing the minimum promoter of hCMV-IE. A DNA fragment containing the minimal promoter of hCMV-IE (the -54 position to the 48 position relative to the start site of transcription), was amplified by PCR using the plasmid pCMV.beta (Clontech) as template and the oligonucleotides 5RDA32 (5 'ACG TAG ATC TCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG 3'; SEQ. ID NO: 8) and 6RDA29 (5 'ACG TAA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GC 3'; SEQ ID NO: 9) as primers. This fragment was digested with HindIII and Bqlll and then was cloned into the plasmid FTKpGL3 previously digested with HindIII and Bqlll to obtain the plasmid FCMVpGL3. Plasmid Jx5AS-TK-pGL3 was digested with Bqlll and Nhel to isolate the Bqlll-Nhel fragment of 179 bp containing 5 copies of site J. This fragment was inserted in the plasmid FCMVpGL3 previously digested with Bqlll and Nhel to give the plasmid Jx5AS-CMV-pGL3. A schematic representation of the plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 is presented in FIG. 8.
Le plasmide Jx5AS-CMV-pGL3 a été digéré par Sphl et Nhel pour isoler le fragment Sphl-Nhel de 982 pb contenant 5 copies du site J, le promoteur minimum hCMV-IE et la partie 5' du gène codant pour la luciférase. Ce fragment a été inséré dans le plasmide Jx5AS-CMV-pGL3 préalablement digéré par Sphl et Spel pour donner le plasmide Jx10AS-CMV-pGL3. Les plasmides Jx15AS- CMV-pGL3 et Jx20AS-CMV-pGL3 ont également été obtenus en suivant la même stratégie.Plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 was digested with Sphl and Nhel to isolate the Sphl-Nhel fragment of 982 bp containing 5 copies of site J, the minimum promoter hCMV-IE and the 5 'part of the gene coding for luciferase. This fragment was inserted into the plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 previously digested with Sphl and Spel to give the plasmid Jx10AS-CMV-pGL3. The plasmids Jx15AS-CMV-pGL3 and Jx20AS-CMV-pGL3 were also obtained by following the same strategy.
3.2. Activité des plasmides contenant le promoteur minimum de hCMV-IE.3.2. Activity of plasmids containing the minimum promoter of hCMV-IE.
Une comparaison des promoteurs minimum pouvant être utilisés dans le système inductible a été réalisée en transfection transitoire. Les résultats, rassemblés dans la figure 9, montrent que selon le promoteur minimum, l'activité finale après induction peut varier d'un facteur deux. Ces résultats montrent en particulier que, dans les conditions testées, le promoteur CMV semble donner une activité supérieure. Bien entendu, d'autres promoteurs minimum, comme des promoteurs ne contenant pas de boîte TATA, peuvent être utilisés. EXEMPLE 4 : Importance du nombre d'éléments de réponse présents dans les promoteurs inductibles .A comparison of the minimum promoters that can be used in the inducible system was carried out in transient transfection. The results, collated in FIG. 9, show that, depending on the minimum promoter, the final activity after induction can vary by a factor of two. These results show in particular that, under the conditions tested, the CMV promoter seems to give a higher activity. Of course, other minimum promoters, such as promoters which do not contain a TATA box, can be used. EXAMPLE 4 Importance of the number of response elements present in the inducible promoters.
L'optimisation du nombre de PPRE présents dans le promoteur inductible a été étudiée en transfection transitoire. Les résultats, présentés dans la figure 10, montrent que plus le nombre de copies du PPRE est important, plus le facteur d'induction par le ligand et l'activité induite sont élevés. Par contre, si ce nombre est trop important, à la fois le facteur d'induction et l'activité induite diminuent, et ceci quelle que soit la quantité de hPPARg2 présente dans l'essai (figure 1 1 ). Le nombre de PPRE optimal semble compris entre 10 et 15.Optimization of the number of PPREs present in the inducible promoter has been studied in transient transfection. The results, presented in FIG. 10, show that the greater the number of copies of PPRE, the higher the factor of induction by the ligand and the induced activity. On the other hand, if this number is too large, both the induction factor and the induced activity decrease, and this regardless of the amount of hPPARg2 present in the test (FIG. 11). The optimal number of PPREs seems to be between 10 and 15.
EXEMPLE 5 : Construction d'un régulateur transcriptionnel fortement inductible par les ligands des PPAR.EXAMPLE 5 Construction of a transcriptional regulator highly inducible by PPAR ligands.
• 5.1. Construction d'un régulateur transcriptionnel comprenant deux copies du domaine de liaison au ligand. Construction du plasmide pSG5-hPPARg2g2.• 5.1. Construction of a transcriptional regulator comprising two copies of the ligand-binding domain. Construction of the plasmid pSG5-hPPARg2g2.
Un fragment d'ADN, noté A, contenant la région de l'ADN complémentaire de hPPARg2 codant pour la partie C-terminale du domaine F, a été amplifié parA DNA fragment, noted A, containing the region of the DNA complementary to hPPARg2 coding for the C-terminal part of the F domain, was amplified by
ACP en utilisant le plasmide pSG5-hPPARg2 comme matrice et les oligonucléotides 20RDA21 (5' GGT TTG CTG AAT GTG AAG CCC 3' ; SEQ ID NO: 10) et 21 RDA42 (5' AGT CTC TAG AGC TAC GCG TAC AAG TCC TTGPCR using the plasmid pSG5-hPPARg2 as template and the oligonucleotides 20RDA21 (5 'GGT TTG CTG AAT GTG AAG CCC 3'; SEQ ID NO: 10) and 21 RDA42 (5 'AGT CTC TAG AGC TAC GCG TAC AAG TCC TTG
TAG ATC TCC TGC 3' ; SEQ ID NO: 1 1 ) comme amorces. Un fragment d'ADN, noté B, contenant la région de l'ADN complémentaire de hPPARg2 codant pour les domaines E et F, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pSG5- hPPARg2 comme matrice et ies oligonucléotides 22RDA32 (5' AGT CAC GCG TGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG AC 3' ; SEQ ID NO: 12) et 23RDA21 (5"TAG ATC TCC TGC 3 '; SEQ ID NO: 1 1) as primers. A DNA fragment, denoted B, containing the DNA region complementary to hPPARg2 coding for domains E and F, was amplified by PCR using the plasmid pSG5- hPPARg2 as template and the oligonucleotides 22RDA32 (5 ′ AGT CAC GCG TGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG AC 3 '; SEQ ID NO: 12) and 23RDA21 (5 "
' GCC TTT GAG TGA GCT GAT ACC 3' ; SEQ ID NO: 13) comme amorces. Le fragment A, digéré par Sacl et Mlul et le fragment B, digéré par Mlul et Xbal ont été clones ensemble dans le plasmide pSG5-hPPARg2 préalablement digéré par Sacl et Xbal pour obtenir le plasmide pSG5-hPPARg2g2. Ce plasmide, dont une représentation schématique est présentée dans la figure 12, contient un ADN complémentaire qui code pour un régulateur transcriptionnel (noté hPPARg2g2) comprenant deux copies des domaines E et F, c'est à dire deux domaines de liaison au ligand.'GCC TTT GAG TGA GCT GAT ACC 3'; SEQ ID NO: 13) as primers. The fragment A, digested with Sacl and Mlul and fragment B, digested with Mlul and Xbal were cloned together in the plasmid pSG5-hPPARg2 previously digested with Sacl and Xbal to obtain the plasmid pSG5-hPPARg2g2. This plasmid, a schematic representation of which is presented in FIG. 12, contains complementary DNA which codes for a transcriptional regulator (denoted hPPARg2g2) comprising two copies of the E and F domains, ie two ligand binding domains.
La séquence complète du PPARγ2γ2 est représentée ci-dessous (SEQ ID NO: 24) : MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPWADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQ YN KPHEEPSNS MAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS RNKCQYCRFQKCLAVGMSH AIRFGRMPQAEKEKLI_AEISSDIDQLNPESADLRAAKHLYD SYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSIΛVIMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIF QGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHE1IYTMLASLMNKDGVLISEG QGF TREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSD AIFIAVIILSGDRPGLLNVKPI EDIQDNLLQA ELQLKLNHPESSQLFAKLLQK TDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPL LQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSI_V_VIGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGC QFRSVEAVQEI EYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGF MTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDI QDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQE IYKDLYThe complete sequence of PPARγ2γ2 is shown below (SEQ ID NO: 24): MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPWADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQ YN KPHEEPSNS MAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS RNKCQYCRFQKCLAVGMSH AIRFGRMPQAEKEKLI_AEISSDIDQLNPESADLRAAKHLYD SYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSIΛVIMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIF QGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHE1IYTMLASLMNKDGVLISEG QGF TREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSD AIFIAVIILSGDRPGLLNVKPI EDIQDNLLQA ELQLKLNHPESSQLFAKLLQK TDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPL LQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSI_V_VIGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGC QFRSVEAVQEI EYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGF MTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDI QDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQE IYKDLY
La séquence de la partie C-terminale de PPARγ2γ2, comprenant les domaines E et F, est la séquence SEQ ID NO : 25 suivante -The sequence of the C-terminal part of PPARγ2γ2, comprising the domains E and F, is the following sequence SEQ ID NO: 25 -
MMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTL LKYGVHE11YTMLASLMNKDGV ISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALEL DDSDLAIFI VIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTD LRQIVTEHVQLLQVIKKTΞTDMSLHPLLQEIYKDLYAAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMG EDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKY GVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDS DI_A FIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQ IVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTL LKYGVHE11YTMLASLMNKDGV ISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALEL DDSDLAIFI VIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTD LRQIVTEHVQLLQVIKKTΞTDMSLHPLLQEIYKDLYAAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMG EDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKY GVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDS DI_A FIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQ IVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY
5.2. Activité du plasmide pSG5-hPPARg2g2. Les résultats présentés dans la figure 13 montrent que si l'activité induite est plus faible en utilisant hPPARg2g2 comme régulateur transcriptionnel (figure 13 a et b), le facteur d'induction par le ligand (figure 13 c) est beaucoup plus fort avec ce régulateur. La différence entre les deux régulateurs transcriptionnels s'explique par le fait que pour hPPARg2g2, le bruit de fond du système en absence de ligand est faible et reste faible, quelle que soit la quantité de régulateur présent. D'autre part, plus la quantité de hPPARg2g2 augmente, plus l'activité induite est forte, ce qui n'est pas le cas du système utilisant hPPARg2 qui semble saturer.5.2. Activity of the plasmid pSG5-hPPARg2g2. The results presented in FIG. 13 show that if the induced activity is weaker using hPPARg2g2 as a transcriptional regulator (FIG. 13 a and b), the factor of induction by the ligand (FIG. 13 c) is much stronger with this regulator. The difference between the two transcriptional regulators is explained by the fact that for hPPARg2g2, the background noise of the system in the absence of ligand is low and remains low, regardless of the quantity of regulator present. On the other hand, the more the amount of hPPARg2g2 increases, the higher the induced activity, which is not the case with the system using hPPARg2 which seems to saturate.
La présence d'un deuxième domaine de liaison au ligand (hPPARg2g2) confère donc au régulateur transcriptionnel une plus grande inductibilité par le ligand.The presence of a second ligand-binding domain (hPPARg2g2) therefore gives the transcriptional regulator greater inducibility by the ligand.
EXEMPLE 6 : Augmentation de l'activité finale des promoteurs inductibles.EXAMPLE 6 Increase in the final activity of inducible promoters.
6.1. Construction d'une cassette d'expression inductible comprenant l'intron de hEF1a. Construction du plasmide Jx10AS-CMV-EF-pGL3.6.1. Construction of an inducible expression cassette comprising the intron of hEF1a. Construction of the plasmid Jx10AS-CMV-EF-pGL3.
Un fragment d'ADN, contenant le premier intron du gène codant pour hEF1 a (de la position +16 à la position +984 par rapport au site d'initiation de la transcription ; numéro d'accès à Genbank : E02627), a été amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotides 25RDA35 (5' AGT CAC TAG TAA GCT TTT TGC CGC CAG AAC ACA GG 3' ; SEQ ID NO: 14) et 26RDA36 (5' AGT CAC TAG TCC ATG GCT GCC CAG TGC CTC ACG ACC 3' ; SEQ ID NO: 15) comme amorces. Ce fragment a été digéré par HindIII et Ncol puis a été clone dans le plasmide Jx10AS-CMV-pGL3 préalablement digéré par HindIII et Ncol pour obtenir le plasmide Jx10AS-CMV-EF-pGL3. Une représentation schématique du plasmide Jx10AS-CMV-EF-pGL3 est présentée dans la figure 14.A DNA fragment, containing the first intron of the gene coding for hEF1 a (from position +16 to position +984 relative to the site of transcription initiation; Genbank access number: E02627), was amplified by PCR using oligonucleotides 25RDA35 (5 'AGT CAC TAG TAA GCT TTT TGC CGC CAG AAC ACA GG 3'; SEQ ID NO: 14) and 26RDA36 (5 'AGT CAC TAG TCC ATG GCT GCC CAG TGC CTC ACG ACC 3 '; SEQ ID NO: 15) as primers. This fragment was digested with HindIII and Ncol then was cloned into the plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 previously digested with HindIII and Ncol to obtain the plasmid Jx10AS-CMV-EF-pGL3. A schematic representation of the plasmid Jx10AS-CMV-EF-pGL3 is presented in Figure 14.
6.2. Activité du plasmide Jx10AS-CMV-EF-pGL3. Dans le but d'augmenter l'activité finale du système, une séquence enhancer, située dans le premier intron du gène hEF1a, a été clonée au voisinage du promoteur inductible. Les résultats présentés dans la figure 15 montrent que la présence de la région enhancer augmente l'activité induite du système et ceci quelle que soit la quantité de régulateur transcriptionnel utilisée.6.2. Activity of the plasmid Jx10AS-CMV-EF-pGL3. In order to increase the final activity of the system, an enhancer sequence, located in the first intron of the hEF1a gene, was cloned in the vicinity of the inducible promoter. The results presented in FIG. 15 show that the presence of the enhancer region increases the induced activity of the system, regardless of the amount of transcriptional regulator used.
EXEMPLE 7 : Construction de plasmides comprenant à la fois une cassette d'expression du régulateur transcriptionnel et une cassette d'expression inductible.EXAMPLE 7 Construction of plasmids comprising both an expression cassette for the transcriptional regulator and an inducible expression cassette.
7.1. Plasmide Jx5AS-TK-luc-hPPARg2.7.1. Jx5AS-TK-luc-hPPARg2 plasmid.
Le plasmide pSG5-hPPARa(Koz) a été digéré par Mlul et Seal pour isoler le fragment Mlul-Scal de 1229 pb contenant la région 3' de l'ADN complémentaire de hPPARa. Ce fragment a été inséré dans le plasmide pSL301 préalablement digéré par Mlul et Smal pour donner le plasmide pSL-The plasmid pSG5-hPPARa (Koz) was digested with Mlul and Seal to isolate the Mlul-Scal fragment of 1229 bp containing the 3 'region of the DNA complementary to hPPARa. This fragment was inserted into the plasmid pSL301 previously digested with Mlul and SmaI to give the plasmid pSL-
3'hPPARa.3'hPPARa.
Le plasmide pSG5-hPPARa(Koz) a été digéré par Sali et Mlul pour isoler le fragment Sall-MIul de 1406 pb contenant le promoteur précoce du virus SV40 et la région 5' de l'ADN complémentaire de hPPARa. Ce fragment a été inséré dans le plasmide pSL-3'hPPARa préalablement digéré par Xhol et Mlul pour donner le plasmide pSL-hPPARa.The plasmid pSG5-hPPARa (Koz) was digested with SalI and Mlul to isolate the Sall-MIul fragment of 1406 bp containing the SV40 virus early promoter and the 5 'region of the DNA complementary to hPPARa. This fragment was inserted into the plasmid pSL-3'hPPARa previously digested with Xhol and Mlul to give the plasmid pSL-hPPARa.
Le plasmide pSL-hPPARa a été digéré par Spel et Sali pour isoler le fragment Spel-Sall de 2664 pb contenant le promoteur précoce du virus SV40 et l'ADN complémentaire de hPPARa. Ce fragment a été inséré dans le plasmide pBluescript II SK+ préalablement digéré par Spel et Sali pour donner le plasmide pBS-hPPARa.The plasmid pSL-hPPARa was digested with Spel and SalI to isolate the Spel-SalI fragment of 2664 bp containing the early promoter of the SV40 virus and the complementary DNA of hPPARa. This fragment was inserted into the plasmid pBluescript II SK + previously digested with Spel and SalI to give the plasmid pBS-hPPARa.
Le plasmide pSG5-hPPARg2 a été digéré par Ayril et Sacl pour isoler le fragment Ayrll-Sacl de 2070 pb, noté C, contenant la région 5' de l'ADN complémentaire de hPPARg2. Un fragment d'ADN, noté D, contenant la région 3' de l'ADN complémentaire de hPPARg2, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pSG5-hPPARg2 comme matrice et les oligonucléotides 10RDA21 (5' CAG GTT TGC TGA ATG TGA AGC 3' ; SEQ ID NO: 16) et 11 RDA40 (5' TGA CGT GTC GAC CTA GTA CAA GTC CTT GTA GAT CTC CTG C 3' ; SEQ ID NO: 17) comme amorces. Le fragment C et le fragment D, digéré par Sacl et Sali, ont été clones ensemble dans le plasmide pBS-hPPARa préalablement digéré par Ayril et Sali pour obtenir le plasmide pBS-hPPARg2.The plasmid pSG5-hPPARg2 was digested with Ayril and SacI to isolate the Ayrll-SacI fragment of 2070 bp, noted C, containing the 5 ′ region of the DNA complementary to hPPARg2. A DNA fragment, denoted D, containing the region 3 'of the DNA complementary to hPPARg2, was amplified by PCR using the plasmid pSG5-hPPARg2 as template and the oligonucleotides 10RDA21 (5' CAG GTT TGC TGA ATG TGA AGC 3 '; SEQ ID NO: 16) and 11 RDA40 (5 'TGA CGT GTC GAC CTA GTA CAA GTC CTT GTA GAT CTC CTG C 3'; SEQ ID NO: 17) as primers. Fragment C and fragment D, digested with Sac1 and SalI, were cloned together in the plasmid pBS-hPPARa previously digested with Ayril and Sali to obtain the plasmid pBS-hPPARg2.
Le plasmide Jx5AS-TK-pGL3 a été digéré par Kpnl et Sali pour isoler le fragment Kpnl-Sall de 2324 pb contenant le gène luc+ sous contrôle d'un promoteur inductible. Ce fragment a été inséré dans le plasmide pBS-hPPARg2 préalablement digéré par Kpnl et SaN pour donner le plasmide Jx5AS-TK-luc- hPPARg2. Une représentation schématique du plasmide Jx5AS-TK-luc- hPPARg2 est présentée dans la figure 16.Plasmid Jx5AS-TK-pGL3 was digested with Kpnl and SalI to isolate the Kpnl-SalI fragment of 2324 bp containing the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid pBS-hPPARg2 previously digested with Kpnl and SaN to give the plasmid Jx5AS-TK-luc-hPPARg2. A schematic representation of the plasmid Jx5AS-TK-luc-hPPARg2 is presented in FIG. 16.
7.2. Plasmide SV-g2-J10-C-pGL3.7.2. Plasmid SV-g2-J10-C-pGL3.
Le plasmide pBS-hPPARg2 a été digéré par Notl et Sali pour isoler le fragment Notl-Sall de 2622 pb, noté E, contenant l'ADN complémentaire de hPPARg2 sous contrôle du promoteur précoce de SV40. Un fragment d'ADN, noté F, contenant le site de polyadenylation du virus SV40, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide FTK-pGL3 comme matrice et les oligonucléotides 18RDA31 (5' AGT CGT CGA CGC TTC GAG CAG ACA TGA TAA G 3' ; SEQ ID NO: 18) et 19RDA35 (5" AGT CGC TAG CGA CGG ATC CTT ATC GAT TTT ACC AC 3' ; SEQ ID NO: 19) comme amorces. Le fragment E et le fragment F, digéré par Sali et Nhel, ont été clones ensemble dans le plasmide JxIOAS- CMV-pGL3 préalablement digéré par Notl et Nhel pour obtenir le plasmide SV- g2-J10-C-pGL3. Une représentation schématique du plasmide SV-g2-J10-C- pGL3 est présentée dans la figure 17.The plasmid pBS-hPPARg2 was digested with NotI and SalI to isolate the NotI-SalI fragment of 2622 bp, noted E, containing the complementary DNA of hPPARg2 under the control of the SV40 early promoter. A DNA fragment, denoted F, containing the polyadenylation site of the SV40 virus, was amplified by PCR using the plasmid FTK-pGL3 as template and the oligonucleotides 18RDA31 (5 'AGT CGT CGA CGC TTC GAG CAG ACA TGA TAA G 3 '; SEQ ID NO: 18) and 19RDA35 (5 "AGT CGC TAG CGA CGG ATC CTT ATC GAT TTT ACC AC 3'; SEQ ID NO: 19) as primers. Fragment E and fragment F, digested with SalI and Nhel, were cloned together in the plasmid JxIOAS-CMV-pGL3 previously digested with Notl and Nhel to obtain the plasmid SV-g2-J10-C-pGL3. A schematic representation of the plasmid SV-g2-J10-C- pGL3 is presented in Figure 17.
7.3. Plasmide hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3. Un fragment d'ADN, noté G, contenant l'ADN complémentaire de hPPARg2, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide Jx5AS-TK-luc- hPPARg2 comme matrice et les oligonucléotides 12RDA50 (5' GTC AGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3' ; SEQ ID NO: 20) et 13RDA42 (5' TAC GGG GTA CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TGG 3' ; SEQ ID NO: 21 ) comme amorces. Un fragment d'ADN, noté H, contenant le promoteur minimum de hCMV-IE (de la position -54 à la position +48 par rapport au site d'initiation de la transcription), a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pCMVβ comme matrice et les oligonucléotides 14RDA33 (5' GTC AGC TAG CCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AGG 3' ; SEQ ID NO: 22) et 15RDA33 (5' TAC GCT CGA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA7.3. HPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 plasmid. A DNA fragment, denoted G, containing the DNA complementary to hPPARg2, was amplified by PCR using the plasmid Jx5AS-TK-luc- hPPARg2 as template and the oligonucleotides 12RDA50 (5 'GTC AGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3 '; SEQ ID NO: 20) and 13RDA42 (5' TAC GGG GTA CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TGG 3 '; SEQ ID NO: 21) as primers. A DNA fragment, noted H, containing the minimum promoter of hCMV-IE (from position -54 to position +48 relative to the site of initiation of transcription), was amplified by PCR using the plasmid pCMVβ as template and the oligonucleotides 14RDA33 (5 'GTC AGC TAG CCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AGG 3'; SEQ ID NO: 22) and 15RDA33 (5 'TAC GCT CGA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA
GCG 3' ; SEQ ID NO: 23) comme amorces. Le fragment G, digéré par Kpnl et Xhol et le fragment H, digéré par Xhol et Nhel ont été clones ensemble dans le plasmide Jx5AS-TK-pGL3 préalablement digéré par Kpnl et Nhel pour obtenir le plasmide hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3. Une représentation schématique du plasmide hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 est présentée dans la figure 18.GCG 3 '; SEQ ID NO: 23) as primers. Fragment G, digested with Kpnl and Xhol and fragment H, digested with Xhol and Nhel were cloned together in the plasmid Jx5AS-TK-pGL3 previously digested with Kpnl and Nhel to obtain the plasmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 . A schematic representation of the plasmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 is presented in Figure 18.
7.4. Plasmides hPPARg2-CMV-JxnAS-CMV-pGL3.7.4. HPPARg2-CMV-JxnAS-CMV-pGL3 plasmids.
Le plasmide Jx5AS-CMV-pGL3 a été digéré par Nhel et Sphl pour isoler le fragment Nhel-SphI de 982 pb contenant la région 5' du gène luc+ sous contrôle d'un promoteur inductible. Ce fragment a été inséré dans le plasmide hPPARg2- CMV-Jx5AS-TK-pGL3 préalablement digéré par Spel et Sphl pour donner le plasmide hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3. Une représentation schématique du plasmide hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 est présentée dans la figure 19.Plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 was digested with Nhel and Sphl to isolate the Nhel-SphI fragment of 982 bp containing the 5 'region of the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 previously digested with Spel and Sphl to give the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3. A schematic representation of the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 is presented in Figure 19.
Le plasmide Jx5AS-CMV-pGL3 a été digéré par Nhel et Sphl pour isoler le fragment Nhel-SphI de 982 pb contenant la région 5' du gène luc+ sous contrôle d'un promoteur inductible. Ce fragment a été inséré dans le plasmide hPPARg2- CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 préalablement digéré par Spel et Sphl pour donner le plasmide hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3.Plasmid Jx5AS-CMV-pGL3 was digested with Nhel and Sphl to isolate the Nhel-SphI fragment of 982 bp containing the 5 'region of the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid hPPARg2- CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 previously digested with Spel and Sphl to give the plasmid hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3.
Le plasmide Jx10AS-CMV-pGL3 a été digéré par Nhel et Sphl pour isoler le fragment Nhel-SphI de 1151 pb contenant la région 5' du gène luc+ sous contrôle d'un promoteur inductible. Ce fragment a été inséré dans le plasmide hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 préalablement digéré par Spel et Sphl pour donner le plasmide hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.The plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 was digested with Nhel and Sphl to isolate the Nhel-SphI fragment of 1151 bp containing the 5 'region of the luc + gene under the control of an inducible promoter. This fragment was inserted into the plasmid hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 previously digested with Spel and Sphl to give the plasmid hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.
EXEMPLE 8 : Comparaison des différentes versions du système inductible in vitro.EXAMPLE 8 Comparison of the different versions of the inducible system in vitro.
La figure 20 rassemble les résultats obtenus in vitro avec plusieurs versions du système inductible. Ces résultats montrent que les systèmes utilisant deux plasmides (figure 20 lignes 1 , 3 et 4) comme les systèmes à un seul plasmide (figure 20 lignes 2 et 5 à 9) sont fonctionnels ; c'est à dire que la présence d'un ligand de PPARg (ici le BRL49653) augmente fortement l'expression du gène placé sous le contrôle du promoteur inductible. On remarque également que pour certains systèmes (figure 20 lignes 3 et 7 à 9) le facteur d'induction par le ligand est supérieur à 30, et que pour le système présenté sur la figure 20 ligne 4, l'activité après induction est égale à celle d'un promoteur fort comme celle du promoteur hCMV-IE.Figure 20 combines the results obtained in vitro with several versions of the inducible system. These results show that the systems using two plasmids (Figure 20 lines 1, 3 and 4) like the systems with a single plasmid (Figure 20 lines 2 and 5 to 9) are functional; that is to say that the presence of a PPARg ligand (here BRL49653) greatly increases the expression of the gene placed under the control of the inducible promoter. We also note that for certain systems (figure 20 lines 3 and 7 to 9) the factor of induction by the ligand is greater than 30, and that for the system presented on figure 20 line 4, the activity after induction is equal to that of a strong promoter like that of the hCMV-IE promoter.
EXEMPLE 9 : Différents ligands des PPAR peuvent activer le système inductible.EXAMPLE 9 Different ligands of PPARs can activate the inducible system.
9.1. Système utilisant hPPARg2.9.1. System using hPPARg2.
Les résultats présentés dans la figure 21 montrent que des ligands de hPPARg autres que le BRL49653, ici le RG12525 (ligand RPR de hPPARg), peuvent être utilisés pour activer le système inductible. A une concentration de 100 μM, un traitement avec le RG12525 conduit même à une induction plus forte que celle obtenue avec le BRL49653. Tout autre ligand de PPARg peut donc être utilisé comme inducteur du système.The results presented in FIG. 21 show that ligands of hPPARg other than BRL49653, here RG12525 (ligand RPR of hPPARg), can be used to activate the inducible system. At a concentration of 100 μM, treatment with RG12525 even leads to a stronger induction than that obtained with BRL49653. Any other PPARg ligand can therefore be used as a system inducer.
9.2. Système utilisant hPPARa.9.2. System using hPPARa.
De la même manière que pour le système utilisant hPPARg, un système utilisant hPPARa comme régulateur transcriptionnel peut être activé avec les fibrates ou le WY-14,643 par exemple ou tout autre ligand de hPPARa.In the same way as for the system using hPPARg, a system using hPPARa as a transcriptional regulator can be activated with the fibrates or WY-14,643 for example or any other ligand of hPPARa.
EXEMPLE 10 : Le système inductible peut être activé in vivo, dans le muscle.EXAMPLE 10 The inducible system can be activated in vivo, in the muscle.
La figure 22 rassemble les résultats obtenus in vivo, dans le muscle, avec différentes versions du système inductible. Les résultats montrent que pour les trois versions testées (figure 22 lignes 2 à 4), un traitement par gavage avec un ligand de hPPARg est capable d'augmenter fortement, dans le muscle, l'activité des promoteurs inductibles. Les facteurs d'induction sont : x14 pour la version figure 22 ligne 2, x8 pour la version figure 22 ligne 3, et x24 pour la version figure 22 ligne 4. De plus, pour l'une des versions (figure 22 ligne 2), l'activité obtenue chez les animaux traités au BRL49653 est de l'ordre de celle d'un promoteur fort comme le promoteur hCMV-IE.FIG. 22 brings together the results obtained in vivo, in the muscle, with different versions of the inducible system. The results show that for the three versions tested (FIG. 22 lines 2 to 4), a treatment by gavage with a ligand of hPPARg is capable of strongly increasing, in the muscle, the activity of the inducible promoters. The induction factors are: x14 for the version figure 22 line 2, x8 for the version figure 22 line 3, and x24 for the version figure 22 line 4. In addition, for one of the versions (figure 22 line 2) , the activity obtained in animals treated with BRL49653 is of the order of that of a strong promoter such as the hCMV-IE promoter.
Les résultats, présentés dans la figure 23, montrent également qu'une seule prise de ligand peut induire le système, que cette prise ait lieu avant ou après le transfert de gène. Cette expérience montre aussi qu'une dose deux fois moins importante que celle utilisée habituellement, permet d'obtenir le même facteur d'induction. Le système, utilisant un récepteur nucléaire PPAR comme régulateur transcriptionnel, est donc fonctionnel in vivo et peut être induit par la prise orale d'un ligand des PPAR.The results, presented in FIG. 23, also show that a single take of ligand can induce the system, whether this take place before or after the gene transfer. This experience also shows that a dose twice less than that usually used, allows to obtain the same induction factor. The system, using a PPAR nuclear receptor as a transcriptional regulator, is therefore functional in vivo and can be induced by the oral intake of a PPAR ligand.
EXEMPLE 11 : Construction d'un plasmide permettant l'expression inductible d'un gène dont le produit est sécrété.EXAMPLE 11 Construction of a plasmid allowing the inducible expression of a gene whose product is secreted.
11.1 Construction du plasmide pRDA02.11.1 Construction of the plasmid pRDA02.
Le plasmide Jx10AS-CMV-pGL3 a été digéré par HindIII et Mlul pour isoler le fragment Hindlll-Mlul de 459 pb. Ce fragment a été inséré dans le plasmide pXL3010 (Bettan M. et coll., Anal. Biochem., 271 (1999) 187-189) préalablement digéré par HindIII et Mlul pour donner le plasmide pRDA02. Ce plasmide contient l'ADN complémentaire du gène codant pour la forme sécrétée de la phosphatase alcaline placentaire humaine (hSeAP) dont l'expression est sous contrôle d'un promoteur inductible par le système utilisant les PPARs comme régulateur transcriptionnel. Une représentation schématique du plasmide pRDA02 est présentée dans la figure 24.Plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 was digested with HindIII and Mlul to isolate the HindIII-Mlul fragment of 459 bp. This fragment was inserted into the plasmid pXL3010 (Bettan M. et al., Anal. Biochem., 271 (1999) 187-189) previously digested with HindIII and Mlul to give the plasmid pRDA02. This plasmid contains DNA complementary to the gene coding for the secreted form of human placental alkaline phosphatase (hSeAP), the expression of which is under the control of a promoter inducible by the system using PPARs as transcriptional regulator. A schematic representation of the plasmid pRDA02 is presented in FIG. 24.
EXEMPLE 12 : Le système inductible permet de réguler, in vivo, la concentration plasmatique d'une protéine sécrétée.EXAMPLE 12 The inducible system makes it possible to regulate, in vivo, the plasma concentration of a secreted protein.
Les résultats présentés dans la figure 25 montrent qu'en utilisant le système inductible, il est possible de réguler dans le temps la concentration plasmatique d'une protéine sécrétée a partir du muscle, et ceci avec une simple prise orale d'un ligand des PPAR. La concentration plasmatique de la hSeAP est augmentée d'un facteur 18 (figure 25A) deux jours après la prise de ligand, puis retourne à son niveau de base une semaine plus tard. Entre le 2 e e et le 39ιeme jour, une réponse immunitaire dirigée contre la hSeAP d'origine humaine est observée et se traduit par une diminution de la concentration plasmatique de cette protéine. Malgré cette réponse immune, il est possible de réaliser un second cycle d'induction (figure 25A).The results presented in FIG. 25 show that by using the inducible system, it is possible to regulate over time the plasma concentration of a protein secreted from the muscle, and this with a simple oral intake of a ligand of PPAR . The plasma concentration of hSeAP is increased by a factor of 18 (Figure 25A) two days after taking the ligand, then returns to its basic level a week later. Between 2 and 39 ιeme ee day, an immune response directed against the hSeAP of human origin is observed and results in a decrease in plasma concentration this protein. Despite this immune response, it is possible to perform a second induction cycle (FIG. 25A).
Comme le montre la figure 25B, le système inductible permet également, par des prises de ligand journalières, de maintenir à un niveau élevé le taux plasmatique de hSeAP, durant une période égale à la durée du traitement.As shown in FIG. 25B, the inducible system also makes it possible, by taking daily ligands, to maintain the plasma level of hSeAP at a high level, for a period equal to the duration of the treatment.
EXEMPLE 13 : Différents ligands des PPAR peuvent activer le système inductible in vivo, et ceci de manière dose dépendante.EXAMPLE 13 Different ligands of PPARs can activate the inducible system in vivo, and this in a dose-dependent manner.
Le BRL49653, sous sa forme commercialisée pour le traitement du diabète de type II (Avandia™, SmithKiine Beecham) et le pioglitazone, sous sa forme commercialisée pour ce même traitement (Actos™, Takeda Pharmaceuticals) peuvent également activer le système inductible (figure 26A). La figure 26B montre également que le facteur d'induction est directement corrélé à la dose de ligand utilisée.BRL49653, in its form marketed for the treatment of type II diabetes (Avandia ™, SmithKiine Beecham) and pioglitazone, in its form marketed for the same treatment (Actos ™, Takeda Pharmaceuticals) can also activate the inducible system (Figure 26A ). Figure 26B also shows that the induction factor is directly correlated to the dose of ligand used.
Le système, utilisant un récepteur nucléaire PPAR comme régulateur transcriptionnel, permet donc de contrôler, de manière très précise, le taux plasmatique d'une protéine sécrétée. De plus, cette régulation peut être obtenue en utilisant divers ligands des PPAR.The system, using a nuclear PPAR receptor as a transcriptional regulator, therefore makes it possible to very precisely control the plasma level of a secreted protein. In addition, this regulation can be achieved by using various PPAR ligands.
EXEMPLE 14 : Construction d'un plasmide permettant l'expression inductible d'un gène dont le produit est un facteur angiogénique.EXAMPLE 14 Construction of a plasmid allowing the inducible expression of a gene whose product is an angiogenic factor.
14.1 Construction du plasmide Jx10AS-CMV-VEGFA165.14.1 Construction of the plasmid Jx10AS-CMV-VEGF A 165.
Le cadre de lecture de VEGF165 humain a été clone par transcription reverse et PCR à partir d'ARN total de placenta humain (Clontech) (Houck et al. Mol. Endocrinol. 12 (1991 ) 1806-1814) puis inséré dans un plasmide pBluescriptThe human VEGF165 reading frame was cloned by reverse transcription and PCR from total RNA of human placenta (Clontech) (Houck et al. Mol. Endocrinol. 12 (1991) 1806-1814) and then inserted into a plasmid pBluescript
(Stratagene) contenant le promoteur CMV E/P de la position -522 à +72 et le polyA tardif de SV40, pour donner le plasmide pXL3218. Ce dernier a été ensuite digéré par HindIII et BsrGI pour isoler le fragment A Hindlll-BsrGI de 482 pb. Le plasmide pXL3218 a également été digéré par BsrGI et BamHI pour isoler le fragment B BsrGI-BamHI de 390 pb. Les fragments A et B ont été insérés dans le plasmide Jx10AS-CMV-pGL3 préalablement digéré par HindIII et BamHI pour donner le plasmide Jx10AS-CMV-VEGFA165. Ce plasmide contient l'ADN complémentaire du gène codant pour le VEGFA165 dont l'expression est sous contrôle d'un promoteur inductible par le système utilisant les PPARs comme régulateur transcriptionnel. Une représentation schématique du plasmide Jx10AS-CMV-VEGFA165 est présentée dans la figure 27.(Stratagene) containing the CMV E / P promoter from position -522 to +72 and the SV40 late polyA, to give the plasmid pXL3218. The latter was then digested with HindIII and BsrGI to isolate the HindIII-BsrGI fragment A of 482 bp. The plasmid pXL3218 was also digested with BsrGI and BamHI to isolate the B fragment BsrGI-BamHI of 390 bp. Fragments A and B were inserted into the plasmid Jx10AS-CMV-pGL3 previously digested with HindIII and BamHI to give the plasmid Jx10AS-CMV-VEGF A 165. This plasmid contains the DNA complementary to the gene coding for VEGF A 165 of which expression is under the control of a promoter inducible by the system using PPARs as a transcriptional regulator. A schematic representation of the plasmid Jx10AS-CMV-VEGF A 165 is presented in FIG. 27.
Ce piasmide pourra être utilisé, par exemple, pour contrôler dans le temps l'activité angiogénique du VEGF à des fins thérapeutiques. This piasmid can be used, for example, to control over time the angiogenic activity of VEGF for therapeutic purposes.

Claims

REVENDICATIONS
1 Composition comprenant1 Composition including
(a) un premier élément comprenant un acide nucléique d'intérêt sous contrôle d'un promoteur mductible comprenant un élément de réponse à un PPAR et un promoteur transcriptionnel minimal, et(a) a first element comprising a nucleic acid of interest under the control of a mductible promoter comprising a response element to a PPAR and a minimal transcriptional promoter, and
(b) un deuxième élément comprenant un acide nucléique codant un PPAR sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel, en vue de leur utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps(b) a second element comprising a nucleic acid encoding a PPAR under the control of a transcriptional promoter, with a view to their simultaneous, separate or time-spaced use
2. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend en outre:2. Composition according to claim 1, characterized in that it further comprises:
(c) un ligand de PPAR. en vue d'une utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps.(c) a PPAR ligand. for simultaneous, separate or time-separated use.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les éléments (a) et (b) sont portés par des constructions génétiques distinctes3. Composition according to claim 1 or 2, characterized in that the elements (a) and (b) are carried by separate genetic constructions
4 Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les éléments (a) et (b) sont assemblés dans une même construction génétique4 Composition according to claim 1 or 2, characterized in that the elements (a) and (b) are assembled in the same genetic construction
5. Composition selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la construction génétique est un vecteur plasmidique ou viral5. Composition according to claim 3 or 4, characterized in that the genetic construction is a plasmid or viral vector
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'élément de réponse à un PPAR comprend un ou plusieurs sites de liaison du PPAR6. Composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that the response element to a PPAR comprises one or more binding sites of the PPAR
7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'élément de réponse à un PPAR comprend un ou plusieurs sites de séquence SEQ ID NO:1 ou de variants fonctionnels de cette séquence 7. Composition according to claim 6, characterized in that the response element to a PPAR comprises one or more sites of sequence SEQ ID NO: 1 or of functional variants of this sequence
8. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'élément de réponse à un PPAR comprend un ou plusieurs sites de séquence SEQ ID NO: 5 ou de variants fonctionnels de cette séquence.8. Composition according to claim 6, characterized in that the response element to a PPAR comprises one or more sites of sequence SEQ ID NO: 5 or of functional variants of this sequence.
9. Composition selon les revendications 6 à 8, caractérisée en ce que l'élément de réponse comprend jusqu'à 30 sites de liaison, de préférence de 3 à 20, plus préférentiellement de 5 à 15.9. Composition according to claims 6 to 8, characterized in that the response element comprises up to 30 binding sites, preferably from 3 to 20, more preferably from 5 to 15.
10. Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le promoteur minimal est un promoteur d'un gène cellulaire ou viral délété de région(s) non essentielle(s) à l'activité transcriptionnelle.10. Composition according to one of claims 1 to 9, characterized in that the minimal promoter is a promoter of a cellular or viral gene deleted from region (s) not essential (s) to transcriptional activity.
11. Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le promoteur inductible comprend en outre une région amplificatrice.11. Composition according to one of claims 1 to 10, characterized in that the inducible promoter further comprises an amplifying region.
12. Composition selon l'une des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce que le promoteur minimal et l'élément de réponse à un PPAR sont dans la même orientation.12. Composition according to one of claims 1 to 11, characterized in that the minimal promoter and the response element to a PPAR are in the same orientation.
13. Composition selon l'une des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce que le promoteur minimal et l'élément de réponse à un PPAR sont en orientation inverse.13. Composition according to one of claims 1 to 11, characterized in that the minimal promoter and the response element to a PPAR are in reverse orientation.
14. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant un PPAR code un PPARα ou un PPARγ.14. Composition according to one of claims 1 to 13, characterized in that the nucleic acid coding for a PPAR codes for a PPARα or a PPARγ.
15. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant un PPAR code un PPAR modifié comprenant -plusieurs sites de liaison au ligand. 15. Composition according to one of claims 1 to 14, characterized in that the nucleic acid coding for a PPAR codes for a modified PPAR comprising - several ligand binding sites.
16. Composition selon l'une des renvendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un élément (d) compenant un acide nucléique codant un RXR sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel.16. Composition according to one of claims 1 to 15, characterized in that it further comprises an element (d) comprising a nucleic acid encoding an RXR under the control of a transcriptional promoter.
17. Vecteur comprenant un élément (a) et un élément (b) selon la revendication.17. Vector comprising an element (a) and an element (b) according to claim.
18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce que les éléments (a) et (b) sont en orientation opposée.18. Vector according to claim 17, characterized in that the elements (a) and (b) are in opposite orientation.
19. Vecteur selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que le promoteur inductible de l'élément (a) et le promoteur transcriptionnel de l'élément (b) sont assemblés dans le vecteur pour former un promoteur bidirectionnel regulable.19. Vector according to claim 17 or 18, characterized in that the inducible promoter of the element (a) and the transcriptional promoter of the element (b) are assembled in the vector to form a regulatable bidirectional promoter.
20. Vecteur selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend, dans le sens 5'->3', un premier acide nucléique codant un PPAR, un premier promoteur transcriptionnel minimal contrôlant l'expression dudit premier acide nucléique, un ou plusieurs éléments de réponse à un PPAR, un deuxième promoteur transcriptionnel minimal et, sous le contrôle dudit deuxième promoteur transcriptionnel minimal, un deuxième acide nucléique codant un produit d'intérêt.20. Vector according to claim 19, characterized in that it comprises, in the 5 '-> 3' direction, a first nucleic acid encoding a PPAR, a first minimal transcriptional promoter controlling the expression of said first nucleic acid, one or several elements of response to a PPAR, a second minimum transcriptional promoter and, under the control of said second minimum transcriptional promoter, a second nucleic acid encoding a product of interest.
21. Vecteur selon l'une des revendications 17 à 20 caractérisé en ce qu'il comprend en outre un élément (d) selon ia revendication 16.21. Vector according to one of claims 17 to 20 characterized in that it further comprises an element (d) according to claim 16.
22. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 16 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 21 pour exprimer un acide nucléique d'intérêt dans une cellule ex vivo ou in vitro.22. Use of a composition according to one of claims 1 to 16 or of a vector according to one of claims 17 to 21 for expressing a nucleic acid of interest in a cell ex vivo or in vitro.
23. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 16 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 21 pour la préparation d'un produit destiné à exprimer un acide nucléique d'intérêt dans une cellule m vivo.23. Use of a composition according to one of claims 1 to 16 or of a vector according to one of claims 17 to 21 for the preparation of a product intended to express a nucleic acid of interest in a vivo m cell.
24. Procédé pour l'expression régulée d'un acide nucléique dans une cellule, m vitro ou ex vivo comprenant la mise en contact de ladite cellule avec une composition selon l'une des revendications 1 à 16 ou un vecteur selon l'une des revendications 17 à 21.24. A method for the regulated expression of a nucleic acid in a cell, m vitro or ex vivo comprising bringing said cell into contact with a composition according to one of claims 1 to 16 or a vector according to one of claims 17 to 21.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule mammifère, de préférence humaine.25. The method of claim 24, characterized in that it is a mammalian cell, preferably human.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule musculaire.26. The method of claim 25, characterized in that it is a muscle cell.
27. Cellule modifiée par mise en contact avec une composition selon l'une des revendications 1 à 16 ou un vecteur selon l'une des revendications 17 à 21.27. Cell modified by contacting with a composition according to one of claims 1 to 16 or a vector according to one of claims 17 to 21.
28. PPAR modifié comprenant plusieurs sites de liaison au ligand.28. Modified PPAR comprising several ligand binding sites.
29. Acide nucléique codant pour un PPAR selon la revendication 28.29. Nucleic acid coding for a PPAR according to claim 28.
30. Procédé d'identification de ligands des PPAR, comprenant la mise en contact d'une cellule selon la revendication 27 avec une molécule test et la mise en évidence d'une expression de l'acide nucléique d'intérêt. 30. A method of identifying ligands for PPAR, comprising contacting a cell according to claim 27 with a test molecule and demonstrating an expression of the nucleic acid of interest.
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