WO2003090665A2 - Regulation der erythrozyten-apoptose - Google Patents

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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels

Definitions

  • the present invention relates to the use of a substance for the detection of cation channels and the use of an active substance for influencing cation channels for the prevention or treatment of diseases which are associated with a disturbed regulation of apoptosis and / or disturbed flow properties of the blood.
  • Apoptosis is understood as the so-called programmed cell death. In a broader sense, this also means cell death, which is regulated by the genetic information of the affected cell itself. Apoptosis is the basis of regulated embryogenesis (death of superfluous organ systems), tissue homeostasis (protection against new growth) and function of the immune system (induction of apoptosis in target cells by cytotoxic T-lymphocytes and natural killer cells) and is determined by various factors (e.g. receptor binding , Protease effect) triggered. Apoptosis also plays a role in cytostatic effects, radiation therapy and other therapeutic principles.
  • BEST ⁇ TIGUIMGSKOPIE are resistant, such as B. against serum withdrawal or the protein kinase C inhibitor staurosporin [Daugas et al. 2001].
  • Affected erythrocytes also bind to endothelial cells via phosphatidylserine [Eda & Sherman 2002] and can thereby obstruct blood flow. These affected erythrocytes therefore have a so-called "stickiness”.
  • the object of the invention is to find new diagnostic and treatment approaches while elucidating the molecular mechanisms and to provide active substances which can be used for therapeutic and diagnostic use in the case of disorders of apoptosis regulation.
  • At least one substance can be used to detect the expression and / or function of cation channels in cells.
  • This substance is used to diagnose diseases that are associated with a disturbed regulation of apoptosis and / or disturbed flow properties of the blood.
  • This can be, for. B. the detection of genetic dispositions for certain diseases due to mutations, z. B. act on the cation channel.
  • a susceptibility to certain illnesses can be diagnosed, so that, with the corresponding symptoms, a disrupted regulation of apoptosis, with the associated clinical symptoms, can be concluded quickly.
  • the substance used for the detection of expression and / or function of cation channels can, for. B. is an antibody that is directed against the cation channel, and is used in a detection method known to the person skilled in the art, such as, for example, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
  • This detection can also be provided, for example, using the so-called PCR technique (polymerase chain reaction).
  • PCR technique polymerase chain reaction
  • certain DNA segments are selectively amplified. DNA sequences framed by two synthetic oligonucleotides are re-synthesized using DNA polymerases. Due to the exponential enrichment, starting from small amounts of DNA (10 "9 -10 " 15 g), the DNA sections can be made detectable after repeating the process several times (20-40 cycles).
  • RNA To detect RNA sections, the RNA must be identified using an RNA-dependent DNA Polymerase be copied into a DNA.
  • the detection according to the invention can thus be carried out by selecting suitable DNA sections on the target protein, the cation channel.
  • Other methods of how a known target protein or domains of a target protein composed of several subunits can be quantitatively and / or qualitatively detected are known to the person skilled in the art, and in this connection reference is made to the extensive corresponding specialist literature.
  • At least one active ingredient can be used for the prevention or treatment of diseases in cells.
  • this active ingredient influences the expression and / or the function of cation channels, with the cation channel in particular being stimulated or inhibited.
  • the flow properties of the blood can be influenced, particularly in the case of erythrocytes.
  • this active ingredient can be the substances already described, on the other hand, the active ingredient can be, for example, a genetically modified mutant of the cation channel or an upstream / downstream member of the signal transduction cascade of this cation channel. So it is z. B. possible with the help of genetic engineering to produce active ingredients that either a) have a higher activity than their physiological equivalents, or b) cannot interact with their physiological inhibitors. Another possibility is to provide the naturally occurring signal elements. Inhibitors of the signal transduction cascade could also be inhibited, in order to activate the corresponding signal transduction cascade To enable cation channel. This active ingredient can then be provided for the manufacture of a medicament or a pharmaceutical composition, which is claimed in a further preferred embodiment.
  • Inhibitors of phosphatidylinositol-dependent kinase such as Wortmannin for activation, and activators of PI3-kinase for inhibiting apoptosis are particularly suitable.
  • Apoptosis can also be modulated accordingly by kinases activated by the PI3 kinase, such as the phosphatidylinositol-dependent kinase (PDK) and the protein kinase B.
  • PI3-kinase phosphatidylinositol-dependent kinase
  • a method for regulating apoptosis is claimed.
  • cells are brought into contact with an active ingredient, the active ingredient influencing the expression and / or function of cation channels, in particular stimulating or inhibiting, and thereby inducing apoptosis in these cells (when stimulated) or inhibited (when inhibited).
  • the "stickiness" of the cells in particular erythrocytes, can also be changed, and thus the flow properties of the blood can be changed.
  • the apoptosis can be influenced in a targeted manner the course of the disease can be positively influenced.
  • the influencing, in particular the stimulation or inhibition, of cation channels results in an influencing and / or control of the intracellular Ca 2+ concentration, ie the influx of Ca 2+ ions into the cell.
  • the cation channel is permeable to Ca 2+ , which allows Ca 2+ to enter the cell.
  • the channel itself is an unspecific cation channel.
  • Apoptosis can also be affected by mechanisms that promote or inhibit cell shrinkage.
  • Inhibitors of the Ca 2+ activated K + channel such as charybdotoxin and clotrimazole [Anfinogenova et al. 2001, Jensen et al. 2001], as well as Cl ⁇ channel blockers (eg 5-nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzene acid, NPPB) hinder cell shrinkage and thus activation of the cation channel.
  • NPPB 5-nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzene acid
  • cells can be influenced, and apoptosis can be regulated by influencing a cation channel.
  • cells also include those cells which are nucleated, but which have arisen from nucleated precursors.
  • these cells are blood cells, ie cells derived from the bone marrow, in particular erythrocytes. These nucleated cells originated from the nucleated precursors, the erythroblasts. During its development through maturation and division (erythropoiesis), the nucleus is expelled from the cell, and hemoglobin formation takes place simultaneously in the cytoplasm.
  • the cell volume regulatory cation channels are not only expressed in erythrocytes, but also in several nucleated cells [Cabado et al. 1994, Chan & Nelson 1992, Gamper et al. 2000, Koch & Korbmacher 1999, Volk et al. 1995, Wehner et al. 1995, 2000]. Since an increase in intracellular calcium can also trigger cell death in nucleated cells [Green & Reed 1998], the activation of cell volume sensitive cation channels play a role in triggering the apoptotic death of nucleated cells.
  • the active substance or the substance is directed against the cation channels themselves.
  • the active substance or the substance can also include, among other things, antisense sequences, genetically modified mutants of the members of the signal transduction cascade of the cation channel, or so-called "small molecular compounds".
  • polynucleotides which code for a peptide which influences, in particular stimulates or inhibits the expression and / or function of cation channels, or polypeptides which preferably influence, in particular stimulate or inhibit the expression and / or function of cation channels.
  • the active ingredient or the substance can be directed against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels. These activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors can e.g. B.
  • a polynucleotide encoding a peptide, or a polypeptide and a "small molecular compound" can be used.
  • the invention encompasses inhibitors or activators of PI3 kinases, PDK, protein kinase B, phospholipase A 2 , Ca 2+ activated K + channels and Cl " channels.
  • Erythropoietin, nerve growth factor are very particularly preferred , Inhibitors of p38 kinase, in particular SB 203580, inhibitors of PI3 kinase, especially Wortmannin, PLA 2 inhibitors, especially quinacrine, Gardos channel inhibitors, especially charybdotoxin and / or clotrimazole, and / or hemolysin, especially from Vibrio parahaemolyticus, as active substances or substances.
  • the use of at least one oxidizing agent as active ingredient or substance is also included.
  • the active substance or the substance is a so-called “small molecular compound”, in particular one with a molecular weight (MW) ⁇ 2,000.
  • This “small molecular compound” is preferably amiloride (MG 229.65) , ionomycin and / or their analogues.
  • An example of an analog of amiloride is, for example, ethylisopropylamiloride.
  • Amiloride is the international short name for the potassium-retaining diuretic N-amidino-3,5-diamino-6-chloropyrazine-2-carbamide.
  • Diuretics are generally drugs that, by inhibiting renal reabsorption, especially from countries, cause an increased excretion of Na + , CI " , and HCO 3 " ions and (indirectly) water, thereby reducing the plasma volume and improving congestion symptoms.
  • Potassium-retaining or potassium-sparing diuretics such as amiloride or triamterene inhibit sodium absorption in the distal tubule. They have a weak diuretic effect with potassium retention.
  • Ionomycin belongs to the so-called lonophores. This name, introduced by Pressmann in 1967 and composed of "ions” and "phor”, summarizes the mostly macrocyclic compounds with a molecular weight (MW) generally ⁇ 2,000, which reversibly form chelates or complexes with ions.
  • the invention can be used to detect or treat all forms of diseases which are associated with a disrupted regulation, in particular a disrupted inhibition or induction, of apoptosis.
  • diseases that are associated with a disturbed inhibition it is z.
  • Dehydrogenase deficiency Dehydrogenase deficiency, iron deficiency anemia and / or immunodeficiency.
  • a longer residence time of erythrocytes in the high osmolar renal medulla during acute kidney failure [Mason et al. 1986] can trigger apoptosis by activating the channel, an effect which contributes to the disruption of the microcirculation.
  • erythrocytes exposed to phosphatidylserine in other tissues can interfere with microcirculation.
  • the cation channel is activated in the event of disorders which lead to shrinkage of erythrocytes, such as sickle cell anemia [Joiner 1993, Lang et al.
  • the diseases associated with impaired induction of apoptosis are tumor diseases and / or infections, well-known diseases in which there is an impaired inhibition of apoptosis.
  • the invention also covers all other diseases which can be treated by induction or inhibition of apoptosis via a cation channel.
  • the diseases that are associated with impaired flow properties are, in particular, circulatory disorders, especially peripheral, arterial and / or venous circulatory disorders, and their sequelae, such as vascular occlusions, organic ischemia, infarction, angina and / or necrosis.
  • the active substance or the substance can be administered primarily orally, intravenously, topically and / or by inhalation.
  • the form of administration and the dose can be chosen freely.
  • age, gender and other factors of the patient play a role.
  • the clinical picture as well as the type and degree of the disease must also be taken into account when selecting the type of application and the dose of the active ingredient or substance.
  • the invention further comprises a pharmaceutical composition which contains at least one active ingredient which influences, in particular stimulates or inhibits the expression and / or function of cation channels, and optionally a pharmaceutical carrier.
  • the active ingredient can be a polynucleotide which encodes a peptide, in particular a polypeptide, this peptide preferably influencing, in particular stimulating or inhibiting, the expression and / or function of cation channels.
  • the active ingredient can be a peptide, preferably a polypeptide, this peptide or polypeptide preferably influencing, in particular stimulating or inhibiting, the expression and / or function of cation channels.
  • the active ingredient can also be a "small molecular compound", preferably a "small molecular compound” with a molecular weight (MW) ⁇ 2,000. So it can be z.
  • the active ingredient is a so-called antisense sequence, ie a sequence which is able to form a double-strand duplex with the mRNA, and thereby the Prevents translation into a polypeptide.
  • the gene sequence itself can be used to achieve over- / under-expression of the cation channel, e.g. B. by incorporation into suitable vectors with strong promoters or by construction of suitable mutants.
  • the active ingredient can be the substances already described, amiloride, ionomycin and / or their analogs, for example ethylisopropylamiloride, and an oxidizing agent.
  • amiloride ionomycin and / or their analogs, for example ethylisopropylamiloride, and an oxidizing agent.
  • the invention further comprises a pharmaceutical composition which has an effective amount of at least one active ingredient which influences, preferably stimulates or inhibits the expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels.
  • This pharmaceutical composition can optionally also contain a pharmaceutical carrier.
  • the activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels can e.g. B. the above-mentioned transcription factors, as well as other known or as yet unknown members of the signal transduction cascade of the cation channel.
  • Polynucleotides encoding a polypeptide which influence, preferably stimulate or inhibit the expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels can also be present in such compositions.
  • the active ingredient can be a peptide, preferably a polypeptide, with this peptide preferably the Expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of cation channels is influenced, in particular stimulated or inhibited.
  • the invention includes a diagnostic kit.
  • This kit contains at least one substance that is used to detect the expression and / or function of cation channels.
  • the diagnostic kit is preferably used to identify susceptibility to diseases which are associated with a disturbed regulation of apoptosis and / or disturbed flow properties of the blood.
  • Such diagnostic kits can be used in a targeted manner in a diagnostic method which is used to identify susceptibilities to neurodegenerative diseases, acute kidney failure, thalassemia, sickle cell anemia, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, iron deficiency anemia, immunodeficiency, tumor diseases and / or infections.
  • Fig. 1 ionomycin-induced erythrocyte apoptosis
  • Fig. 2 Osmotically triggered erythrocytic apoptosis
  • Fig. 3 Oxidatively triggered erythrocytic apoptosis
  • Fig. 4 Erythrocytic apoptosis triggered by a lack of glucose
  • Fig. 5 Inhibition of erythrocyte apoptosis by erythropoietin
  • Fig. 6 Inhibition of erythrocyte apoptosis when extracellular Ct is removed by 100 ng / ml nerve growth factor (NGF)
  • Fig. 7 Inhibition of erythrocyte apoptosis after Ct removal (0 glucose for 48 hours) by p38 kinase inhibitor SB 203580 (0.5 ⁇ M).
  • Fig. 8 Inhibition of the apoptotic effect of hyperosmotic shock (700 mösm) by erythropoietin (epo) and their reversal by PI3-kinase inhibitor Wortmannin (10 ⁇ M)
  • Fig. 9 Inhibition of erythrocyte apoptosis under osmotic shock (850 mösm) by phospholipase A 2 inhibitor quinacrine (25 ⁇ M)
  • Fig. 11 Inhibition of erythrocyte apoptosis by Cl-channel blocker NPPB
  • Fig. 12 Stimulation of erythrocyte apoptosis by hemolysin from Vibrio parahaemolyticus (0.01-0.5 units)
  • Erythrocytes were taken from healthy volunteers. The experiments were as follows at 37 ° C in Ringer's solution
  • HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid
  • CaCl 2 was replaced by 1 mM ethylene glycol bis ( ⁇ -aminoethyl ether) - ⁇ /, ⁇ /, ⁇ / ', ⁇ /' - tetra-acetic acid (EGTA).
  • the osmolarity was increased to 700-850 mosmol / l by adding sucrose, ionomycin was used in a concentration of 1 ⁇ M, amiloride in a concentration of 1 mM.
  • the concentration of the solvent dimethyl sulfoxide DMSO was 0.1% in each case.
  • the cation channel inhibitor amiloride can suppress the osmotic, oxidative or metabolically induced apoptosis.
  • Amiloride inhibits a cation channel that is caused by osmotic shock [Huber et al. 2001] and oxidative stress [Duranton et al. 2001] is activated and Ca 2+ flows into the cell [Duranton et al. 2001].
  • the inhibition of erythrocytic apoptosis by amiloride therefore shows that apoptosis is caused by activation of this channel. Findings in nucleated cells show that these cells can also be killed by activating the amiloride-sensitive cation channel.
  • FACS fluorescence activated row sorting
  • Ionomycin-induced cell shrinkage and annexin binding are both inhibited in the absence of extracellular Ca 2+ .
  • Treatment of erythrocytes with ionomycin thus triggers two typical features of apoptosis, ie the breakdown of the phosphatidylserine asymmetry (which leads to annexin binding) and the cell shrinkage.
  • Osmotic shock leads to erythrocytic annexin binding
  • the cells were further exposed to the hyperosmolar solution in the absence of Ca 2+ (C) or in the presence of 1 mM Ca 2+ but in the presence of 1 mM amiloride (D).
  • Arithmetic mean (+ SEM) of annexin-binding cells with different osmolarities after 24 and 48 hours E.
  • Osmotic shock is known to trigger apoptosis in nucleated cells [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998
  • Oxidative stress triggers erythrocytic apoptosis
  • Glucose deficiency induces erythrocyte apoptosis
  • the cells were further exposed to a glucose-free solution without Ca 2+ (C) or with 1 mM Ca 2+ and 1mM amiloride (D).
  • Glucose deficiency has previously been shown to weaken the antioxidant mechanisms of erythrocytes. Therefore the effect of glucose deficiency was examined (Fig. 4A-E).
  • the increase in annexin-binding cells was significantly reduced in the nominal absence of calcium.
  • Controls are erythrocytes in solvent-containing buffer for 24 hours.
  • the erythrocyte count under control conditions in the absence and presence of erythropoietin were (2.5 ⁇ 0.2) x 10 7 cells / ml and (2.4 ⁇ 0.2) x 10 7 cells / ml.
  • the effect of the osmotic shock was weakened and the inhibitory effect of erythropoietin was largely abolished.
  • the Ca 2+ ionophore ionomycin caused annexin binding. This effect was not reversed by erythropoietin.
  • erythropoietin inhibits the apoptosis of erythrocytes after osmotic shock.
  • NGF nerve growth factor
  • Annexin-binding cells (arithmetic mean ⁇ SEM) after removal of CI " for 48 hours in the absence and presence of 100 ng / ml nerve growth factor.
  • the erythrocytic cell shrinkage induced by oxidative stress results from an activation of Ca 2+ sensitive K + channels in the erythrocytic cell membrane, which leads to erythrocytic loss of KCI via hyperpolarization of the cell membrane [Bookchin et al. 1987, Brugnara et al. 1993].
  • the mechanisms shown play a role in limiting erythrocyte life.
  • the presentation of phosphatidylserine on the cell surface stimulates the uptake of erythrocytes
  • Macrophages [Boas et al. 1998, Romero & Romero 1999]. Therefore encourages an increase in the intracellular calcium concentration, as occurs in aging erythrocytes [Kiefer & Snyder 2000, Romero & Romero 1999], the removal of the affected erythrocytes from the bloodstream.
  • Oxidative stress or reduced effectiveness of antioxidative mechanisms accelerates at least partially removal of erythrocytes via activation of the cation channel. This death is delayed by inhibiting the cation channels. Similar findings can also be found in nucleated cells.
  • Boas FE Forman L and Beutler E (1998) Phosphatidylserine exposure and red cell viability in red cell aging and in hemolytic anemia. Proc Natl Acad Sci US 95: 3077-81 Bookchin RM, Ortiz OE and Lew VL (1987) Activation of calcium- dependent potassium channels in deoxygenated sickled red cells. Prog Clin Biol Res. 240: 193-200
  • Fadok VA Bratton DL, Rose DM, Pearson A, Ezekewitz RA, Henson PM: A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells. Nature 2000; 405: 85-90.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zum Nachweis von Kationenkanälen sowie die Verwendung eines Wirkstoffes zur Beeinflussung von Kationenkanälen zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen.

Description

Beschreibung
Regulation der Apoptose
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zum Nachweis von Kationenkanälen sowie die Verwendung eines Wirkstoffes zur Beeinflussung von Kationenkanälen zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose und/oder gestörten Fließeigenschaften des Blutes in Zusammenhang stehen.
Unter Apoptose wird der sogenannte programmierte Zelltod verstanden. Im weiteren Sinne ist darunter auch der Zelluntergang zu verstehen, der durch genetische Informationen der betroffenen Zelle selbst reguliert wird. Die Apoptose ist die Grundlage einer geregelten Embryogenese (Absterben überflüssiger Organanlagen), Gewebehomöostase (Schutz vor Neubildungen) und Funktion des Immunsystems (Auslösung von Apoptose bei Zielzellen durch zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen) und wird durch verschiedene Faktoren (z. B. Rezeptorbindungen, Proteasenwirkung) ausgelöst. Ferner spielt die Apoptose auch eine Rolle bei der Zytostastikawirkung, Strahlentherapie und anderen therapeutischen Prinzipien.
Wissenschaftliche Untersuchungen zeigen, daß oxidativer und osmotischer Streß, wohlbekannte Auslöser von apoptotischem Tod kernhaltiger Zellen [Gulbins et al. 2000, Michea et al. 2000, Rosette and Karin 1996], auch erythrozytäre Apoptose hervorrufen. Obgleich Erythrozyten weder Kerne noch Mitochondrien enthalten, sind sie doch fähig, morphologische Änderungen zu durchlaufen, wie sie für apoptotische kemhaltige Zellen typisch sind [Daugas et al. 2001], obwohl die Erythrozyten gegenüber manchen apoptotischen Stimuli
BESTÄTIGUIMGSKOPIE resistent sind, wie z. B. gegen Serum-Entzug oder den Proteinkinase C- Hemmer Staurosporin [Daugas et al. 2001].
Ca2+ -Einstrom in die Erythrozyten über einen Ca2+-Kanal aktiviert eine Scramblase, die zu einer Umlagerung von Phosphatidylserin in der Zellmembran führt [Woon et al. 1999]. Phosphatidylserin an der Oberfläche von Erythrozyten bindet an Phosphatidylserin-Rezeptoren von Makrophagen, die in der Folge die betroffenen Zellen phagozytieren und intrazellulär abbauen [Fadok et al. 2000, Henson et al. 2001]. Über Phosphatidylserin binden betroffene Erythrozyten auch an Endothelzellen [Eda & Sherman 2002] und können dadurch die Blutströmung behindern. Diese betroffenen Erythrozyten weisen daher eine sogenannte „Klebrigkeit" auf.
Obwohl Apoptose eine wichtige Rolle in vielen Krankheitsverläufen spielt, sind die molekularen Mechanismen, welche die Apoptose vermitteln, und deren Bedeutung für den Krankheitslauf bisher weitgehend unklar.
Dementsprechend stellt sich die Erfindung die Aufgabe, unter Aufklärung der molekularen Mechanismen neue Diagnose- und Behandlungsansätze aufzufinden sowie Wirkstoffe bereitzustellen, die für die therapeutische und die diagnostische Anwendung bei Störungen der Apoptoseregulation genutzt werden können.
Überraschenderweise konnte am Beispiel von Erythrozyten ein Mechanismus aufgezeigt werden, über den diese kernlosen Zellen in den programmierten Zelltod getrieben bzw. gegen wohlbekannte Auslöser von apoptotischem Tod resistent gemacht werden können.
Demzufolge wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 bis 4, 26, 29 und 44 gelöst. Bevorzugte Ausführungen sind in den abhängigen Ansprüchen genannt. Der Inhalt aller dieser Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Erfindungsgemäß kann mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen verwendet werden. Dabei wird diese Substanz zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose und/oder gestörten Fließeigenschaften des Blutes im Zusammenhang stehen, genutzt. Hierbei kann es sich z. B. um die Erkennung von genetischen Dispositionen für bestimmte Erkrankungen infolge von Mutationen, z. B. am Kationenkanal, handeln. Es kann so unter Umständen eine Anfälligkeit gegenüber bestimmten Erkrankungen diagnostiziert werden, so daß bei entsprechenden Symptomen schnell auf eine gestörte Regulation der Apoptose, mit den damit einhergehenden klinischen Symptomen, geschlossen werden kann.
Bei der Substanz, die zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen eingesetzt wird, kann es sich z. B. um einen Antikörper handeln, der gegen den Kationenkanal gerichtet ist, und in einem dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, wie z.B. ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) eingesetzt wird. Weiterhin kann z.B. mit Hilfe der sogenannten PCR-Technik (polymerase chain reaction) dieser Nachweis erbracht werden. Bei diesem molekulargenetischen Verfahren werden selektiv bestimmte DNA- Abschnitte amplifiziert. Dabei erfolgt eine Neusynthese von DNA- Sequenzen, die von zwei synthetischen Oligonukleotiden eingerahmt werden, mittels DNA-Polymerasen. Durch die exponentielle Anreicherung, ausgehend von geringen Mengen DNA (10"9-10"15 g) können nach mehrmaliger Wiederholung des Vorgangs (20-40 Zyklen) die DNA-Abschnitte nachweisbar gemacht werden. Zum Nachweis von RNA-Abschnitten muß die RNA mittels einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase in eine DNA umkopiert werden. Durch Auswahl von geeigneten DNA-Abschnitten am Zielprotein, dem Kationenkanal, kann so der erfindungsgemäße Nachweis erfolgen. Weitere Verfahren, wie ein bekanntes Zielprotein bzw. Domänen eines aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzten Zielproteins quantitativ und/oder qualitativ nachgewiesen werden kann, sind dem Fachmann bekannt, und in diesem Zusammenhang wird auf die umfangreiche dementsprechende Fachliteratur verwiesen.
Weiterhin kann erfindungsgemäß mindestens ein Wirkstoff zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen in Zellen verwendet werden. Dieser Wirkstoff beeinflußt nach Applikation die Expression und/oder die Funktion von Kationenkanälen, wobei es insbesondere zu einer Stimulierung oder Inhibierung des Kationenkanals kommt. Dies resultiert in einer Induktion, alternativ zu einer zumindest partiellen Hemmung, der Apoptose, d. h. generell in einer Regulation der Apoptose in den betroffenen Zellen. Darüber hinaus können insbesondere bei Erythrozyten dadurch die Fließeigenschaften des Blutes beeinflusst werden.
Es kann sich bei diesem Wirkstoff zum einen um die schon beschriebenen Substanzen handeln, zum anderen kann der Wirkstoff z.B. eine gentechnisch veränderte Mutante des Kationenkanals, bzw. ein up-/downstream liegendes Mitglied der Signaltransduktionskaskade dieses Kationenkanals, sein. So ist es z. B. möglich, mit Hilfe der Gentechnologie Wirkstoffe herzustellen, die entweder a) eine höhere Aktivität als ihre physiologischen Äquivalente haben, oder b) keine Wechselwirkungen mit ihren physiologischen Inhibitoren eingehen können. Eine weitere Möglichkeit ist die Bereitstellung der natürlich vorkommenden Signalelemente. Auch könnten Inhibitoren der Signaltransduktionskaskade ihrerseits inhibiert werden, um so eine Aktivierung der entsprechenden Signaltransduktionskaskade des Kationkanales zu ermöglichen. Dieser Wirkstoff kann dann zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden, was in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beansprucht wird.
Insbesondere kommen Hemmstoffe der Phosphatidylinositol- abhängigen Kinase (PI3-Kinase), wie Wortmannin zur Aktivierung, sowie Aktivatoren der PI3-Kinase zur Hemmung der Apoptose in frage. Ferner kann die Apoptose durch Kinasen entsprechend moduliert werden, die durch die PI3-Kinase aktiviert werden, wie die Phosphatidylinositol- abhängige Kinase (PDK) und die Protein Kinase B.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Regulation der Apoptose beansprucht. Bei diesem Verfahren werden Zellen mit einem Wirkstoff in Kontakt gebracht, wobei der Wirkstoff die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und dadurch die Apoptose in diesen Zellen induziert (bei Stimulierung) bzw. inhibiert (bei Hemmung). Darüberhinaus kann hierdurch auch die „Klebrigkeit" der Zellen, insbesondere Erythrozyten, verändert und damit die Fließeigenschaft des Blutes verändert werden. Abhängig von der Erkrankung, die mit der Apoptose bzw. mit den Fließeigenschaften des Blutes assoziiert ist, kann dabei durch gezielte Beeinflussung der Apoptose der Krankheitsverlauf positiv beeinflußt werden.
Erfindungsgemäß hat die Beeinflussung, insbesondere die Stimulierung oder Inhibierung, von Kationenkanälen eine Beeinflussung und/oder Kontrolle der intrazellulären Ca2+-Konzentration, d.h. des Einstroms von Ca2+-lonen in die Zelle, zur Folge. Der Kationenkanal ist dabei Ca2+ durchlässig, wodurch ein Eintritt von Ca2+ in die Zelle gewährt wird. Bei dem Kanal selbst handelt es sich um einen unspezifischen Kationenkanal. Durch Steigerung der intrazellulären Ca2+-Konzentration wird die zelluläre Apoptose unter geeigneten Bedingungen stimuliert, durch Herabsetzung der intrazellulären Ca2+-Konzentration dementsprechend die zelluläre Apoptose inhibiert.
Die Apoptose kann auch durch Mechanismen beeinflußt werden, die eine Zellschrumpfung fördern oder hemmen. Inhibitoren des Ca2+ aktivierten K+-Kanales (sogen. Gardos-Kanal), wie Charybdotoxin und Clotrimazol [Anfinogenova et al. 2001 , Jensen et al. 2001], sowie Cl~- Kanalblocker (z.B. 5-Nitro-2-(3-Phenylpropylamino)Benzolsäure, NPPB) behindern eine Zellschrumpfung und damit eine Aktivierung des Kationenkanales. Hämolysin aus Vibrio parahaemolyticus führt umgekehrt zu einer Steigerung des Apoptose.
Generell sind erfindungsgemäß alle Zellen, d. h. sowohl kernhaltige als auch kernlose Zellen, beeinflußbar, wobei mittels Beeinflussung eines Kationenkanals die Apoptose reguliert werden kann. Unter Zellen werden erfindungsgemäß auch die Zellen umfaßt, die zwar kernlos sind, aber aus kernhaltigen Vorstufen hervorgegangen sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesen Zellen um Blutzellen, d. h. vom Knochenmark abstammende Zellen, insbesondere um Erythrozyten. Diese kernlosen Zellen sind aus den kernhaltigen Vorstufen, den Erythroblasten, hervorgegangen. Während ihrer Entwicklung durch Reifung und Teilung (Erythropoese) wird der Kern aus der Zelle ausgestoßen, und im Zytoplasma findet gleichzeitig die Hämoglobinbildung statt. Die Zellvolumen-regulatorischen Kationenkanäle werden aber nicht nur in Erythrozyten, sondern auch in mehreren kernhaltigen Zellen exprimiert [Cabado et al. 1994, Chan & Nelson 1992, Gamper et al. 2000, Koch & Korbmacher 1999, Volk et al. 1995, Wehner et al. 1995, 2000]. Nachdem eine Zunahme von intrazellulärem Caicium auch in kernhaltigen Zellen Zelltod auslösen kann [Green & Reed 1998], kann die Aktivierung der Zellvolumen- empfindlichen Kationenkanäle gleichermaßen bei der Auslösung des apoptotischen Todes kemhaltiger Zellen eine Rolle spielen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Substanz gegen die Kationenkanäle selbst gerichtet. Bei dem Wirkstoff oder der Substanz kann es sich, neben den schon beschriebenen, auch unter anderem um Antisensesequenzen, gentechnisch veränderte Mutanten der Mitglieder der Signaltransduktionskaskade des Kationenkanals, oder um sogenannte "small molecular compounds" handeln. Weiter zu nennen sind Polynukleotide, welche für ein Peptid kodieren, welches die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, oder Polypeptide, welche vorzugsweise die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflussen, insbesondere stimulieren oder inhibieren. Weiterhin kann der Wirkstoff oder die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von Kationenkanälen gerichtet sein. Diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer können z. B.
Transkriptionsfaktoren, die für den Expressionslevel des entsprechenden Kationenkanals verantwortlich sind, und andere bekannte Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von Kationenkanälen sein. Auch gegen diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer kann als Wirkstoff oder als Substanz z. B. ein Polynukleotid, welches ein Peptid kodiert, oder ein Polypeptid sowie ein „small molecular compound" eingesetzt werden.
Insbesondere werden von der Erfindung Hemmstoffe oder Aktivatoren von PI3-Kinasen, PDK, Protein Kinase B, von Phospholipase A2, von Ca2+ aktivierten K+-Kanälen und von Cl"-Kanälen umfasst. Ganz besonders bevorzugt sind Erythropoietin, Nerve Growth Factor, Hemmstoffe der p38-Kinase, insbesondere SB 203580, Hemmstoffe der PI3-Kinase, insbesondere Wortmannin, Hemmstoffe der PLA2, insbesondere Quinacrin, Hemmstoffe des Gardos-Kanals, insbesondere Charybdotoxin und/oder Clotrimazol, und/oder Hämolysin, insbesondere aus Vibrio parahaemolyticus, als Wirkstoffe oder Substanzen. Auch der Einsatz mindestens eines oxidierenden Agens als Wirkstoff oder Substanz ist gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt.
Bei der vorliegenden Erfindung ist es möglich, bekannte sowie noch unbekannte Wirkstoffe oder Substanzen zu verwenden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Substanz ein sogenannter „small molecular compound", insbesondere ein solcher mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000. Bei diesem „small molecular compound" handelt es sich vorzugsweise um Amilorid (MG 229,65), lonomycin und/oder deren Analoga. Ein Beispiel für ein Analogon von Amilorid ist z.B. Ethylisopropylamilorid. Amilorid ist die internationale Kurzbezeichnung für das Kalium-retinierende Diuretikum N-Amidino-3,5-diamino-6-chlorpyrazin-2-carbamid. Diuretika sind allgemein Arzneimittel, die durch Hemmung der renalen Rückresorption vor allem von Nationen eine erhöhte Ausscheidung von Na+, CI", und HCO3 " -Ionen sowie (indirekt) von Wasser bewirken und dadurch das Plasmavolumen senken und Stauungssymptome verbessern. Kalium- retinierende bzw. kaliumsparende Diuretika wie Amilorid oder Triamteren hemmen die Natriumresorption im distalen Tubulus. Sie haben eine schwache diuretische Wirkung bei gleichzeitiger Kaliumretention. lonomycin zählt zu den sogenannten lonophoren. Diese von Pressmann 1967 eingeführte und aus „Ionen" und „phor" zusammengesetzte Bezeichnung faßt die meist makrozyklischen Verbindungen mit einem Molekulargewicht (MG) im allgemeinen < 2.000 zusammen, die reversibel Chelate oder auch Komplexe mit Ionen bilden. Aufgrund ihrer relativ hydrophoben Oberfläche können sie diese Ionen als Carrier durch sonst für Ionen undurchlässige biologische Membranen transportieren. Durch diese Carrierfunktion wird der Einstrom von Ca2+ ermöglicht, wodurch es zu einer Induzierung der Apoptose in den entsprechenden Zellen kommt.
Die Erfindung kann benutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation, insbesondere einer gestörten Inhibierung oder Induzierung, der Apoptose im Zusammenhang stehen, zu erkennen oder zu behandeln. Bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Inhibierung im Zusammenhang stehen, handelt es sich dabei z. B. um neurodegenerative Erkrankungen, akutes Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie und/oder Immundefizienz. Eine längere Verweildauer von Erythrozyten im hochosmolaren Nierenmark während eines akuten Nierenversagens [Mason et al. 1986] kann über Aktivierung des Kanals Apoptose auslösen, eine Wirkung, welche zur Störung der MikroZirkulation beiträgt. In ähnlicher Weise können in anderen Geweben Phosphatidylserin-exponierende Erythrozyten die MikroZirkulation behindern. Darüber hinaus wird der Kationen-Kanal bei Störungen aktiviert, welche zur Schrumpfung von Erythrozyten führen, wie Sichelzellanämie [Joiner 1993, Lang et al. 1998], Thalassämie [Mach-Pascual et al. 1996] oder Eisenmangelanämie [Jolobe 2000, Mach-Pascual et al. 1996]. Das beschleunigte Absterben der Erythrozyten bei diesen Erkrankungen kann demnach durch Hemmung des Kationenkanals zumindest partiell abgeschwächt werden. Alternativ dazu handelt es sich bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Induzierung der Apoptose in Zusammenhang stehen, um Tumorerkrankungen und/oder Infektionen, wohlbekannte Erkrankungen, bei denen eine gestörte Inhibierung der Apoptose vorliegt. Durch die Erfindung sind auch alle anderen Erkrankungen, die durch Induktion bzw. Inhibierung der Apoptose über einen Kationenkanal behandelbar sind, erfaßt. Bei den Erkrankungen, die mit gestörten Fließeigenschaften in Zusammenhang stehen, handelt es sich insbesondere um Durchblutungsstörungen, vor allem periphere, arterielle und/oder venöse Durchblutungsstörungen, und deren Folgeerscheinungen, wie beispielweise Gefäßverschlüsse, Organischämie, Infarkt, Angina und/oder Nekrosen.
Erfindungsgemäß kann der Wirkstoff oder die Substanz vor allem oral, intravenös, topisch und/oder durch Inhalation verabreicht werden. Die Verabreichungsform sowie die Dosis kann frei gewählt werden. Dabei spielen bekanntermaßen insbesondere Alter, Geschlecht, sowie andere Faktoren des Patienten eine Rolle. Auch das Krankheitsbild, sowie Art und Grad der Erkrankung müssen bei der Auswahl der Applikationsart sowie der Dosis des Wirkstoffes oder der Substanz berücksichtigt werden.
Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen Wirkstoff enthält, der die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger. Dabei kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Polynukleotid handeln, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert. Alternativ dazu kann der Wirkstoff ein Peptid sein, vorzugsweise ein Polypeptid, wobei dieses Peptid bzw. Polypeptid vorzugsweise die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt. Der Wirkstoff kann ferner ein "small molecular compound", vorzugsweise ein "small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000, sein. So kann es sich z. B. bei dem Wirkstoff um eine sogenannte Antisensesequenz handeln, d. h. eine Sequenz, die in der Lage ist, mit der mRNA eine Doppelstrangduplex auszubilden, und dadurch die Translation in ein Polypeptid verhindert. Auch kann z. B. die Gensequenz selbst genutzt werden, um eine Über-/Unterexpression des Kationenkanals zu erzielen, z. B. durch Einbau in geeignete Vektoren mit starken Promotoren oder durch Konstruktion von geeigneten Mutanten. Weiterhin kann es sich bei dem Wirkstoff um die schon beschriebenen Stoffe Amilorid, lonomycin und/oder deren Analoga, so z.B. Ethylisopropylamilorid, sowie um ein oxidierendes Agens handeln. Bezüglich weiterer geeigneter Wirkstoffe wird auf die obige Beschreibung verweisen.
Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes aufweist, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, vorzugsweise stimuliert oder inhibiert. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch einen pharmazeutischen Träger enthalten. Die Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufer von Kationenkanälen können z. B. die weiter oben schon erwähnten Transkriptionsfaktoren, sowie weitere bekannte oder bis jetzt unbekannte Mitglieder der Signaltransduktionskaskade des Kationenkanals sein. Auch Polynukleotide, die ein Polypeptid kodieren, welches die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflussen, vorzugsweise stimulieren oder inhibieren, können in solchen Zusammensetzungen enthalten sein. Weiterhin sind sogenannte „small molecular compounds", die vorzugsweise ein Molekulargewicht (MG) von < 2.000 haben, und die gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von Kationenkanälen gerichtet sind, und dabei die Expression bzw. Funktion dieses Kanals stimulieren oder inhibieren, erfindungsgemäß einsetzbar. Außerdem kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Peptid handeln, vorzugsweise ein Polypeptid, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt. Zu den weiteren Merkmalen einer solchen Zusammensetzung wird auf den bisherigen entsprechenden Text der Beschreibung Bezug genommen.
Schließlich umfaßt die Erfindung ein Diagnosekit. In diesem Kit ist mindestens eine Substanz enthalten, die zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen genutzt wird. Das Diagnosekit dient vorzugsweise zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose und/oder gestörten Fließeigenschaften des Blutes in Zusammenhang stehen. Gezielt können solche Diagnosekits in einem Diagnoseverfahren eingesetzt werden, welche zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber neurodegenerativen Erkrankungen, akutem Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogena- se-Mangel, Eisenmangelanämie, Immundefizienz, Tumorerkrankungen und/oder Infektionen benutzt wird.
Die genannten Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und Figuren. Hierbei können die Einzelmerkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Figuren zeigen:
Fig. 1 : lonomycin induzierte Erythrozytenapoptose
Fig. 2: Osmotisch ausgelöste erythrozytäre Apoptose
Fig. 3: Oxidativ ausgelöste erythrozytäre Apoptose Fig. 4: Durch Glucosemangel ausgelöste erythrozytäre Apoptose
Fig.5: Hemmung der Erythrozytenapoptose durch Erythropoietin
Fig.6: Hemmung der Erythrozytenapoptose bei Wegnahme des extrazellulären Ct durch 100 ng/ml Nerve Growth Factor (NGF)
Fig. 7: Hemmung der Erythrozytenapoptose nach Ct -Wegnahme (0 Glucose für 48 Stunden) durch p38-Kinase-Hemmer SB 203580 (0,5 μM).
Fig. 8: Hemmung der apoptotischen Wirkung von hyperosmotischem Schock (700 mösm) durch Erythropoietin (epo) und deren Umkehr durch PI3-Kinase- Hemmer Wortmannin (10 μM)
Fig. 9: Hemmung der Erythrozytenapoptose unter osmotischem Schock (850 mösm) durch Phospholipase A2-Hemmer Quinacrin (25 μM)
Fig. 10: Hemmung der Erythrozytenapoptose durch r -Kanalblocker Charybdotoxin (Chx) und Clot mazol (Clz)
Fig. 11: Hemmung der Erythrozytenapoptose durch Cl-Kanalblocker NPPB
Fig. 12: Stimulation der Erythrozytenapoptose durch Hämolysin aus Vibrio parahaemolyticus (0,01-0, 5 Units)
Methoden
Erythrozyten wurden gesunden Freiwilligen entnommen. Die Experimente wurden bei 37°C in Ringer-Lösung folgender
Zusammensetzung vorgenommen: 125 mM NaCI, 5mM KCI, 1mM MgS04, 32 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES), 5 mM Glucose, 1 mM CaCI2, pH=7.4. Für die nominal Calcium- freie Lösung wurde CaCI2 durch 1 mM Ethylenglycol-bis(ß- aminoethyläther)-Λ/,Λ/,Λ/',Λ/'-tetra-Essig-säure (EGTA) ersetzt. Die Osmolarität wurde durch Zugabe von Sucrose auf 700-850 mosmol/l gesteigert, lonomycin wurde in einer Konzentration von 1 μM, Amilorid in einer Konzentration von 1 mM eingesetzt. Die Konzentration des Lösungsmittels Dimethylsulfoxid DMSO war jeweils 0.1%.
Die FACS-Analyse (flow cytometric analysis) wurde nach Standardmethoden durchgeführt [Andree et al., 1990]. Nach Inkubation wurden die Zellen in Annexin-bindendem Puffer gewaschen, der 125 mM NaCI, 10 mM HEPES; pH = 7.4) und 5 mM CaCI2 enthielt. Die Erythrozyten wurden mit Annexin-Flous (Böhringer Mannheim, Germany) 1 : 100 verdünnt. Nach 15 min. wurden die Proben 1 :5 verdünnt und durch FACS analysiert (FACS-Calibur from Becton Dickinson). Von den Zellen wurden Vorwärtsstreuung (forward scatter), Seitwärtsstreuung (sideward scatter) und Annexin-Fluoreszenz (FL-1) gemessen.
Die Werte werden als arithmetische Mittelwerte ± SEM angegeben, die statistische Analyse wurde mit Hilfe des gepaarten oder ungepaarten t- Tests durchgeführt.
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um der Frage nachzugehen, ob osmotischer Schock oder oxidativer Streß, gut bekannte Auslöser von apoptotischem Zelltod in kernhaltigen Zellen [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998, Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &, Karin 1996] auch Erythrozyten in die Apoptose treiben. Es konnte gezeigt werden, daß beide Maßnahmen sowie Glucosemangel Apoptose auslösen. Überraschenderweise wurde die Apoptose durch Entfernen des extrazellulären Ca2+ unterbunden. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß der Kationenkanal- Hemmstoff Amilorid die osmotisch, oxidativ oder metabolisch induzierte Apoptose unterbinden kann. Amilorid hemmt einen Kationenkanal, der durch osmotischen Schock [Huber et al. 2001] und oxidativen Streß [Duranton et al. 2001] aktiviert wird und Ca2+ in die Zelle einströmen läßt [Duranton et al. 2001]. Die Hemmung der erythrozytären Apoptose durch Amilorid zeigt daher, daß die Apoptose durch Aktivierung dieses Kanals zustande kommt. Befunde in kernhaltigen Zellen zeigen, daß auch diese Zellen durch Aktivierung des Amilorid-sensitiven Kationenkanales getötet werden können.
Experiment 1 :
Steigerung der cytosolischen Calcium-Konzentration durch das lonophor lonomycin löst erythrozytäre Apoptose aus
Änderungen des Zellvolumens (gemessen als forward scatter) nach einer 3-stündigen Inkubation von Erythrozyten mit 1 μM lonomycin in Abwesenheit von Ca2+ (A) oder in Anwesenheit von Ca2+ (B). Phosphatidylserin-Assymmetrie (gemessen als Annexinbindung) nach 3- stündiger Inkubation mit lonomycin in Abwesenheit von Ca2+ (C) oder Anwesenheit von Ca2+ (D). Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen nach 3 Stunden Vorbehandlung mit 1 μM lonomycin mit oder ohne Ca2+ in der extrazellulären Flüssigkeit (E).
Um die Bedeutung von Ca2+ für die erythrozytäre Apoptose zu überprüfen, wurde das Calciumionophor lonomycin eingesetzt. Wie in Fig. 1 B gezeigt wird, führt die Verabreichung von 1 μM lonomycin binnen 3 Stunden zu massiver, Ca2+-abhängiger Zellschrumpfung, wie anhand der "Vorwärtsstreuung" (forward scatter FC) der Fluoreszenz- aktivierten Zeil Sortierung (FACS) gezeigt werden kann. Die FC nimmt von einem Wert von 428 ± 13 (n=3) auf einen Wert von 121 ± 2 (n=4) ab. Darüber hinaus steigert 1 μM lonomycin die Bindung von Annexin von 4.1 ± 0.4% (n=3) auf 71.3 ± 3.2 % (n=4) (Fig. 1 D). lonomycin- induzierte Zellschrumpfung und Annexinbindung werden beide in Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ gehemmt. Die entsprechenden Werte betragen 337 ± 16 (n=4) für die FC und 12.9 ± 3.1 % (n = 4) für die Annexinbindung (Fig. 1 E). Die Behandlung von Erythrozyten mit lonomycin löst somit zwei typische Merkmale der Apoptose aus, d.h. das Zusammenbrechen der Phosphatidylserin-Asymmetrie (welche zur Annexinbindung führt) und die Zellschrumpfung.
Experiment 2:
Osmotischer Schock führt zu erythrozytärer Annexinbindung
Annexin-Bindung von Erythrozyten in isotonischem Medium (A) und in 850 mosmolarem Medium nach Zugabe von Sucrose für 24 Stunden (B). Die Zellen wurden der hyperosmolaren Lösung ferner in Abwesenheit von Ca2+ (C) oder in Anwesenheit von 1 mM Ca2+ aber Anwesenheit von 1 mM Amilorid (D) ausgesetzt. Arithmetische Mittelwerte (+ SEM) von Annexin-bindenden Zellen bei verschiedenen Osmolaritäten nach 24 und 48 Stunden (E). Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen, die für 24 Stunden in 850 mosmol/l mit oder ohne Ca2+ bzw. mit oder ohne 1 mM Amilorid inkubiert wurden (F).
Osmotischer Schock ist als Auslöser von Apoptose in kernhaltigen Zellen bekannt [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998,
Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &,
Karin 1996]. Wie überraschenderweise beobachtet wurde, steigert osmotischer Schock die Annexinbindung auch von kernlosen Erythrozyten (Fig. 2B,E). Werden Erythrozyten einer Osmolarität von 850 mosmol/l ausgesetzt (Zugabe von Sucrose), dann steigt die Zahl Annexin-bindender Zellen binnen 24 Stunden von 3.9 ± 0.3 % (n=4) auf 51.4 ± 3.8 % (n=9). Ein typisches Experiment ist in Fig. 2B dargestellt. Nominale Abwesenheit von Caicium mindert die Zahl Annexin-bindender Zellen nach osmotischem Schock signifikant auf 21.1 ± 7.2 % (n=4, siehe Fig. 2C für ein typisches Experiment und Fig. 2F für arithmetische Mittelwerte ± SEM). Darüber hinaus senkt der Kationenkanalblocker Amilorid (1 mM) die Zahl Annexin-bindender Zellen signifikant auf 29.8 ± 4.0 % (n=5, siehe Fig. 2D für ein typisches Experiment und Fig. 2F für arithmetische Mittelwerte ± SEM).
Experiment 3:
Oxidativer Streß löst erythrozytäre Apoptose aus
Annexinbindung vor (A) und nach (B,C,D) 15-minütiger Oxidation von Erythrozyten mit 0.66 tert-butyl-hydroperoxid (tBOOH). Nach der Oxidation wurden die Zellen für 24 Stunden in Ringerlösung mit 1 mM Ca2+ (B) oder ohne Ca2+ (C) bzw. mit 1 mM Ca2+ und 1 mM Amilorid (D) inkubiert. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen 24 Stunden nach einer 15-minütigen Behandlung mit 1mM tBOOH oder 0.66 mM tBOOH, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM Ca2+ oder in der Anwesenheit von 1 mM Ca + und 1 mM Amilorid (E).
Oxidativer Streß, hervorgerufen durch die Verabreichung von 0.66 mM oder 1 mM tert-butyl-hydroperoxid (tBOOH) führte zu massiver
Schrumpfung von Erythrozyten, wie durch die Änderung der
Vorwärtsstreuung (forward scatter) in der FACS-Analyse von 370 ± 13 (n=4) auf 314 ± 51 (n=4) bzw. 167 + 14 (n= 4) erkennbar wird. In einer ersten Serie von Experimenten konnte beobachtet werden, daß eine Behandlung der Zellen für 15 min mit 0.66 mM tBOOH signifikante Annexin-Bindung auslöst (Fig. 3B). Die Annexinbindung konnte durch Weglassen des extrazellulären Caiciums (Fig. 3C) oder durch Verabreichung von 1 mM Amilorid (Fig. 3D) signifikant reduziert werden. Wie in Fig. 3E gezeigt wird, steigern 0.66 mM und 1 mM tBOOH die Zahl Annexin-bindender Zellen von 3.2 ± 0.5 % (n=4) auf 26 ± 7.5 % (n=4) und 68.5 ± 5.3 % (n=4). In der nominalen Abwesenheit extrazellulären Caiciums sind sowohl die Oxidations-induzierte Zellschrumpfung, als auch die Annexin-Bindung beide herabgesetzt. Die Werte für die Vorwärtsstreuung (forward scatter) in Calcium-freiem
Incubationsmedium erreichten 339 ± 22 (n=4) (0.66 mM tBOOH) und 307 ± 15 (n=4) (1 mM tBOOH), im Vergleich zu 314 ± 51 (n=4) und 167 ± 14 (n=4) in der Anwesenheit von Caicium. Die Zahlen für Annexin- positive Zellen erreichten nur 11.0 ± 1.4 % (n=4) (0.66 mM tBOOH) und 34.1 ± 2.6 % (n=4) (1 mM tBOOH) in der Abwesenheit von Caicium (Fig. 3E). Entsprechend hemmte das Weglassen von extrazellulärem Caicium die tBOOH-induzierte Phosphatidylserin-Umlagerung um 66 % bzw. 53 %. Gleichermaßen minderte die Anwesenheit von 1 mM Amilorid die Wirkung von tBOOH selbst in der Anwesenheit von 1 mM Ca2+. Die jeweiligen Werte für die Vorwärtsstreuung (forward scatter) erreichten 356 ± 24.0 (n=4) (0.66 mM tBOOH) und 291 ± 27 (n=4) (1mM tBOOH). In der Anwesenheit von 1 mM Amilorid wurde die Zahl Annexin-positiver Zellen auf 7.9 ± 3.2 % (0.66 mM tBOOH) bzw. 37.7 ± 4.4% (1 mM tBOOH) herabgesetzt, ein Befund, welcher die Hemmung der t-BOOH- induzierten Annexin-Bindung um 80 % bzw. 48 % reflektiert (Fig. 3E). Experiment 4:
Glucosemangel induziert Erythrozytenapoptose
Annexin-Bindung von Erythrozyten nach 48-stündiger Inkubation in der Anwesenheit (A) oder der Abwesenheit von Glucose (B). Die Zellen wurden ferner einer Glucose-freien Lösung ohne Ca2+ (C) oder mit 1 mM Ca2+ und 1mM Amilorid (D) ausgesetzt. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen, welche einem Glucoseentzug für 24 oder 48 Stunden mit oder ohne Anwesenheit von Ca2+ oder 1 mM Amilorid (E) ausgesetzt wurden.
Es wurde früher gezeigt, daß Glucosemangel die antioxidativen Mechanismen von Erythrozyten schwächt. Daher wurde die Wirkung von Glucosemangel untersucht (Fig. 4A-E). In der Anwesenheit von Glucose banden 3.1 ± 0.6 % (n=4) der Erythrozyten Annexin. Die Entfernung von Glucose aus dem extrazellulären Medium steigerte die Zahl Annexin- bindender Zellen auf 11.2 ± 2.2 % (n=4) nach 24 Stunden und auf 49.4 ± 5.7 % (n=4) nach 48 Stunden. Die Zunahme Annexin-bindender Zellen war in der nominalen Abwesenheit von Caicium signifikant herabgesetzt. Die entsprechenden Werte waren 10.4 ± 2.5 % (n=4) nach 24 Stunden und 10.0 ± 1.9% (n=4) nach 48 Stunden. In gleicher Weise wurde die Wirkung von Glucose-Entzug durch Amilorid (1 mM) abgeschwächt. Die jeweiligen Werte waren 5.7 ± 1.8 % (n=4) nach 24 Stunden und 11.7 ± 1.9 % (n=4) nach 48 Stunden (Fig. 4E).
Experiment 5:
Hemmung der Erythrozytenapoptose durch Erythropoietin (Fig. 5)
(A) Wirkung eines osmotischen Schocks (700 mOsm für 24 h) auf die Zahl Annexin- bindender Erythrozyten in Abwesenheit (C 700) oder Anwesenheit (E 700) von 1 U/ml Erythropoietin sowie auf die Zahl Annexin-bindender Erythrozyten bei 300 mOsm in Abwesenheit (C 300) oder Anwesenheit von Erythropoietin (E 300).
(B) Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen in 300 mOsm oder 700 mOsm für 24 Stunden, jeweils in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 U/ml Erythropoietin. Kontrollen (Controls) sind jeweils Erythrozyten in Lösungsmittel-enthaltendem Puffer für 24 Stunden.
(C) Arithmetische Mittelwerte (± SEM) Annexin-bindender Zellen in unterschiedlicher Osmolarität für 24 Stunden, jeweils in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 U/ml Erythropoietin. Kontrollen (Controls) sind wiederum Erythrozyten in Lösungsmittel-enthaltendem Puffer für 24 Stunden.
(D) Arithmetische Mittelwerte (± SEM) der Erythrozytenzahl in % der Kontrolle in 300 mOsm oder 700 mOsm für 24 Stunden, jeweils in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 U/ml Erythropoietin. Kontrollen (Controls) sind jeweils Erythrozyten in Lösungsmittel-enthaltendem Puffer für 24 Stunden. Die Erythrozytenzahl unter Kontrollbedingungen in Abwesenheit und Anwesenheit von Erythropoietin waren (2.5 ± 0.2) x 107 Zellen/ml und (2.4 ± 0.2) x 107 Zellen/ml. Der osmotische Schock bewirkte eine Annexinbindung von 66,5 ± 11 ,0 % (n = 6) und 26,8 ± 7,9 % (n = 6) der Erythrozyten in der Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Erythropoietin (1 U/ml). In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ wurde der Effekt des osmotischen Schocks abgeschwächt und die inhibitorische Wirkung von Erythropoietin weitgehend aufgehoben. Das Ca2+-lonophor lonomycin bewirkte eine Annexinbindung. Dieser Effekt wurde durch Erythropoietin nicht rückgängig gemacht. Insgesamt hemmt Erythropoietin die Apoptose von Erythrozyten nach osmotischen Schock. Experiment 6:
Hemmung der Erythrozytenapoptose durch Nerve Growth Factor (NGF) (Fig. 6)
Annexin-bindende Zellen (arithmetische Mittelwerte ± SEM) nach Wegnahme von CI" für 48 Stunden in Abwesenheit und Anwesenheit von 100 ng/ml Nerve Growth Factor.
Experiment 7:
Hemmung der Erythrozytenapoptose durch den p38-Kinase-Hemmer SB 203580 (Fig. 7)
Änderung der Zahl Annexin-bindender Zellen (arithmetische Mittelwerte ± SEM) nach Wegnahme von CI" für 48 Stunden in Anwesenheit des p38 Kinase
Hemmers SB 203580 im Vergleich zur Abwesenheit von SB 203580 (= 0,5 μM).
Experiment 8:
Hemmung der antiapoptotischen Wirkung von Erythropoietin durch den PI3- Kinase-Hemmer Wortmannin (Fig. 8)
Änderung der Zahl Annexin-bindender Zellen (arithmetische Mittelwerte ± SEM) nach osmotischem Schock (700 mOsm) durch Erythropoietin (epo) und durch zusätzliche Verabreichung von Wortmannin (10 μM). Die Daten sind im Vergleich zu osmotischem Schock in Abwesenheit von Erythropoietin und Wortmannin ausgedrückt. Experiment 9:
Hemmung der Erythrozytenapoptose durch Quinacήn (Fig.9)
Zahl Annexin-bindender Zellen (arithmetische Mittelwerte ± SEM) nach osmotischem Schock (850 mOsm) für 6 Stunden in Abwesenheit und Anwesenheit von 25 μM Quinacrin.
Experiment 10:
Hemmung der lonomycin-induzierten Erythrozytenapoptose durch den -Kanalblocker Charybdotoxin und Clotrimazol (Fig. 10)
A. Histogramme Annexin-bindender Erythrozyten in representativen Experimenten von Erythrozyten, die in isotoner Ringerlösung (jeweils links) oder in Ringer mit 1 μM lonomycin (jeweils Mitte) oder in Ringer + lonomycin + 230 nM Charybdotoxin (Chx, oben rechts) oder 5 μM Clotrimazol (Clz, unten rechts) inkubiert wurden.
B. und C. Zahl Annexin-bindender Erythrozyten (arithmetische Mittelwerte + SEM, n = 8) nach einstündiger Behandlung mit Ringer ohne (Control) oder mit 1 μM lonomycin (lono) ± 230 nM Charybdotoxin (Chx) oder 5 μM Clotrimazol (Clz).
Experiment 11 :
Hemmung der lonomycin-induzierten Erythrozytenapoptose durch den Cl~- Kanalblocker NPPB (Fig.11)
Änderung der Zahl Annexin-bindender Zellen (arithmetische Mittelwerte ± SEM) nach lonomycin (1 μM für 1 Stunde) durch NPPB (100 μM). Daten sind im Vergleich zu lonomycin in Abwesenheit von NPPB ausgedrückt. Experiment 12:
Stimulation der Erythrozytenapoptose durch Hämolysin aus Vibrio parahaemolyticus (Fig. 12)
Zahl Annexin-bindender Erythrozyten (arithmetische Mittelwerte ± SEM, n = 4) nach einstündiger Inkubation ohne (Control) oder mit 0,01 bis 0,5 U Hämolysin.
Jüngste Befunde zeigten, daß der Ca2+-lonophor lonomycin erythrozytäre Zellschrumpfung und Annexinbindung von Erythrozyten auslöst, beides typische Hinweise auf Apoptose in kernhaltigen Zellen [Bratosin et al. 2001 , Berg et al. 2001 , Daugas et al. 2001]. Wie und unter welchen Bedingungen die Ca2+-Konzentration in Erythrozyten gesteigert wird, blieb bisher unklar. Mit den vorliegenden Ergebnissen ist zum ersten Mal die Bedeutung eines Amilorid-sensitiven, Zellvolumen- regulierten Kationenkanales für die Auslösung von apoptotischem Zelltod gezeigt worden. Die Kanäle wurden früher charakterisiert, ihre Hemmbarkeit durch Amilorid [Huber et al. 2001 , Duranton et al. 2002], sowie ihre Empfindlichkeit gegenüber osmotischem [Huber et al. 2001] und oxidativem [Duranton et al. 2002] Streß gezeigt.
Die durch oxidativen Streß induzierte erythrozytäre Zellschrumpfung resultiert aus einer Aktivierung von Ca2+-sensitiven K+-Kanälen in der erythrozytären Zellmembran, die über eine Hyperpolarisation der Zellmembran zu erythrozytärem Verlust von KCI führt [Bookchin et al. 1987, Brugnara et al. 1993].
Die gezeigten Mechanismen spielen eine Rolle in der Begrenzung der Erythrozytenlebensdauer. Die Präsentation von Phosphatidylserin auf der Zelloberfläche stimuliert die Aufnahme der Erythrozyten durch
Makrophagen [Boas et al. 1998, Romero & Romero 1999]. Daher fördert eine Zunahme der intrazellulären Calcium-Konzentration, wie sie in alternden Erythrozyten auftritt [Kiefer & Snyder 2000, Romero & Romero 1999], die Entfernung der betroffenen Erythrozyten aus der Blutbahn.
Oxidativer Streß oder herabgesetzte Wirksamkeit von antioxidativen Mechanismen [Damonte et al. 1992] beschleunigt zumindest z.T. über Aktivierung des Kationenkanales die Entfernung von Erythrozyten. Durch Hemmung der Kationenkanäle wird dieses Absterben verzögert. Ähnliche Befunde lassen sich auch in kernhaltigen Zellen nachweisen.
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Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen, zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose und/oder gestörten Fließeigenschaften des Blutes in Zusammenhang stehen.
2. Verwendung mindestens eines Wirkstoffes zur Beeinflussung, insbesondere zur Stimulierung oder Inhibierung der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen, zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose und/oder gestörten Fließeigenschaften des Blutes in Zusammenhang stehen.
3. Verwendung mindestens eines Wirkstoffes zur Beeinflussung, insbesondere zur Stimulierung oder Inhibierung der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen, zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von
Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose und/oder gestörten Fließeigenschaften des Blutes in Zusammenhang stehen.
4. Verfahren zur Regulation der Apoptose, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen mit einem Wirkstoff in Kontakt gebracht werden, der die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und dadurch die Apoptose in diesen Zellen und/oder eine „Klebrigkeit" dieser Zellen induziert oder hemmt.
5. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Beeinflussung, insbesondere Stimulierung oder Inhibierung, von Kationenkanälen eine Beeinflussung und/oder Kontrolle des Ca2+-Einstroms in die Zellen zur Folge hat.
6. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Blutzellen, insbesondere um Erythrozyten, handelt.
7. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz gegen Kationenkanäle gerichtet ist.
8. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufer von Kationenkanälen gerichtet ist.
9. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.
10. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein
Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von
Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.
11. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000 ist.
12. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz Amilorid oder ein Analogon ist.
13. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz Erythropoietin ist.
14. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz Nerve Growth Factor ist.
15. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die
Substanz ein Hemmstoff der p38-Kinase, insbesondere SB 203580, ist.
16. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die
Substanz ein Aktivator oder Hemmstoff der Phosphatidylinositol 3 Kinase, insbesondere Wortmannin, ist.
17. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die
Substanz ein Aktivator der Proteinkinase B ist.
18. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Hemmstoff der Phospholipase A2 insbesondere Quinacrin, ist.
19. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Hemmstoff des Gardos-Kanales, insbesondere Charybdotoxin und/oder Clotrimazol, ist.
20. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Hemmstoff von CP-kanälen, insbesondere NPPB, ist.
21. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz Hämolysin, insbesondere Hämolysin aus Vibrio parahaemolyticus, ist.
22. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein oxidierendes Agens ist.
23. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den
Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation, insbesondere einer gestörten Inhibierung, der Apoptose in Zusammenhang stehen, um neurodegenerative Erkrankungen, akutes Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie und/oder
Immundefizienz handelt.
24. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation, insbesondere einer gestörten Induzierung, der Apoptose in Zusammenhang stehen, um Tumore und/oder Infektionen handelt.
25. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen, die mit gestörten Fließeigenschaften des Blutes in Zusammenhang stehen, um periphere, arterielle und/oder venöse
Durchblutungsstörungen, Gefäßverschlüsse, Organischämie, Infarkt, Angina und/oder Nekrosen handelt.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder
Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.
27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt.
29. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/ oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000, ist.
33. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Amilorid oder ein Analogon ist.
34. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff Erythropoietin ist.
35. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Nerve Growth Factor ist.
36. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein
Hemmstoff der p38-Kinase, insbesondere SB 203580, ist.
37. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Aktivator oder Hemmstoff der Phosphatidylinositol 3 Kinase, insbesondere
Wortmannin, ist.
38. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Aktivator der Proteinkinase B ist.
39. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Hemmstoff der Phospholipase A2, insbesondere Quinacrin, ist.
40. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Hemmstoff des Gardos-Kanales, insbesondere Charybdotoxin und/oder Clotrimazol, ist.
41. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Hemmstoff von CP-kanälen, insbesondere NPPB, ist.
42. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Hämolysin, insbesondere Hämolysin aus Vibrio parahaemolyticus, ist.
43. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein oxidierendes Agens ist.
44. Diagnosekit, umfassend mindestens eine Substanz zum Nachweis von Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen, zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose und/oder gestörten Fließeigenschaften des Blutes in Zusammenhang stehen.
45. Diagnosekit nach Anspruch 44 zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber neurodegenerativen Erkrankungen, akuten Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie, Immundefizienz, Tumorerkrankungen und/oder Infektionen.
46. Diagnosekit nach Anspruch 44 oder Anspruch 45 zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber Durchblutungsstörungen, Gefäßverschlüssen, Organischämien, Infarkten, Angina und/oder Nekrosen.
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