WO2001098475A2 - Method for the detection of cathepsins, asparaginyl endopeptidases and isozymes thereof and leukocystatin - Google Patents

Method for the detection of cathepsins, asparaginyl endopeptidases and isozymes thereof and leukocystatin Download PDF

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WO2001098475A2
WO2001098475A2 PCT/EP2001/006791 EP0106791W WO0198475A2 WO 2001098475 A2 WO2001098475 A2 WO 2001098475A2 EP 0106791 W EP0106791 W EP 0106791W WO 0198475 A2 WO0198475 A2 WO 0198475A2
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Wolfgang Wienhold
Eva Tolosa
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for the selective detection of nucleic acid molecules in biological material which are specific for cathepsins, asparaginyl endopeptidase and their isozymes and for leukocystatin, as well as nucleotide sequences used in the method and their use.
  • Cathepsins form a group of lysosomal enzymes that belong to the cysteine or aspartate proteinases. They occur in animal and human cells.
  • cathepsins are expressed much more strongly in different tumor tissues and cells than in healthy tissues and cells. This increase in expression is the result of increased transcription, ie mRNA re-synthesis of the corresponding genes.
  • cathepsin B, D and L by Duffy, MJ, "Cancer etastasis: biological and clinical aspects", Ir J Med Sei 167: 4-8, 1998 ", by Lah, TT and Kos, J.”
  • Cysteine proteinases in cancer progression and their clinical relevance for prognosis
  • Detection methods are also known in the prior art in which antibodies against cathepsins are used.
  • Herszenyi et al. "The role of cysteine and serial proteases in colorectal carcinoma", Cancer 86: 1135-42, 1999, the detection of cathepsin B and L in human colorectal cancer by means of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA ).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Foekens et al. "Prognostic significance of cathepsins B and L in primary human breast cancer", J Clin Oncol 16: 1013-21, 1998, show data on the detection of cathepsin B and L in human breast tumor cells by means of ELISA.
  • EP 0 582 477 AI describes a diagnostic method for the detection of cancer and a pharmaceutical composition.
  • the application relates to both an anti-Cathepsin E antibody and a hybridization probe (DNA or RNA) that hybridizes with the Cathepsin E mRNA. In this registration is contain no indication of a sequence that can be used as a hybridization probe.
  • ELISA techniques or immunostaining for the detection of cathepsins are characterized by their low selectivity.
  • the anti-cathepsin antibodies used are often cross-reactive.
  • cathepsin L and V have an 85% sequence homology, with the result that all existing antibodies against these cathepsins cross-react with one another, as described, for example, by Santamaria et al., "Cathepsin L2 and novel human cysteine proteinase produced by breast and colo- rectal carcinomas ", Cancer Res ' 58: 1624-30, 1998.
  • the reproducibility of the results obtained in this way is heavily dependent on the experimenter using the methods used to date.
  • AEP Asparaginyl endopeptidase
  • cathepsin B, L, S, D and E in antigen processing in various antigen-presenting cells (APC) could be demonstrated using specific inhibitors and purified enzymes.
  • Bennett et al. "Antigen processing for presentation by class II major histocompatibility complex requires cleavage by cathepsin E", Eur J Immunol 22: 1519-24, 1992, Blum and Cresswell, "Role for intracellular proteases in the processing and the transport of class II HLA antigens ", Pro ⁇ Natl Acad Sei USA 85: 3975-9, 1988, and by Hewitt et al.," Natural processing sides for human cathepsin E and cathepsin D in tetanus toxin: Implications for T cells epitope generation " , J Immunol 195: 4693-9, 1997.
  • cathepsin V is involved in the formation of certain self-MHC / self-peptide complexes which are necessary for the selection of thymocytes, a lymphoid cell line which occurs in the thymus and is derived from pluripotent stem cells of the bone marrow. As described by Chen et al., Op. Asparaginyl endopeptidase also plays an important role in APCs.
  • this object is achieved according to the invention in that the detection using at least one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to 18 from the enclosed sequence listing or of sequences which bind (hybridize) to sequences to which one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18.
  • the object underlying the invention is completely achieved in this way.
  • the inventors of the present application have recognized that by using the nucleic acid molecules described here for the first time with the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18, due to their very high specificity and sensitivity, the detection of various cathepsins or leukocystatin and Asparaginylendopeptidase succeeds in biological material. All of the above nucleic acid molecules bind to highly conserved areas of the underlying coding sequences of the respective proteins, ie for example to areas of the mRNA transcripts that code for these proteins. These areas are referred to in the context of this application as nucleic acid molecules specific for the respective proteins.
  • nucleic acid molecules particularly suitable, for example, as hybridization probes or as primers in the context of DNA amplification.
  • Method for the detection of the above-mentioned specific nucleic acid molecules expressed in tumor tissues or APC can therefore be used both for the diagnosis of a course of the disease or for the early detection of a certain predisposition to disease as well as for evaluating the success of a therapy.
  • the invention further relates to a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence which consists of one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 from the enclosed sequence listing or a nucleotide sequence which binds (hybridizes) to sequences which binds (hybridizes) one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18, and the use of the above nucleic acid molecules in a detection method, preferably a polymerase chain reaction (PCR), a real-time PCR or Northern blot analysis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention relates in particular to those of the abovementioned nucleic acid molecules or their use or use in one of the stated processes which are highly affinity to their target molecules, i.e. hybridize to cathepsin, asparaginyl or their isozyme-specific and leukocystatin-specific nucleic acid molecules. They hybridize with their target molecules even under stringent conditions, i.e. even at high salt concentrations or high reaction temperatures.
  • the invention relates not only to a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from the enclosed sequence listing or its use or application in one of the methods specified, but also to a nucleic acid molecule which sequences hybridized to which one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 hybridizes.
  • a nucleic acid molecule can differ from a nucleic acid molecule with one of the sequences SEQ ID No. 1 to 18 in individual bases or sequence sections. Since the nucleic acid molecules with one of the sequences SEQ ID Nos.
  • 1 to 18 can be changed by shortening, lengthening, substitution, insertion and / or deletion without losing their function according to the invention or without losing their affinity for their target molecule, such lies Modified nucleic acid molecules or their use or use in one of the specified methods also within the scope of the invention.
  • nucleic acid molecules e.g. can be used as primers in a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • nucleic acid molecules can be used to specifically detect the proteins listed below:
  • SEQ ID Nos. 17 and 18 leukocystatin If these nucleic acid molecules are used in a PCR, an amplification product of approx. 100 to 150 base pairs (bp) is produced. This ensures that the authorization efficiency is almost 100%.
  • the amplification product can then be detected using simple standard methods, for example by ethidium bromide staining after gel electrophoretic separation.
  • a preferred embodiment of the methods or the use of the claimed nucleic acid molecules consists in the detection or amplification of the specific nucleic acid molecules using real-time PCR (RT-PCR).
  • RT-PCR real-time PCR
  • the sensitivity of this method compared to traditional end-point PCR is based on the large number of measurement points obtained. This enables, for example, a linear quantification of the specific nucleic acid molecules to be detected over a range 3-5 times as large as compared to an end-point PCR.
  • the prerequisite for the reliable detection of the nucleic acid molecules mentioned by the real-time PCR is an extremely high specificity of the primer sequences used. According to the inventor's knowledge, the claimed nucleic acid molecules fulfill this requirement in an outstanding manner. The use prevents amplification of non-specific sections and the associated increase in "false positive" fluorescence.
  • the inventors have recognized that with the designed primer pairs also very homologous sequences, e.g. of Cathepsin V and L, can be differentiated. This is not possible with the previous methods. Because of this surprising selectivity of the method and the claimed nucleic acid molecules, important new knowledge can be gained. It can now e.g. investigated whether the in the literature by Herszenyi et al., 1999; Duffy et al., 1998; Lah et al., 1998, op. Cit., Described increase in expression of cathepsin L in human tumors need not be attributed to the increased expression of cathepsin V.
  • the methods described are preferably used in the context of methods for diagnosis and / or early detection.
  • the existing detection methods are very sensitive, they are suitable both for the diagnosis of a disease course or for the early detection of a certain predisposition to disease as well as for the evaluation of a therapy success.
  • the amount of sample material to be checked such as blood, biopsy samples, smears, can be greatly reduced. This means that only minimally invasive interventions in the patient are necessary.
  • the new method is also suitable for use in the context of an early diagnosis examination and / or a diagnostic method for the detection of tumors and / or metastases.
  • the sensitivity of the method according to the invention allows tumor cells to be identified even with minimally invasive methods and the success of the treatment, e.g. by blood analysis during leukemia treatment. Due to the extremely high sensitivity of the claimed sequences as PCR primers in conjunction with real-time PCR, only a few metastatic cells can be detected. Furthermore, the treatment success of patients after cancer therapy can be monitored.
  • the target molecules i.e. the cathepsin, asparaginyl endopeptidase and leukocystatin-specific nucleic acid molecules as the molecules to be detected
  • the design of the primers ensures reliable, fast and inexpensive detection of the most common types of tumor.
  • Fig. 1 agarose gel analysis of the PCR amplificates; exemplified for Cathepsin D-, Cathepsin L- and Cathepsin W-specific amplificates;
  • Fig. 3 standard curves, exemplified for cathepsin D- (a), cathepsin V- (b) and leukocystatin-specific amplificates (c).
  • the biological sample to be examined is made available in the form of patient blood, tissue or swab material.
  • the starting point of the detection method is the entire mRNA of the biological sample. To use the method, it must first be rewritten into a corresponding cDNA. This is done according to the manufacturer's instructions. With Trizol® (GibcoBRL) or StrataPrep Total RNA Miniprep Kit (Stratagene), the total RNA is isolated after DNase treatment of the sample and transcribed into cDNA with random hexamers and M-MLV reverse transcriptase (Promega). The resulting cDNA is diluted 1:10 with water and according to the manufacturer's instructions (Perkin Elmer) used as a template together with the primers and the SYBR® Green PCR Core Reagent in a real-time PCR.
  • the design of the primers for the PCR determines the selectivity and sensitivity of the detection method. Since the added dye is nonspecifically embedded in double-stranded DNA during RT-PCR, genomic DNA may be amplified minimally by the PCR primer.
  • the primers must be such that the amplificates have a size of 100-150 bp.
  • a total volume of 25 ⁇ l is selected for each reaction batch. This contains (final concentration) 1 x SYBR® PCR buffer (to be obtained from Perkin-Elmer), 3 mM MgCl 2 , each 0.05 M dATP, dCTP, dGTP and 0.1 mM dUTP, 0.025 u / 25 ⁇ l AmpliTaq Gold , 0.01 u / 25 ⁇ l AmpErase UNG and 300 nM each of the forward and reverse primers. The amount of the (cDNA) template used per 25 ⁇ l mixture corresponds to a total RNA equivalent of approx. 5 ng.
  • the PCR reaction is preferably carried out with the following temperature profile: AmpErase UNG incubation for 2 minutes at 50 ° C, AmpliTaq Gold activation for 10 minutes at 95 ° C; this is followed by 40 cycles of 15 seconds heat denaturation at 95 ° C and primer hybridization / polymerization for 1 minute at 60 ° C.
  • the mRNA preparations on which the library is based were additionally Previous DNase treatment subjected to a first-strand cDNA synthesis reaction once with and once without reverse transcriptase and then used in the PCR. In the approach without reverse transcriptase, a PCR product should only arise if the corresponding target sequence can be amplified within DNA contaminations with the primers. Table 1 shows the percentage of amplification of genomic DNA for each pair of primers.
  • primer sequences were designed by Perkin-Elmer for the TaqMan® ribosomal RNA control reagents kit and were used as an endogenous control in quantitative RT-PCT.
  • the desired size limit for the amplicon of 150 bp is reached.
  • the genomic DNA is almost completely destroyed by DNase degradation before reverse transcription, the amplification of genomic DNA observed here no longer plays a role in the actual analysis. There is no amplification of genomic DNA in the other primer pairs.
  • the efficiency of the individual amplification approaches can be determined via the so-called threshold cycle (c t , English: stress cycle).
  • a c t value represents the number of cycles at which an increase in reporter fluorescence is detected significantly above the background signal for the first time in RT-PCR. Accordingly, an efficient PCR reaction is characterized by the lowest possible c t value. With specific c t values ⁇ 35 one can speak of highly efficient amplification. In all approaches, the target molecule is therefore highly efficiently amplified.
  • Primer dimer formations which can lead to the accumulation of non-specific amplificates, did not play a role in any of the approaches examined.
  • Fig. 1 shows the cathepsin D-PCR approach without template (NTC); lanes 7 and 8 the cathepsin L-PCR approach without template (NTC); lanes 13 and 14 the Cathepsin W-PCR approach without template (NTC).
  • Lanes 4 to 6 show the separated amplificate of the Cathepsin D-PCR approach (with cDNA as template); in tracks 9 to 11 the cathepsin L-PCR approach (with cDNA) and in tracks 15 to 17 the cathepsin W-PCR approach (with cDNA).
  • the marker sizes are given in the relevant area.
  • the amplificates have the expected size (- 100-125 bp) and show no contamination with unspecific DNA.
  • the NTC approaches show no amplicons. That there is no unspecific formation of primer dimers.
  • Example 4 Melting curves of the specific amplificates
  • the temperature in ° C is plotted on the x-axis, and the first derivative of the fluorescence is plotted on the y-axis. It can be seen from the melting profile that a specific amplification has taken place in the batch. As shown here by way of example, all amplificates release the embedded fluorescent dye at ⁇ 80 ° C, a secondary peak at lower temperatures is not found.
  • both the agarose gel electrophoresis and the melting curve analysis clearly demonstrate the specificity of the detection method described and the nucleic acid molecules.
  • the specific amplicons were isolated, partly cloned into plasmids (pTNOT, pKS +), sequenced and used as templates in various dilutions.
  • the amount of template DNA was determined by an absorption measurement at 260 n wavelength.
  • the sensitivity can now be tested by determining the c t values of the individual amplification batches for a predetermined amount of template and plotting them against the logarithm of the predetermined cDNA molecules / batch become (standard curve). A straight line is drawn through the points thus obtained. Accurate quantification is possible up to the concentration at which the corresponding c t values are still on the determined straight line.
  • cathepsin D (a), cathepsin V (b) and leukocystatin (c) are shown by way of example in FIG. 3.
  • a dilution series of cathepsin D cDNA and a cathepsin V or leukocystatin plasmid was set up and used in the quantitative RT-PCR.
  • cathepsin D 10 specific cDNA molecules per ⁇ l batch volume can still be detected.
  • cathepsin V and leukocystatin it is still possible to detect 100 specific plasmid molecules per ⁇ l batch volume.
  • nucleic acid molecules are part of the methods described, e.g. as a PCR primer.
  • PCR primer pair 1 (specific for: asparaginyl endopeptidase)
  • PCR primer pair 3 (specific for: cathepsin D)
  • PCR primer pair 4 (specific for: Cathepsin H)
  • PCR primer pair 5 (specific for: cathepsin L)
  • PCR primer pair 6 (specific for: Cathepsin S)
  • PCR primer pair 7 (specific for: Cathepsin V)
  • PCR primer pair 9 (specific for: leukocystatin)

Abstract

A method for the selective detection of nucleic acid molecules in biological material, which are specific for cathepsins, asparaginyl endopeptidases and isozymes thereof and for leukocystatin is disclosed and the nucleic acid molecules used in said method and the use thereof.

Description

Verfahren zum Nachweis von Cathepsinen, Asparaqinylen- dopeptidase und deren Isozyme, sowie von Leukocystatin Method for the detection of cathepsins, asparaqinylene dopeptidase and their isozymes, as well as of leukocystatin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum selektiven Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in biologischem Material, die spezifisch für Cathepsine, Asparaginylendopeptidase und deren Isozyme sowie für Leukocystatin sind, sowie in dem Verfahren verwendete Nukleotidsequenzen und deren Verwendung.The present invention relates to a method for the selective detection of nucleic acid molecules in biological material which are specific for cathepsins, asparaginyl endopeptidase and their isozymes and for leukocystatin, as well as nucleotide sequences used in the method and their use.
Verfahren der oben erwähnten Art für den Nachweis von Cathepsinen sind aus verschiedenen Veröffentlichungen bekannt. Cathepsine bilden eine Gruppe von lysosomalen Enzymen, die zu den Cystein- oder Aspartat-Proteinasen gehören. Sie kommen in tierischen und menschlichen Zellen vor.Methods of the type mentioned above for the detection of cathepsins are known from various publications. Cathepsins form a group of lysosomal enzymes that belong to the cysteine or aspartate proteinases. They occur in animal and human cells.
Viele Proteinasen, einschließlich der Cathepsine, werden in verschiedenen Tumorgeweben und Zellen wesentlich stärker expri- miert als in gesunden Geweben und Zellen. Dieser Expressionsanstieg ist die Folge einer verstärkten Transkription, also mRNA-Neusynthese der entsprechenden Gene. So konnte z.B. eine verstärkte Expression von Cathepsin B, D und L durch Duffy, M.J., "Cancer etastasis: biological and clinical aspects", Ir J Med Sei 167 : 4-8, 1998", durch Lah, T.T. and Kos, J. , "Cysteine proteinases in cancer progression and their clinical relevance for prognosis", Biol Chem 379 : 125-30, 1998, sowie von Cathepsin H durch Kos, J. et al., "Cathepsin B, H, L, and their inhibitors stefin A and cystatin C in sera of melanoma patients", Clin Cancer Res . 3 : 1815-22, 1997, in transformiertem Gewebe nachgewiesen werden. Ebenso scheint die Expressionsrate endogener Proteinaseinhibitoren in Tumorgewebe eine Rolle zu spielen, siehe Kos, J. and Lah, T.T., a.a.O. Aus diesem Grund wird angenommen, daß auch der Inhibitor Leukocystatin, der in hä atopoetischen Zellen eine Rolle spielt, verstärkt in Tumoren exprimiert wird.Many proteinases, including cathepsins, are expressed much more strongly in different tumor tissues and cells than in healthy tissues and cells. This increase in expression is the result of increased transcription, ie mRNA re-synthesis of the corresponding genes. For example, an increased expression of cathepsin B, D and L by Duffy, MJ, "Cancer etastasis: biological and clinical aspects", Ir J Med Sei 167: 4-8, 1998 ", by Lah, TT and Kos, J.," Cysteine proteinases in cancer progression and their clinical relevance for prognosis ", Biol Chem 379: 125-30, 1998, and by Cathepsin H by Kos, J. et al.," Cathepsin B, H, L, and their inhibitors stefin A and cystatin C in sera of melanoma patients ", Clin Cancer Res. 3: 1815-22, 1997, in transformed tissue. The expression rate of endogenous proteinase inhibitors in tumor tissue also appears to play a role, see Kos, J. and Lah, TT, loc. Cit For this reason, it is assumed that the inhibitor leukocystatin, which plays a role in haematopoietic cells, is also increasingly expressed in tumors.
Die Beobachtung, daß eine Tumorzelle über die verstärkte Expression von Cathepsinen identifiziert werden kann, führte bereits vor einigen Jahren zur Entwicklung von Nachweisverfahren für diese Proteine bzw. für deren kodierende Nukleinsäuremole- küle, auch im Hinblick auf den möglichen Einsatz in der Prognose, Diagnose oder Therapie von Krebserkrankungen; Überblick in Kos, J. and Lah, T.T., "Cysteine proteinases and their endoge- nous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer", Oncol Rep 5 : 1349-61, 1998.The observation that a tumor cell can be identified by the increased expression of cathepsins led to the development of detection methods for these proteins or for their coding nucleic acid molecules a few years ago, also with regard to their possible use in prognosis, diagnosis or Cancer therapy; Overview in Kos, J. and Lah, TT, "Cysteine proteinases and their endogenous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer", Oncol Rep 5: 1349-61, 1998.
Chauhan et al., "Expression of cathepsin L in human tu ors", Cancer Res 51 : 1478-81, 1991, konnten über Northern-Blot- Analyse Cathepsin L in verschiedenen menschlichen Tumoren nachweisen. Saad et al., "Expression of genes that contribute to proliferative and metastatic ability in breast cancer resected during various menstrual phases", Lancet 351 , 1170-1173, 1998, konnten ebenfalls über Northern-Blot-Analysen Cathepsin L and D in menschlichen Brusttumorzellen nachweisen. In keiner der beiden Schriften wurden die Sequenzen der Hybridisierungssonden offenbart.Chauhan et al., "Expression of cathepsin L in human doors", Cancer Res 51: 1478-81, 1991, were able to detect cathepsin L in various human tumors via Northern blot analysis. Saad et al., "Expression of genes that contribute to proliferative and metastatic ability in breast cancer resected during various menstrual phases", Lancet 351, 1170-1173, 1998, were also able to use Northern blot analyzes of cathepsin L and D in human breast tumor cells prove. The sequences of the hybridization probes were not disclosed in either of the two publications.
Im Stand der Technik sind ebenfalls Nachweisverfahren bekannt, in denen Antikörper gegen Cathepsine verwendet werden. So beschreibt z.B. Herszenyi et al., "The role of cysteine and seri- ne proteases in colorectal carcinoma", Cancer 86: 1135-42, 1999, den Nachweis von Cathepsin B und L in humanen colorekta- len Karzinomen mittels enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Foekens et al., "Prognostic significance of cathepsins B and L in primary human breast cancer", J Clin Oncol 16 : 1013- 21, 1998, zeigen Daten über den Nachweis von Cathepsin B und L in humanen Brusttumorzellen mittels ELISA.Detection methods are also known in the prior art in which antibodies against cathepsins are used. For example, Herszenyi et al., "The role of cysteine and serial proteases in colorectal carcinoma", Cancer 86: 1135-42, 1999, the detection of cathepsin B and L in human colorectal cancer by means of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA ). Foekens et al., "Prognostic significance of cathepsins B and L in primary human breast cancer", J Clin Oncol 16: 1013-21, 1998, show data on the detection of cathepsin B and L in human breast tumor cells by means of ELISA.
In der EP 0 582 477 AI wird ein Diagnoseverfahren zum Nachweis von Krebs und eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben. Gegenstand der Anmeldung ist sowohl ein Anti-Cathepsin E-Anti- körper als auch eine Hybridisierungssonde (DNA oder RNA) , die mit der Cathepsin E-mRNA hybridisiert. In dieser Anmeldung ist keine Angabe einer Sequenz enthalten, die als Hybridisierungs- sonde verwendet werden kann.EP 0 582 477 AI describes a diagnostic method for the detection of cancer and a pharmaceutical composition. The application relates to both an anti-Cathepsin E antibody and a hybridization probe (DNA or RNA) that hybridizes with the Cathepsin E mRNA. In this registration is contain no indication of a sequence that can be used as a hybridization probe.
Die insoweit beschriebenen, bekannten Verfahren weisen verschiedene Nachteile auf: Aufgrund ihrer niedrigen Sensitivität werden für die Northern-Blot-Analysen große Mengen an RNA benötigt. Das bedeutet, daß für diese Analysen ein größerer invasi- ver Eingriff in den Patienten erforderlich ist, um genügend Ausgangsmaterial für einen zuverlässigen Nachweis zu erhalten. Die damit verbundenen Belastungen für den erkrankten Patienten sind offensichtlich. iThe known methods described so far have various disadvantages: Because of their low sensitivity, large amounts of RNA are required for the Northern blot analyzes. This means that these analyzes require a larger invasive intervention in the patient in order to obtain enough starting material for reliable detection. The associated burdens for the sick patient are obvious. i
ELISA-Techniken oder Immunfärbungen für den Nachweis von Cathepsinen sind durch ihre niedrige Selektivität gekennzeichnet. Die verwendeten Anti-Cathepsin-Antikörper sind häufig kreuzreaktiv. Beispielsweise haben Cathepsin L und V eine 85%-ige Sequenzhomologie, was zur Folge hat, daß sämtliche vorhandenen Antikörper gegen diese Cathepsine miteinander kreuzreagieren, was z.B. von Santamaria et al., "Cathepsin L2 and novel human cystein proteinase produced by breast and colo- rectal carcinomas", Cancer Res '58 : 1624-30, 1998, beschrieben wurde. Des weiteren ist die Reproduzierbarkeit der so gewonnenen Ergebnisse durch die bisher verwendeten Verfahren stark vom Experimentator abhängig.ELISA techniques or immunostaining for the detection of cathepsins are characterized by their low selectivity. The anti-cathepsin antibodies used are often cross-reactive. For example, cathepsin L and V have an 85% sequence homology, with the result that all existing antibodies against these cathepsins cross-react with one another, as described, for example, by Santamaria et al., "Cathepsin L2 and novel human cysteine proteinase produced by breast and colo- rectal carcinomas ", Cancer Res ' 58: 1624-30, 1998. Furthermore, the reproducibility of the results obtained in this way is heavily dependent on the experimenter using the methods used to date.
Asparaginylendopeptidase (AEP) ist eine erst vor kurzem gefundene und von Chen et al., "Cloning, isolation and characteriza- tion of mammalian legumain, an asparaginyl endopeptidase" , J Biol Chem 272 : 8090-8, 1997, beschriebene Asparagin- spezifische Cystein-Endopeptidase. Sie spielt im Rahmen der Immunantwort eine wichtige Rolle bei der Antigenprozessierung. Außerdem wird angenommen, daß AEP in Tumoren verstärkt expri- miert wird.Asparaginyl endopeptidase (AEP) is a recently found asparagine-specific cysteine described by Chen et al., "Cloning, isolation and characterization of mammalian legumain, an asparaginyl endopeptidase", J Biol Chem 272: 8090-8, 1997 -Endopeptidase. It plays an important role in antigen processing in the context of the immune response. It is also believed that AEP is more strongly expressed in tumors.
Des weiteren konnte unter Verwendung spezifischer Inhibitoren und aufgereinigter Enzyme eine Beteiligung von Cathepsin B, L, S, D und E bei der Antigenprozessierung in verschiedenen Anti- gen-präsentierenden Zellen (APC) nachgewiesen werden. Dies wird z.B. durch Bennett et al., "Antigen processing for presentation by class II major histocompatibility complex requires cleavage by cathepsin E" , Eur J Immunol 22 : 1519-24, 1992, Blum and Cresswell, "Role for intracellular proteases in the processing and the transport of class II HLA antigens", Proσ Natl Acad Sei USA 85 : 3975-9, 1988, und durch Hewitt et al., "Natural processing sides for human cathepsin E and cathepsin D in tetanus- toxin: Implications for T cells epitope generation", J Immunol 195 : 4693-9, 1997 beschrieben. Es wird außerdem vermutet, daß Cathepsin V an der Entstehung bestimmter Selbst-MHC/Selbst- Peptid-Komplexe beteiligt ist, die für die Selektion von Thymo- zyten, einer im Thymus vorkommenden, von pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks abstammenden lymphoiden Zellinie, notwendig sind. Wie von Chen et al., a.a.O. beschrieben, spielt außerdem die Asparaginylendopeptidase in APCs eine wichtige Rolle.Furthermore, the involvement of cathepsin B, L, S, D and E in antigen processing in various antigen-presenting cells (APC) could be demonstrated using specific inhibitors and purified enzymes. This will e.g. by Bennett et al., "Antigen processing for presentation by class II major histocompatibility complex requires cleavage by cathepsin E", Eur J Immunol 22: 1519-24, 1992, Blum and Cresswell, "Role for intracellular proteases in the processing and the transport of class II HLA antigens ", Proσ Natl Acad Sei USA 85: 3975-9, 1988, and by Hewitt et al.," Natural processing sides for human cathepsin E and cathepsin D in tetanus toxin: Implications for T cells epitope generation " , J Immunol 195: 4693-9, 1997. It is also suspected that cathepsin V is involved in the formation of certain self-MHC / self-peptide complexes which are necessary for the selection of thymocytes, a lymphoid cell line which occurs in the thymus and is derived from pluripotent stem cells of the bone marrow. As described by Chen et al., Op. Asparaginyl endopeptidase also plays an important role in APCs.
Trotz dieser Erkenntnisse ist der proteolytische Mechanismus bei der Antigenpräsentation, hauptsächlich der der MHC Klasse II, noch weitgehend ungeklärt. Um das Netzwerk der Antigenprozessierung und die unterschiedliche Präsentationseffizienz in verschiedenen APC besser verstehen zu können, muß die Expression der verschiedenen, daran beteiligten Moleküle durch ein geeignetes und effizientes Nachweisverfahren analysiert werden.Despite these findings, the proteolytic mechanism in antigen presentation, mainly that of MHC class II, is still largely unclear. In order to better understand the network of antigen processing and the different presentation efficiency in different APC, the expression of the different molecules involved must be carried out a suitable and efficient detection method can be analyzed.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, das einen zuverlässigen und einfach, sowie reproduzierbar durchzuführenden Nachweis ermöglicht.Against this background, it is an object of the present invention to provide a method of the type mentioned at the outset which enables reliable, simple and reproducible detection to be carried out.
Bei dem eingangs genannten Verfahren wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Nachweis unter Verwendung von zumindest einer der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder von Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 bindet, erfolgt.In the method mentioned at the outset, this object is achieved according to the invention in that the detection using at least one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to 18 from the enclosed sequence listing or of sequences which bind (hybridize) to sequences to which one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, daß durch den Einsatz der hier erstmals beschriebenen Nukleinsauremoleküle mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aufgrund ihrer sehr hohen Spezi- fität und Sensitivität der Nachweis verschiedener Cathepsine, bzw. Leukocystatin und Asparaginylendopeptidase in biologischem Material gelingt. Sämtliche vorstehenden Nukleinsauremoleküle binden nämlich an hochkonservierte Bereiche der zugrunde liegenden Kodierungssequenzen der jeweiligen Proteine, d.h. beispielsweise an Bereiche der mRNA-Transkripte, die für diese Proteine kodieren. Diese Bereiche werden im Rahmen dieser Anmeldung als für die jeweiligen Proteine spezifischen Nukleinsauremoleküle bezeichnet. Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sich die neuen Nukleinsauremoleküle z.B. besonders als Hybridisierungssonden oder als Primer im Rahmen einer DNA-Amplifizie- rungsmethode zum Nachweis der in Tumorgeweben oder APC verstärkt exprimierten, oben erwähnten, spezifischen Nukleinsauremoleküle. Sie sind damit sowohl zur Diagnostik eines Krankheitsverlaufs bzw. zur Früherkennung einer bestimmten Krankheitsveranlagung als auch zur Bewertung eines Therapieerfolgs einsetzbar.The object underlying the invention is completely achieved in this way. The inventors of the present application have recognized that by using the nucleic acid molecules described here for the first time with the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18, due to their very high specificity and sensitivity, the detection of various cathepsins or leukocystatin and Asparaginylendopeptidase succeeds in biological material. All of the above nucleic acid molecules bind to highly conserved areas of the underlying coding sequences of the respective proteins, ie for example to areas of the mRNA transcripts that code for these proteins. These areas are referred to in the context of this application as nucleic acid molecules specific for the respective proteins. These properties make the new nucleic acid molecules particularly suitable, for example, as hybridization probes or as primers in the context of DNA amplification. Method for the detection of the above-mentioned specific nucleic acid molecules expressed in tumor tissues or APC. They can therefore be used both for the diagnosis of a course of the disease or for the early detection of a certain predisposition to disease as well as for evaluating the success of a therapy.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner ein Nu- kleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die aus einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll besteht bzw. einer Nukleotidsequenz, die an Sequenzen bindet (hybridisiert), an die eine der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 bindet (hybridisiert), sowie die Verwendung der vorstehenden Nukleinsauremoleküle in einem Nachweisverfahren, vorzugsweise einer Polymerase-Ketten- reaktion (PCR), einer Real-Time-PCR oder Northern-Blot-Analyse.Against this background, the invention further relates to a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence which consists of one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 from the enclosed sequence listing or a nucleotide sequence which binds (hybridizes) to sequences which binds (hybridizes) one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18, and the use of the above nucleic acid molecules in a detection method, preferably a polymerase chain reaction (PCR), a real-time PCR or Northern blot analysis.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere solche der vorstehend genannten Nukleinsauremoleküle bzw. deren Verwendung oder Einsatz in einem der angegebenen Verfahren, die hochaffin an ihre Zielmoleküle, d.h. an cathepsin-, aspara- ginyl- bzw. deren isozymspezifischen und leukocystatinspezifi- schen Nukleinsauremoleküle hybridisieren. Sie hybridisieren mit ihren Zielmolekülen selbst unter stringenten Bedingungen, d.h. auch bei hohen Salzkonzentrationen oder hohen Reaktionstemperaturen .The present invention relates in particular to those of the abovementioned nucleic acid molecules or their use or use in one of the stated processes which are highly affinity to their target molecules, i.e. hybridize to cathepsin, asparaginyl or their isozyme-specific and leukocystatin-specific nucleic acid molecules. They hybridize with their target molecules even under stringent conditions, i.e. even at high salt concentrations or high reaction temperatures.
Gegenstand der Erfindung ist nicht nur ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll bzw. dessen Verwendung oder Einsatz in einem der angegebenen Verfahren, sondern auch ein Nukleinsäuremolekül, das an Se- quenzen hybridisiert, an die eine der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 hybridisiert. Solch ein Nukleinsäuremolekül kann sich von einem Nukleinsäuremolekül mit einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 18 in einzelnen Basen bzw. Sequenzabschnitten unterscheiden. Da die Nukleinsauremoleküle mit einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 18 durch Verkürzung, Verlängerung, Substitution, Insertion und/oder Deletion verändert werden können, ohne dabei ihre erfindungsgemäße Funktion zu verlieren bzw. ohne ihre Affinität zu ihrem Zielmolekül zu verlieren, liegen solch modifizierte Nukleinsauremoleküle bzw. deren Verwendung oder Einsatz in einem der angegebenen Verfahren ebenfalls im Rahmen der Erfindung.The invention relates not only to a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from the enclosed sequence listing or its use or application in one of the methods specified, but also to a nucleic acid molecule which sequences hybridized to which one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 hybridizes. Such a nucleic acid molecule can differ from a nucleic acid molecule with one of the sequences SEQ ID No. 1 to 18 in individual bases or sequence sections. Since the nucleic acid molecules with one of the sequences SEQ ID Nos. 1 to 18 can be changed by shortening, lengthening, substitution, insertion and / or deletion without losing their function according to the invention or without losing their affinity for their target molecule, such lies Modified nucleic acid molecules or their use or use in one of the specified methods also within the scope of the invention.
Das beschriebene Verfahren sowie die Verwendung der angegebenen Nukleinsauremoleküle führen zu besonders guten Ergebnissen, wenn die Nukleinsauremoleküle z.B. als Primer in einer Polyme- rase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt werden.The described method and the use of the specified nucleic acid molecules lead to particularly good results if the nucleic acid molecules e.g. can be used as primers in a polymerase chain reaction (PCR).
Insgesamt gelingt mit den Nukleinsäuremolekülen der spezifische Nachweis der nachstehend angegebenen Proteine:Overall, the nucleic acid molecules can be used to specifically detect the proteins listed below:
SEQ ID Nr. 1 und 2: AsparaginylendopeptidaseSEQ ID Nos. 1 and 2: Asparaginylendopeptidase
SEQ ID Nr. 3 und 4 : Cathepsin BSEQ ID Nos. 3 and 4: Cathepsin B
SEQ ID Nr. 5 und 6 : Cathepsin DSEQ ID Nos. 5 and 6: Cathepsin D
SEQ ID Nr. 7 und 8: Cathepsin HSEQ ID Nos. 7 and 8: Cathepsin H
SEQ ID Nr. 9 und 10: Cathepsin LSEQ ID Nos. 9 and 10: Cathepsin L
SEQ ID Nr. 11 und 12 Cathepsin SSEQ ID Nos. 11 and 12 Cathepsin S
SEQ ID Nr. 13 und 14 Cathepsin VSEQ ID Nos. 13 and 14 Cathepsin V
SEQ ID Nr. 15 und 16 Cathepsin WSEQ ID No. 15 and 16 Cathepsin W
SEQ ID Nr. 17 und 18 Leukocystatin Werden diese Nukleinsauremoleküle im Rahmen einer PCR eingesetzt, so entsteht ein Amplifikationsprodukt von ca. 100 bis 150 Basenpaaren (bp). Damit wird gewährleistet, daß die A pli- fizierungseffizienz nahezu 100% beträgt. Das Amplifikationsprodukt kann dann mittels einfacher Standardmethoden, z.B. durch Ethidiumbromidanfärbung nach gelelektrophoretischer Auftrennung, nachgewiesen werden.SEQ ID Nos. 17 and 18 leukocystatin If these nucleic acid molecules are used in a PCR, an amplification product of approx. 100 to 150 base pairs (bp) is produced. This ensures that the authorization efficiency is almost 100%. The amplification product can then be detected using simple standard methods, for example by ethidium bromide staining after gel electrophoretic separation.
Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Verfahren bzw. der Verwendung der beanspruchten Nukleinsauremoleküle besteht darin, daß der Nachweis bzw. die Amplifikation der spezifischen Nukleinsauremoleküle mittels Real-Time-PCR (RT-PCR) erfolgt. Dabei handelt es sich um ein besonders sensitives Verfahren, bei dem die Zunahme an Amplifikat während des Verfahrens dadurch beobachtet werden kann, daß in den Ansatz ein unspezifisch an doppelsträngige DNA bindendes Fluorochrom, z.B. SYBR® Green, zugegeben wird. Ausgehend von ausschließlich einzelsträngiger cDNA als Template, die durch Umschreibung von mRNA hergestellt wird, steigt die Fluoreszenz mit zunehmender Zyklenzahl aufgrund der sich aus dem Amplifikat gebildeten Menge an doppel- strängiger DNA an. Typischerweise steigt die Fluoreszenz in einer RT-PCR nach einer gewissen Verzögerung nach ca. 20-25 Zyklen proportional zur Amplifikatmenge an und verläuft dann wiederum nach ca. 20-25 weiteren Zyklen in ein Plateau. Die Sensitivität dieses Verfahrens beruht im Vergleich zur traditionellen End-Punkt-PCR auf der Vielzahl der erhaltenen Meßpunkte. Dies ermöglicht z.B. eine lineare Quantifizierung der nachzuweisenden spezifischen Nukleinsauremoleküle über einen 3- 5 mal so großen Bereich im Vergleich zu einer End-Punkt-PCR. Die Voraussetzung für den zuverlässigen Nachweis der genannten Nukleinsauremoleküle durch die Real-Time-PCR ist eine extrem hohe Spezifität der verwendeten Primer-Sequenzen. Diese Anforderung erfüllen die beanspruchten Nukleinsauremoleküle nach Erkenntnis des Erfinders in hervorragender Weise. Durch die Verwendung wird eine Amplifikation von unspezifischen Abschnitten und damit verbunden der Anstieg "falsch-positiver" Fluoreszenz vermieden .A preferred embodiment of the methods or the use of the claimed nucleic acid molecules consists in the detection or amplification of the specific nucleic acid molecules using real-time PCR (RT-PCR). This is a particularly sensitive process in which the increase in amplificate during the process can be observed by adding a fluorochrome which binds non-specifically to double-stranded DNA, for example SYBR® Green, to the batch. Starting from only single-stranded cDNA as a template, which is produced by circumscribing mRNA, the fluorescence increases with increasing number of cycles due to the amount of double-stranded DNA formed from the amplificate. Typically, the fluorescence in an RT-PCR increases after a certain delay after approx. 20-25 cycles in proportion to the amount of amplified product and then again plateaus after approx. 20-25 further cycles. The sensitivity of this method compared to traditional end-point PCR is based on the large number of measurement points obtained. This enables, for example, a linear quantification of the specific nucleic acid molecules to be detected over a range 3-5 times as large as compared to an end-point PCR. The prerequisite for the reliable detection of the nucleic acid molecules mentioned by the real-time PCR is an extremely high specificity of the primer sequences used. According to the inventor's knowledge, the claimed nucleic acid molecules fulfill this requirement in an outstanding manner. The use prevents amplification of non-specific sections and the associated increase in "false positive" fluorescence.
Die Erfinder haben nämlich erkannt, daß mit den entworfenen Primer-Paaren auch sehr homologe Sequenzen, wie z.B. von Cathepsin V und L, differenziert erfaßt werden können. Mit den bisherigen Verfahren ist dies nicht möglich. Aufgrund dieser überraschenden Selektivität des Verfahrens bzw. der beanspruchten Nukleinsauremoleküle lassen sich wichtige neue Erkenntnisse gewinnen. Es kann jetzt z.B. untersucht werden, ob der in der Literatur von Herszenyi et al., 1999; Duffy et al., 1998; Lah et al., 1998, a.a.O., beschriebene Expressionsanstieg von Cathepsin L in humanen Tumoren nicht der verstärkten Expression von Cathepsin V zugeordnet werden muß.The inventors have recognized that with the designed primer pairs also very homologous sequences, e.g. of Cathepsin V and L, can be differentiated. This is not possible with the previous methods. Because of this surprising selectivity of the method and the claimed nucleic acid molecules, important new knowledge can be gained. It can now e.g. investigated whether the in the literature by Herszenyi et al., 1999; Duffy et al., 1998; Lah et al., 1998, op. Cit., Described increase in expression of cathepsin L in human tumors need not be attributed to the increased expression of cathepsin V.
Die beschriebenen Verfahren werden bevorzugt im Rahmen von Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung eingesetzt.The methods described are preferably used in the context of methods for diagnosis and / or early detection.
Da die vorliegenden Nachweisverfahren sehr sensitiv sind, eignen sie sich sowohl zur Diagnostik eines Krankheitsverlaufs bzw. zur Früherkennung einer bestimmten Krankheitsveranlagung als auch zur Bewertung eines Therapieerfolgs. Die Menge des zu überprüfenden Probenmaterials, wie z.B. Blut, Biopsieproben, Abstriche, kann dabei stark reduziert werden. D.h., es sind lediglich minimale invasive Eingriffe in den Patienten notwendig. Das neue Verfahren ist ebenfalls dazu geeignet, im Rahmen einer Früherkennungsuntersuchung und/oder eines Diagnoseverfahrens zum Nachweis von Tumoren und/oder Metastasen eingesetzt zu werden.Since the existing detection methods are very sensitive, they are suitable both for the diagnosis of a disease course or for the early detection of a certain predisposition to disease as well as for the evaluation of a therapy success. The amount of sample material to be checked, such as blood, biopsy samples, smears, can be greatly reduced. This means that only minimally invasive interventions in the patient are necessary. The new method is also suitable for use in the context of an early diagnosis examination and / or a diagnostic method for the detection of tumors and / or metastases.
Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt es, Tumorzellen auch mit minimal-invasiven Methoden zu identifizieren und schon während einer Therapie den Erfolg der Behandlung, z.B. durch Blutanalyse während einer Leukämiebehandlung, zu überprüfen. Durch die extrem hohe Sensitivität der beanspruchten Sequenzen als PCR-Primer in Verbindung mit der Real-Time-PCR lassen sich schon wenige metastatisierende Zellen nachweisen. Des weiteren kann der Behandlungserfolg von Patienten nach einer Krebs-Therapie überwacht werden.The sensitivity of the method according to the invention allows tumor cells to be identified even with minimally invasive methods and the success of the treatment, e.g. by blood analysis during leukemia treatment. Due to the extremely high sensitivity of the claimed sequences as PCR primers in conjunction with real-time PCR, only a few metastatic cells can be detected. Furthermore, the treatment success of patients after cancer therapy can be monitored.
Durch die Auswahl der Zielmoleküle, d.h. der Cathepsin-, Aspa- raginylendopeptidase- und Leukocystatin-spezifischen Nukleinsauremoleküle als nachzuweisende Moleküle, und durch das Design der Primer wird der zuverlässige, schnelle und kostengünstige Nachweis der häufigsten Tumorarten gewährleistet. Mit der Bereitstellung eines Kits, das die beanspruchten Nukleotidsequenzen beinhaltet, kann auch in der Klinik durch angelerntes Personal routinemäßig ein eingangs beschriebenes Verfahren durchgeführt werden. Deshalb ist auch ein Kit, der die beanspruchten Nukleotidsequenzen enthält, von der Erfindung umfaßt.By selecting the target molecules, i.e. the cathepsin, asparaginyl endopeptidase and leukocystatin-specific nucleic acid molecules as the molecules to be detected, and the design of the primers ensures reliable, fast and inexpensive detection of the most common types of tumor. With the provision of a kit that contains the claimed nucleotide sequences, a procedure described at the outset can also be routinely carried out in the clinic by trained personnel. A kit which contains the claimed nucleotide sequences is therefore also included in the invention.
Es versteht sich, daß die vorstehend erwähnten Merkmale nicht nur in der angegebenen Kombination, sondern auch einzeln oder auch in anderer Kombination verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben.It is understood that the features mentioned above can be used not only in the specified combination, but also individually or in any other combination, without leaving the scope of the present invention. The invention is explained below on the basis of examples, from which further features and advantages result.
Drei beigefügte Abbildungen sollen der Beschreibung der Erfindung dienen. Es zeigen:Three attached figures are intended to describe the invention. Show it:
Fig. 1 Agarosegel-Analyse der PCR-Amplifikate; beispielhaft für Cathepsin D-, Cathepsin L- und Cathepsin W-spe- zifische Amplifikate dargestellt;Fig. 1 agarose gel analysis of the PCR amplificates; exemplified for Cathepsin D-, Cathepsin L- and Cathepsin W-specific amplificates;
Fig. 2 Schematische Darstellung einer Schmelzkurvenanalyse eines spezifischen PCR-Amplifikats ;2 shows a schematic representation of a melting curve analysis of a specific PCR amplificate;
Fig. 3 Standardkurven, beispielhaft für Cathepsin D- (a), Cathepsin V- (b) und Leukocystatin-spezifische Amplifikate (c) dargestellt.Fig. 3 standard curves, exemplified for cathepsin D- (a), cathepsin V- (b) and leukocystatin-specific amplificates (c).
Beispiel 1: Umschreibung der mRNA in cDNAExample 1: Description of the mRNA in cDNA
Die zu untersuchende biologische Probe wird in Form von Patientenblut, Gewebe oder Abstrichmaterial zur Verfügung gestellt. Ausgangspunkt des Nachweisverfahrens ist die gesamte mRNA der biologischen Probe. Für die Anwendung des Verfahrens muß diese zuerst in eine entsprechende cDNA umgeschrieben werden. Dies erfolgt nach den Angaben des Herstellers. Mit Trizol® (GibcoBRL) oder StrataPrep Total RNA Miniprep Kit (Stratagene) wird die Total-RNA nach DNase-Behandlung der Probe isoliert und mit random Hexamers und M-MLV-Reverse Transkriptase (Promega) in cDNA umgeschrieben. Die resultierende cDNA wird mit Wasser 1:10 verdünnt und entsprechend den Angaben des Herstellers (Perkin Eimer) als Template zusammen mit den Primern und dem SYBR® Green PCR Core Reagent in eine Real-Time-PCR eingesetzt.The biological sample to be examined is made available in the form of patient blood, tissue or swab material. The starting point of the detection method is the entire mRNA of the biological sample. To use the method, it must first be rewritten into a corresponding cDNA. This is done according to the manufacturer's instructions. With Trizol® (GibcoBRL) or StrataPrep Total RNA Miniprep Kit (Stratagene), the total RNA is isolated after DNase treatment of the sample and transcribed into cDNA with random hexamers and M-MLV reverse transcriptase (Promega). The resulting cDNA is diluted 1:10 with water and according to the manufacturer's instructions (Perkin Elmer) used as a template together with the primers and the SYBR® Green PCR Core Reagent in a real-time PCR.
Beispiel 2: Primer-Design und Optimierung der Real-Time-PCRExample 2: Primer design and optimization of real-time PCR
Das Design der Primer für die PCR bestimmt die Selektivität und Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens. Da sich bei der RT-PCR der zugegebene Farbstoff unspezifisch in doppelsträngige DNA einlagert, darf durch die PCR-Primer genomische DNA höchstens minimal amplifiziert werden.The design of the primers for the PCR determines the selectivity and sensitivity of the detection method. Since the added dye is nonspecifically embedded in double-stranded DNA during RT-PCR, genomic DNA may be amplified minimally by the PCR primer.
Damit die PCR mit einer annähernd 100%-igen Effizienz verläuft, d.h. daß sich nach jedem Zyklus die Menge der Ziel-DNA verdoppelt, müssen die Primer erfahrungsgemäß so beschaffen sein, daß die Amplifikate eine Größe von 100-150 bp aufweisen.So that the PCR proceeds with approximately 100% efficiency, i.e. experience has shown that the amount of target DNA doubles after each cycle, the primers must be such that the amplificates have a size of 100-150 bp.
Es ist notwendig, für jedes Primer-Paar die Spezifität der Produktbildung zu überprüfen und gegebenenfalls die Reaktionsbedingungen der PCR zu optimieren. Eventuell stattfindende unspezifische Amplifikationen, unspezifische Bildungen von Pri- mer-Dimeren bzw. Kontaminationen der Amplifikationsprodukte wurden durch Produktanalysen von NTC-(engl.: no template con- trol) Proben, d.h. Proben ohne Template, mit Hilfe der Agarose- Gelelektrophorese (Fig. 1, Beispiel 3) oder durch Schmelzkurvenanalyse der Amplikate (Fig. 2, Beispiel 4) ausgeschlossen. Die RT-PCR führt zu besonders guten Ergebnissen bei folgenden Reaktionsbedingungen :It is necessary to check the specificity of the product formation for each primer pair and, if necessary, to optimize the reaction conditions of the PCR. Any unspecific amplifications, unspecific formation of primer dimers or contamination of the amplification products were carried out by product analysis of NTC (no template control) samples, ie samples without template, using agarose gel electrophoresis (Fig. 1, example 3) or by melting curve analysis of the amplicons (FIG. 2, example 4). The RT-PCR leads to particularly good results under the following reaction conditions:
Pro Reaktionsansatz wird ein Gesamtvolumen von 25 μl gewählt. Dieses enthält (Endkonzentration) 1 x SYBR® PCR-Puffer (zu beziehen über Perkin-Elmer) , 3 mM MgCl2, jeweils 0,05 M dATP, dCTP, dGTP und 0,1 mM dUTP, 0,025 u/25 μl AmpliTaq Gold, 0,01 u/25 μl AmpErase UNG und jeweils 300 nM des Vorwärts- und Rückwärtsprimers . Die Menge des pro 25 μl-Ansatz eingesetzten (cDNA-) Templates entspricht einem Total-RNA-Äquivalent von ca. 5 ng.A total volume of 25 μl is selected for each reaction batch. This contains (final concentration) 1 x SYBR® PCR buffer (to be obtained from Perkin-Elmer), 3 mM MgCl 2 , each 0.05 M dATP, dCTP, dGTP and 0.1 mM dUTP, 0.025 u / 25 μl AmpliTaq Gold , 0.01 u / 25 μl AmpErase UNG and 300 nM each of the forward and reverse primers. The amount of the (cDNA) template used per 25 μl mixture corresponds to a total RNA equivalent of approx. 5 ng.
Die PCR-Reaktion wird vorzugsweise mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: AmpErase UNG-Inkubation für 2 Minuten bei 50°C, AmpliTaq Gold Aktivierung für 10 Minuten bei 95°C; anschließend folgen 40 Zyklen von jeweils 15 Sekunden Hitzedena- turierung bei 95°C und Primerhybridisierung/Polymerisierung für 1 Minute bei 60°C.The PCR reaction is preferably carried out with the following temperature profile: AmpErase UNG incubation for 2 minutes at 50 ° C, AmpliTaq Gold activation for 10 minutes at 95 ° C; this is followed by 40 cycles of 15 seconds heat denaturation at 95 ° C and primer hybridization / polymerization for 1 minute at 60 ° C.
Um die Spezifität des Verfahrens zu charakterisieren, wurden sämtliche Amplifikate sequenziert. In allen Fällen wurde nur das gewünschte Produkt amplifiziert.To characterize the specificity of the method, all amplificates were sequenced. In all cases, only the desired product was amplified.
Die Ergebnisse verschiedener PCR-Ansätze, bei denen als Template eine cDNA-Bibliothek aus Mononuklearen Zellen peripheren Blutes (PBMC) gesunder Patienten eingesetzt wurde, sind in Tabelle 1 dargestellt.The results of various PCR approaches, in which a cDNA library from mononuclear cells of peripheral blood (PBMC) of healthy patients was used as a template, are shown in Table 1.
Um den Einfluß von Kontaminationen durch genomische DNA auf die spezifische Amplifikation zu überprüfen, wurden zusätzlich die der Bibliothek zugrunde liegenden mRNA-Präparationen ohne vor- herige DNase-Behandlung einer Erst-Strang-cDNA-Synthesereaktion einmal mit und einmal ohne Reverse Transkriptase unterzogen und anschließend in die PCR eingesetzt. In dem Ansatz ohne Reverse Transkriptase sollte nur dann ein PCR-Produkt entstehen, wenn die entsprechende Zielsequenz innerhalb von DNA-Kontaminationen mit den Primern amplifiziert werden kann. In der Tabelle 1 ist für jedes Primer-Paar der prozentuale Anteil der Amplifikation von genomischer DNA angegeben.In order to check the influence of contamination by genomic DNA on the specific amplification, the mRNA preparations on which the library is based were additionally Previous DNase treatment subjected to a first-strand cDNA synthesis reaction once with and once without reverse transcriptase and then used in the PCR. In the approach without reverse transcriptase, a PCR product should only arise if the corresponding target sequence can be amplified within DNA contaminations with the primers. Table 1 shows the percentage of amplification of genomic DNA for each pair of primers.
TABELLE 1TABLE 1
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Diese Primersequenzen wurden von Perkin-Elmer für das TaqMan® ribosomal RNA control reagents-Kit entworfen und wurden als endogene Kontrolle in der quantitativen RT-PCT verwendet.These primer sequences were designed by Perkin-Elmer for the TaqMan® ribosomal RNA control reagents kit and were used as an endogenous control in quantitative RT-PCT.
n = nicht beobachtet; - = nicht durchgeführt; AEP = Asparaginylendo- peptidase; ct = Schwellenwertzyklus In allen Fällen wird die gewünschte Größenlimitierung für das Amplifikat von 150 bp erreicht. Wie der Tabelle zu entnehmen ist, kommt es nur in den Fällen von Cathepsin B, L und V und bei der Kontrolle zu einer wenn auch schwachen Amplifikation genomischer DNA. Da jedoch bei der RNA-Isolierung (siehe Bsp. 1) die genomische DNA vor der Reversen Transkription durch DNase-Abbau nahezu vollständig zerstört wird, spielt die hier beobachtete Amplifikation von genomischer DNA bei der eigentlichen Analyse keine Rolle mehr. Bei den übrigen Primerpaaren kommt es zu keinerlei Amplifikation genomischer DNA.n = not observed; - = not carried out; AEP = asparaginyl endopeptidase; c t = threshold cycle In all cases, the desired size limit for the amplicon of 150 bp is reached. As can be seen in the table, only in the cases of cathepsin B, L and V and in the control does an albeit weak amplification of genomic DNA occur. However, since in RNA isolation (see Example 1) the genomic DNA is almost completely destroyed by DNase degradation before reverse transcription, the amplification of genomic DNA observed here no longer plays a role in the actual analysis. There is no amplification of genomic DNA in the other primer pairs.
Die Effizienz der einzelnen Ampli ikationsansätze läßt sich über den sogenannten Schwellenwertzyklus (ct, englisch: thres- hold cycle) bestimmen. Ein ct-Wert repräsentiert jene Zyklenzahl, bei der in der RT-PCR zum ersten Mal ein Anstieg der Reporter-Fluoreszenz signifikant über dem Hintergrundsignal de- tektiert wird. Demnach ist eine effiziente PCR-Reaktion durch einen möglichst niedrigen ct-Wert charakterisiert. Bei spezifischen ct-Werten < 35 kann von hocheffizienter Amplifikation gesprochen werden. In sämtlichen Ansätzen gelingt folglich eine hocheffiziente Amplifizierung des Zielmoleküls.The efficiency of the individual amplification approaches can be determined via the so-called threshold cycle (c t , English: stress cycle). A c t value represents the number of cycles at which an increase in reporter fluorescence is detected significantly above the background signal for the first time in RT-PCR. Accordingly, an efficient PCR reaction is characterized by the lowest possible c t value. With specific c t values <35 one can speak of highly efficient amplification. In all approaches, the target molecule is therefore highly efficiently amplified.
Primer-Dimerbildungen, die zur Akkumulierung unspezifischer Amplifikate führen können, spielten in keinem der überprüften Ansätze eine Rolle.Primer dimer formations, which can lead to the accumulation of non-specific amplificates, did not play a role in any of the approaches examined.
Beispiel 3: Agarose-Gelanalyse der PCR-ProdukteExample 3: Agarose gel analysis of the PCR products
Nach der RT-PCR-Reaktion wurden die Amplifikate mittels Agaro- se-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Ethidiumbromid angefärbt. Unter UV-Anregung wurden die aufgetrennten Produkte sichtbar gemacht, und die Größen der Amplifikate konnten über den Vergleich mit einer 100-bp-Leiter bestimmt werden. Dabei konnten auch eventuelle Kontaminationen durch unspezifische Produkte beurteilt werden. Dies ist in Fig. 1 beispielhaft für Cathepsin D, L und W dargestellt. In den Spuren 1 und 12 wurde als Referenz die 100-bp-Leiter aufgetrennt. Die Spuren 2 und 3 zeigen den Cathepsin D-PCR-Ansatz ohne Template (NTC); die Spuren 7 und 8 den Cathepsin L-PCR-Ansatz ohne Template (NTC); die Spuren 13 und 14 den Cathepsin W-PCR-Ansatz ohne Template (NTC) . Die Spuren 4 bis 6 zeigen das aufgetrennte Amplifikat des Cathepsin D-PCR-Ansatzes (mit cDNA als Template); in den Spuren 9 bis 11 den Cathepsin L-PCR-Ansatz (mit cDNA) und in den Spuren 15 bis 17 den Cathepsin W-PCR-Ansatz (mit cDNA) . Die Markergrößen sind im relevanten Bereich angegeben.After the RT-PCR reaction, the amplificates were separated by means of agarose gel electrophoresis and stained by ethidium bromide. The separated products were under UV excitation visualized, and the sizes of the amplificates could be determined by comparison with a 100 bp ladder. Any contamination from unspecific products could also be assessed. This is shown in Fig. 1 as an example for Cathepsin D, L and W. In tracks 1 and 12, the 100 bp ladder was cut for reference. Lanes 2 and 3 show the cathepsin D-PCR approach without template (NTC); lanes 7 and 8 the cathepsin L-PCR approach without template (NTC); lanes 13 and 14 the Cathepsin W-PCR approach without template (NTC). Lanes 4 to 6 show the separated amplificate of the Cathepsin D-PCR approach (with cDNA as template); in tracks 9 to 11 the cathepsin L-PCR approach (with cDNA) and in tracks 15 to 17 the cathepsin W-PCR approach (with cDNA). The marker sizes are given in the relevant area.
Die Amplifikate haben die erwartete Größe (- 100-125 bp) und weisen keine Kontaminationen mit unspezifischer DNA auf. Die NTC-Ansätze zeigen keine Amplifikate. D.h. es kommt zu keiner unspezifischen Bildung von Primer-Dimeren. Diese Ergebnisse belegen die hohe Spezifität der Primer in Verbindung mit einer optimierten RT-PCR.The amplificates have the expected size (- 100-125 bp) and show no contamination with unspecific DNA. The NTC approaches show no amplicons. That there is no unspecific formation of primer dimers. These results demonstrate the high specificity of the primers in connection with an optimized RT-PCR.
Beispiel 4: Schmelzkurven der spezifischen AmplifikateExample 4: Melting curves of the specific amplificates
Um zusätzlich die Spezifität der beschriebenen Nukleinsauremoleküle als PCR-Primer zu charakterisieren, wurden einige der spezifischen Amplifikate einer Schmelzkurven- bzw. Dissoziationskurvenanalyse unterzogen. Dazu wurden diese Amplifikate mit <SYBR® Green versetzt, der sich, wie oben erwähnt, unspezifisch in doppelsträngige DNA einlagert. Eine graduelle Temperaturerhöhung führt zu einer zunehmenden Denaturierung bzw. Auf- Schmelzung der doppelsträngigen Bereiche. Bei einer bestimmten kritischen Temperatur kommt es dann zum Freisetzen der eingelagerten Fluoreszenz. Spezifische Amplifikate sind durch eine relativ hohe Schmelztemperatur von ca. 80 °C gekennzeichnet, wohingegen nicht-spezifisch amplifizierte Abschnitte bei niedrigeren Temperaturen von ca. 75°C aufschmelzen. In Fig. 2 ist ein derartiges Analysenergebnis schematisch dargestellt. Dabei ist auf der x-Achse die Temperatur in °C aufgetragen, auf der y- Achse die erste Ableitung der Fluoreszenz. Dem Schmelzprofil läßt sich demnach entnehmen, daß in dem Ansatz eine spezifische Amplifikation stattgefunden hat. Sämtliche Amplifikate geben, wie hier exemplarisch dargestellt, bei ~ 80 °C den eingelagerten Fluoreszenzfarbstoff frei, einen Nebenpeak bei niedrigeren Temperaturen findet man nicht.In order to additionally characterize the specificity of the nucleic acid molecules described as PCR primers, some of the specific amplificates were subjected to a melting curve or dissociation curve analysis. For this purpose, these amplificates were mixed with <SYBR® Green, which, as mentioned above, is nonspecifically embedded in double-stranded DNA. A gradual increase in temperature leads to increasing denaturation or Melting of the double-stranded areas. The embedded fluorescence is then released at a certain critical temperature. Specific amplificates are characterized by a relatively high melting temperature of approx. 80 ° C, whereas non-specifically amplified sections melt at lower temperatures of approx. 75 ° C. Such an analysis result is shown schematically in FIG. The temperature in ° C is plotted on the x-axis, and the first derivative of the fluorescence is plotted on the y-axis. It can be seen from the melting profile that a specific amplification has taken place in the batch. As shown here by way of example, all amplificates release the embedded fluorescent dye at ~ 80 ° C, a secondary peak at lower temperatures is not found.
Beide Analyseverfahren, sowohl die Agarose-Gelelektrophorese als auch die Schmelzkurvenanalyse belegen eindeutig die Spezifität des beschriebenen Nachweisverfahrens bzw. der Nukleinsauremoleküle .Both analysis methods, both the agarose gel electrophoresis and the melting curve analysis clearly demonstrate the specificity of the detection method described and the nucleic acid molecules.
Beispiel 5: Sensitivität des NachweisverfahrensExample 5: Sensitivity of the detection method
Um die Sensitivität des beanspruchten Verfahrens zu testen, wurden die spezifischen Amplikons isoliert, z.T. in Plasmide (pTNOT, pKS+) kloniert, sequenziert und als Template in verschiedenen Verdünnungen eingesetzt. Die Menge der Template-DNA wurde durch eine Absorptionsmessung bei 260 n Wellenlänge bestimmt. Die Sensitivität läßt sich nun testen, indem die ct- Werte der einzelnen Amplifikations-Ansätze bei jeweils vorgegebener Menge an Template bestimmt werden und gegenüber dem Logarithmus der vorgegebenen cDNA-Moleküle/Ansatz aufgetragen werden (Standardkurve). Durch die so erhaltenen Punkte wird eine Gerade gelegt. Eine akkurate Quantifizierung ist bis zu der Konzentration möglich, bei der die entsprechenden ct-Werte noch auf der ermittelten Geraden liegen.In order to test the sensitivity of the claimed method, the specific amplicons were isolated, partly cloned into plasmids (pTNOT, pKS +), sequenced and used as templates in various dilutions. The amount of template DNA was determined by an absorption measurement at 260 n wavelength. The sensitivity can now be tested by determining the c t values of the individual amplification batches for a predetermined amount of template and plotting them against the logarithm of the predetermined cDNA molecules / batch become (standard curve). A straight line is drawn through the points thus obtained. Accurate quantification is possible up to the concentration at which the corresponding c t values are still on the determined straight line.
In Fig. 3 sind beispielhaft die Standardkurven für Cathepsin D (a) Cathepsin V (b) und Leukocystatin (c) gezeigt. Hier wurde eine Verdünnungsreihe von Cathepsin D-cDNA und eines Cathepsin V- bzw. Leukocystatin-Plasmids angelegt und in die quantitative RT-PCR eingesetzt. Im Falle von Cathepsin D gelingt demnach noch der Nachweis von 10 spezifischen cDNA Molekülen pro μl Ansatzvolumen. Für Cathepsin V und Leukocystatin ist noch der Nachweis von 100 spezifischen Plasmidmolekülen pro μl Ansatzvolumen möglich.The standard curves for cathepsin D (a), cathepsin V (b) and leukocystatin (c) are shown by way of example in FIG. 3. A dilution series of cathepsin D cDNA and a cathepsin V or leukocystatin plasmid was set up and used in the quantitative RT-PCR. In the case of cathepsin D, 10 specific cDNA molecules per μl batch volume can still be detected. For cathepsin V and leukocystatin it is still possible to detect 100 specific plasmid molecules per μl batch volume.
Die beiden dargestellten Beispiele belegen die extrem hohe Sensitivität des beschriebenen Verfahrens bzw. der erstmals offenbarten Nukleinsauremoleküle.The two examples shown demonstrate the extremely high sensitivity of the method described and the nucleic acid molecules disclosed for the first time.
Beispiel 6: Verwendete NukleinsauremoleküleExample 6: Nucleic acid molecules used
Die folgenden Nukleinsauremoleküle sind Bestandteil der beschriebenen Verfahren, z.B. als PCR-Primer.The following nucleic acid molecules are part of the methods described, e.g. as a PCR primer.
PCR-Primer-Paar 1 (spezifisch für: Asparaginylendopeptidase)PCR primer pair 1 (specific for: asparaginyl endopeptidase)
SEQ ID Nr. 1 5 ' -GAAGCCTGTGAGTCTGGGTC-3 • SEQ ID Nr. 2 5 ' -CAGTCCCCCAGGTACGTG-3 ' PCR-Primer-Paar 2 (spezifisch für: Cathepsin B)SEQ ID No. 1 5 '-GAAGCCTGTGAGTCTGGGTC-3 • SEQ ID No. 2 5' -CAGTCCCCCAGGTACGTG-3 ' PCR primer pair 2 (specific for: cathepsin B)
SEQ ID Nr. 3 5 ' -CTGTGTATTCGGACTTCCTGC-3 ' SEQ ID Nr. 4 5 ' -CCAGGAGTTGGCAACCAG-3 'SEQ ID No. 3 5 '-CTGTGTATTCGGACTTCCTGC-3' SEQ ID No. 4 5 '-CCAGGAGTTGGCAACCAG-3'
PCR-Primer-Paar 3 (spezifisch für: Cathepsin D)PCR primer pair 3 (specific for: cathepsin D)
SEQ ID Nr. 5 5 ' -AACTGCTGGACATCGCTTG-3 ' SEQ ID Nr. 6 5 ' -AGGTACCCGGAGAGGCTG-3 'SEQ ID No. 5 5 '-AACTGCTGGACATCGCTTG-3' SEQ ID No. 6 5 '-AGGTACCCGGAGAGGCTG-3'
PCR-Primer-Paar 4 (spezifisch für: Cathepsin H)PCR primer pair 4 (specific for: Cathepsin H)
SEQ ID Nr. 7 5 ' -ACTGGCTGTTGGGTATGGAG-3 ' SEQ ID Nr. 8 5 ' -AGGCCACACATGTTCTTTCC-3 'SEQ ID No. 7 5 '-ACTGGCTGTTGGGTATGGAG-3' SEQ ID No. 8 5 '-AGGCCACACATGTTCTTTCC-3'
PCR-Primer-Paar 5 (spezifisch für: Cathepsin L)PCR primer pair 5 (specific for: cathepsin L)
SEQ ID Nr. 9 5 ' -ACCAAGTGGAAGGCGATG-3 ' SEQ ID Nr. 10 5 ' -TTCCCTTCCCTGTATTCCTG-3 'SEQ ID No. 9 5 '-ACCAAGTGGAAGGCGATG-3' SEQ ID No. 10 5 '-TTCCCTTCCCTGTATTCCTG-3'
PCR-Primer-Paar 6 (spezifisch für: Cathepsin S)PCR primer pair 6 (specific for: Cathepsin S)
SEQ ID Nr. 11 5 ' -ACTCAGAATGTGAATCATGGTG-3 ' SEQ ID Nr. 12 5 * -TTCTTGCCATCCGAATATATCC-3 'SEQ ID No. 11 5 '-ACTCAGAATGTGAATCATGGTG-3' SEQ ID No. 12 5 * -TTCTTGCCATCCGAATATATCC-3 '
PCR-Primer-Paar 7 (spezifisch für: Cathepsin V)PCR primer pair 7 (specific for: Cathepsin V)
SEQ ID Nr. 13 5 ' -TGGAAGGCAACACACAGAAG-3 SEQ ID Nr. 14 5 * -GAAGCCATGTTTCCCTTGG-3 ' PCR-Primer-Paar 8 (spezifisch für: Cathepsin W)SEQ ID No. 13 5 '-TGGAAGGCAACACACAGAAG-3 SEQ ID No. 14 5 * -GAAGCCATGTTTCCCTTGG-3' PCR primer pair 8 (specific for: Cathepsin W)
SEQ ID Nr. 15 5 ' -GACCAGAAAAACTGCAACTGC-3 ' SEQ ID Nr. 16 5 ' -CCACAGTCCAGCAGTTCATG-3 'SEQ ID No. 15 5 '-GACCAGAAAAACTGCAACTGC-3' SEQ ID No. 16 5 '-CCACAGTCCAGCAGTTCATG-3'
PCR-Primer-Paar 9 (spezifisch für: Leukocystatin)PCR primer pair 9 (specific for: leukocystatin)
SEQ ID Nr. 17 5 ' -ACTGCACGAACGACATGTTC-3 SEQ ID Nr. 18 5 ' -AGTCATCCAGACGCAGGTG-3 ' SEQ ID No. 17 5 '-ACTGCACGAACGACATGTTC-3 SEQ ID No. 18 5' -AGTCATCCAGACGCAGGTG-3 '

Claims

Patentansprüche Patent claims
Verfahren zum selektiven Nachweis von Nukleinsäuremolekü- len in biologischem Material, die spezifisch für Cathepsine, Asparaginylendopeptidase und deren Isozyme, sowie für Leukocystatin sind, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis unter Verwendung von zumindest einem Nukleinsäuremolekül erfolgt, das eine der folgenden Nukleotidsequenzen aufweist:Method for the selective detection of nucleic acid molecules in biological material which are specific for cathepsins, asparaginyl endopeptidase and their isozymes, as well as for leukocystatin, characterized in that the detection is carried out using at least one nucleic acid molecule which has one of the following nucleotide sequences:
SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 bindet.SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 from the enclosed sequence listing or sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 binds.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis über Amplifikation mittels Polymerase-Ketten- reaktion (PCR), vorzugsweise einer Real-Time-PCR, erfolgt.Method according to claim 2, characterized in that the detection is carried out via amplification using a polymerase chain reaction (PCR), preferably a real-time PCR.
Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Asparaginylendopeptidase, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. Method according to claim 2 for the detection of aspartic endopeptidase, characterized in that the primer pair for the PCR is nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No.
2 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin B, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 2 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds can be used. Method according to claim 2 for the detection of cathepsin B, characterized in that the primer pair for the PCR is nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No.
3 und SEQ ID Nr. 3 and SEQ ID No.
4 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden .4 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds can be used.
Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin D, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. Method according to claim 2 for the detection of cathepsin D, characterized in that the primer pair for the PCR is nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No.
5 und SEQ ID Nr. 5 and SEQ ID No.
6 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden.6 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds can be used.
Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin H, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr . Method according to claim 2 for the detection of cathepsin H, characterized in that the primer pair for the PCR is nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No.
7 und SEQ ID Nr. 7 and SEQ ID No.
8 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden.8 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds can be used.
Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin L, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 10 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden. Method according to claim 2 for the detection of cathepsin L, characterized in that the primer pair for the PCR is nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 9 and SEQ ID No. 10 from the enclosed sequence protocol or with sequences that bind (hybridize) to sequences. to which one of the above sequences binds can be used.
. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin S, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden.. Method according to claim 2 for the detection of cathepsin S, characterized in that as a primer pair for the PCR, nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 11 and SEQ ID No. 12 from the enclosed sequence protocol or with sequences that bind (hybridize) to sequences, to which one of the above sequences binds can be used.
9. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin V, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR' Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden.9. The method according to claim 2 for the detection of cathepsin V, characterized in that as a primer pair for the PCR ' nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14 from the enclosed sequence protocol or with sequences that bind to sequences ( hybridize) to which one of the above sequences binds can be used.
10. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin W, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden.10. The method according to claim 2 for the detection of cathepsin W, characterized in that the primer pair for the PCR is nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 15 and SEQ ID No. 16 from the enclosed sequence protocol or with sequences that bind (hybridize) to sequences ), to which one of the above sequences binds, can be used.
11. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Leukocystatin, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsauremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet werden.11. The method according to claim 2 for the detection of leukocystatin, characterized in that the primer pair for the PCR is nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 17 and SEQ ID No. 18 from the enclosed sequence protocol or with sequences that bind (hybridize) to sequences. , at which binds one of the above sequences can be used.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es im Rahmen eines Diagnose- und/oder Früherkennungsverfahrens durchgeführt wird.12. Method according to one of claims 1 to 11, characterized in that it is carried out as part of a diagnostic and/or early detection process.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es im Rahmen einer Diagnose und/oder Früherkennung von Tumoren und/oder Metastasen durchgeführt wird.13. The method according to claim 12, characterized in that it is carried out as part of a diagnosis and / or early detection of tumors and / or metastases.
14. Nukleinsäuremolekül mit einer der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll.14. Nucleic acid molecule with one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 from the enclosed sequence listing.
15. Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die an eine Sequenz bindet (hybridisiert), an die eine der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll bindet (hybridisiert).15. Nucleic acid molecule with a nucleotide sequence that binds (hybridizes) to a sequence to which one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 18 from the enclosed sequence listing binds (hybridizes).
16. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Asparaginylendopeptidase .16. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 from the attached sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds for the detection of asparaginyl endopeptidase.
17. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin B. 17. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds, for the detection of cathepsin B.
8. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 aus beiliegendem Ξe- quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin D.8. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 from the enclosed sequence protocol or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds, for the detection of cathepsin D.
19. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin H.19. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds for the detection of cathepsin H.
20. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 10 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin L.20. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 9 and SEQ ID No. 10 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds, for the detection of cathepsin L.
21. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin S.21. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 11 and SEQ ID No. 12 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds for the detection of cathepsin S.
22. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin V. 22. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds, for the detection of cathepsin V.
3. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin W.3. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 15 and SEQ ID No. 16 from the enclosed sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds, for the detection of cathepsin W.
24. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Leukocystatin.24. Use of nucleic acid molecules with nucleotide sequences SEQ ID No. 17 and SEQ ID No. 18 from the attached sequence listing or with sequences that bind (hybridize) to sequences to which one of the above sequences binds for the detection of leukocystatin.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis mittels einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) erfolgt.25. Use according to one of claims 16 to 24, characterized in that the detection is carried out using a polymerase chain reaction (PCR).
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die PCR eine Real-Time-PCR umfaßt.26. Use according to claim 25, characterized in that the PCR comprises a real-time PCR.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis mittels einer Northern- Blot-Analyse erfolgt.27. Use according to one of claims 16 to 24, characterized in that the detection is carried out by means of a Northern blot analysis.
28. Kit, das zumindest eines der Nukleinsauremoleküle nach Anspruch 14 oder 15 enthält. 28. Kit containing at least one of the nucleic acid molecules according to claim 14 or 15.
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