WO2004004771A1

WO2004004771A1 - 免疫賦活組成物

Info

Publication number: WO2004004771A1
Application number: PCT/JP2003/008420
Authority: WO
Inventors: Tasuku Honjo; Nagahiro Minato; Yoshiko Iwai; Shiro Shibayama
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2002-07-03
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2004-01-15
Also published as: US9073994B2; JPWO2004004771A1; US20140314714A1; AU2003281200A1; JP6258428B2; JP2012236861A; JP5885764B2; JP2018039835A; US20160158355A1; US9067999B1; JP2009286795A; US8728474B2; EP2206517A1; EP1537878B1; EP1537878A4; US9402899B2; LU92905I2; US20060110383A1; PT1537878E; US20110081341A1

Abstract

PD-1、PD-L1またはPD-L2によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害した結果惹起される免疫賦活を介した癌の治療若しくは感染症の治療のための組成物およびそれらを用いた治療方法、その有効成分として含まれる免疫賦活物質、癌治療物質若しくは感染症治療物質のスクリーニング方法、それらスクリーニング方法に使用される細胞株、癌治療物質を選別する評価法、およびその評価に用いられる癌細胞移植哺乳動物に関する。PD-1、PD-L1、またはPD-L2の機能を阻害する本発明の組成物は、癌または感染症に対する治療に有用である。

Description

明細書免疫賦活組成物技術分野

本発明は、 P D— 1、 P D— L l、または P D—L 2によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害することを特徴とする免疫賦活、癌の治療若しくは感染症の治療のための糸且成物、およびそれらを用いる治療方法に関する。さらに詳しく言えば、 P D— 1、 P D— L l、または P D— L 2によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害した結果惹起される免疫賦活を介した癌の治療若しくは感染症の治療ための組成物、それらを用いる治療方法、その組成物に有効成分として含まれる免疫賦活物質、癌治療物質若しくは感染症治療物質のスクリーニング方法、それらスクリーニング方法に使用される細胞株、癌治療物質を選別する評価法、およびその評価に用いられる癌細胞移植哺乳動物に関する。背景技術

免疫療法は、ほとんどの薬物療法において避け難い副作用が軽減され、極めて特異性の高い治療方法として期待されている。特に、癌治療や感染症治療における薬物療法が、患者に対して大きな負担を課す治療方法であるために、患者の Q O L (クオリティ 'ォブ 'ライフ）の回復が重要視されているが、免疫療法は、ヒトがもともと備え持っている免疫反応を外因的な方法によって賦活化させ、薬物投与による負担の一部を肩代わりさせることによつて、患者の Q O Lを回復させる目的のもとに行なうことができる。

免疫の賦活化は、 Tリンパ球細胞の免疫反応を活性化させる方法で行なうことができる。 T細胞の活性化には、抗原レセプター（T C R)' を介した刺激だけでなく、共役刺激分子群（例えば、 CD 2 8) を介した付加的な刺激誘導が必要であるといわれている。一方、最近、共役刺激分子群と相同的な構造を有する分子群、 CTLA— 4と PD— 1が発見され、抗原レセプター (TCR) シグナルを抑制するシグナルを発していることが報告されている。

T細胞の活性化の方法として、この共役抑制分子の機能を抑制することも有効な 1つの手段であると考えられている。

PD— 1は免疫グロプリンフアミリーに属する 5 5 kDの I型膜タンパクとしてクローユングされた（The EMBO Journal, 1992年，第 11卷，第 11号， p.3887〜3895、特開平 5-336973号公報、特開平 7-291996号公報）。ヒト P D 一 1 c D N Aは、 EMBL I GenBank Acc. No. M— 005018に示される塩基配列で構成され、マウス PD_ l c DNAは、 Acc. No. X67914に示される塩基配列で構成され、それら発現は、胸腺細胞においては CD 4— CD 8—から CD 4 + CD 8 +細胞に分化する際に認められる（International Immunology, 1996 年，第 18卷，第 5号， p.773〜780、 Journal of Experimental Medicine, 2000年，第 191卷，第 5号， p.891〜898) 。また、末梢における P D— 1の発現は、抗原レセプターからの刺激により活性化した T細胞、 B細胞（International Immunology, 1996年，第 18卷，第 5号， p.765〜772参照）または活性化マク口ファージを含む骨髄細胞に認められることが報告されている。

PD- 1の細胞内領域には、 I T I Mモチーフ（Immunoreceptor Tyrosine - based Inhibitory Motif) があり、免疫反応に対する抑制ドメインと考えられている。さらに、 PD— 1欠損マウスが、糸球体腎炎、関節炎といったループス様自己免疫病（C 5 7 B LZ 6遺伝子背景の場合）（International Immunology, 1998年，第 10巻，第 10号， ρ·1563〜1572、 Immunity, 1999年，第 11巻，第 2号， ρ.141〜151) や拡張性心筋症様疾患（BALBZc遺伝子背景の場合） (Science, 2001年，第 291卷，第 5502号， p.319〜332) を発症することから、 PD— 1が自己免疫疾患発症、特に、末梢自己免疫寛容の制御因子であることも示唆されている。

PD— 1のリガンドである PD— L 1 (ヒト PD— L I c DNAは EMBL/ GenBank Acc. No. AF233516,マウス PD— L 1 c DNAは M— 021893で示される塩基配列で構成される。）は、活性化した単球ゃ樹状細胞などのいわゆる抗原提示細胞に発現している（Journal of Experimental Medicine, 2000年，第 19巻，第 7号， ρ.1027〜1034) 。これら細胞は、 Tリンパ球細胞に対して、さまざまな免疫誘導シグナルを誘導する相互作用分子を提示しており、 P D — L 1は、 PD— 1による抑制シグナルを誘導する分子の 1つである。 PD — L 1リガンド刺激は、 PD- 1を発現している Tリンパ球細胞の活性ィ匕（細胞増殖、各種サイト力イン産生誘導）を抑制することが示されている。さらに、 PD— L 1の発現は、免疫担当細胞のみでなく、ある種の腫瘍細胞株（単球性白血病由来細胞株、肥満細胞種由来細胞株、肝癌由来細胞株、神経芽細胞種由来細胞株、乳癌由来各種細胞株）でも確認されている（Nature Immunology, 2001年，第 2巻，第 3号， p.261〜267参照）。

P D - L 2 (ヒト P D— L 2 c D NAは EMBL I GenBank Acc. No. NM— 025239、マウス PD— L 2 c DNAは M— 021896で示される塩基配列で構成される (Nature Immunology, 2001年，第 2巻, 第 3号， p.261〜267)。）は、 PD— 1の第 2番目リガンドとして同定されたが、その発現と機能は P D-L 1とほぼ同じであることが報告されている。

PD— 1に代表される共役抑制分子からの抑制シグナルは、抗原レセプタ一 (TCR) および共役刺激分子によるポジティブなシグナルを適性に制御するメカニズムによって、リンパ球発生または成熟過程での免疫寛容や自己抗原に対する異常な免疫反応を制御していると考えられている。また、ある種の腫瘍やウィルスは、直接的もしくは間接的なメカニズムによって、 T細胞の活性化および増殖を遮断し、これら共役抑制分子を自らに対する宿主免疫反応を衰弱させるのに利用していると考えられている（Cell, 1992年，第 71卷，第 7号， ρ.1093〜1102、 Science, 1993年，第 259巻，第 5093号， .368 〜370参照）。さらに、 T細胞の機能障害に起因すると考えられている疾患の一部では、これら共役抑制分子の異常が T細胞の機能障害を起していると考えられている。発明の開示

本発明の課題は、 PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2による抑制シグナルを阻害して、免疫賦活させる組成物およびこの機構を介した癌治療または感染症治療のための組成物の提供にある。

本発明者らは、癌治療または感染症治療における新たな標的として、 PD — 1、 PD— L l、または PD— L 2に注目し、 PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2による抑制シグナルを阻害する物質が、免疫機能の回復、さらには賦活機構を介して癌の増殖を阻害することを見出した。さらに、感染したウィルスのお除に PD— 1シグナル、具体的には PD_ 1と PD— L 1 または PD— 1と PD—L 2の相互作用が関与していることを見出した。これら事実に基いて、 PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2による抑制シグナルを阻害する物質が、癌または感染症に対して治療効果を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

1. PD— 1、 PD— L 1、または P D— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる免疫賦活組成物、

2. PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる癌治療組成物、

3. 癌転移を抑制する組成物である前項 2記載の癌治療組成物、

4. PD— 1、 PD— L l、または P D— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる感染症治療組成物、 5. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項 2または 3記載の癌治療組成物、

6. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項 4記載の感染症治療組成物、

7. PD— 1と PD— L 1若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用阻害物質、 PD— 1の細胞内シグナル阻害物質、および PD— 1、 PD— L 1若しくは PD— L 2の産生阻害物質から選択される一以上の免疫抑制シグナル阻害物質である前項 1乃至 6のいずれかに記載の組成物、

8. ?0— 1抗体、？0—し 1抗体、可溶化 PD— 1、および可溶化 PD— L 1から選択される一以上の PD— 1と PD— L 1の相互作用阻害物質である前項 7記載の組成物、

9. 国際受託番号 FERM BP-8392で識別されるハイプリドーマが産生する抗ヒト PD— 1抗体、非ヒト抗体をヒト化させた抗 PD— 1抗体、，および完全ヒト型抗ヒト PD— 1抗体から選択される PD— 1抗体である前項 8記載の組成物、

10. 遺伝子改変により PD—1発現が阻害されたリンパ球細胞が、免疫抑制シグナノレ阻害物質である前項 1乃至 6のいずれかに記載の組成物、

1 1. PD— 1と PD— L 1若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用阻害物質、 PD— 1の細胞内シグナル阻害物質、または PD— 1、 PD— L 1若しくは PD— L 2の産生阻害物質が、タンパク質、ポリペプチド若しくはぺプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれらの誘導体、有機合成化合物、無機化合物、および天然物から選択されるー以上の物質である前項 7記載の組成物、

12. PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる免疫賦活方法、

13. PD— 1、 PD—L 1、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる癌治療方法、

14. 癌転移を抑制する前項 13記載の癌治療方法、

15. PD— 1、 PD— L l、または PD—L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる感染症治療方法、

16. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項 13または 14記載の癌治療方法、

17. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項 15記載の感染症治療方法、

18. PD— 1と PD— L 1若しくは PD— 1と PD—L2の相互作用阻害物質、 PD— 1の細胞内シグナル阻害物質、および PD— 1、 PD— L 1若しくは PD— L 2の産生阻害物質から選択される一以上の免疫抑制シグナル阻害物質である前項 12乃至 17のいずれかに記載の方法、

19. PD— 1抗体、 PD— L 1抗体、可溶化 PD— 1、およぴ可溶化 PD — L 1から選択される一以上の PD_ 1と PD— L 1の相互作用阻害物質である前項 18記載の方法、

20. 国際受託番号 FERM BP-8392で識別されるハイプリドーマが産生する抗ヒト PD— 1抗体、非ヒト抗体をヒト化させた PD— 1抗体、および完全ヒト型抗ヒト PD— 1抗体から選択される PD— 1抗体である前項 1 9記載の方法、

21. 遺伝子改変により P D— 1発現が阻害されたリンパ球細胞が、免疫抑制シグナル阻害物質である前項 12乃至 17のいずれかに記載の方法、 22. PD—1と PD— L 1若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用阻害物質、 PD— 1の細胞内シグナル阻害物質、または PD— 1、？0—し 1若しくは PD— L 2の産生阻害物質が、タンパク質、ポリペプチド若しくはぺプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれらの誘導体、有機合成化合物、無機化合物、および天然物から選択される 1つ以上の物質である前項 18記載の方法、

23. 免疫賦活組成物を製造するための PD— 1、 PD— L l、または PD_ L 2の免疫抑制シグナル阻害物質の使用、

24. 癌治療組成物を製造するための PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質の使用、

25.癌治療組成物が、癌転移抑制組成物である前項 24記載の物質の使用、 26. 感染症治療組成物を製造するための PD— 1、 PD— L l、または PD 一 L 2の免疫抑制シグナル阻害物質の使用、

27. PD-L 1または PD— L 2を発現するように形質転換されたスクリ一ユング用癌細胞株、

28. 前項 27記載の細胞、リンパ球細胞および被験物質を接触させて、前項 27記載の細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用を評価することを特徴とする免疫賦活物質のスクリ一ユング方法、

29. 癌細胞である前項 27記載の細胞、リンパ球細胞および被験物質を接触させて、その癌細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用またはその腫瘍細胞の増殖に対する阻害作用を評価することを特徴とする癌治療物質のスクリ一二ング方法、

30. 病原体を感染させた前項 27記載の細胞または PD— L 1若しくは P D— L 2を発現する細胞、リンパ球細胞および被験物質を接触させて、その感染細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用または病原体増殖に対する阻害作用を評価することを特徴とする感染症治療物質のスクリーニング方法、

31. 前項 27記載の癌細胞株を移植して作出した哺乳動物、

32. 前項 31記載の哺乳動物に被験物質を投与し、被験物質による移植癌細胞の増殖に対する抑制率またはその被移植哺乳動物の生存率を評価することを特徴とする癌治療物質の選別方法に関する。本発明中の PD— 1、 PD— L 1または PD— L 2は、それぞれマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ィヌ、ブタ、サルまたはヒトを含む霊長類の哺乳動物を由来とするものを含む。好ましくは、ヒト PD— 1、ヒト P D-L 1およぴヒト PD— L 2である。

本発明中の PD— 1、 PD— L 1、または PD— L 2によ ¾免疫抑制シグナルは、少なくとも PD— 1と PD— L 1または PD— 1と PD— L 2との相互作用、 PD— 1の細胞内シグナルから構成される。さらに、 PD_1、 PD— L 1、または PD— L 2分子自身の産生もこれに含まれる。

本発明中の PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2による免疫抑制シグナルは、 PD— 1と PD— L 1または PD— 1と PD— L 2との相互作用または PD— 1の細胞内シグナルの直接的あるいは間接的な阻害によって阻害される。これらの阻害活性を有する物質として、 PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2にそれぞれ選択的に結合する物質が挙げられる。好ましくは、例えば、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれら誘導体、有機合成化合物、無機化合物、または天然物が挙げられる。特に、特異性に優れた物質として、 PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2に対する抗体が挙げられる。

また、当該免疫抑制シグナルは、 PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2分子自身の産生の阻害によっても阻害される。

PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2に対する抗体は、 PD— 1、 P D— L 1、または PD— L 2による免疫抑制シグナを阻害するものであれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ゥサギ由来抗体またはャギ由来抗体のいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナル若しくはモノクローナノレ抗体、完全型若しくは短縮型（例えば、 F (a b') ₂、 F a b\ F a bまたは F v断片）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。そのような抗体は、 P D— 1、 P D— L l、または P D— L 2の細胞外領域の部分タンパク質を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従つて製造することができる。細胞外領域の部分タンパク質は、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。

ポリクローナル抗体は、公知の方法によって製造することができる。例えば、抗原タンパク質あるいはそれとキャリアー蛋白質との混合物で、適当な動物に免疫を行ない、その免疫動物から抗原タンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。用いられる動物としては、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、モルモットが一般的に挙げられる。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを抗原タンパク質と共に投与することができる。投与は、通常約 2週毎に 1回ずつ、計約 3〜 1 0回程度行なうのが一般的である。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 E L I S A法によって測定することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、例えば、抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプ口ティン Gなどの活性吸着剤を用いた精製法、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法などの免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。抗体製剤としては、モノクローナル抗体あるいはその修飾体がより好ましレ、。

モノクローナル抗体産生細胞の作製は、抗原で免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、継代培養可能なモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを作製することにより行なうことができる。抗原タンパク質の投与は、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と共に行なう。投与には、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与するのが一般的である。また、 "D NA免疫" と呼ばれる方法によっても、動物を免疫することができる。この方法は、免疫動物の後足前脛骨筋にカルジォトキシン（Cardiotoxin) を処置し、さらに抗原タンパク質を発現するベクターを導入した後、組織修復の過程でベクターが筋細胞に取りこまれ、タンパク質を発現する現象を利用した方法である (Nature Immunology, 2001年，第 2卷，第 3号， ρ·261〜267) 。

免疫される動物としては、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ、ゥサギまたはモルモットが可能であるが、好ましくはマウスまたはラットが用いられる。融合操作は、コーラ一（Kohler) とミルシュタイン（Milstein)の方法（Nature, 1975年，第 256卷，第 5517号， ρ·495〜497) で実施することができ、融合促進剤としては、ポリエチレンダリコーノレ ( P E G) やセンダイウィルスなどが用いられる。骨髄腫細胞としては、 P 3 U 1、 N S 1、 S P 2 Z 0、 A P 1などの骨髄腫細胞が挙げられるが、通常 P 3 U 1がよく利用される。モノクローナル抗体産生細胞の選別は、例えば、抗原タンパク質を直接あるいは担体と共に吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加することによる E L I S A法などにより検出して行なうことができる。さらに、ハイプリド一マ培養上清の抗体価は、 E L I S A法によって測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は、上記のポリクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。具体的には、国際受託番号 FERM BP-8392で識別されるハイブリドーマが産生する抗ヒト P D— 1 抗体あるいは国際受託番号 FERM BP-8396で識別されるハイブリドーマが産生する抗マウス P D— L 1抗体である。

国際受託番号 FERM BP-8392で識別されるハイプリドーマは、 2002年 12月 19 日付で日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM P-19162で寄託され、 2003年 6月 5日付で国際寄託に移管されている。また、国際受託番号 FERM BP-8396で識別されるハイプリドーマは、 2002 年 6月 25日付で同センターに受託番号 FERM P-18908で寄託され、 2003年 6 月 11日付で国際寄託に移管されている。

抗体断片とは、 F ( a b ') ₂、 F a b '、 F a bまたは s c F v抗体フラグメントであり、プロテアーゼ酵素により処理し、場合により還元して得ることができる。

F ( a b ') ₂抗体フラグメントは、精製されたモノクローナル抗体をぺプシンで完全に消化し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、プロテイン Aあるいはプロテイン Gカラムなどのァフィ二ティークロマトグラフィーのいずれかの方法により精製することができる。ペプシンの消化時間は、 I g サブタイプにより異なるため、適当に調製することが必要である。 F a b '抗体フラグメントは、調製した F ( a b ') ₂を 2 _メルカプトェチルァミンで部分還元することによって作製することができる。また、 F a b抗体フラグメントは、システィン存在下で消化酵素パパインで直接消化し、精製して作製することができる。

また、モノクローナル抗体は、抗体のアミノ酸配列を決定したり、ハイプリドーマから単離できる抗体をコードする D NA配列を利用して、遺伝子組換え技術により改変し、改変抗体やハイブリッド抗体を産生させることも可能である。例えば、通常の完全型抗体ではなく単鎖抗体として作製することもできる。 s c F v抗体（Single Chain Fv) は、ジョストらの方法（Journal of Biological Chemistry, 1994年，第 269卷，第 42号， p.26267〜26273) により行なうことができる。重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれコードする D N A断片を中性アミノ酸（グリシンあるいはセリン）をコードするスぺーサーで連結し、この融合 D N Aを含む発現べクタ一を適当な宿主細胞で発現させることによって、本来の抗体の特性と親和性を保持する単鎖の抗体を作製することができる。

非ヒト抗体をヒトの治療に用いる場合、その抗体の抗原性を減少させることが不可欠である。患者の抗体に対する免疫反応は、有効な治療期間を短縮させる場合が多く、抗体をヒト化あるいは完全ヒト型化させ、抗体の抗原个生を減らす工程が必要である。ヒトへの投与が可能となるよう改変されたヒト化抗体とは、同抗体をヒトに投与したときに薬理学的に許容し得る程度に、抗原性が減少あるいは血中動態が改善するよう改変された抗体である。

本発明の明細書中のヒト P D—1抗体またはヒト P D— L 1抗体は、これをヒト化あるいは完全ヒト型化した抗体をも含む。

ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された非ヒト抗体の一部をヒト抗体の一部に置換することによって作製できる。具体的には、ヒト抗体の定常領域をコードする遺伝子とのキメラを構築することによって作製できることが知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) ， 1987年，第 84卷， p.3439〜3443、 Journal of Immunology, 1987年，第 139巻，第 1号 , ρ·3521)。ヒトの定常領域の D NA配列は文献に記載されており、その定常領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。続いて、抗体の可変領域をコードする D N Α配列をヒトの定常領域の配列に融合させる。ヒトの定常領域のァイソタイプは所望のェフエクタ一機能または抗体依存細胞性細胞毒性における活性によって選択できる。好ましいアイソタイプは I g G l、 I g G 3おょぴ I g G 4である。また、ヒト軽鎖定常領域、 κ鎖または λ鎖のいずれも用いることができる。このヒト化キメラ抗体は通常の方法によって発現させることができる。

完全ヒト型抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域遺伝子を導入されたマウス（ゼノマウス（Chemical Biology, 2000年，第 7卷，第 8号， p.R185-6) 、ヒユーマブマウス（infection and immunity, 2002年，第 70巻，第 2号， p.612-9)、 T Cマウス (Biotechnology and Genetics Enginnering Revew, 2002年，第 19巻， p.73〜82)、 KMマウス (Cloning Stem Cells, 2002年，第 4巻，第 1号， p.91-102) ) を利用して作製することができ、さらにそれらマウスから単離した抗体産生リンパ球をハイプリドーマにして、目的の抗体を量産させることができる。また、ファージ 'ディスプレー法（FEBS Letter, 1998年，第 441卷， p.20-24) によっても作製することができる。この方法は、環状一本鎖 DN Aにヒト抗体遺伝子を組み込んだファージを利用して、ファージを構成する外殻タンパク質と融合した形で、ヒト型抗体をファ一ジの表面に発現されることができる。

PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2に結合するポリペプチドまたはその誘導体は、 PD— 1、 PD_L 1、または PD— L 2のそれぞれの部分タンパク質であって、免疫抑制シグナルを誘導しないものが挙げられる。 P D— 1の免疫抑制シグナルの誘導には、 PD_ 1が抗原レセプターの近傍に存在することが不可欠であり、そのためには抗原提示細胞、腫瘍あるいは癌細胞に存在する PD— L 1または PD— L 2との相互作用による拘束が必要である。したがって、細胞外ドメインのみであって PD— 1と相互作用する部分を有する可溶化 PD— L 1または可溶化 PD— L 2は、 PD— 1の免疫抑制シグナルを阻害することができる。逆に、同様の構造を有し、 PD— L 1または PD— L 2に結合できる可溶化 PD— 1も、免疫抑制シグナルを阻害することができる。これら可溶化タンパク質は、 PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2に結合するのに必要十分な細胞外領域を含むものであればよく、公知のタンパク質発現法およぴ精製法によつて調製することができる。

PD- 1と PD— L 1または PD— 1と P D— L 2の相互作用阻害物質がタンパク質またはポリぺプチドであり、それらの相互作用に必須の領域が、連続するポリペプチドのみによって構成されている場合、そのようなポリべプチド断片は、互いの拮抗物質になり得る。さらに、このポリペプチド断片を化学的に修飾されたあるいはポリべプチド断片の立体構造をもとにコンビユータによつて設計された分子群から、より強力な活性を有する拮抗物質を同定することが可能となる。また、相互作用領域のタンパク質立体構造解析データをもとにコンピュータによって設計された分子群の中から、最適の拮抗分子をより効率的に選択することもできる。

また、 PD— 1と PD— L 1または PD— 1と PD— L 2のの相互作用を阻害する物質を直接スクリーニングすることができる。そのような物質は、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、非ペプチド' I"生ィ匕合物、有機合成化合物、または天然物（例えば、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物）のライブラリーから同定することが可能である。

PD- 1細胞内ドメィンの抑制シグナルは、 P D— 1細胞内ドメィンである I T I Mに結合した脱リン酸化酵素（例えば、 S H P— 1、 2 (SathishJG, Journal of Immunology) ， 2001年，第 166巻，第 3号， p.1763-70) 力抗原受容体複合体の細胞内複合体に接触することによって生じることから、総じて抗原受容体複合体と PD_ 1の接触の阻害によって阻害される。抑制シグナルを阻害する物質として、 I T I Mのチロシン残基のリン酸化を阻害する物質、 I T IMへの脱リン酸化酵素の結合を阻害する物質、その脱リン酸化酵素の活性を直接阻害する物質などが挙げられる。抗原受容体複合体としては、 T細胞受容体複合体、 B細胞受容体複合体が挙げられる。

PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の産生は、特定のポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、有機合成化合物、無機化合物、または天然物などによって阻害できる。特に、好適なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオシドとして、リボザィムと呼ばれるアンチセンスヌクレオチド誘導体が挙げられる。これは、 PD— 1、 PD— L 1または、 PD— L 2の mRNA に相補的なポリヌクレオチド誘導体を、対象の発現細胞に導入することによつて、発現する mRNAが破壌される機構を利用したものである。さらに、ベクターは、患者から採取したリンパ球前駆細胞に対して、 PD— 1の発現を阻害するような遺伝子操作に使用でき、その操作された細胞は、増殖、分化、そして、活性ィヒさせて、再び患者に投与する細胞医療に利用することができる。特に、癌に対する免疫療法においては、リンパ球前駆細胞の成熟化および活性化の際に、標的細胞の特異抗原を添加することによって、標的細胞に特異的で、よりクロ一ナルなリンパ球細胞を調製することができる。

本発明のスクリ一二ング法は、細胞機能を測定する方法で行なうことができる。同方法で使用される PD— L 1または PD— L 2を発現するように形質転換したスクリーニング用癌細胞株とは、 PD— L 1または PD— L 2を発現するように構築された発現ベクターを公知の方法によって細胞に導入し、一過性あるいは安定的に形質転換された癌細胞株を含む。使用される癌細胞株としては、サル COS— 1細胞、 COS— 7細胞、 Ve r o、チヤィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記する。）、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記する。）、マウス L細胞、マウス A t T— 20、マウスミエローマ細胞、ラット GH3、 HEK293 T細胞、ヒト F L細胞などが用いられる。特に、動物細胞を形質転換する場合には、例えば、「細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロトコール」（秀潤社、 1995年、第 263)や「Virology」（1973年、第 52卷、第 456号）に記載の方法に従って行なうことができる。

また、自然に PD— L 1または PD— L 2を発現する細胞を用いることもできる。そのような細胞として、白血球細胞、好ましくは単球、マクロファージ若しくは抗原提示細胞、上皮系細胞、腫瘍細胞、癌細胞またはそれらの細胞株などである。腫瘍細胞または癌細胞として使用できる細胞として、例えば、 P 38 D 1細胞、 P 815細胞、 NB 41 A 3細胞、 MD A— 231 細胞、 SKBR— 3細胞、 MCF—7細胞、 BT474細胞、 J 558 L細胞、 P 3U1細胞、 PA I細胞、 X63細胞または S P 2Z0細胞を用いることができる。

PD-L 1若しくは PD— L 2を自然に発現する細胞または強制的に発現させた細胞であって、病原体を感染させた細胞を用いることもできる。感染させる病原体としては、ヒト肝炎ウィルス（B型肝炎、 C型肝炎、 A型肝炎）または E型肝炎）、ヒトレトロウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（H I V 1、 H I V 2) 、ヒト T細胞白血病ウィルス、ヒト Tリンパ向性ウイノレス (HT LV 1、 HTLV 2) 、単純へルぺスゥィルス 1型若しくは 2型、ェプスタイン .バーゥイノレス、サイトメガロウイノレス、水痘一帯状疱疹ゥイノレス、ヒトヘルぺスウィルス 6を含むヒトヘルぺスウィルス、ポリオウイルス、麻疹ウィルス、風疹ウィ^/ス、日本脳炎ウィルス、おたふくウィルス、インフルェンザゥイノレス、アデノウィルス、ェンテロウィルス、ライノウィルス、重症急性呼吸器症候群（SARS) を発症するウィルス、エボラウィルス、西ナイルウィルス、またはそれらを人為的に改変されたウィルスが挙げられる。その他の病原体として、例えば、病原性原生動物（例えば、トリパノソーマ、マラリアおよびトキソプラズマ）、細菌（例えば、マイコパクテリゥム、サルモネラおよびリステリア）、または真菌（例えば、カンジダ）が挙げられる。

本発明のスクリ一ユング法で使用されるリンパ球細胞としては、 T細胞または B細胞であり、好ましくは、細胞傷害性 Tリンパ球細胞（CTL) である。また、本発明のスクリーニング法におけるリンパ球細胞の免疫反応は、細胞傷害反応（例えば、腫瘍免疫反応）、混合リンパ球反応、サイトカイン、抗体、補体若しくはその他細胞表面抗原の産生、または細胞増殖が挙げられる。

本発明の免疫賦活または癌治療組成物の有効成分のスクリ一ユング法は、具体的には、細胞傷害性 Tリンパ球の対象細胞に対する細胞傷害活性を測定し、その活性に対する被験物質の効果を定量することによって行なうことができる。この方法は、 PD— 1を自然に発現する細胞傷害性 Tリンパ球細胞 (CTL) あるいは細胞株（例えば、 2C細胞）および同系マウス由来であつて PD— L 1または PD— L 2を自然に発現するもしくは強制的に発現させた細胞の混合培養に対して、被験物質を添加することによる細胞傷害活性の回復あるいは増強を定量するものである。本法の特徴は、 PD— L 1または PD— L 2を発現していない細胞に対する細胞傷害活性に比べ、 PD— L 1または PD— L 2を発現している細胞に対する細胞傷害活性が低く、被験物質による細胞傷害活性の回復（上昇幅）をより明確に測定できるところにある。被験物質による細胞傷害性の回復は、本発明の特徴とする PD— L 1 または P D— L 2による細胞傷害性の抑制の阻害に相当するものとして評価することができる。さらに、被験物質による細胞毒性を任意に測定することがより望ましい。これに使用される細胞としては、自然に PD— L 1または PD— L 2を発現する腫瘍細胞株または癌細胞株（Nature Immunology, 2001 年，第 2卷，第 3号， p.261〜267)、例えば、 P 38 D 1細胞、 P 815細胞、 NB 41八3細胞、 MDA— 231細胞、 SKBR— 3細胞、 MCF— 7細胞、 BT474細胞、 J 558 L細胞、 P 3 U 1細胞、 PA I細胞、 X63 細胞、または S P 2ノ0細胞を用いることができるが、 PD— L 1または P D-L2を安定的にあるいは一過的に発現するように形質転換させた腫瘍細胞株または癌細胞株も使用することができる。

一方、使用できる細胞傷害性リンパ球は、 PD— 1を発現しているものであって、対象とする細胞に対して同系の動物由来の細胞であることが好ましい。

本発明の感染症治療組成物の有効成分のスクリ一ユングは、 P D— 1を自然に発現する細胞傷害性 Tリンパ球細胞（C T L) あるいは細胞株（例えば、 2C細胞）、病原菌またはウィルスを感染させた同系由来の PD— L 1または P D— L 2を自然に発現するもしくは強制的に発現させた細胞の混合培養に対して、被験物質を添加することによるその感染細胞へのリンパ球細胞の免疫反応の増強作用または病原菌若しくはウィルスの増殖活性に対する阻害作用を定量するものである。

さらに、同様の原理を利用した評価法では、上記の P D— L 1または P D 一 L 2を発現するように形質転換させたスクリーニング用癌細胞株または自然に P D— L 1または P D— L 2を発現する細胞を、同系哺乳動物に移植して作出した哺乳動物を使用することができる。作出する工程としては、細胞を移植する工程、評価対象が適切となるまで同哺乳動物を飼育する工程が不可欠である。この評価法は、移植細胞の増殖、各種サイト力イン若しくは細胞表面抗原の産生量、特に、細胞が癌細胞の場合は、同細胞の増殖、浸潤若しくは転移の組織学的解析または被移植哺乳動物の生存率を評価することを特徴とする。細胞増殖は、腹水癌または血液癌の場合はその単位容量当りの癌細胞数、固形癌の場合はその大きさまたは摘出後の重量によって評価することができる。本法における被験物質による癌治療効果は、 P D— L 1または P D— L 2による細胞傷害性抑制の阻害に由来する効果に相当するものとして評価することができる。移植する癌細胞株は、インビトロでのスクリー二ング法で使用できる癌細胞のレ、ずれも使用できるが、移植哺乳動物と同系由来のもので、増殖性が良いものがより好ましい。哺乳動物としては、ヒトを除く霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ィヌ、ブタ、サルが挙げられる。産業上の利用可能性

本発明者らは、癌細胞移植動物モデルへの投与によって、癌の増殖を顕著に抑制し個体の延命効果を発揮する物質として、 P D— 1、 P D— L 1の機能を阻害するそれぞれの特異的抗体（抗 P D— 1抗体、抗 P D— L 1抗体）を発明した。これら抗体は、 PD— 1を発現している CTL (細胞傷害性 T リンパ球細胞）への PD— L 1リガンドの提示によって相対的に低下する細胞傷害活性を回復あるいは増強させる作用を示した（実施例 1，第 1図参照）。これは、 CTLによる癌細胞に対する細胞傷害活性が、これら抗体の投与によって増強しうることを示唆するものである。さらに、抗 PD— L 1抗体の投与は、 PD— L 1を人為的に発現させた肥満細胞腫由来細胞株を移入した同系マウスを用いた癌細胞移植動物モデル（蛋白質 ·核酸 ·酵素、 1981年、 26卷、 3号、 ρ·208〜224)において、癌細胞の増殖、浸潤おょぴ転移を抑制し、個体の延命効果を示した（第 2図、第 3図参照）。さらに、この抗体による PD— L 1機能の阻害による ¾果と同様の効果が、 PD— 1の機能あるいは産生を阻害することによって得られることが示唆された。これは、 PD— 1 欠損マウスを用いた癌移入モデルでは、移入癌細胞の増殖が全く認められなかったからであり、 PD— 1の機能阻害あるいは産生阻害も有効な癌治療方法になることを示すものである（実施例 5, 第 5図参照）。

実際に、癌細胞移植動物モデルにおいて、抗 PD— 1抗体の投与が移入癌細胞の肝臓への転移を有意に抑制することが証明されていた（実施例 13参照）。

さらに、発明者らは、 PD—1、 PD— L l、または PD— L2によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害する物質が、感染症治療に有用であることを示した（実施例 1 1，第 15図，第 16図参照）。

本発明者らが実験的に示したこれら結果は、 PD— 1抗体または PD— L 1抗体のみが既述の効果を呈することを示すものではなく、 PD— 1、 PD — L 1、または PD— L 2からの免疫抑制シグナルを阻害し得るいずれの物質もほぼ同様の効果を呈することを証明するものである。そのような効果を有する物質として、例えば、抗 PD— L 2抗体、可溶化 PD_1、可溶化 P D— L l、可溶化 PD— L 2、 PD—1拮抗物質、 PD— L 1拮抗物質、 P D-L 2拮抗物質、 PD— lと PD— L I若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用を阻害する物質、 PD— 1産生阻害物質、 0— 1産生阻害物質、 PD— L 2産生阻害物質、または PD— 1による細胞内抑制シグナル阻害物質が挙げられる。

本発明の癌治療組成物の投与によって、その効果が期待される癌または腫瘍として、例えば、癌腫、扁平上皮癌（例えば、子宮頸管、瞼、結膜、膣肺、口腔、、皮膚、膀胱、舌、喉頭、食道）、腺癌（例えば、前立腺、小腸、子宫内膜、子宮頸管、大腸、肺、膝、食道、直腸、子宮、胃、乳房、卵巣）が挙げられる。さらに、肉腫（例えば、筋原性肉腫）、白血病、神経腫、メラノーマ、リン/ JSも含まれる。

これら癌または腫瘍のうち、特に PD— L 1または PD— L 2を顕著に発現しているものに対してその効果が顕著である。 PD— L 1または PD— L 2の発現を、外科的に切除した癌または腫瘍塊あるいは体外に採取した病変部をサンプルとする検査により同定でき、本発明の組成物の投与は、 PD— L 1または PD— L 2を顕著に発現している腫瘍または癌を有する患者に対する外科的処置後の治療として、効率的で有効な方法となる。 PD— L 1または PD— L 2の発現の同定は、例えば、 PD— L 1抗体若しくは PD— L 2抗体を用いた免疫化学的方法、 R T— P C R法または D NATレイ法によつて検查することができる。

癌に対する化学療法および放射線療法は、リンパ球の増殖を激しく減少させるという副作用が不可避である。本発明の組成物の投与は、減少したリンパ球細胞を刺激、増殖させる効果を示すと共に、通常の化学療法に付随する激烈な副作用を最小限に抑制することができる。また、放射線療法についても同様である。また、本発明の組成物との併用によって、化学療法剤の用量または照射放射線量を通常使用される用量あるいは照射量から大幅に減少させることができる。本発明の癌治療組成物は、既存の化学療法剤と併用あるいは合剤化することができる。そのような化学療法剤として、例えば、アルキル化剤、ニトロソゥレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポィソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、ァロマターゼ阻害剤、 P糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、その他免疫療法剤またはその他の抗癌剤が挙げられる。さらに、患者の QOL回復のための癌治療捕助剤である白血球（好中球）減少症治療薬、血小板減少症治療薬、制吐剤、癌性疼痛治療薬と併用あるいは合剤化ができる。

本発明の癌治療組成物は、その他の免疫賦活物質と併用あるいは合剤化することができる。そのような免疫賦活物質としては、例えば、各種サイト力インや腫瘍抗原などが挙げられる。免疫反応を刺激するサイトカインとしては、例えば、 GM— CSF、 M-C S F、 G— C S F、インターフェロン一 α、 β、 y I L—1、 I L— 2、 I L— 3、 I L— 12などが挙げられる。また、 B 7リガンド誘導体、抗 CD 3抗体および抗 CD 28抗体、抗 CTL A— 4抗体も免疫反応を高めることができる。

癌抗原の投与も、癌細胞に対する Tリンパ球細胞の特異的免疫反応を高めることができ、本発明の癌治療組成物との併用によって、付加的あるいは相乗的な増強を与えることができる。癌抗原は、遺伝子が明らかなものについては精製タンパク質として、また不明なものについては、癌細胞自体の溶角早物として調製することができる。

そのような癌抗原として、例えば、悪性黒色腫の MAGE— 1、 MAGE - 3由来の HLA— A 1および HLA— A 2拘束べプチドゃ MART— 1、 g p 100が挙げられる。また、乳癌や卵巣癌の HER 2 /n e uペプチドや腺癌の MUC— 1ペプチド、さらに、転移性癌の NY— E SO— 1も挙げることができる。

ウィルスは、感染宿主の免疫防御から逃れるための 1つの方法として、 T リンパ球細胞の共役抑制因子を利用していると考えられている（Journal Experimental Medicine, 2000年，第 191卷，第 11号， ρ.1987〜1997) 。ウィルス感染は、このようなウィルスのエスケープ機能に一部起因しており、本発明の組成物の投与によって Tリンパ球細胞のウィルスに対する免疫反応を高めることができると考えられる。

本発明の感染症治療組成物の投与は、例えば、ヒト肝炎ウィルス（B型肝炎、 C型肝炎、 A型肝炎または E型肝炎）、ヒトレトロウイルス、ヒト免疫不全ウィルス（H I VI、 H I V2) 、ヒト T細胞白血病ウィルスまたはヒト Tリンパ向性ウィルス（HTLV1、 HTLV2) の感染治療に有効である。また、単純へルぺスウィルス 1型および 2型、ェプスタイン .バーウイルス、サイトメガロウィルス、水痘 -帯状疱疹ゥイノレス、ヒトヘルぺスウイノレス 6を含むヒトへノレぺスゥイノレス、ポリオウイルス、麻疹ウィルス、風疹ウィルス、日本脳炎ウィルス、おたふくウィルス、ィンフルェンザゥイノレスまたは風邪ウィルスとして挙げられるアデノウィルス、ェンテロウィルス若しくはライノウィルス、重症急性呼吸器症候群（SARS) を発症するウイルス、エボラウィルス、または西ナイルウィルスの感染治療にも有効であると考えられる。

その他の病原体として、例えば、病原性原生動物（例えば、トリパノソ一マ、マラリアおよびトキソプラズマ）、細菌 (例えば、マイコバクテリゥム、サルモネラおよびリステリア）または真菌（例えば、カンジダ）による感染に対しても有効であると考えられる。

本発明の感染症治療組成物は、既存の抗 HI V剤、抗ウィルス剤、抗生物質製剤、抗菌剤、内臓真菌症治療薬と併用あるいは合剤化することができる。抗 H I V剤として、例えば、逆転写酵素阻害剤（例えば、 AZT， d d I, 3 TC, d4T) 、プロテアーゼ阻害剤（例えば、メシル酸サキナビル、リトナビル、メシル酸ネルフィナビル、アンプレナビル、メシル酸デラビルジン、サキナビル、口ピナビルリトナビル）、または C C R 5受容体拮抗剤が挙げられる。抗ウィルス剤としては、例えば、抗ヘルぺスウィルス剤、抗インフルエンザウイルス剤、インターフェロン一 a;および j3、または各種免疫グロプリンが挙げられる。

本発明の感染症治療組成物は、ウィルスもしくは病原体のワクチンと併用あるいは共に製剤化することができる。そのようなワクチンとしては、例えば、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、日本脳炎ワクチン、 B C Gワクチン、 3種混合ワクチン、おたふくワクチン、水痘ワクチン、インフルエンザワクチン、 A型肝炎ワクチン、 B型肝炎ワクチン、またはコレラワクチンが挙げられる。

本発明の組成物は、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。

投与量は、本発明に用いる薬物により異なると同時に、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、経口投与の場合は、通常、成人一人あたり、 1回につき、 1 μ gから 1 0 O m gの範囲で、 1 Θ 1回力ら数回投与される。非経口投与の場合は、成人一人あたり、 1回につき、 0.1 n gから 1 O m gの範囲で、 1日 1回から数回投与され、その非経口投与形態は、好ましくは、静脈内投与であり、 1日 1時間から 2 4時間の範囲で静脈内に持続投与される。

もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。

本発明の,組成物と他の薬剤の併用剤を投与する際には、経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤および、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤、吸入斉 IJ、経鼻剤等として用いられる。

経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。また錠剤には舌下錠、口腔内貼付錠、口腔内速崩壌錠などが含まれる。

このような内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質はそのままか、または賦形剤（ラタトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解捕助剤（グルタミン酸、ァスパラギン酸等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチノレセノレロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また 2以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。

舌下錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質に賦形剤（ラタトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカ、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（デンプン、 Lーヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセノレロース、クロスカノレメロースナトリウム、繊維素グリコール酸カノレシゥム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、膨潤剤（ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カーボポーノレ、力ルボキシメチルセルロース、ポリビュルアルコール、キサンタンガム、グァ一ガム等）、膨潤補助剤（グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クェン酸塩、ケィ酸塩、グリシン、グルタミン酸、アルギニン等）安定剤、溶解補助剤（ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸、ァスパラギン酸等）、香味料（オレンジ、ストロベリー、ミント、レモン、バユラ等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また 2以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を加えることもできる。口腔内貝占付錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質に賦形剤（ラタトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカ、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセル口ース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壌剤（デンプン、 Lーヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、付着剤（ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセルロース、カーボポール、力ノレボキシメチルセルロース、ポリビュルアルコール、キサンタンガム、グァーガム等）、付着捕助剤（グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クェン酸塩、ケィ酸塩、グリシン、グルタミン酸、アルギニン等）安定剤、溶解捕助剤（ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸、ァスパラギン酸等）、香味料（オレンジ、ストロベリー、ミント、レモン、バニラ等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また 2以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を加えることもできる。口腔内速崩壊錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質をそのまま、あるいは原末もしくは造粒原末粒子に適当なコーティング剤（ェチルセルロース、ヒドキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アクリル酸メタクリル酸コポリマー等）、可塑剤（ポリエチレングリコール、クェン酸トリェチル等）を用いて被覆を施した活性物質に賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカ、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壌剤（デンプン、 L—ヒドロキシプロピルセルロース、カルポキシメチノレセノレロース、クロスカノレメロースナトリウム、繊糸隹素グリコーノレ酸力ルシゥム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、分散捕助剤（グルコース、フノレクトース、マンニトーノレ、キシリトーノレ、エリスリトーノレ、マトース、トレハロース、リン酸塩、クェン酸塩、ケィ酸塩、グリシン、グルタミン酸、アルギニン等）安定剤、溶解補助剤（ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸、ァスパラギン酸等）、香味料（ォレンジ、ストロベリー、ミント、レモン、バニラ等）等と混合され、常法に従つて製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また 2以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を加えることもできる。

経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノールまたはそれらの混液等）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。

非経口投与のための外用剤の剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾル剤、点眼剤、および点鼻剤等が含まれる。これらはひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、公知の方法または通常使用されている処方により製造される。

軟膏剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に研和、または溶融させて調製される。軟膏基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸または高級脂肪酸エステル（アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ォレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸ェステル、ハレミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、ォレイン酸エステル等）、ロウ類（ミツロウ、鯨ロウ、セレシン等）、界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル等) 、高級アルコール (セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等) 、シリコン油 (ジメチルポリシロキサン等）、炭化水素類（親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、グリコール類（エチレングリコール、ジエチレングリコーノレ、プロピレンダリコーノレ、ポリエチレングリコーノレ、マクロゴール等)、植物油（ヒマシ油、ォリーブ油、ごま油、テレビン油等）、動物油（ミンク油、卵黄油、スクヮラン、スクワレン等）、水、吸収促進斉 U、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または 2種以上を混合して用いられる。さらに、保湿剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。

ゲル剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させて調製される。ゲル基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、低級アルコール (エタノール、イソプロピルアルコール等) 、ゲル化剤 (カルボキシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピノレセノレ口ース、ェチルセルロース等）、中和剤（トリエタノールァミン、ジイソプロパノールアミン等）、界面活性剤（モノステアリン酸ポリエチレングリコール等）、ガム類、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または 2種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。

クリーム剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融または乳化させて調製される。クリーム基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸エステル、低級アルコール、炭化水素類、多価アルコール (プロピレンダリコール、 1 , 3—ブチレングリコール等) 、高級アルコール ( 2—へキシルデカノール、セタノール等) 、乳化剤 (ポリオキシェチレンアルキルエーテル類、脂肪酸エステル類等）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または 2種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。

湿布剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、練合物とし支持体上に展延塗布して製造される。湿布基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、増粘剤（ポリアクリル酸、ポリビュルピロリドン、アラビアゴム、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース等）、湿潤剤（尿素、グリセリン、プロピレングリコーノレ等）、充填剤（カオリン、酸化亜鉛、タルク、カルシウム、マグネシウム等）、水、溶解補助剤、粘着付与剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または 2種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。

貼付剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、支持体上に展延塗布して製造される。貼付剤用基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高分子基剤、油脂、高級脂肪酸、粘着付与剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または 2種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。

リニメント剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物を水、アルコール（エタノール、ポリエチレングリコール等）、高級脂肪酸、グリセリン、セッケン、乳化剤、懸濁化剤等から選ばれるもの単独または 2種以上に溶解、懸濁または乳化させて調製される。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。噴霧剤、吸入剤、およびスプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、クェン酸ナトリウムあるいはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。

非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液およぴ用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解捕助剤（グルタミン酸、ァスパラギン酸、ポリソルベート 8 0 (登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。

非経口投与のための吸入剤としては、エアロゾル剤、吸入用粉末剤又は吸入用液剤が含まれ、当該吸入用液剤は用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁させて使用する形態であってもよい。

これらの吸入剤は公知の方法に準じて製造される。

例えば、吸入用液剤の場合には、防腐剤（塩ィヒベンザルコニゥム、パラべン等）、着色剤、緩衝化剤（リン酸ナトリウム、酢酸ナトリゥム等）、等張化剤（塩化ナトリウム、濃グリセリン等）、増粘剤（カリポキシビュルポリマー等）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。

吸入用粉末剤の場合には、滑沢剤（ステアリン酸およびその塩等）、結合剤（デンプン、デキストリン等）、賦形剤（乳糖、セルロース等）、着色剤、防腐剤（塩化ベンザルコユウム、パラベン等）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。

吸入用液剤を投与する際には通常噴霧器（アトマイザ一、ネブライザ一）が使用され、吸入用粉末剤を投与する際には通常粉末薬剤用吸入投与器が使用される。

非経口投与のためその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される直腸内投与のための坐剤および膣内投与のためのペッサリー等が含まれる。

スプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、クェン酸ナトリウムあるいはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば、米国特許第 2,868,691号明細書および米国特許第 3，095，355号明細書に詳しく記載されている。図面の簡単な説明

第 1図（A) は、 H— 2 L ^d特異的 2C CTLクローンの P D— 1発現と、 P 8 1 5 (肥満細胞種由来細胞株）の P D— L 1発現安定形質転換株での P D — L 1発現を示すフローサイトメトリー、（B) は、 PD— L 1発現 P81 5細胞株に対する 2C CTL細胞株の細胞傷害活性と抗 P D— L 1抗体（anti— PD-L 1 F (a b') ₂I gG) の細胞傷害活性に対する効果を示す。

第 2図は、同系マウスにおける移植 PD— L 1発現 P 815細胞株の腫瘍増殖性と浸潤性を示す。（A) は移植 PD— L 1発現 P 815腫瘍の腫瘍容積（上）、移植後の生存率（下）であり、（B) は同系 DBA/ 2マウスにおける移植 PD— L 1発現 P 815腫瘍塊の組織染色像である（aは腹壁および腹膜への腫瘍細胞の浸潤を示す 40倍像、 bは同じく 400倍像、 cは脾臓への転移、 dは肝臓への転移を示す。）。

第 3図は、同系マウスにおける移植 PD— L 1発現 P 815細胞株の腫瘍増殖性に対する抗 P D -L 1抗体の in vivo効果を示す。 (A) は当該マウスにおける腫瘍特異的 CD 8 +T細胞からの I FN— γ産生に対する抗 PD— L 1抗体の in vivo効果、（B) は当該マウスにおける移植 PD— L 1発現 P 815腫瘍の腫瘍容積（上）と生存率（下）に対する抗 PD— L 1抗体の in vivo 効果を示す（図中、口は対照群（ラット I gG投与群）、〇は抗 PD— L 1 抗体（anti— PD— L 1 F (a b') ₂ I g G) 投与群）。

第 4図は、 PD— 1遺伝子ホモ欠損同系マウス（PD— 1 ）での PD— L 1発現 B 16メラノーマの増殖抑制を示す。

第 5図は、同系マウス（BALBZc) における移植ミエローマ細胞株の腫瘍増殖性に対する抗 P D— L 1抗体の in vivo効果と P D _ 1の関与を示す。

(A) は各種ミエローマ細胞株での PD— L 1発現を示すフローサイトメトリー、（B) は前記マウスにおける移植 J 558 L腫瘍の腫瘍容積に対する抗 P D— L 1抗体の in vivo効果、（ C ) は野生型および P D— 1遺伝子欠損 PD— 1 の同系マウスにおける移植 J 558 L腫瘍の腫瘍増殖の比較を示す。 ,

第 6図は、血管内皮での PD— L 1発現を示す。（A) はマウス心臓の血管内皮細胞での PD— L 1， PD— L 2の発現を示す。（B) はマウス各組織での P D— L 1発現の確認を組織染色を示す。（ a ) ：眼球、（ b ) ：顎下腺、（c) ：心臓、（d) ：肺、（e) ：肝臓、 (f ) ：腎臓での PD— L 1の発現を示す。図中、 Chは脈絡膜、 CVは中心静脈、 G 1は糸球体、 Reは網膜を示す。各矢印は、血管内皮細胞を示す。各染色像は 40倍拡大像である。

第 7図は、肝臓非実質細胞での PD— L 1発現を示す。（A) はマウス肝臓での I CAM— 1、 (B) は PD— L 1の発現を示す（CV：中心静脈）。第 8図は、タップファ一細胞（Kupffer Cell) およぴ肝臓類洞周囲腔内皮細胞（LSEC) での細胞表面分子のフヱノタイプを示す。

第 9図は、 PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1 ）あるいは野生型マウス（wt) の CD 4陽 I"生 T細胞での細胞表面分子のフエノタイプを示す。第 10図は、 PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1— ）あるいは野生型マウス（wt)の CD 8陽性 T細胞での細胞表面分子のフエノタイプを示す。第 1 1図は、 T細胞増殖に対する LNPCの PD— L 1の効果を示す。 (A)は PD— 1— マウスおよび w tマウスのそれぞれのナイーブ T細胞刺激時の細胞増殖を示す。 (B)は PD— 1— ^Λマウスおよび w tマウス由来で既に活性化された T細胞と L N P Cとの共培養における細胞増殖に対する抗 P D — L 1抗体の効果を示す。

第 12図は、サイト力イン産生に対する LNPCの PD—L 1の効果を示す。 (A)は PD— l —マウスおょぴ w tマウスのそれぞれのナイーブ T細胞刺激時のサイトカイン産生を示す。 (B) は、 P D— 1—トマウスおょぴ w tマウス由来で既に活性化された T細胞と LNPCとの共培養におけるサイトカイン産生に対する抗 PD— L 1抗体の効果を示す。（C) は LNPCとの共培養における P D— 1 マウスおよび w tマウスからの活性化 T細胞の細胞分裂を示す。第 13図は、ウィルス感染したマウス肝臓における Tリンパ球細胞の増殖に対する PD— 1の関与を示す。（A)はアデノウイルス感染後 0日目、（B) は同 7日目での P D— 1 マウスおょぴ w tマウスの肝臓および脾臓での C D 19陽性および C D 3陽性リンパ球細胞の増殖を示す。

第 14図は、ウィルス感染したマウス肝臓における Tリンパ球細胞の増殖に対する PD— 1の関与を示す。（A) はアデノウイルス感染後 7日目での PD— 1— マウスおょぴ w tマウスの肝臓での CD4陽性および CD8陽性リンパ球細胞の増殖を示す。（B) は、感染後 7日目での各種増殖性リンパ球の割合を示す。

第 15図は、ウィルス感染に対する PD— 1の関与を示す。図中（a) 〜 (d) は、アデノウィルス感染後 0日おょぴ 7日目での PD— I マウスおよぴ w tマウスの肝臓でのそれぞれの細胞増殖を示す組織染色像である。（ e )、

(f ) はアデノウィルス感染後 7日目での PD— 1— ^Λマウスでの CD4陽性、 CD 8陽性 T細胞の細胞増殖を示す。

第 16図は、ウィルス感染に対する PD— 1の関与を示す。図中（g) 〜 (n) は、アデノウィルス感染後 0日および 7日目での PD— 1— ^Λマウスおよぴ w tマウスの肝臓のへマトキシリン &ェォジン組織染色像である。図中 (o) 〜（r) は、アデノウイルス感染後 0日および 7日目での PD— 1一マウスおよび w tマウスの肝臓の X— Ga 1染色像である。

第 1 7図は、細胞傷害活性に対する各物質の増強作用を示す。図中（a) 抗マウス PD— 1抗体の増強作用、（b) 抗マウス PD— L 1抗体の増強作用、（c) マウス PD_ 1 F cの増強作用（d) ヒト PD— l F cの増強作用を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げて本発明を、より具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。実施例 1

マウス PD— L 1発現べクターの作製は、マウス PD-LlcDNA (Journal of Experimental Medicine, 2000年，第 19巻，第 7号， ρ.1027〜1034) を制限酵素 EcoRIで消化して、発現ベクター pApuroXS (The EMBO Journal, 1994年，第 13巻，第 6号， ρ.1341〜1349) に揷入し、連結させることによって行った。作製した発現ベクター pApuroXS-PD-Llの P 815細胞への導入は、エレクト口ポーレーシヨン法（360 V、 500 F) で行った。 Ρ 81 5細胞の培養は、 FCS (10%) 、 2—メルカプトエタノール（10^_5Μ) 、各種抗生物質含 RPMI-1640培地で培養できるが、さらに、抗生物質ピュー口マイシン（Puromycin; 3 μ g/m 1 ) を含んだ培地の培養に対して耐性の同細胞株を継代培養することによって、マウス PD— L 1を安定的に発現する形質転換 P 815細胞株を取得した。 PD— L 1の発現は、フローサイトメトリー解析にて確認した。第 1図（A) に H— 2L^d特異的 2CCTLクローンの PD 一 1発現（i) と、 P815 (肥満細胞種由来細胞株）の P D— L 1発現安定形質転換株での PD— L 1発現（ii) を示すフローサイトメトリーを示す。同様の方法で、 PD— L 1を安定的に発現する形質転換 B 16細胞株（B 16/PD-L 1) を取得した（第 1図（A) (iii) 〜（V) 参照）。ここでは発現べクターとして同様の方法で作製した pEFBOSneo-PD-Ll (Nucleic Acid Research, 1990年，第 18卷，第 17号， p.5322) を用い、細胞株の選択培養には G 418 (0.5m g /m 1 ) を使用した。

全長マウス PD-LlcDNAの 3'末端側に 6個のヒスチジンがタンデムに並んだぺプチドタグ（His-Tag) を連結させたタンパク質をコードする c D N Aを制限酵素 EcoRIおよび Notlで消化して、発現ベクター pVL1393 (商品名： Clontechより購入）に挿入させた。続いて、この発現ベクターを S F 9昆虫細胞（Invitrogenより購入）に導入して、封入体を回収した。この封入体ウィルスを HiFive昆虫細胞（Invitrogenより購入）に 2日間、 27 °C下で培養することによつて感染させた。溶解緩衝液 (Tris-H C 1 (50 mM, pH7, 含 1 % TritonX-100) 、 EDTA (10 mM) 、 Na C 1 (1 50 mM) 、各種プロテアーゼ阻害剤）で溶解させた細胞溶解液を、 N i—セファロースカラムク口マトグラフィ一で処理することによって、抗原となる精製 PD— L 1タンパク質を取得した。

透析した同 PD— L 1タンパク質を完全フロイントアジュパンドと共に 8 週令メス Whisterラット（SLC Japanより購入）に免疫して、数日後、末梢リンパ節から回収した 2 X 10⁸細胞を、 PEG1500 (Amersham より購入）を用いて同数の S P 2ノ0細胞と細胞融合させた。さらに、 RPMI1640培地（HA T (Sigmaより購入）、 Origen ( 10 %, Igenより購入）、 F C S (10%) 、 2—メルカプトエタノール（10—⁵M) 、各種抗生物質）で培養することによって選択し、産生抗体の存在をフローサイトメトリー解析にて確認した。これによつて樹立されたハイブリドーマ（国際受託番号： FERMBP-8396で認識されるハイブリドーマ）を Balb/Cnu/nuマウスに移入して、後に腹水からの回収液をプロテイン Gセファロースカラムクロマトグラフィーで精製することによって、 PD— L 1に対するモノクローナル抗体（1— 1 1 1) を取得した。フローサイトメトリー等で使用される抗体は、 Sulfo-NHS-LC-biotin (商品名： Pierceより購入）を用いてピオチン化したものを用いた。

また、同様の方法に従い、抗ヒト PD— 1抗体（国際受託番号： FERM BP-8392で認識されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体）を作製した。

細胞傷害性アツセィは、 ⁵¹C r (クロム）遊離アツセィによって行った。 2 C細胞（Journal of Immunology, 1996年，第 157卷，第 2号， p.670〜678) は、 2 Cトランスジエニック B 6マウス由来の（H— 2L) ^dァロ反応性の細胞傷害性 T細胞である。第 1図（Β) に、 2C細胞（Ε ：エフェクター）を⁵ ^XC rラベルイ匕した P 815細胞（T：ターゲット）と共に（〇）または 3つの PD— L 1発現 P 8 15細胞株 (P 81 5/PD— L 1) (□、 ◊、 △) と共にあるいはさらに 10 m g /m 1ラット anti-PD-LlF(ab')₂IgG存在下（▲) を、さまざまな E/T比で混合して、 4時間で遊離される⁵¹ C rを測定した結果を示す。

抗 PD— L 1抗体（anti-PD-LlF(ab')₂) は、細胞傷害性 Tリンパ球細胞の低下した細胞傷害活性を回復させた。これらの結果から、 PD— L 1の機能を阻害することによる PD— 1および PD— L 1シグナノレの阻害は、癌細胞に対する細胞傷害活性を増強させることができると考えられる。実施例 2

1 X 10⁶細胞の P815細胞（n = 6) または P815/PD-L 1細胞 (n = 6) を同系 DBA, 2マウスの皮下にそれぞれ移入し、腫瘍増殖とマウスの生存率を評価した。その結果を第 2図（A) に示す。図中、〇は P 8 1 5細胞株移植群、口、 △は PD— L 1発現 P 815細胞株移植群である。さらに P 81 5 / P D— L 1細胞を移入した群の組織学的解析を行つた。移入 20日後のマウスの腹壁ならぴに腹膜腔の組織切片を、 10%ホルムアルデヒドで固定、パラフィンで砲架して、へマトキシリン、ェォジンで染色して得られた染色像を第 2図（B) に示す。図中、 aは腹壁および腹膜への腫瘍細胞の浸潤を示す 40倍像、 bは同じく 400倍像であり、 cは脾臓への転移、 dは肝臓への転移を示す。

P 815細胞を移植した群では、 P 81 5細胞の増殖は抑えられており、 6〜 7週目では 30%が生存したのに対して、 PD— L 1を発現する P 81 5細胞（P 8 15/PD— L 1) を移植した群では、癌細胞の増殖は著しく、 2〜4週目までに全例が死亡した（第 2図（A) ) 。 P 81 5/PD— L 1 は、腹膜腔、さらに、腹腔へ浸潤しており、また、肝および脾臓への転移が認められた（第 2図（B) a〜d参照）。実施例 3

P 815細胞を移入し免疫したマウスから細胞傷害性 T細胞 CTLを調整し、 2 X 10⁶個数の CTL細胞と、 5 X 10⁶個数の P 815細胞または P 815/PD-L 1細胞のみ、あるいは anti-PD-LlF(ab')₂IgG (1 Omg/m 1 ) 存在下で P815ノ PD— L 1細胞をそれぞれ混合培養し、 24時間後の培養上清中の I F N— Vを E L I S Aキット（Bioscienceから購入）で測定した。その結果を第 3図（A) に示す。

また、第 3図（B) に、 3X 10⁶個数の P 815/PD-L 1細胞を皮下移入した同系 DBA/2マウス（n=10) に、ラット I gG (□) あるいは anti-PD-LlF(ab')₂IgG (0.1m gZ—匹）（〇）を、細胞移入後 1、 3、 5、 7日後にそれぞれ腹腔内投与し、腫瘍増殖とマウスの生存率を評価した結果を示す。

抗 PD— L 1抗体は、 P 815/PD-L 1により抑制された細胞傷害性 Tリンパ球細胞からの I FN— γ産生を回復させた（第 3図（Α) ) 。抗 Ρ D— L 1抗体の投与は、癌細胞増殖を抑制し、明確な生存効果を示した（第 3図（Β) ) 。この結果は、抗 PD— L 1抗体の投与が癌治療に有効であることを示している。実施例 4

1 X 10⁶個数の Β 16メラノーマ（η = 6) または Β 16 ΖΡ D— L 1細胞（η = 6) を Β 6マウスにはぞれぞれ皮下移入し、同数の B 16ZPD— L 1細胞を PD— 1 トランスジエニック Β 6マウス（η = 5) および PD— 1遺伝子ホモ欠損 B 6マウス（PD— 1— (n = 4) ) (Science, 2001 年， 291卷， 5502号， p.319〜332) に移入し、以後 25日までそれぞれの腫瘍増殖を測定した。その結果を第 4図に示す。実施例 5

2.5 X 10⁸個数の J 558 Lミエローマ細胞を皮下移入した同系 B a 1 b ZCマウス（n=9) に、ラット I gGあるいは anti-PD-LlF(ab')₂IgG (0.1m gノー匹）を細胞移入後 3、 5、 7日後にそれぞれ腹腔内投与し、腫瘍増殖を評価した（第 5図（B) ) 。また、同様に J 558 Lミエローマ細胞を皮下移入した PD— 1ホモ欠損マウスと B a 1 bZC (n = 4) での腫瘍増殖を比較した（第 5図（C) ) 。

抗 PD— L 1抗体の投与は、 PD— L 1を発現している J 558癌細胞（第 5図（A) に各種ミエローマ細胞株での PD— L 1発現を示すフローサイトメトリーを示す。 ) の増殖を抑制した（第 5図（B) ) 。また、 J 558細胞を移植した P D— 1欠損マウスでは移植癌細胞の増殖は完全に阻害された (第 5図（C) ) 。これらの結果は、 PD— L 1もしくは PD— 1の阻害が癌治療に有効であることを示している。実施例 6

血管内皮細胞（以下、 EC sと略す。）をマレリーパーグの方法（Journal Immunology Methods, 2000年，第 244卷，第 1-2号， p.205〜215) により、マウス心臓から取得した。具体的には、心臓組織をコラゲナーゼで消化した後、マウス I gとともに前培養、さらに、 F I TC修飾した抗 CD31抗体、同修飾抗 CD 105抗体、同修飾抗 isolectinB4抗体、および、抗 F I TCビーズを添加して培養した。この血管内皮細胞を Magnetic-activated cell-sorting separation columns (商品名： Miltenyi Biotecより購入）を用いて、ポジティブ選択によって精製した。取得した血管内皮細胞での PD— L 1、 PD— L 2の発現を、フローサイトメトリーで確認した。同細胞の標識には、抗 PD— L 1抗体（抗体名： 1. -11 1) 、抗 PD— L 2抗体（抗体名： # 122) および蛍光標識した 2 次抗体を用いて行った（第 6図（A))。解析は CellQuestソフトウエア（Dickinson より購入）を使用した Facscalibur (機器名： Becton Dickinsonより購入）で、 1万回イベントで解析した。 PD— L 1あるいは PD— L 2の発現は、開口曲線で示され、コント口ール I gは充填曲線で示される。

マウス各組織での P D— L 1発現の確認を組織染色によつて行つた。各組織サンプリング 1時間前に 100 μ gピオチン標識化抗 P D -L 1抗体（ 1 -11 1) を溶解した 100 μ 1 PB Sをマウスに静脈投与した。続いて、 5 m凍結切片を 4 %パラホルムアルデヒド（P FA) で固定して、 Streptavidin-FITCで染色した。さらに、各切片を Phalloidinで対比染色した（第 6図（B) 、 (a) 眼球、（b) 顎下腺、（c) 心臓、（d) 肺、（e) 肝臓、（f ) 腎臓での PD— L 1の発現を示す。図中、 Chは脈絡膜、 CVは中心静脈、 G 1は糸球体、 R eは網膜を示す。各矢印は、血管内皮細胞を示す。各染色像は 40倍拡大像である。）。 PD— L 1は、心臓、肺、腎臓、胃、小腸、顎下腺、眼球、肝臓の血管内皮で認められた。肝臓での発現は、肝臓洞様毛細血管に局在していた。実施例 7

肝臓非実質細胞（以下、 LNPC sと略記する。）での PD— L 1発現を組織染色（第 7図（A) ) ならびにフローサイトメトリー（第 7図（B) ) で確認した。組織染色は、 3 % P F Aで固定した 5 μ m肝臓凍結切片をラット血清で前処理し、ビォチン標識化抗 PD— L 1抗体（1— 1 1 1) あるいはビォチン標識化抗 I C AM— 1抗体（商品名： BD Pharmingenより購入）にて 1時間、室温下で抗体反応を行ない、ピオチン抗体を tyramide signal amplification (TSA) fluorescence system (機器名： PerkinElmer Life Sciences より購入）にて視覚化した（第 7図（A) ： I CAM— 1の発現、同図（B) ： PD-L 1の発現、 C V：中心静脈を示す。各染色像は 40倍拡大像である。 )。

L N P C sは、 pronaseE法（Experimental Cell Research, 1976年，第 99卷， p.444〜449) によってマウス肝臓より単離した。具体的には、 LNPC sは、肝臓を pronaseE溶液 (Merck) にて還流、培養し、密度勾配遠心法にて分離した。その細胞懸濁液中のクップファー細胞（Kupffer Cells) ( C D 54 +、 C D 1 1 b^hish) の相対的分布は 20〜 25 %であり、肝臓類洞周囲腔内皮細胞 (以下、 LSEC sと略記する。）（CD54+、 CD 1 1 b^high) は、 75 〜 80%である。

クップファー細胞と L S EC sを、 F I TC標識化抗 CD 1 1 b抗体およぴ I CAM— 1、 PD— L l、 B 7— 1、 B 7— 2に対するそれぞれのビォチン化モノクローナル抗体、それに続く P E標識化 Streptavidinにて、それぞれ二重染色した。タップファ一細胞と L S E C sは、それぞれ C D 1 1 b^high と CD 11 b^li)W細胞としてゲートされる（第 8図）。

PD— L 1は、クップファー細胞では、 I CAM— 1、 B 7— 1、 B 7- 2を共発現しているが、 LS EC sではその発現は弱いものであった（第 8 図）。実施例 8

PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1— ^Λ ) あるいは野生型 C 57 B L/ 6マウス（w の脾臓ならぴにリンパ組織から、 T-cell enrichment column (商品名： Genzyme より購入）を用いたネガティブ選別によって、ナイーブ T細胞（精製度 90%以上）を精製した。同細胞を10 ^ _§/1!11抗〇03モノクローナル抗体（2C 11) とともに 48時間培養して活性化させた。

上記方法によって活性ィヒしたナイーブ T細胞を、 F I TC標識化抗 CD4 抗体あるいは APC標識化抗 CD 8抗体ならびに PE標識化抗 CD 25抗体、 PE標識化抗 CD 44抗体、 PE標識化抗 CD 69抗体、 PE標識化抗 CT L A— 4抗体、ビォチン標識化抗 B 7— 1 (CD 80) 抗体、ビォチン標識化抗 B 7— 2 (CD86) 抗体、抗 PD— 1抗体（抗体名： J 43、国際受託番号 FERM BP-8118で認識されるハイブリドーマから産生されるモノクロ —ナル抗体）、抗 PD— L 1抗体（1— 1 1 1) で二重染色して、フローサィトメトリーにてそれぞれの分子の発現を解析した（第 9図、第 10図）。なお、国際受託番号 FERM BP-8118で識別されるハイプリドーマは、 2001 年 5月 30 日付で日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) 、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERMP-18356で寄託され、 2002年 7月 16日付で国際寄託に移管されている。実施例 9

PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1 ）あるいは野生型マウス（w t) のナイーブ T細胞の活性化は、上記実施例 8に記載の方法で行った。活性化後の同細胞の増殖を B r dU取りこみ法によって測定した（第 1 1図（A))。 B r d Uを 4 8時間の最後の 6時間に添加して細胞を標識し、これを Proliferation ELISA kit (商品名： Rocheより購入）を用いる測定によって細胞増殖を決定した。また、この時の I FN— γ産生量を ELISA Kit (商品名： Genzymeより購入）にて測定した（第 12図（A) ) 。

PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1 ）あるいは野生型マウス（w t) 由来の T細胞を上記実施例 8で記載の方法であらかじめ活性化させた。続いて、既に活性化している T細胞に対して、野生型マウスからのマイトマイシン C処理 LNPC sの存在あるいは非存在下で、さらに、 30 /z g/m l抗 PD-L 1抗体（1一 1 1 1) (コントロールとしたラット I g G) 、 20 μ g /m 1 CTLA4-Ig (Genzyme) (コント口ールとしたヒト I g G) の存在あるいは非存在下でそれぞれ 60時間培養して、最後の 12時間の同細胞の増殖を B r dU取りこみ法によって測定した（第 1 1図（B) ) 。また、 4 8時間時点での I FN— y産生量も測定した（第 12図（B) ) 。

ナイーブ T細胞の活性ィヒ時における I F N— γ産生量は、 P D _ 1— と野生型マウスの違いによる有意な差異は認められなかった。一方、既に活性ィ匕された Τ細胞においては、野生型マウス由来の Τ細胞の I FN— γ産生量は、 PD— 1 由来のものに比べ有意に低かった（第 12図）。このことから、既に活性ィ匕している Τ細胞に対する PD— 1の抑制作用の効果は、ナイーブ Τ 細胞の活性化に対する効果よりも高いことが示唆された。

野生型マウス由来の活性化した Τ細胞は、 LNPC sとの共培養では、 Τ 細胞の細胞増殖おょぴ I FN— γ産生量に有意な変化は認められないが、 Ρ D— 1— ^Λ由来の活性ィ匕した Τ細胞は、 LNPC sとの共培養によって、その細胞増殖に有意な増加が認められた（第 1 1図（Β) 、第 1 2図（Β) ) 。また、野生型マウス由来の活性化した Τ細胞と LNPC sとの共培養への抗 P D— L 1抗体の添加によって、 T細胞の細胞増殖の増加が認められた（第 1 1図（B) ) 。これらの結果は、 LNPC sの PD— 1あるいは PD— L 1 力活 1"生化 T細胞の抑制に関与しており、 PD— 1の欠如あるいは PD— 1 と P D— L 1間の相互作用の阻害が、 T細胞を活性化することを示すものである。

PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1— ^/_ )あるいは野生型マウス（w t) の活性化 T細胞を、 5 CFSE (5-(6)-carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl diester) (商品名： Molecular probesより購入）で標識して、 LNPC sとともに 48時間共培養した。この時の細胞分裂を、 FACSを用いた CFSE活性測定によって決定した（第 12図（C) ) 。

活性化 T細胞の細胞増殖抑制は、細胞分裂の停止に起因しており、 PD— 1シグナルが T細胞の細胞分裂を抑制することが示唆された（第 12図（C) )。実施例 10

PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1— ）あるいは野生型マウス（w t) ( 3匹 Z群）に 10⁹-10¹⁽⁾PFU (plaque-forming units) Ad-lacZを静脈内投与して、マゥスをアデノウィルスに感染させた。ここで使用した Ad-lacZは、 E 1およぴ E 3領域に欠損を有し、さらに、 1 a c Z遺伝子を持った 5型アデノウィルスであり、 293細胞で増殖させた後、塩化セシウム密度勾配遠心分離 (Nucleic Acid Research, 1995年，第 234卷，第 19号， p.3816〜3821) の記載によって精製したものである。

感染後 0日日あるいは 7日目に、同マウスに対して屠殺 1時間前に 0.5m g B r dU (商品名： Sigmaより購入）を静脈内投与して、採取した脾臓細胞および月干臓内リンパ球を抗 B r dU抗体および抗 CD 1 9抗体あるいは抗 CD 3抗体で二重標識した（第 13図）。

さらに、感染後 7日目の同細胞に対しては、抗 B r dU抗体、抗 CD 1 9 抗体、抗 C D 3抗体、抗 C D 4抗体、抗 C D 8抗体で二重標識した（第 14 図（B) 、それぞれの棒グラフは B r dU陽性細胞の割合を示す。 ) 。

アデノウィルス感染した PD— マウスの肝臓では、同様に感染した野生型マウスの月干臓に比較して、増殖'性（B r dl^ ) の各リンパ球（CD 1 9陽性、 CD 3陽性、 CD 4陽性、 CD 8陽性）の割合が増加していた。一方、このような現象が脾臓では認められなかったことから、 PD— 1は、炎症を起した組織での T細胞の増殖を阻害することが示唆された（第 14図 (B) ) 。実施例 1 1

PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1 )あるいは野生型マウス（w t) ( 3匹/群）に 10⁹-10^1C)PFU Ad-lacZを静脈内投与して、マウスをアデノウイルスに感染させ、さらに、感染後 0日目あるいは 7日目の屠殺 1時間前に 0.5 mg B r dU (商品名： Sigmaより購入）を静脈内投与して、採取した肝臓切片を抗 B r dU抗体で標識した（第 15図（a) 〜（d) ) 、 20倍拡大像）。感染後 7日目の PD—1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— 1— ）の肝臓切片に対しては、抗 B r dU抗体おょぴ抗 CD 4抗体あるいは抗 CD 8抗体で二重標識した（第 15図（e) 、 (f ) 、 40倍拡大像）。

感染後 30日目の野生型マウスの肝臓では、洞様毛細血管および非実質領域への中程度の局所的な細胞浸潤が認められたが、 PD— 1— マウスでは、肝炎を示す症状は認められなかった（第 16図（h) 、 ( i) および（j ) 、 (n) ) 。

感染後 7日目あるいは 30日目の PD— 1遺伝子ホモ欠損マウス（PD— I ) あるいは野生型マウス（wt) の肝臓切片に対して、へマトキシリン & ェォジン染色（第 16図（g) 〜（j ) , 20倍拡大像、（k) 〜 (n) ， 40倍拡大像）および X— Ga 1染色を行った（第 16図（o) 〜（r) , 40倍拡大像）。

感染後 7日目おょぴ 30日目の野生型マウ^の肝臓では、 X— Ga 1染色像が示すアデノウイルスの感染が認められたが、 PD— 1— マウスでは、その感染は、 30日目にはほぼ排除されていた（第 16図（o) 、（p) および (q) 、（r) ) 。これらの結果から、 PD— 1シグナルが、ウィルス感染による炎症組織におけるエフヱクター T細胞の細胞増殖を誘導することによるウィルスの排除に関与することが示された。実施例 12

マウス PD— L 1を強制発現させた P— 81 5/PD— L 1細胞は、 5 g/mL puromycin (Sigmaより購入）を含む通常培地（以下、選択培地と略す。）を用いて、培養フラスコに播種し、 3 7°C、 5%CO₂Z9 5%airの条件で 5 0 %〜 9 0 %コンフルェントになるまで培養した。マウス cytotoxic T lymphocyte 2C細胞は、 MMC (Mitomycin C) 処理した P— 8 1 5細胞おょぴ C o n A刺激ラット脾細胞培養上清とともに通常培地中で数日継代培養した。回収した P— 8 1 5/PD-L 1細胞に DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents (PerkinElmerより購入）の BATDA Reagentを加え、 1 5分間培養した。さらに、 P B Sで洗浄した。 2 C細胞は、 P— 8 1 5細胞を加えて継代した 5〜8日目の,細 J3包を用いた。

被検物質である抗マウス PD— 1抗体 (第 1 7図中、 anti-mPD-lAb( J 4 3))、抗マウス PD— L 1抗体（同図中、 anti-mPD-LlAb (1— 1 1 1) ) 、マウス PD- 1 F c (同図中、 mPD— l F c) 、ヒト PD— l F c (同図中、 h PD- 1 F c) 、マウス I g G 2 a κ (同図中、 Controllg) または P B Sを 9 6 well plateに 20 L ( 1 0 n g L) ずつ分注し、 P— 8 1 5/PD— L 1細胞または通常培地を 5 0 Lずつ加えた。さらに 2 C細胞、通常培地または 1 %TritonX100を含む通常培地を 5 0 μ Lずつ加えた。通常培地を添加したゥエルの上清 5 0 μ Lをバックグラウンド用として回収し、その他の上清を回収するまで、 3 7 °Cで保存した。残りの細胞は 4時間培養した。続いて、同 9 6wellplateを遠心し、上清を回収した。回収した上清に Cytotoxicity Reagents (PerkinElmerより購入）の DELFIA Europium Solutionを 20 0 μ L添加して 1 5分間振とうした。振とう後、 ARVOsx マルチラベルカウンター (WALLAC) にて時間分解蛍光測定を行った。なお、 l %TritonX100 を含む通常培地を添加したゥエルの上清を高コントロール、通常培地を添加したゥエルの上清を低コントロールとした。

評価群の組成は、被検物質、 P— 8 1 5ZPD— L 1細胞及び 2 C細胞、高コントロール群の組成は、 PB S、 P- 8 1 5/PD-L 1細胞および 1 % TritonXlOOを含む通常培地、低コントロール群の組成は、 P B S、 P— 8 1 5 /PD-L 1細胞およぴ通常培地、 2 C細胞コント口ール群の組成は、 P B S、通常培地および 2 C細胞、パックグラウンド群の組成は、 PBS、 P- 815/PD— L 1細胞及び通常培地である。 CTL活性（％) は、以下の式にて算出した。すべての値は、バックグランドで得た平均値を引いたものを使用した。

CTL活性 (％) = ([評価群測定値]— [2C細胞コントロール群測定値]— [低コント口ール群測定値]) ÷ ([高コントロール群測定値]— [低コントロール群測定値]) X 100 抗 PD—1抗体、抗 PD— L 1抗体および PD— 1 F cは、 CTL活性を有意に増強した（第 17図（a) 〜（d) 、図中、 E： Tmtioは、 2C細胞と PD— L1/P815細胞の混合比を示す。 ) 。実施例 13

B 16メラノーマ細胞を脾臓に移入した C 57BLZ6マウスに、抗マウス PD—1モノクローナル抗体を 2日おきに腹腔内に投与して、移入後 18 日目の肝臓重量を測定することによって、癌転移に対する抗 PD— 1抗体の抑制効果を評価した。

コントロール I g Gのみを投与したコントロール群に比べ、抗 PD— 1抗体投与群では、肝臓重量増加が有意に抑制された（肝臓重量/癌細胞非移入群： 1.3g、コントロール群： 6.8gから抗 PD— 1抗体投与群： 3.5gへ減少）。この重量増加の抑制は、 B 16メラノ一マ細胞の転移を抑制することを示すものである。

Claims

請求の範囲

1. PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる免疫賦活組成物。

2. PD— 1、 PD— L 1、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる癌治療組成物。

3. 癌転移を抑制する糸且成物である請求の範囲 2記載の癌治療組成物。

4. PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる感染症治療糸且成物。

5. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする請求の範囲 2または 3記載の癌治療,祖成物。

6. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする請求の範囲 4記載の感染症治療組成物。

7. PD— 1と PD— L 1若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用阻害物質、 PD— 1の細胞内シグナル阻害物質、および PD— 1、 PD— L 1若しくは PD— L 2の産生阻害物質から選択される一以上の免疫抑制シグナル阻害物質である請求の範囲 1乃至 6のいずれかに記載の組成物。

8. PD— 1抗体、 PD— L 1抗体、可溶ィ匕 PD— 1、および可溶化 PD — L 1から選択される一以上の PD— 1と PD— L 1の相互作用阻害物質である請求の範囲 7記載の組成物。

9. 国際受託番号 FERM BP-8392で識別されるハイプリドーマが産生する抗ヒト PD— 1抗体、非ヒト抗体をヒト化させた抗 PD— 1抗体、およぴ完全ヒト型抗ヒト PD— 1抗体から選択される PD— 1抗体である請求の範囲 8記載の組成物。

10. 遺伝子改変により PD— 1発現が阻害されたリンパ球細胞が、免疫抑制シグナル阻害物質である請求の範囲 1乃至 6のいずれかに記載の組成物。

1 1. PD— 1と PD— L 1若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用阻害物質、 PD— 1の細胞内シグナル阻害物質、または PD— 1、 PD-L 1 若しくは PD— L 2の産生阻害物質が、タンパク質、ポリペプチド若しくはぺプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれらの誘導体、有機合成化合物、無機化合物、および天然物から選択される一以上の物質である請求の範囲 7記載の組成物。

1 2. PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる免疫賦活方法。

13. PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる癌治療方法。

14. 癌転移を抑制する請求の範囲 13記載の癌治療方法。

5. PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる感染症治療方法。

16. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする請求の範囲 13または 14記載の癌治療方法。

1 7. 免疫賦活を介して作用することを特徴とする請求の範囲 1 5記載の感染症治療方法。

18. PD— 1と PD— L 1若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用阻害物質、 PD— 1の細胞内シグナル阻害物質、および PD— 1、 PD-L 1 若しくは PD— L 2の産生阻害物質から選択される一以上の免疫抑制シグナル阻害物質である請求の範囲 12乃至 17のいずれかに記載の方法。

19. PD— 1抗体、 PD— L 1抗体、可溶ィ匕 PD— 1、および可溶化 P D-L 1から選択される一以上の PD— 1と PD— L 1の相互作用阻害物質である請求の範囲 18記載の方法。

20. 国際受託番号 FERM BP-8392で識別されるハイプリドーマが産生する抗ヒト PD— 1抗体、非ヒト抗体をヒト化させた PD— 1抗体、および完全ヒト型抗ヒト PD— 1抗体から選択される PD— 1抗体である請求の範囲 19記載の方法。

21. 遺伝子改変により PD— 1発現が阻害されたリンパ球細胞が、免疫抑制シグナル阻害物質である請求の範囲 12乃至 1 7のいずれかに記載の方法。

22. PD— 1と PD— L I若しくは PD— 1と PD— L 2の相互作用阻害物質、 P D— 1の細胞内シグナル阻害物質、または PD— 1、 PD-L 1 若しくは PD— L 2の産生阻害物質が、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれらの誘導体、有機合成化合物、無機化合物、および天然物から選択される 1 つ以上の物質である請求の範囲 18記載の方法。

23. 免疫賦活組成物を製造するための PD— 1、 PD-L 1, または PD 一 L 2の免疫抑制シグナル阻害物質の使用。

24. 癌治療組成物を製造するための PD— 1、 PD— L l、または PD— L 2の免疫抑制シグナル阻害物質の使用。

25. 癌治療組成物が、癌転移抑制組成物である請求の範囲 24記載の物質の使用。

26. 感染症治療組成物を製造するための PD— 1、 PD— L 1、または P D-L 2の免疫抑制シグナル阻害物質の使用。

27. PD— L 1または PD— L 2を発現するように形質転換されたスクリーユング用癌細胞株。

28. 請求の範囲 27記載の細胞、リンパ球細胞およぴ被験物質を接触させて、請求の範囲 27記載の細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用を評価することを特徴とする免疫賦活物質のスクリーニング方法。

2 9 . 癌細胞である請求の範囲 2 7記載の細胞、リンパ球細胞および被験物質を接触させて、その癌細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用またはその腫瘍細胞の増殖に対する阻害作用を評価することを特徴とする癌治療物質のスクリーニング方法。

3 0 . 病原体を感染させた請求の範囲 2 7記載の細胞または P D— L 1若しくは P D— L 2を発現する細胞、リンパ球細胞およぴ被験物質を接触させて、その感染細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用または病原体増殖に対する阻害作用を評価することを特徴とする感染症治療物質のスクリーニング方法。

3 1 . 請求の範囲 2 7記載の癌細胞株を移植して作出した哺乳動物。

3 2 . 請求の範囲 3 1記載の哺乳動物に被験物質を投与し、被験物質による移植癌細胞の増殖に対する抑制率またはその被移植哺乳動物の生存率を評価することを特徴とする癌治療物質の選別方法。