明細書 Specification
抗体組成物を含有する医薬 Drug containing antibody composition
技術分野 Technical field
本発明は抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 N—グリコシド結合複合型糖鎖のう ち、糖鎖還元末端の N—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50% 以上である抗体組成物と、 少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬に関する。 The present invention relates to a total N-glycoside-linked complex type sugar chain that binds to the Fc region contained in the antibody composition, of the sugar chain in which fucose is not bound to N-acetyltylcolasamine at the reducing end of the sugar chain. antibody composition ratio is 50% or more, relates to a pharmaceutical comprising a combination of at least one agent.
背景技術 Background art
抗体依存性細胞障害活性(以下、 ADCC活性と略記する)は、 NK細胞、単球'マクロファージ、 顆粒球など、 ェフエクタ一細胞と呼ばれる細胞集団に発現する Fc γ受容体に、 抗体の Fc領域 が結合することにより起こる。 NK細胞は細胞上の Fe y受容体の一種 Fc y RIIIaを介して強い A DCC活性を誘導する。 Fc y RIIIa遺伝子は 158番目のアミノ酸に機能的な遺伝子多型が存在し、 158番目のアミノ酸が Valine (以下 Valと称する) の Fc γ Rlllaは Phenylalanine (以下 Phe と称する) の Fc y RIIIaよりも強い ADCC活性を誘導する [ジャーナル'ォブ 'クリニカル'ィ ンべスティゲーシヨン . Clin. Invest. ) , 100, 1059-1070 (1997) ]。近年 Val/Valの遺伝子 型を有する患者において、 その他の遺伝子型の患者よりも Rituxanの臨床効果が有意に高いご とが示されており [ブラッド(blood) , 99, 754-758 (2002)、 アースライティス 'アンド ' リュ 一マテイズム(Arthritis Reum. ) , 48, 455-459 (2003) ] 、 ヒ ト IgGlサブクラスの抗体医薬の 臨床効果に ADCC活 1·生が重要な役割を果たすことが示唆されている。 Antibody-dependent cytotoxic activity (hereinafter abbreviated as ADCC activity) is based on the expression of the Fc region of the antibody on the Fc gamma receptor expressed in a cell population called efector, such as NK cells, monocytes' macrophages, and granulocytes. It happens by combining. NK cells induce strong ADCC activity through FcyRIIIa, a type of Fey receptor on cells. The FcyRIIIa gene has a functional polymorphism at the 158th amino acid, and the 158th amino acid has Valine (hereinafter referred to as Val) FcγRllla more than Phenylalanine (hereinafter referred to as Phe) FcyRIIIa Induces strong ADCC activity [Journal of Clinical Investigation. Clin. Invest.), 100, 1059-1070 (1997)]. In recent years, it has been shown that the clinical effect of Rituxan is significantly higher in patients with Val / Val genotype than in patients with other genotypes [Blood, 99, 754-758 (2002), Arthritis Reum., 48, 455-459 (2003)], suggesting that ADCC activity plays an important role in the clinical efficacy of human IgGl subclass antibody drugs Have been.
抗体などの糖タンパク質の糖鎖は、 タンパク質部分との結合様式により、 ァスパラギンと結 合する糖鎖 (N-グリコシド結合糖鎖) とセリン、 スレオニンなどと結合する糖鎖 (0 -グリコシ ル結合糖鎖) の 2種類に大別される。 N-グリコシド結合糖鎖は、 以下の構造式 (I) に示す基本 となる共通のコア構造を有する [生物化学実験法 23—糖蛋白質糖鎖研究法(学会出版センター) 高橋禮子編 (1989年) ] 。 The sugar chains of glycoproteins such as antibodies are linked to asparagine (N-glycoside-linked sugar chains) and sugar chains linked to serine, threonine, etc. (0-glycosyl-linked sugars) depending on the mode of binding to the protein part. Chains). N- glycoside-linked sugar chain, the following structural formula have a common core structure underlying shown in (I) [Biochemical Experimental Methods 2 3 - glycoprotein sugar chain research methods (Gakkai Shuppan Center) Reiko Takahashi Hen (1989 Year) ] .
(化 1 )
^ / 稱途 (I ). 上記構造式 (I ) において、 GlcNAcは N-ァセチルダルコサミン、 anはマンノースを示す。 またァスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、 反対側を非還元末端という。 (Formula 1) ^ / Named (I). In the above structural formula (I), GlcNAc represents N-acetyl dalcosamine, and an represents mannose. The end of the sugar chain that binds to asparagine is called the reducing end, and the opposite side is called the non-reducing end.
抗体分子は重鎖と軽鎖が 2分子ずつ会合した 4量体として構成される。 IgGl型ヒト抗体は、 重鎖の Fc領域中に存在する N末端から 297番目のァスパラギンに上記のコァ構造を有する糖鎖 が結合している。 このコア構造にさらに非還元末端側に N -ァセチルダルコサミン、 ガラクトー ス、 シアル酸、還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ一スがそれぞれ付加する可能 性があるが、 通常これらの成分は均一ではなく、 抗体を生産する細胞によって変化する [トレ ンズ.イン .バイオテクノロジー (Trends Biotechnol. ) , 15, 26-32 (1997) ] 。 ヒ ト IgGl
の ADCC活性は、 この糖鎖中のガラクトース [ヒューマン 'アンティボディズ'アンド'ハイプ リ ドーマズ (Hum Antibodies Hybridomas) , 5, 143-151 (1994)、 ヒューマン .アンティボデ ィズ.アンド 'ハイプリ ドーマズ (Hum Antibodies Hybridomas) , 6, 82-88 (1995) ]、 Ν -ァ セチルダルコサミン [ネィチヤ一'バイオテクノロジー(Nat. Biotechnol. ) , 17, 176-180, (1 999)、 バイオテクノロジー .アンド 'バイオエンジニアリング(Biotechnol. Bioeng. ) , 74, 2 88-294, (2001) ] 、 フコース [ジャーナノレ ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 277, 26733-26740 (2002)、 ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカノレ 'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 278, 3466-3473 (2003) ] の含有量に影響を受けることが報告されている。 中 でも最も影響が大きいのはフコースであり、還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースが付加した糖鎖の割合が少ないヒ ト IgGl型の抗体は ADCC活性を顕著に増強する [ジャー ナル■ォブ ·バイオロジカノレ 'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 277, 26733-26740 (2002)、 ジャーナル 'ォブ'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 278, 3466 - 3473 (20 03) ] 。 しかしこれらの報告はいずれも抗体単独での ADCC活性であり、 他の薬剤によってフコ ースの量が少ないヒ ト IgGl型の抗体の ADCC活性がさらに増強するかどうかは知られていない。 一方 ADCC活性はェフエクタ一細胞を刺激するサイト力インによつて上昇することが知られ ている。 例えばィンターロイキン (以下 IL) -2 [キャンサー 'ィムノロジ一'ィムノセラピー (Cancer Immunol. Immunother. ) , 46, 213 (1998)、 キャンサー'ィムノロジ一'ィムノセラピ ― (Cancer Immunol. Immunother. ) , 51, 171 (2002)、プラッド(Blood) , 93, 3922 (1999)、 ジ ャパニーズ .ジャーナノレ .ォブ .キヤンサー . リサーチ(Jpn. J. Cancer Res. ) , 87, 497 (19 96) ]、 IL-12 [ブラッド(Blood) , 93, 3922 (1999)、 ジャパニーズ ·ジャーナノレ ·ォブ ·キヤ ンサ一. リサーチ(jpn. j. Cancer Res. ), 87, 497 (1996) ]、 IL-15 [ブラッド(Blood), 93, 3922 (1999)、 ジャーナノレ ·ォプ ·ェクスペリメンタル ·メディスン(J. Exp. Med) , 180, 139 5 (1994) ] 、 インターフェロン (以下 IFN) - a [キャンサー ·ィムノロジー ·ィムノセラピ一 (Cancer Immunol. Immunother. ) , 46, 213 (1998)、 キャンサー 'ィムノロジー 'ィムノセラピ 一(Cancer Immunol. Immunother. ) , 51,, 171 (2002) ]、 IFN— γ [キャンサー'ィムノロジ一' ィムノセラ.ピー (Cancer Immunol. Immunother. ) , 46, 213 (1998)、 キャンサー ·ィムノロジ 一.ィムノセラピー (Cancer Immunol. Immunother. ), 51, 171 (2002)、 ジャパニーズ ·ジャー ナノレ .ォプ ·キャンサー · リサーチ(Jpn. J. Cancer Res. ) , 87, 497 (1996) ] 、 マクロファー ジ-コ口ニー刺激因子 (以下 M-CSF) [キヤンサー 'ィムノロジー 'ィムノセラピー(Cancer Im munol. Immunother. ) , 46, 213 (1998)、 プラッド(Blood), 93, 3922 (1999)、 ジャパニーズ ' ジャーナノレ .ォブ .キャンサー . リサーチ(Jpn. J. Cancer Res. ) , 87, 497 (1996)、 ジャパ二 ーズ ·ジャーナノレ .ォブ ·キヤン リサーチ(Jpn. J. Cancer Res. ) , 81, 79 (1990) ]等、 様々なサイトカインをエフェクター細胞に in vitroで加えて刺激することにより、 ADCC活性 を上昇させることが知られている。 Antibody molecules are composed of tetramers in which two heavy and two light chains are associated. In the IgGl-type human antibody, a sugar chain having the above core structure is bound to asparagine at position 297 from the N-terminus existing in the Fc region of the heavy chain. In addition to this core structure, there is a possibility that fucose may be added to the non-reducing terminal side at the 6-position of N-acetyldarcosamine, galactose, sialic acid, and the reducing terminal N-acetyldarcosamine, respectively. These components are not homogeneous and vary with the antibody-producing cells [Trends Biotechnol., 15, 26-32 (1997)]. Human IgGl ADCC activity of galactose in this sugar chain [Hum Antibodies Hybridomas, 5, 143-151 (1994), Human Antibody's and 'Hypuri Dorma's] Antibodies Hybridomas), 6, 82-88 (1995)], Ν-cetyldarcosamine [Natya Biotechnol.], 17, 176-180, (1999), Biotechnology and Bio Engineering (Biotechnol. Bioeng.), 74, 288-294, (2001)], Fucose [Giannole of Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 277, 26733-26740 (2002), Journal It is reported that it is affected by the content of ォ ob ォ biological canole '' chemistry (J. Biol. Chem.), 278, 3466-3473 (2003)]. Among them, fucose has the greatest effect.Human IgGl type antibodies with a small proportion of sugar chains with fucose added to position 6 of 還 元 -acetyltylcolsamine at the reducing end markedly enhance ADCC activity. [Jarnal Biolka Nolle 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 277, 26733-26740 (2002), Journal' Ob 'Biological' Chemistry (J. Biol. Chem.), 278 , 3466-3473 (20 03)]. However, these reports all show ADCC activity of the antibody alone, and it is not known whether the ADCC activity of a human IgGl antibody having a small amount of fucose is further enhanced by other drugs. On the other hand, it is known that ADCC activity is increased by the site force which stimulates efecta cells. For example, Interleukin (hereinafter referred to as IL) -2 [Cancer 'Immology I' immunotherapy. (Cancer Immunol. Immunother.), 46, 213 (1998), Cancer 'Immology I' immunotherapy. (2002), Blood, 93, 3922 (1999), Japanese journal, research, and cancer research (Jpn. J. Cancer Res.), 87, 497 (1996)], IL-12 [ Blood (Blood), 93, 3922 ( 1999), Japanese Jananore, O blanking-wire carrier capacitors scratch. research (j pn. j. Cancer R es.), 87, 497 (1996)], IL-15 [ Blood ( Blood), 93, 3922 (1999), Jianore Opéperimental Medicine (J. Exp. Med), 180, 1395 (1994)], Interferon (hereinafter IFN)-a [Cancer Immunology · Immunotherapy. (Cancer Immunol. Immunother.), 46, 213 (1998), Cancer 'Imology' (Cancer Immunol. Immunother.), 51, 171 (2002)], IFN-γ [Cancer Immunol. Immunother., 46, 213 (1998), Cancer Immunol. Immunotherapy. (Cancer Immunol. Immunother.), 51, 171 (2002), Japanese jar nanoreop. Cancer Research (Jpn. J. Cancer Res.), 87, 497 (1996)], Macropharmaco Mouth knee stimulating factor (hereinafter M-CSF) [Cancer 'Immology' Immunotherapy., 46, 213 (1998), Prad (Blood), 93, 3922 (1999), Japanese 'journal Cancer Research (Jpn. J. Cancer Res.), 87, 497 (1996), JAPANESE JANORALEOV QUEAN RESEARCH (Jpn. J. Cancer Res.), 81, 79 (1990)] And stimulate various effector cells in vitro by adding them to effector cells. It is known that increase ADCC activity.
化学療法剤のような低分子の薬剤が in vitroの ADCC活性を増強することは知られていない 力、 化学療法と抗体との併用により優れた治療効果が得られることが知られている。 抗 HER2/n euヒ ト化抗体 rhuMAb HER2 (Herceptin, Roche社) は taxane系抗癌剤との併用療法により乳 癌に対して顕著な効果を示すことが知られている [Clinical Therapeutics, 21, 309 (1999) ]。 また、 抗 CD20ヒ ト型キメラ抗体 IDEC - C2B8 (Rituxan, IDEC社) は多剤療法との併用療法によ
り B細胞リンパ腫に対して顕著な効果を示すことが知られている [J. Clin. Oncol. , 17, 268It is not known that low-molecular-weight drugs such as chemotherapeutic agents enhance ADCC activity in vitro. It is known that excellent therapeutic effects can be obtained by using chemotherapy in combination with antibodies. The anti-HER2 / neu humanized antibody rhuMAb HER2 (Herceptin, Roche) is known to have a remarkable effect on breast cancer when combined with taxane-based anticancer drugs [Clinical Therapeutics, 21, 309 ( 1999)]. In addition, the anti-CD20 human chimeric antibody IDEC-C2B8 (Rituxan, IDEC) is available in combination therapy with multidrug therapy. Is known to have a significant effect on B-cell lymphoma [J. Clin. Oncol., 17, 268
(1999) ] 。 , (1999)]. ,
発明の開示 Disclosure of the invention
本発明の目的は、 高い治療効果を有する抗体組成物と少なくとも 1種類の薬剤とを用いる医 薬を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a drug using an antibody composition having a high therapeutic effect and at least one drug.
本発明は、 以下の (1) 〜 (1 4) に関する。 The present invention relates to the following (1) to (14).
( 1 ) 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—ダリコシド結合複合型糖鎖のう ち、糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50% 以上である抗体組成物と、 少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬。 (1) Of the total ダ -daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, of the sugar chains in which fucose is not linked to 還 元 -acetyltylcolasamine at the reducing end of the sugar chain an antibody composition is proportion 50% or more, a pharmaceutical including a combination of at least one agent.
( 2 ) 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—グリコシド結合複合型糖鎖のう ち、糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50% 以上である抗体組成物と、 少なくとも 1種類の薬剤とを併用して投与するための医薬。 (2) Of the total Ν-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, of the sugar chains in which fucose is not bound to 還 元 -acetyltylcolasamine at the reducing end of the sugar chain. an antibody composition is proportion 50% or more, a medicament for administration in combination with at least one agent.
( 3 ) 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—グリコシド結合複合型糖鎖のう ち、糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50% 以上である抗体組成物と、 少なくとも 1種類の薬剤とを同時に又は逐次的に投与するための医 。 (3) Of all Ν-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, of the sugar chains in which fucose is not linked to 還 元 -acetyltylcolasamine at the reducing end of the sugar chain medical for proportion and antibody compositions is 50% or more, the administration of at least one agent at the same time or sequentially.
( 4 ) 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—グリコシド結合複合型糖鎖のう ち、糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50% 以上である抗体組成物を単独で投与した場合よりも、 高い治療効果を示すことを特徴とする、 上記 (1) 〜 (3) のいずれか 1項に記載の医薬。 (4) Of the total Ν-glycosidic bond complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, of the sugar chains in which fucose is not bound to 還 元 -acetyltylcolasamine at the reducing end of the sugar chain. ratio than when the antibody composition is 50% or more was administered alone, a high therapeutic effect and wherein the indicating the above (1) to (3) the medicament according to any one of.
(5) 高い治療効果を示すことが、 高い抗体依存性細胞障害活性を示すことである、 上記 (4) 記載の医薬。 (5) The medicament according to (4), wherein exhibiting high therapeutic effect means exhibiting high antibody-dependent cytotoxicity.
( 6 ) 抗体組成物が、 Ν _グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミ ンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から 生産される抗体組成物である上記 (1) 〜 (5) のいずれか 1項に記載の医薬。 (6) A cell in which the antibody composition is resistant to a lectin recognizing a sugar chain structure in which the 6-position of _-glycoside-linked complex-type sugar chain reducing terminal and the 1-position of fucose are α-linked. The medicament according to any one of the above (1) to (5), which is an antibody composition produced from:
(7) 抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる F c顦域に結合する全 Ν—ダリコシド結合 複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖である抗体糸且成物である、 上記 (1) 〜 (6) のいずれか 1項に記載の医薬。 (7) Fucose binds to Ν-acetyl dalcosamine at the reducing end of the sugar chain in the total Ν-daricoside bond complex type sugar chain in which the antibody composition binds to the Fc region contained in the antibody composition. The medicament according to any one of the above (1) to (6), which is an antibody thread that is not a sugar chain.
(8) ' フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が Ν—グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンの 6位に 結合していない糖鎖である、 上記 (1) 〜 (7) のいずれか 1項に記載の医薬。 (8) 'The sugar chain to which fucose is not bonded is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not bonded to the 6-position of 還 元 -glycidylcosamine at the reducing end of Ν-glycoside-linked complex type sugar chain. The medicament according to any one of the above (1) to (7).
( 9 ) 抗体組成物が、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックァゥトさ れた細胞から生産された抗体組成物である、 上記 (7) または (8) 記載の医薬。 (9) The genomic gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which fucose is bonded to position 6 of fucose at the reducing end of 還 元 -glycoside-linked complex type glycan at the reducing end is knocked out. The medicament according to the above (7) or (8), which is an antibody composition produced from the obtained cells.
(1 0) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコー スの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、 α 1, 6-フコシルトランスフヱラーゼである 上記 (9) 記載の医薬。 (10) An enzyme involved in glycosylation, in which the first position of fucose is a-linked to the sixth position of チ ル -acetyldarcosamine at the reducing end of Ν-glycoside-linked complex-type sugar chain, is α1,6-fucosyltransferase. The medicament according to the above (9), which is perase.
(1 1) 薬剤が、 蛋白質、 低分子の薬剤および生物学的応答調節剤からなる群から選ばれ る物質である上記 (1) ~ (10) のいずれか 1項に記載の医薬。
( 1 2 ) 蛋白質が、 サイトカインまたは抗体である、 上記 (1 1 ) 記載の医薬。 (11) The medicament according to any one of the above (1) to (10), wherein the drug is a substance selected from the group consisting of a protein, a small molecule drug, and a biological response modifier. (12) The medicament according to the above (11), wherein the protein is a cytokine or an antibody.
( 1 3 ) サイトカインが、 IFN- V、 IL-2および IL - 15から選ばれるサイトカインである上 記 (1 2 ) に記載の医薬。 (13) The medicament according to the above (12), wherein the cytokine is a cytokine selected from IFN-V, IL-2 and IL-15.
( 1 4 ) 医薬が、 ϋ瘍を伴う疾患に対する治療薬である、 上記 (1 ) ~ ( 1 3 ) のいずれ 力 1項に記載の医薬。 本発明の医薬の形態としては、 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—ダリコシ ド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合してい ない糖鎖の割合が 50%以上である抗体組成物と、少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてな る医薬、抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50%以 上である抗体組成物と、 少なくとも 1種類の薬剤とを併用して投与するための医薬、 抗体組成 物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50%以上である抗体組 成物と、 少なくとも 1種類の薬剤とを同時に又は逐次的に投与するための医薬があげられる。 ここで、 組み合わせてなる医薬とは、 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—グ リコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合 していない糖鎖の割合が 50%以上である抗体組成物と、少なくとも 1種類の薬剤とを別々に調 製し、 これらの薬剤を組み合わせて同時にまたは逐次的に投与する医薬であってもよいし、 そ れぞれの薬剤成分を混合させた合剤であってもよい。 それぞれの薬剤成分を混合させた合剤に は、 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 Ν—グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖 鎖還元末端の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 《)%以上 である抗体組成物に少なくとも 1種類の薬剤を結合させた融合抗体なども包含する。 (14) The medicament according to any one of the above (1) to (13), wherein the medicament is a remedy for a disease associated with a tumor. As the form of the medicament of the present invention, of the total ダ -daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, fucose is bound to Ν-acetylethyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain. A drug comprising a combination of an antibody composition having a sugar chain content of not less than 50% and at least one drug, a total 、 -daricoside binding complex that binds to the Fc region contained in the antibody composition A combination of an antibody composition in which the percentage of sugar chains in which fucose is not bound to glycine glucosamine at the reducing end of sugar chains is 50% or more, and at least one drug in combination Sugars in which fucose is not bound to glycine-linked glucosamine at the reducing end of all glycan-linked glycosides that bind to the Fc region contained in the pharmaceutical or antibody composition for administration. antibodies sets the proportion of the chain is 50% or more Pharmaceuticals for the simultaneous or sequential administration of the composition and at least one agent. Here, the drug in combination refers to fucose at the reducing end of glycine-linked glycoside of glycine-linked glycoside, which is bound to the Fc region contained in the antibody composition. Even if a drug is prepared by separately preparing an antibody composition having an unbound sugar chain ratio of 50% or more and at least one drug, and simultaneously or sequentially administering these drugs in combination. Or a mixture of the respective drug components. In the mixture prepared by mixing the respective drug components, among the total シ ド -glycoside-linked complex-type sugar chains binding to the Fc region contained in the antibody composition, に -acetylmethylcolasamine at the reducing end of the sugar chain was added. A fusion antibody in which at least one drug is bound to an antibody composition in which the ratio of sugar chains to which fucose is not bound is <<)% or more is also included.
本発明において、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖 鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合と は、 該組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ての N-グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に 対して、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占め る割合をいう。 糖鎖の割合は、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が a結合していない糖鎖の割合が好ましい。 In the present invention, the ratio of sugar chains in which fucose is not linked to N-acetyltyl glucosamine at the sugar chain reducing end, of all N-daricoside-linked complex type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition Refers to that the fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain with respect to the total number of all N-glycoside-linked complex type sugar chains that bind to the Fc region contained in the composition. Refers to the ratio occupied by the number of sugar chains. The ratio of the sugar chain is preferably such that the 1-position of fucose is not a-bonded to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain.
本発明において、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコー スが結合していない糖鎖とは、該フコースが、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセ チルダノレコサミンに α結合していない糖鎖をいい、具体的には、該フコースの 1位が Ν-グリコ シド結合複合型糖鎖の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していな 、糖鎖があげられる。 本発明における抗体組成物としては、 Ν-ダリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分 子を含有してなる組成物であればいかなるものも包含される。 In the present invention, a sugar chain in which fucose is not bonded to N-acetyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal is defined as the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end. -Acetyl danolecosamine refers to a sugar chain that is not α- linked. Specifically, position 1 of the fucose is α- linked to position 6 of Ν-acetyldarcosamine of the Ν-glycoside-linked complex type sugar chain. If not linked, sugar chains can be mentioned. The antibody composition of the present invention includes any composition as long as it contains an antibody molecule having an Ν-daricoside-linked complex type sugar chain in the Fc region.
抗体分子とは、 重鎖および軽鎖 (以下、 それぞれ H鎖および L鎖と表記する) の 2種類のポ リぺプチド鎖がそれぞれ 2分子ずつ会合した 4量体である。 H鎖の N末端側の約 4分の 1と L 鎖の N末端側の約 2分の 1 (それぞれ 100余アミノ酸) は V領域と呼ばれ、 多様†生に富み、 抗 原との結合に直接関与する。 V領域以外の部分の大半は C領域と呼ばれる。 抗体分子は C領域
の相同性により IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgEの各クラスに分寧される。 An antibody molecule is a tetramer in which two types of heavy chains and light chains (hereinafter, referred to as H chains and L chains, respectively) are associated with two molecules of each. About one-fourth of the N-terminal side of the H chain and about one-half of the N-terminal side of the L chain (each more than 100 amino acids) are called V regions, and are rich in diversity and can bind to antigens. Directly involved. Most of the part other than the V region is called the C region. Antibody molecule is C region IgG by homology, I g M, IgA, IgD , are BunYasushi to each class of IgE.
また IgGクラスは C領域の相同性により、 さらに IgGl〜IgG4のサブクラスに分類される。 H鎖は N末端側より VH、 CH1、 CH2、 CH3の 4つのィムノグロブリンドメインに分かれ、 CH1 と CH2の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、 CH1と CH2とが区切 られる。 ヒンジ領域以降の CH2と CH3からなる構造単位は Fc領域と呼ばれ、 N-グリコシド結合 型糖鎖が結合している。また、この領域は、 Fcレセプター、捕体などが結合する領域である (免 疫学イラストレイテッド原書第 5版、 2000年 2月 10日発行、 南江堂版、 抗体工学入門、 1994 年 1月 25ョ初版、 地人書館)。 The IgG class by homology C region, are further classified into subclasses IgGl~I g G4. The H chain is divided into four immunoglobulin domains, VH, CH1, CH2, and CH3, from the N-terminal side.There is a highly flexible peptide region called the hinge region between CH1 and CH2, which separates CH1 and CH2. Can be Structural unit comprising CH2 and CH 3 after the hinge region is called Fc region, N- glycoside-linked sugar chain is attached. This region is the region where Fc receptors, traps, etc. bind (Immunology Illustrated, Original 5th Edition, published February 10, 2000, Nankodo Edition, Introduction to Antibody Engineering, January 25, 1994) First edition, Citizen Library).
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、 蛋白質部分との結合様式により、 ァスパラギンと結合する糖 鎖 (N-グリコシド結合糖鎖) とセリン、 スレオニンなどと結合する糖鎖 (0-グリコシル转合糖 鎖) の 2種類に大別される。 N-グリコシド結合糖鎖は、以下の構造式 (I) に示す基本となる共 通のコア構造を有する [生物化学実験法 23—糖蛋白質糖鎖研究法 (学会出版センター) 高橋禮 子編 (1989年)] 。 . The sugar chains of glycoproteins such as antibodies can be linked to asparagine (N-glycoside-linked sugar chains) and sugar chains linked to serine, threonine, etc. (0-glycosyl-glycoside), depending on the mode of binding to the protein part. ) Are roughly divided into two types. The N-glycoside-linked sugar chain has a basic common core structure represented by the following structural formula (I) [Biochemical Experimental Method 23—Glycoprotein Glycan Research Method (Society Press Center), edited by Reiko Takahashi ( 1989)]. .
上記構造式 (i) において、ァスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元 末端という。 In the above structural formula (i), the terminal of the sugar chain binding to asparagine is called a reducing end, and the opposite side is called a non-reducing terminal.
N-グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式 (I) のコア構造を有するものであればいかなる ものでもよいが、 コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、 コア 構造の非還元末端側にガラクトース -N-ァセチルダルコサミン (以下、 Gal-GlcNAcと表記する) の枝を並行して 1ないしは複数本有し、更に Gal-GlcNAcの非還元末端側にシアル酸、パイセク ティングの N-ァセチルダルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型 (複合型)、 コア構 造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型な どがあげられる。 As the N-glycoside-linked sugar chain, any one having a core structure of the above structural formula (I) may be used, but a high mannose type in which only mannose is bonded to the non-reducing end of the core structure, and a non-core structure having a core structure It has one or more parallel branches of galactose-N-acetyldarcosamine (hereinafter referred to as Gal-GlcNAc) at the reducing end, and sialic acid and piecing at the non-reducing end of Gal-GlcNAc. Complex-type (complex type) having a structure such as N-acetyldarcosamine, and a hybrid type having both high-mannose type and complex type branches on the non-reducing end side of the core structure.
抗体分子の Fc領域には、 N-ダリコシド結合糖鎖が 1力所ずつ結合する領域を有しているので、 抗体 1分子あたり 2本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合する N -ダルコシド結合糖鎖とし ては、前記構造式 (I) で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合 する 2本の N-ダルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。 Since the Fc region of the antibody molecule has a region in which N-daricoside-linked sugar chains bind one by one, two sugar chains are bound per antibody molecule. Since the N-darcoside-linked sugar chain that binds to the antibody molecule includes any sugar chain containing the core structure represented by the structural formula (I), two N-darcoside-linked sugar chains that bind to the antibody are included. Has many combinations of sugar chains.
したがって、 本発明における抗体組成物は、 本発明の効果が得られる範囲であれば、 単一の 糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、 複数の異なる糖鎖構造を有する抗体 分子から構成されていてもよい。 Therefore, the antibody composition according to the present invention may be composed of an antibody molecule having a single sugar chain structure or an antibody having a plurality of different sugar chain structures as long as the effects of the present invention can be obtained. It may be composed of molecules.
抗体分子としては、抗体の Fc領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的に は、 抗体、 抗体の断片、 Fc領域を含む融合蛋白質などがあげられる。 Antibody molecules include any molecules that contain the Fc region of the antibody. Specific examples include an antibody, an antibody fragment, and a fusion protein containing an Fc region.
抗体としては、 動物に抗原を免疫し、 免疫動物の脾臓細胞より作製したハイプリ ドーマ細胞
が分泌する抗体、 遺伝子組換え技術により作製された抗体、 .すなわち、 抗体遺伝子を揷入した 抗体発現ベクターを、 宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。 具体 的には、 ノ、イブリ ドーマが生産する抗体、 ヒト化抗体、 ヒト抗体などをあげることができる。 ハイプリ ドーマは、 ヒ ト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、 マウス、 ラ ット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、 所望の抗原特異性を有したモ ノク口 ナル抗体を生産する細胞をいう。 Antibodies include hybridoma cells prepared from spleen cells of immunized animals by immunizing animals with the antigen. And an antibody produced by a gene recombination technique, that is, an antibody obtained by introducing an antibody expression vector containing an antibody gene into a host cell. Specific examples include antibodies produced by humans and hybridomas, humanized antibodies, human antibodies, and the like. Hybridomas have a desired antigen specificity, obtained by cell fusion of B cells obtained by immunizing a mammal other than human with an antigen and myeloma cells derived from mice, rats, and the like. A cell that produces a monoclonal antibody.
ヒト化抗体としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられる。 Examples of the humanized antibody include a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体 H鎖 V領域 (以下、 HVまたは VHとも称す) お よび抗体 L鎖 V領域 (以下、 LVまたは VLとも称す) とヒト抗体の H鎖 C領域 (以下、 CHとも 称す) およびヒ ト抗体の L鎖 C領域 (以下、 CLとも称す) とからなる抗体をいう。 ヒト以外の 動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ラビット等、 ハイプリ ドーマを作製することが 可能であれば、 いかなるものも用いることができる。 The human chimeric antibody is composed of a non-human animal H chain V region (hereinafter also referred to as HV or VH) and an antibody L chain V region (hereinafter also referred to as LV or VL) and a human antibody H chain C region (hereinafter referred to as LV or VL). Hereafter, it refers to an antibody consisting of a human antibody L chain C region (hereinafter, also referred to as CL). As a non-human animal, any animal such as a mouse, a rat, a hamster, and a rabbit can be used as long as it can produce a hybridoma.
ヒト型キメラ抗体は、 モノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマより、 VHおよび VLを コードする cDNAを取得し、ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 CLをコードする遺伝子を有する宿主細 胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、 宿主細胞へ導 入することにより発現させ、 製造することができる。 The human chimeric antibody is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody, and inserting the cDNAs into host cell expression vectors having genes encoding human antibodies CH and CL, respectively. The expression vector can be produced by constructing a human-type chimeric antibody expression vector and introducing it into a host cell.
ヒト型キメラ抗体の CHとしては、 ヒトイムノグロブリン (以下、 hlgと表記する) に属すれ ばいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、更に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4 といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型キメ ラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよく、 κクラスあるいは; Lクラスのも のを用いることができる。 . As the CH of the human chimeric antibody, a human immunoglobulin (hereinafter referred to as hlg) may be any so long as it belongs to, but it is preferable that the hlgG class, hI g Gl, hIgG2 belonging more hlgG class, Any of the subclasses hIgG3 and hIgG4 can be used. As the CL of the human chimeric antibody, any CL belonging to hlg may be used, and a κ class or L class can be used. .
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の坑体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列をヒト 抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。 The human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of a non-human animal to the human body at appropriate positions of VH and VL of a human antibody.
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列を任意のヒト抗体 の VHおよび VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構築し、 ヒト抗体の CHおよ びヒト抗体の CL をコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ揷入してヒ ト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒ ト型 CDR移植抗体を発現させ、 製造することができる。 The human CDR-grafted antibody is constructed by constructing a cDNA encoding a V region obtained by grafting the VH and VL CDR sequences of a non-human animal antibody to the VH and VL CDR sequences of any human antibody, A human CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting each into a host cell expression vector having a gene encoding the CL of a human antibody, and the expression vector is introduced into a host cell to obtain the human CDR. The transplant antibody can be expressed and manufactured.
ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスの ものが好適であり、 更に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 MgG3、 MgG4といったサブクラ スのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移植抗体の CLとしては、 hlgに属すれば いかなるものでもよく、 κクラスあるいはえクラスのものを用いることができる。 The CH of human CDR-grafted antibody may be any so long as it belongs to the hlg but it is preferable that the hlgG class, further hI g belonging to hlgG class Gl, hIgG2, MgG3, any of subclasses such MgG4 Can be used. The CL of the human CDR-grafted antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and a κ class or え class can be used.
ヒト抗体は、 元来、 ヒ ト体内に天然に存在する抗体をいうが、 最近の遺伝子工学的、 細胞ェ 学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライプラリーならびにヒト 抗体トランスジエニック非ヒト動物あるいはヒト抗体トランスジヱニック植物から得られる抗 体等も含まれる。 . Human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in a human body, but human antibody phage libraries and human antibodies produced by recent advances in genetic engineering, cytology, and developmental engineering technologies Also included are antibodies obtained from transgenic non-human animals or human antibody transgenic plants. .
ヒト体内に存在する抗体は、 例えば、 ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィルス等を感染さ せ不死化、 クローニングすることにより、 該抗体を生産するリンパ球を培養でき、 培養物中よ り該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリ一は、 ヒ ト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に 揷入することにより Fab、 一; 鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライプラリー である。 該ライプラリーより、 抗原を固定ィ匕した基質に対する結合活性を指標として所望の抗 原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、 更に遺伝子工学的手法により、 2本の完全な Η鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分 子へも変換することができる。 Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting them with an EB virus, etc., immortalizing them, and cloning the cells to produce the antibody-producing lymphocytes. The antibody can be purified. The human antibody phage library 1 is a library in which antibody fragments such as Fab and single-chain antibodies are expressed on the phage surface by introducing an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, a phage expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted to a human antibody molecule consisting of two complete L chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
ヒト抗体トランスジエニック非ヒト動物は、 ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をい う。 具体的には、 マウス胚性幹細胞ヘヒ ト抗体遺伝子を導入し、 該胚性幹細胞を他のマウスの 初期胚へ移植後、 発生させることによりヒト抗体トランスジエニック非ヒト動物を作製するこ とができる。 また、 動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、 該受精卵を発生させることにヒ ト抗体トランスジエニック非ヒト動物を作製することもできる。 ヒト抗体トランスジエニック 非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、 通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイプリ ドーマ作製方法によりヒト抗体ハイプリ ドーマを得、 培養することで培養物中にヒト抗体を蓄 積させることができる。 A human antibody transgenic non-human animal refers to an animal in which a human antibody gene has been integrated into cells. Specifically, it is possible to produce a human antibody transgenic non-human animal by introducing a mouse antibody gene from a mouse embryonic stem cell, transplanting the embryonic stem cell into the early embryo of another mouse, and then developing the embryonic stem cell. it can. In addition, a human antibody transgenic non-human animal can be prepared by introducing a human antibody gene into a fertilized egg of an animal and generating the fertilized egg. Human antibody transgenic methodA method for producing human antibodies from non-human animals is to obtain human antibody hybridomas by the normal hybridoma production method used in mammals other than humans, and to culture human antibodies in culture. Antibodies can be accumulated.
トランスジエニック非ヒト動物としては、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラッ ト、 ニヮトリ、 サルまたはゥサギ等があげられる。 Transgenic non-human animals include porcupines, sheep, goats, pigs, porcupines, mice, rats, chickens, monkeys, and egrets.
抗体の断片は、 上記抗体の少なくとも Fc領域の一部を含んだ断片をいう。 Fc領域とは、 ¾ 体の H鎖の C末端側の領域、 CH2領域および CH3領域をいう。 少なくとも Fc領域の一部とは、 好ましくは CH2 域を含む断片、 より好ましくは CH2領域内に存在する 1番目のァスパラギン 酸を含む領域をいう。 IgGクラスの Fc領域は、 力バット (Kabat) らの EU Index [シーケンシ ズ ·ォブ ·プロティンズ ·ォブ ·ィムノロジカル' ·ィンタレスト (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ] のナンバリングで 226番目の Cysから C末端、 あるいは 230番目の Pro から C末端までをいう。 抗体の断片としては、 H鎖の単量体、 H鎖の 2量体などがあげられる。 本 明における Fc領域としては、 天然型およびその変異型を包含する。 The antibody fragment refers to a fragment containing at least a part of the Fc region of the antibody. The Fc region refers to a region on the C-terminal side of the whole H chain, a CH2 region and a CH3 region. At least a part of the Fc region preferably refers to a fragment containing the CH2 region, more preferably a region containing the first aspartic acid present in the CH2 region. Fc region of IgG class, power bat (Kabat) et al., EU Index [sequencing's O Breakfast, Protein's O Breakfast, Imunorojikaru '· Intaresuto (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] means from the 226th Cys to the C-terminus or the 230th Pro to the C-terminus. Antibody fragments include H chain monomers, H chain dimers, and the like. The Fc region in the present invention includes a natural type and its mutant type.
Fc領域の一部を有する融合蛋白質とは、 抗体の Fc領域の一部を含んだ抗体あるいは抗体の 断片と、 酵素、 サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質 (以下、 Fc融合蛋白質と称す) いう。 A fusion protein having a part of the Fc region is a substance obtained by fusing an antibody or a fragment of the antibody containing a part of the Fc region of an antibody with a protein such as an enzyme or a cytokine (hereinafter referred to as an Fc fusion protein). Say.
本発明の抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 5 0 %以 上、 好ましくは 6 0 %以上、 より好ましくは 7 0 %以上、 さらに好ましくは 8 0 %以上、 特に 好ましくは 9 0 %以上であり、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ての N -グリコシ ド結合複合型糖鎖が、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖であることが最も好ましい。 Of the total N-daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition of the present invention, the proportion of sugar chains in which fucose is not linked to N-acetyldarcosamine at the sugar chain reducing end is low. 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, and binds to the Fc region contained in the antibody composition. It is most preferred that all of the N-glycoside-linked complex-type sugar chains to be used are sugar chains in which fucose is not linked to N-acetyltyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain.
以上のように抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結 複合型糖鎖の うち、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が高け れば高いほど、 抗体組成物は、 高い抗体依存性細胞障害活性を有する。 As described above, of the total N-daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, the proportion of sugar chains in which fucose is not linked to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain The higher the, the higher the antibody composition has the higher antibody-dependent cytotoxic activity.
; N -グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖 還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子から
ヒ ドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [生物化学実験法 23—糖タンパク質糖鎖研究法 (学会出版センター) 高橋禮子編 (1989) ]を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標 識又は同位元素標識し、 標識した糖鎖をク口マトグラフィ一法にて分離することによつて決定 することができる。 また、 遊離させた糖鎖を HPAED-PAD法 [ジャーナル 'ォプ 'リキッド 'クロ マトグラフィー (J. Liq. Chromatogr. ) , 6, 1577 (1983) ]によって分析することによつても 決定することができる。 The ratio of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyltylcolasamine at the reducing end of sugar chains contained in a composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region is determined by the ratio of the antibody From the molecule Using known methods such as hydrazinolysis and enzymatic digestion [Biochemical Experimental Method 23—Glycoprotein Glycosylation Research Method (Academic Press Center), edited by Reiko Takahashi (1989)], the sugar chains are released and the released sugar chains are released. Can be determined by fluorescent labeling or isotope labeling, and separating the labeled sugar chains by one of the methods of mouth chromatography. In addition, the released sugar chains can be determined by analysis by the HPAED-PAD method [Journal 'Op' Liquid 'Chromatography (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)]. Can be.
本発明において、 高い治療効果としては、 例えば細胞障害活 1"生が高いこと等があげられる。 抗体組成物の有する細胞障害活性としては抗体依存性細胞障害活性(以下、 ADCCと略記する)、 ネき体依存性細胞障害活个生 (モノクローナル ·アンティボディズ) 、 抗原に結合することによる 抗原発現細胞の増殖抑制活性などがあげられる。 増殖抑制活性には標的細胞のアポトーシス誘 導や分化誘導を促進するものも包含される [キャンサー · リサーチ (Cancer Research) 60, 7170 (2000)、 ネイチヤー 'メディスン (Nature Medicine) 1, 644 (1995)、 セル ·グロース · ディファレンシエーション (Cell Growth Differ. ) 3, 401 (1992) ] 。 In the present invention, high therapeutic effects include, for example, a high level of cytotoxic activity 1 ". Examples of the cytotoxic activity of the antibody composition include antibody-dependent cytotoxic activity (hereinafter abbreviated as ADCC), Nematode-dependent cytotoxicity (monoclonal antibodies), activity to suppress the growth of antigen-expressing cells by binding to antigens, etc. The growth-suppressing activity includes inducing apoptosis and inducing differentiation of target cells. Also include those that promote cell growth [Cancer Research 60, 7170 (2000), Nature's Medicine (Nature Medicine) 1, 644 (1995), Cell Growth Differ. 3, 401 (1992)].
ADCC活性とは、 生体内で、 腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、 抗体 Fc領域 とエフェクター細胞表面上に存在する Fc受容体との結合を介してエフェクター細胞を活性ィ匕 し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう [モノクローナル ·アンティボディズ:プリンシプルズ · / ン 卜 · フ リケーショ ンズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wi ley-Li ss, Inc. , Capter 2. 1 (1995) ]。エフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞、 マクロファージ、 単球、 樹状細胞、 顆粒球等の免疫細胞があげられる。 また Fc受容体は Fc o; 受容体 I、 Fc E受容体I、 ?(:£受容体 II、 FC T受容体]:、 Fc V受容体 IIa、 Fe y受容体 IIb、 Fc y受容体 IIc、 FC T /受容体 IIIa、 Fc y受容体 IIIb、 Fc受容体 n等のタイプに分かれる。 この内 Fc y受容体 Iliaは主にナチュラルキラー細胞上に発現し、 ADCC活性に重要な Fc受容体の一つ である [モノクローナル ' アンティボディズ: プリンシプルズ ' アンド 'プラクティス (Monoclonal Antibodies : principles and practice) , Thirdiidition, Acad. Press, 1996 (以 下、 モノクローナル 'アンティボディズと略す) ]。 ADCC activity means that in vivo, an antibody bound to a cell surface antigen such as a tumor cell activates an effector cell through the binding of an antibody Fc region to an Fc receptor present on the effector cell surface. , Which refers to the activity of damaging tumor cells, etc. [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Capter 2.1 ( 1995)]. Effector cells include immune cells such as natural killer cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, and granulocytes. Fc receptor is Fco; receptor I, Fc E receptor I,? (: £ receptor II, FCT receptor) :, Fc V receptor IIa, Fey receptor IIb, Fcy receptor IIc, FCT / receptor IIIa, Fcy receptor IIIb, Fc receptor n, etc. Among them, Fcy receptor Ilia is mainly expressed on natural killer cells and is one of the important Fc receptors for ADCC activity [monoclonal 'Antibodies: Principles'and' practice ( Monoclonal Antibodies: principles and practice), Thirdiidition, Acad. Press, 1996 (hereinafter abbreviated as "monoclonal 'Antibodies')".
したがって、 本発明において、 抗体分子の Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖 鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサ.ミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 5 0 %以上である抗体組成物を単独で投与した場合よりも、 高い治療効果を示すとは、 抗体分 子の Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダ ルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 5 0 %以上である抗体組成物と少なくと も 1種類以上の薬剤とを組み合わせることにより、 該抗体組成物単独で投与した場合に発揮さ れる治療効果よりも高い治療効果を発揮する医薬をいう。 Therefore, in the present invention, the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of sugar chains is 50% of all complex N-glycoside-linked sugar chains that bind to the Fc region of the antibody molecule. % Of the total N-glycoside-linked complex type glycan that binds to the Fc region of the antibody molecule, indicating that the antibody composition exhibits a higher therapeutic effect than when the antibody composition alone is administered alone. The combination of an antibody composition in which the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetylsyllucosamine is 50% or more and at least one or more drugs results in a case where the antibody composition is administered alone. A drug that exerts a therapeutic effect that is higher than the therapeutic effect that is exhibited.
また、 本発明の医薬は、 抗体分子の Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のう ち、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 5 0 % 未満である抗体組成物と少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬よりも、 高い治療 効果を示す。 In addition, the medicament of the present invention is characterized in that, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region of an antibody molecule, a sugar chain in which fucose is not linked to N-acetyltyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain. It shows a higher therapeutic effect than a drug comprising a combination of an antibody composition having a ratio of less than 50% and at least one drug.
本発明の医薬は、 薬剤を単独で使用する場合よりも少ない薬剤の量にすることができ、 薬剤 を単独で高用量を患者に投与した場合に懸念された副作用を低減させることができる。 The medicament of the present invention can have a smaller amount of drug than when the drug is used alone, and can reduce the side effects of concern when a high dose of the drug alone is administered to a patient.
N—グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N—ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1
位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 (以下、 a 1, 6-フコー クチン耐性^ Β胞と称す) としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞など抗体組成物を製 造することカできる細胞であって、 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコ サミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞で あればいかなる細胞でもよい。 N-glycoside-linked complex type sugar chain 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end and 1 of fucose Cells that are resistant to lectins that recognize an α-linked sugar chain structure (hereinafter referred to as a 1,6-fucoccin-resistant ^ cells) include antibody compositions such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells. A cell capable of producing a product, which has lectin resistance that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of 還 元 -glycidyl-linked glycan-reducing terminal 鎖 -acetyldarcosamine and the 1-position of fucose are α-linked. Any cells can be used.
具体的には、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、 ハイプリドーマ細胞、 ヒト抗体およびヒト化抗体を製造するための宿主細胞、 ヒト抗体を生産するためのトランスジ ヱニック非ヒト動物を製造するための胚性幹細胞および受精卵細胞、 ヒト抗体を生産するため のトランスジエニック植物を製造するための植物カルス細胞、 ミエローマ細胞、 トランスジェ ニック非ヒ ト動物由来の細胞などがあげられる。 ミエローマ細胞はハイプリ ドーマ細胞を製造 する際に融合細胞として用いることができる。 また、 トランスジエニック非ヒト動物に抗原を 免疫し、'該動物の脾臓細胞を取り出し、 ハイプリドーマ細胞を製造するために用いることがで きる。 Specifically, a hybridoma resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of の -glycidyl-linked glycan at the reducing end of 複合 -glycidyl-linked glycan and the 1-position of fucose is α-linked Cells, host cells for producing human antibodies and humanized antibodies, transgenic for producing human antibodies, embryonic stem cells and fertilized egg cells for producing non-human animals, transgenic for producing human antibodies Examples include plant callus cells, myeloma cells, and cells derived from transgenic non-human animals for producing plants. Myeloma cells can be used as fusion cells when producing hybridoma cells. Alternatively, a transgenic non-human animal can be immunized with an antigen, and the spleen cells of the animal can be removed and used to produce hybridoma cells.
レクチン Iこ耐性を有する細胞とは、 培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を行つた ときにも、 生育が阻害されない細胞をいう。 Lectin I A cell having this resistance is a cell whose growth is not inhibited even when cell culture is performed by giving an effective concentration of lectin to a culture medium.
本発明において、 生育が阻害されないレクチン有効濃度は、 細胞株に応じて適宜定めればよ いが、 通常 10 μ §/ηι1〜10. 0πιεΑι1、 好ましくは 0. 5〜2. 0mg/mlである。 親株細胞に変異を導入 した場合のレクチンの有効濃度とは、 該親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、 好ま しくは親株細胞が正常に生育できな 、濃度と同濃度、 より好ましくは 2~5倍、 さらに好ましく は 10倍、 ¾も好ましくは 20倍以上の濃度をいう。 In the present invention, lectin effective concentration that does not inhibit growth, yo be appropriately determined according to each cell line bur normally 10 μ § / ηι1~10. 0πι ε Αι1, preferably 0. 5~2. 0m g / ml. The effective concentration of lectin when a mutation is introduced into the parent cell is not less than the concentration at which the parent cell cannot grow normally, preferably the same concentration as that at which the parent cell cannot grow normally, more preferably 2%. The concentration refers to a concentration of up to 5 times, more preferably 10 times, and preferably 20 times or more.
親株細胞とは、 何らかの処理を施す前の細胞、 すなわち本発明で用いる a 1, 6-フコース/レ クチン耐性細胞を選択する工程を行う前の細胞、 上述した酵素活性を低下または欠失するため に遺伝子工学的な処理を行う前の細胞をいう。 The parent cell is a cell before any treatment, that is, a cell before performing the step of selecting a1,6-fucose / lectin-resistant cells used in the present invention, because the above-mentioned enzyme activity is reduced or deleted. Refers to cells before being subjected to genetic engineering treatment.
親株細胞としては、 特に限定はないが、 種々の細胞株の親株細胞の具体例として、 以下に^ す細胞があけられる。 The parent cell is not particularly limited, but specific examples of the parent cell of various cell lines include the following cells.
NS0細胞の親株細胞としては、 バイオ/テクノロジー (BIO/TECHNOLOGY) , 10, 169 (1992)、 バイオテクノロジー 'バイオエンジニアリング (Biotechnol. Bioeng. ) , 73, 261, (2001) 等 の文献に記載されている NS0細胞があげられる。 また、 理化学研究所細胞開発銀行に登録され ている ^0 ¾9胞株 (RCB0213)、 あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあ げられる。 · Parent cells of NS0 cells are described in the literature such as BIO / TECHNOLOGY, 10, 169 (1992), and Biotechnology 'Bioengineering (Biotechnol. Bioeng.), 73, 261, (2001). NS0 cells. Also, there are ^ 0-9 cells registered with the RIKEN Cell Development Bank (RCB0213), or substrains obtained by adapting these strains to a growth medium. ·
SP2/0-Agl4細胞の親株細胞としては、ジャーナル ·ォプ 'ィムノロジー (J. Immunol'. ) , 126, 317 (1981)、 ネイチヤー(Nature) , 276, 269 (1978)、 ヒュ一マン ·アンチイボディズ ·アンド · ハイプリ ドーマズ (Human Antibodies and Hybridomas) , 3, 129 (1992) 等の文献に記載され ている SP2/0 - Agl4細胞があげられる。 また、 ATCCに登録されている SP2/0-Agl4細胞 (ATCC CRL-1581) あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株 (ATCC CRL-15S1. 1) なども あげられる。 Parent cells of SP2 / 0-Agl4 cells include, for example, Journal of Immunology (J. Immunol '.), 126, 317 (1981), Nature, 276, 269 (1978), and Human Antibody. SP2 / 0-Agl4 cells described in the literature such as Ibodies and Hypridomas (Human Antibodies and Hybridomas), 3, 129 (1992). In addition, SP2 / 0-Agl4 cells registered with the ATCC (ATCC CRL-1581), or a substrain (ATCC CRL-15S1.1.1) obtained by adapting these strains to a medium in which they can grow, may also be mentioned.
チヤイエーズハムスター卵巣糸且織由来 CH0 細胞の親株細胞としては、 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、
Genetics, 55, 513 (1968)、 Chromosoma, 41 , 129 (1973)、 Methods in Cell Science, 18, 115 ( 1996)、 Radiat ion Research, 148, 260 (1997)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、 Cel l, 6, 121 (1975)、 Molecular Cell Genetics, Appendix 1, 11 (p883- 900)等の文献に記載されている CHO細胞などがあげられる。 また、 ATCC に登録されている CHO- K1 株 (ATCC CCL-61) DUXB11 株 (ATCCCRL-9096)、 Pro - 5株 (ATCC CRL-1781) や、 市販の CHO - S株 (Lif etechnologies社 Cat#l l6l9)、 あるいはこれら株を生育 可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。 As parental cells of CH0 cells derived from chick hamster ovary fibrous tissue, Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968), Chromosoma, 41, 129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA Natl.Acad.Sci. 60, 1275 (1968), Cell, 6, 121 (1975), Molecular Cell Genetics, Appendix 1, 11 (p883-900). CHO cells and the like. In addition, CHO-K1 strain (ATCC CCL-61), DUXB11 strain (ATCCCRL-9096) and Pro-5 strain (ATCC CRL-1781) registered with ATCC, and commercially available CHO-S strain (Lif etechnologies Cat # ll 6 l 9), or the like sub-cell lines obtained by naturalizing these cell lines to viable medium may be mentioned.
ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL. P2. GI L 16Ag. 20細胞の親株細胞としては、 Y3/Agl. 2. 3細 胞 (ATCC CRL - 1631) から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、 J. Cell. Biol., 93, 576 ( 1982)、 Methods Enzymol. , 73Β. 1 (1981) 等の文献に記載されている YB2/3HL. Ρ2. Gi l. 16Ag. 20 細胞が あげられる。 また、 ATCC に登録されている YB2/3HL. P2. Gi l. 16Ag. 20細胞 (ATCC CRL - 1662) あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化さ せた亜株などもあげられる。 Parent cells of the rat myeloma cell line YB2 / 3HL. P2. GIL 16Ag. 20 cells include cell lines established from Y3 / Agl. 2.3 cells (ATCC CRL-1631). Specific examples thereof include YB2 / 3HL. Ρ2.Gil. 16Ag described in documents such as J. Cell. Biol., 93, 576 (1982) and Methods Enzymol., 73Β1 (1981). 20 cells. Also, there are YB2 / 3HL. P2.Gil. 16Ag. 20 cells (ATCC CRL-1662) registered with the ATCC, or substrains obtained by adapting these strains to a medium capable of growing.
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が c結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、 いずれのレクチンも包含される。 その具体的な例としては、 レンズマメレクチン LCA (Lens Cul inari s由来の Lenti l Agglutinin) , エンドゥマメレクチン PSA (Pi sum sativum由来の Pea Lectin) , ソラマメレクチン VFA (Vicia f aba由来の Agglutinin)、 ヒィロチャワンタケレクチ ン ML (Aleuria aurantia由来の Lectin) など力けあげられる。 As a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose are c-bonded, any lectin that can recognize the sugar chain structure can be used. All lectins are included. Specific examples thereof include lentil lectin LCA (Lenti l Agglutinin from Lens Cul inari s), enduma lectin PSA (Pea Lectin from Pi sum sativum), fava bean lectin VFA (Agglutinin from Vicia f aba), phyllo Chawantakelectin ML (Lectin from Aleuria aurantia) and other products are also being promoted.
本発明において、 a l, 6 -フコース/レクチン耐性細胞としては、 一定の有効濃度のレクチン 存在下で生育が阻害されない細胞であれば、 いずれでもよいが、 例えば、 以下にあげる少なく とも 1つの蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞などがあげられる。 In the present invention, al, 6-fucose / lectin-resistant cells may be any cells as long as their growth is not inhibited in the presence of a certain effective concentration of lectin. For example, at least one of the following proteins may be used. A cell whose activity is lower or deleted than that of the parent cell line is exemplified.
(a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースの合成に関与する酵素蛋白質 (以下、 「GDP-フコー ス合成酵素」 と表記する) ; (a) Intracellular sugar nucleotide GDP-an enzyme protein involved in the synthesis of fucose (hereinafter referred to as "GDP-fucose synthase");
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が 結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質 (以下、 「ひ 6 -フコース修飾酵素」 と表記す る) ; (b) An enzyme protein involved in glycosylation in which the first position of fucose binds to position 6 of N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex-type sugar chain (hereinafter referred to as “hi 6-fucose modifying enzyme”). Notation);
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質 (以下、 「GDP -フコース輸送蛋白質」 と表記する)。 (c) Intracellular sugar nucleotide GDP-a protein involved in the transport of fucose to the Golgi apparatus (hereinafter referred to as "GDP-fucose transport protein").
GDP-フコース合成酵素とし Tは、 細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含し、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に影響を与える酵素などがあげられる。 As a GDP-fucose synthase, T includes any enzyme involved in the synthesis of sugar nucleotide GDP-fucose, which is a source of fucose to sugar chains in the cell. Enzymes that affect synthesis and the like.
細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースは、 de novoの合成経路あるいは Salvage合成経路に より供給されている。 したがって、 これら合成経路に関与する酵素はすべて GDP-フコース合成 酵素に包含される。 GDP-fucose, an intracellular sugar nucleotide, is supplied by the de novo synthetic pathway or the salvage synthetic pathway. Therefore, all enzymes involved in these synthetic pathways are included in GDP-fucose synthase.
de novoの合成経路に関与する GDP-フコース合成酵素としては、 GDP- mannose 4- dehydratase (GDP-マンノース 4-デヒドラターゼ;以下、 GMD と表記する)、 GDP-keto-6-deoxymannose 3, 5-epimerase, 4-reductase (GDP—ケト-デォキシマンノース 3, 5 -ェピメラーゼ, 4一リダクタ ーゼ;以下、 Fxと表記する) などがあげられる。
Salvage 合成経路に関与する GDP-フコース合成酵素としては、 GDP - beta-L-fucose pyrophosphorylase (GDP -ベータ- L -フコース-ピロホスフォリラーゼ;以下、 GFPPと表記する)、 Fucokinase (フコキナーゼ) などがあげられる。 GMD としては、 配列番号 1、 2または 3で表 されるアミノ酸配列を有する GMDがあげられる。 GDP-fucose synthase involved in the de novo synthesis pathway includes GDP-mannose 4-dehydratase (GDP-mannose 4-dehydratase; hereinafter referred to as GMD), GDP-keto-6-deoxymannose 3, 5-epimerase , 4-reductase (GDP-keto-deoxymannose 3,5-epimerase, 4-reductase; hereinafter referred to as Fx). GDP-beta-L-fucose pyrophosphorylase (GDP-beta-L-fucose-pyrophosphorylase; hereinafter referred to as GFPP), Fucokinase (fucokinase) and the like are involved in the GDP-fucose synthase involved in the Salvage synthesis pathway. can give. Examples of GMD include GMD having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3.
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の細胞内の糖 ヌクレオチド GDP-フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質 となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。 Examples of the enzyme that affects the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include those that affect the activity of the enzyme involved in the above-described synthesis pathway of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose and the substances that serve as substrates for the enzyme. Enzymes that affect structure are also included.
a 1, 6-フコース修飾酵素としては、 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダル コサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包 含される。 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位とフコース の 1位が α結合する反応に関与する酵素としては、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν- ァセチルグノレコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に影響を与える酵素であれば いかなる酵泰も包含される。具体的には、 a l, 6-フコシルトランスフェラーゼやひ一L—フコシ ダーゼなどがあげられる。 α ΐ, 6-フコシルトランスフェラーゼとしては、 配列番号 4または 5 で表される: Τミノ酸配列を有する α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼがあげられる。 , また、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に影響を与える酵素としては、 上述の Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元 末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する反応に関与する酵素の活 性に影響を与えたり、 該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。 a 1,6-Fucose-modifying enzyme includes any enzyme that participates in the reaction in which the 6-position of N-glycidyl-linked complex-type sugar chain reducing terminal N-acetyldarcosamine and the 1-position of fucose are α-linked. Included. The enzyme involved in the reaction in which the 6-position of 還 元 -glycidyl-linked glycan at the reducing end of 複合 -acetyldarcosamine and the 1-position of fucose are α-linked is the Ν-glycoside-linked glycan at the reducing end of glycan. Any enzyme that affects the reaction in which the 6-position of acetyl gnorecosamine and the 1-position of fucose are α-linked is included. Specific examples include al, 6-fucosyltransferase and Hi-L-fucosidase. The αΐ, 6-fucosyltransferase is represented by SEQ ID NO: 4 or 5: α1,6-fucosyltransferase having a amino acid sequence is exemplified. In addition, the enzyme which affects the reaction in which the 6-position of 還 元 -acetyldarcosamine at the reducing end of Ν-glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose are α-linked includes the Ν-glycoside-linked complex type sugar described above. Enzyme that affects the activity of the enzyme involved in the reaction in which the position 1 of fucose binds to position 6 of fucose at the 6-position of Ν-acetyldarcosamine at the chain reduction terminal, or that affects the structure of the substrate substance of the enzyme Are also included.
GDP-フコース輸送蛋白質としては、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送 に関与する蛋白質であればいかなる蛋白質も包含され、 具体的には、 GDP-フコーストランスポ 一ターなどがあげられる。 The GDP-fucose transport protein includes any protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus, and specifically includes the GDP-fucose transporter.
また、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースをゴノレジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白 質も GDP-フコース輸送蛋白質に包含され、具体的には上述の細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコー スのゴルジ ίφ:への輸送に関与する蛋白質の活性に影響を与えたり、 発現に影響を与える蛋白質 などがあげられる。 In addition, proteins that influence the reaction of transporting the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose into the gonoresi are also included in the GDP-fucose transport protein, and specifically, the above-mentioned intracellular sugar nucleotide GDP-fucose Golgi ίφ: Proteins that affect the activity of proteins involved in transport to the cell or that affect expression.
本発明の製造方法に用いられる細胞を取得する方法としては、 α 1, 6-フコース Ζレクチン耐 性細胞を選択することができる手法であればいかなる手法でも用いることができる。 具体的に は、 上述し 蛋白質の活性を低下または欠失させる手法などがあげられる。 上述の蛋白質の活 性を低下ますこは欠失させる手法としては、 As a method for obtaining cells used in the production method of the present invention, any method can be used as long as α1,6-fucose lectin-resistant cells can be selected. Specific examples include the above-described techniques for reducing or deleting the activity of a protein. Techniques for deleting the above-mentioned proteins that reduce their activity include:
(a) 蛋白質の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法; (a) gene disruption techniques targeting protein genes;
(b) 蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法; (b) a method for introducing a dominant negative body of a protein gene;
(c) 蛋白 についての突然変異を導入する手法; (c) a technique for introducing a mutation in a protein;
(d) 蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法; (d) a method for suppressing transcription or translation of a protein gene;
などがあデられる (W002/31140、 003/085107, W003/085118) 。 Nadogaa de are (W00 2/3 11 4 0 , 003/085107, W003 / 085118).
本発明において、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細 胞としては、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコー スの 1位が 結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子の発現または機能を完全に抑制
された細胞などがあげられる。 しだがつて、 本発明において、 ゲノム遺伝子がノックアウトさ れた糸田胞としては、 以下に述べる手法を用いて、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺 伝子をノックアウトした細胞があげられる。 In the present invention, as a cell in which a genomic gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which fucose is linked to α-position at position 6 of N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain is knocked out. Completely inhibits the expression or function of the genomic gene of an enzyme involved in glycosylation, in which fucose binds to position 6 of 還 元 -acetyldarcosamine at the reducing end of Ν-glycoside-linked complex type glycan Cells and the like. However, in the present invention, the Itoda vesicle in which the genomic gene has been knocked out has a fucose at position 6 of N-acetylacetylcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain using the method described below. Cells in which the genomic gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 is α- linked are knocked out.
ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞の具体的な例としては、 標的となる遺伝子のすべて または一部がゲノムから削除された細胞があげられる。 このような細胞を取得する方法として は、目的とするゲノムの改変を行うことができれば、レ、ずれの手法でも用いることができるが、 遺伝子工学的な手法が望ましい。 その具体的な手法としては、 上述した酵素の活性を低下また は欠失させる手法があげられる。 Specific examples of cells in which a genomic gene has been knocked out include cells in which all or part of a target gene has been deleted from the genome. As a method for obtaining such cells, any method can be used, as long as the desired genome can be modified, but a genetic engineering method is preferable. As a specific method, there is a method of reducing or deleting the activity of the above-mentioned enzyme.
また、上述した、 Ν-グリコシド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位とフコー スの 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選択する方法を用いるこ とにより、 Ν-ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコース の 1 ί立が 結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞を選択 することができる。 In addition, a method for selecting a lectin-resistant cell line that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of 還 元 -acetyltilcosamine at the reducing end of Ν-glycoside-linked glycan and the 1-position of fucos, as described above, is used. As a result, cells in which the genomic gene of an enzyme involved in glycosylation, in which fucose is linked to position 6 of の -acetyldarcosamine at the reducing end of Ν-daricoside-linked complex type glycan, are knocked out are selected. can do.
本突明における抗体組成物としては、 疾患に関連する細胞に発現する抗原、 もしくは疾患に 関連する細胞の増殖や転移など、 病態形成に関わる抗原などに対する抗体組成物などがあげら れる。 具体的には GD2、 GD3、 GM2、 HER2、 CD20、 CD22、 CD25、 CD33、 CD52、 MAGE, HMl. 24、 CC ケモカイン受容体 4 (CCR4) 、 副甲状腺ホルモン関連蛋白 (PTHrP) 、 塩基性線維芽細胞増殖因 子、線維芽細胞増殖因子 8、塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子 8受容体、 上皮糸田胞成長因子受容体 (EGFR) 、 上皮†生細胞接着分子 (EpCam) 、 インスリン様増殖因子、 ィ ンスリン様増殖因子受容体、 PMSA、 血管内皮細胞増殖因子、 血管内皮細胞増殖因子受容体、 呼 吸器合胞体ウィルス (RSV) 、 IL- 5受容体 ο;鎖などに対する抗体組成物があげられる。 Examples of the antibody composition in the present invention include an antigen expressed on a cell associated with a disease, or an antibody composition against an antigen associated with pathogenesis such as proliferation or metastasis of a cell associated with a disease. Specifically, GD2, GD3, GM2, HER2, CD20, CD22, CD25, CD33, CD52, MAGE, HMl. 24, CC chemokine receptor 4 (CCR4), parathyroid hormone-related protein (PTHrP), basic fibroblast Cell growth factor, fibroblast growth factor 8, basic fibroblast growth factor receptor, fibroblast growth factor 8 receptor, epithelial fibroblast growth factor receptor (EGFR), epithelial cell adhesion molecule (EpCam ), Insulin-like growth factor, insulin-like growth factor receptor, PMSA, vascular endothelial cell growth factor, vascular endothelial cell growth factor receptor, respiratory syncytial virus (RSV), IL-5 receptor ο; chain, etc. Antibody compositions are included.
上言己の抗体組成物の具体例としては、抗 GD2抗体 [アンチ'キャンサー'リサーチ(Anticancer Res. ) , 13, 331 (1993) ]、 抗 GD3抗体 [キャンサー 'ィムノロジー ·ィムノセラピー (Cancer Immunol. Immunother. ) , 36, 260 (1993)、 W001/23432、 US6437098] 、 抗 GM2抗体 [キャンサ 一 . リサーチ (Cancer Res. ) , 54, 1511 (1994)、 US6423511] 、 抗 HER2抗体 [プロシーディ ングス ·ォプ ·ザ ·ナショナル .アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 89, 4285 (1992) ] 、 抗 CD20抗体 [ブラッド (Blood) , 83, 435 (1994)、 W003/55993] 、 抗 CD22 抗体 [セミナーズ.イン .オンコロジ一 (Semmin. Oncol. ) , 30, 253 (2003) ] 、 抗 CD25抗体 [ヒュ一マン · アンティボディズ (Human Antibodies) , 10, 127 - 142 (2001) ] 、 抗 CD33抗体 [ジャーナノレ ·ォブ · クリ二カル ·オンコロジ一 (J. Cl in. Oncol. ) , 19, 3244 (2001) ] 、 抗 CD52抗体 [プロシーディングス ·ォプ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォプ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 89, 4285 (1992) ] 、 抗 MAGE抗体 [ブリティッシュ 'ジャーナル'ォ ブ. キャンサー (British J. Cancer) , 83, 493 (2000) ] 、 抗 HMl. 24抗体 [モレキュラー · ィムノロジー(Molecular Immunol. ) , 36, 387 (1999) ]、抗 CCR4抗体 [W001/64754、 W003/18635、 W00O/42O74, W099/15666、 US6245332] 、 抗副甲状腺ホルモン関連蛋白 (PTHrP) 抗体 [キャン サー (Cancer) , 88, 2909 (2000) ] 、 抗線維芽細胞増殖因子 8抗体 [プロシーディンダス 'ォ ブ ·ザ ·ナショナノレ ·アカデミー.ォプ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 86, 9911 (1989)、 003/002608] 、抗線維芽細胞増殖因子 8受容体抗体 [ジャーナル'ォブ'バイオロジ
カル *ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 265, 16455 (1990) ] 、 抗上皮細胞成長因子受容体抗 体 [キャンナー . リサーチ (Cancer Res. ) , 59, 1236 (1999)3 、 抗上皮性細胞接着分子抗体Specific examples of the above-mentioned antibody composition include anti-GD2 antibody [Anti 'Cancer' Research (Anticancer Res.), 13, 331 (1993)], anti-GD3 antibody [Cancer 'Imology Immunotherapy (Cancer Immunol. Immunother. ), 36, 260 (1993), W001 / 23432, US6437098], anti-GM2 antibody [Cancer Res. (Cancer Res.), 54, 1511 (1994), US6423511], anti-HER2 antibody [Proceedings Op. The National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992)], anti-CD20 antibody [Blood], 83, 435 (1994), W003 / 55993 ], Anti-CD22 antibody [Seminars. Oncol., 30, 253 (2003)], anti-CD25 antibody [Human Antibodies, 10, 127-142 (2001) )], Anti-CD33 antibody [J. Clin. Oncol., 19, 3244 (2001)], anti-CD33 antibody CD52 antibody [Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992)], anti-MAGE antibody [British 'Journal' ob. Cancer (British J. Cancer), 83, 493 (2000)], anti-HMl. 24 antibody [Molecular Immunol., 36, 387 (1999)], anti-CCR4 antibody [W001 / 64754, W003 / 18635, W00O / 42O74, W099 / 15666, US6245332], anti-parathyroid hormone-related protein (PTHrP) antibody [Cancer, 88, 2909 (2000)], anti-fibroblast growth factor 8 antibody [Proceedindus Prob. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911 (1989), 003/002608], anti-fibroblast growth factor 8 receptor antibody [Journal 'Ob' biology Cal * chemistry (J. Biol. Chem.), 265, 16455 (1990)], anti-epidermal growth factor receptor antibody [Canner. Research (Cancer Res.), 59, 1236 (1999) 3, anti-epithelial activity Cell adhesion molecule antibody
[プロシーディングス 'ォプ 'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 1438 (1979) ] 、 抗インスリン様増殖因子抗体 [ジャーナル'ォプ 'ニューロ サイエンス.. リサーチ (J. Neurosci . Res. ) , 40, 647 (1995)、 W003/93317] 、 抗インスリン 様増殖因子受容体抗体 [ジャーナル'ォブ 'ニューロサイエンス 'リサーチ(J. Neurosci. Res. ) , 40, 647 (1995) ]、抗 PMSA抗体 [ジャーナル.ォブ.ゥロロジー(J. Urology) , 160, 2396 (1998) ]、 抗血管内皮細胞増殖因子抗体 [キャンサー . リサーチ (Cancer Res. ) , 57, 4593 (1997) ] 、 抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体 [オンコジーン (Oncogene) , 19, 2138 (2000) ] 、 抗 RSV 抗体 [アンティバイラル · リサーチ(Antiviral Res. ) , 47, 57-77 (2000) ] 、 抗 IL - 5受容体 ct 鎖抗体 (US6O 18032、 US6538111) などがあげられる。 具体的な抗体名としては、 ハーセプチン (Herceptin)、 リツキサン(Rituxan)、 キャンパス(Campath)、 アバスチン(Avast in)、 ベクサ一 (Bexxar)、 リ ンフォサイド(LytnphoCi de)、 マイ口ターグ(Mylotarg)、 パノレックス(Panorex)、 ゼバリン(Zevalin) [ネイチヤー.レビューズ.キャンサー(Nat. Rev. Cancer) , 1, 118 (2001) ]、 ゼナパックス (Zenapax)、シムレクト (S imulect)、 レミケード (Remicade)、シナジス (Synagis)、 レオプロ(Reopro) [ヒユーマン'アンティボディズ(Human Antibodies) , 10, 127-142 (2001) ]、 ェンブレノレ(Enbrel) [エキスパート ·オピニオン ·オン ·ファーマコセラピー (Expert Opinion on Pharmacotherapy) , 2, 1137 - 1148 (2001) ]、 ゾレア(Zolair) [レスビラトリー .メディスン[Proceedings 'Op' The 'National' Academy 'Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 1438 (1979)], Anti-insulin-like growth factor antibody [Journal 'Op' Neuro Science .. Research (J. Neurosci. Res.), 40, 647 (1995), W003 / 93317], Anti-insulin-like growth factor receptor antibody [Journal 'ob' Neuroscience 'Research (J. Neurosci. Res.) ), 40, 647 (1995)], anti-PMSA antibody [J. Urology, 160, 2396 (1998)], anti-vascular endothelial cell growth factor antibody [Cancer Res. , 57, 4593 (1997)], anti-vascular endothelial cell growth factor receptor antibody [Oncogene, 19, 2138 (2000)], anti-RSV antibody [Antiviral Res., 47, 57- 77 (2000)], anti-IL-5 receptor ct chain antibody (US6O 18032, US6538111). Specific antibody names include Herceptin, Rituxan, Campus, Avast in, Bexar, LytnphoCi de, Mylotarg, and Panorex. (Panorex), Zevalin (Nat. Rev. Cancer, 1, 118 (2001)), Zenapax, Simulect, Remicade, Synagis ), ReoPro (R eo p ro) [Hiyuman 'ante body's (Human Antibodies), 10, 127-142 (2001)], Enburenore (Enbrel) [expert opinion on Pharmacology Therapy (expert opinion on Pharmacotherapy) , 2, 1137-1148 (2001)], Zolair [Lesviratory Medicine.
(Respiratory Medicine) , 97, 123-129 (2003) ]などがあげられる。 (Respiratory Medicine), 97, 123-129 (2003)].
本発明において、 ADCC活性は、 51Cr遊離法、 lactate dehydrogenase (LDH) 遊離法、 フロー サイトメトリー等による in vitroの測定系、 あるいは動物モデルを用いた in vivoの評価系等 で測定することができる。 In the present invention, ADCC activity can be measured by an in vitro measurement system such as 51 Cr release method, lactate dehydrogenase (LDH) release method, flow cytometry, or an in vivo evaluation system using an animal model. .
本発明において、 抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 N—グリコシド結合複合型 糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割 合が 50%以上である抗体組成物とともに用いられる薬剤としては、 サイトカイン、抗体などの 蛋白質、 低分子の薬剤、 生物学的応答調節物質 (以下 BRMと称する) などがあげられる。 サイトカインとしては、 インターロイキン (IL) 類、 コロニー刺激因子 (CSF) 類、 インター フエロン (IFN) 類、 腫瘍壊死因子 (T F) 類、 ケモカイン類、 あるいはこれらの組み合わせが あげられる。 具体的には、 IFN- c¾、 IFN- β , IFN- -y , T F- a、 TNF- /3、 IL-1 a , IL-1 ;3、 IL - 2、 IL一 3、 IL-4、 IL一 6、 IL- 7、 IL- 9、 IL - 12、 IL_15、 IL_17、 IL- 18、 IL-21、 fractalkine, GM-CSFヽ G - CSF、 M - CSF、 SCF、あるいはこれらの組み合わせがあげられる。好ましくは IL - 2、 IL - 15、 IFN- a、 IFN二 γがあげられる。 In the present invention, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, of the sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the sugar chain reducing end, Drugs used in combination with the antibody composition having a ratio of 50% or more include cytokines, proteins such as antibodies, small molecule drugs, biological response modifiers (hereinafter referred to as BRMs), and the like. Cytokines include interleukins (ILs), colony stimulating factors (CSFs), interferons (IFNs), tumor necrosis factors (TFs), chemokines, or combinations thereof. Specifically, IFN-c¾, IFN-β, IFN--y, TF-a, TNF- / 3, IL-1a, IL-1; 3, IL-2, IL-13, IL-4 , IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL_15, IL_17, IL-18, IL-21, fractalkine, GM-CSF ヽ G-CSF, M-CSF, SCF, or a combination of these can give. Preferably, IL-2, IL-15, IFN-a and IFN-2γ are mentioned.
低分子の薬剤としては、 アミフォスチン (ェチオール) [amifost ine (ethyol) ] 、 シスプラ チン ( ci spl at in) 、 ダカノレバジン (DTIC) [ dacarbazine (DTIC) ] 、 ダクチノマイシン Low molecular drugs include amifostine (ethyol), cisplatin (ci spl at in), dacanolevadine (DTIC) [dacarbazine (DTIC)], and dactinomycin
(dactinomyc in) 、メクロレタミン (ナイ トロシェンマスター ) [mechlorethamine ^ni trogen mustard) ] 、■ストレプトゾシン streptozocm)、ンクロフォスファ: ト (cyclophosphamide)、 力ノレムスチン (BCNU) [carmustine (BCNU) ] 、 口ムスチン (CCNU) [lomustine (CCNU) ] 、 ドキソルビシン (アドリアマイシン) [doxorubi cin (adriamycin) ]、 ドキソルビシンリポ (ド キシノレノ [doxorubi cin lipo (doxilj J 、グムシタビン ケムサ一ノレ) [gemcitabine、gemzar) ] 、
ダウノルビシン (daunorubicin) 、 ダウノルビシンリポ (ダウノゾーム) [daunorubicin lipo (daunoxome)コ、プロ力ノレノくジン (procarbazine) 、 マイ I、マイシン (mitomycin) 、 シタラヒ ン ^cytarab ine) 、 エトホシド etoposide) 、 メ 卜卜レキセ一卜 (methotrexate)、 5 -フノレオ 口ゥラシル(5- fluorouracil)、ビンブラスチン(vinblastine)、ピンクリスチン(vincri stine)、 ブレオマイシン (bleomycin) 、 パクリタキセノレ (タキソーノレ) [paclitaxel (taxol) ] 、 ドセ タキセル (タキソテア) [docetaxel (taxotere) ] 、 ァノレデスロイキン (aldesleukin) 、 ァス ノ ラギナーゼ (asparaginase) 、 ブスノレファン (busulfan) 、 カノレポプラチン (carboplatin) 、 クラドリビン (cladribine) 、 カンプトテシン (camptothecin) 、 CPT- 11、 10-ヒドロキシ -7- ェチル-カンプトテシン (SN38) [10- hydroxy - 7-ethyl - camptothecin (SN38) ] 、 フロクスゥリ ジン (floxaridine) 、 フノレダラビン (fludarabine) 、 ヒ ドロキシゥレア (hydroxyurea) 、 ィ ホスフアミ ド (ifosfamide) 、 ィ.ダノレビシン (idarubicin) 、 メスナ (mesna) 、 イリノテカン (irinotecan) 、 ミ 卜キサン卜ロン (mitoxantrone) 、 トポテカン (topotecan) 、 ロイプロリ ド (leuprol ide) 、 メゲス卜 d—ノレ (megestrol) 、 メノレファラン (melpharan) 、 メノレ; ¾プ卜 プリン (mercaptopurine) 、 プリカマイシン (plicamycin) 、 ミ トタン (mitotane) 、 へ刀ス ノヽフガ1 i pegaspargaseリ ヽヘン卜スタテン (pentostatin) ヽ ピポフロマン (pipobroman 、 ストレプトゾシン(streptozocin)、タモキシフェン(tamoxifen)、テ -ポシド(teniposide)、 テストラク トン (testolactone) 、 チォグァニン (thioguanine) 、 チォテパ (thiotepa) 、 ゥ ラシノレマスタード (uracil mustard) 、 ビノレノレビン ( vinorelbine) 、 クロラムブシノレ (chlorambucil) 、 プレドニゾロン (prednisolone) 、 ビンデシン (vindesine) 、 ニムスチン (nimstine)、セムステン semustinリ、力へシタビン (capecitabine)、 トムアツクス (.tomudex)、 ァザシチジン (azacytidine)、 UFT、 ォキザロプラチン (oxaloplatin) 、 ゲフイチニプ (ィレ ッサ) [gefitinib (Iressa) ] 、 イマチニブ (STJ571) [imatinib (STI571) ] 、 アムサクリン (amsacrine) 、 ォーノレ一 ランスレテノづン酸 11 - trans retinoic acid) 、 サリ ドマィド (thalidomi de) 、 ベキサロテン (ターグレチン) [bexarotene (targretin) ] 、 デキサメタゾ ン (dexamethasone) 、 アナストロン一ノレ (アリミデックス) [anastrozole (Alimidex) ] 、 口 ィプリン (leuplin)あるいはこれらの組み合わせがあげられる。好ましくは、ピンクリスチン、 シクロフォスフアミド、 エトポシド、 メ トトレキセートあるいはこれらの組み合わせがあげら れる。 (dactinomyc in), mechlorethamine (nitroshen master) [mechlorethamine ^ ni trogen mustard), ■ streptozocin streptozocm), cyclophosphamide, cyclophosphamide, carnotine (BCNU) [carmustine (BCNU)], mouth mucin (CCNU) ) [lomustine (CCNU)], doxorubicin (adriamycin) [doxorubi cin (adriamycin)], doxorubicin lipo (doxorubi cin lipo (doxilj J, gumcitabine Jemcitabine, gemzar)], Daunorubicin (daunorubicin), daunorubicin lipo (daunoxome), daunorubicin lipo (daunoxome), procarinazine (procarbazine), my I, mycin (mitomycin), cytarabine ^ cytarab ine, ethoside etoposide Methotrexate, 5-fluoroenocil, 5-fluorouracil, vinblastine, pinklistin, bleomycin, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotea) ) [docetaxel (taxotere)], anoledesleukin (aldesleukin), asno laginase (asparaginase), busnolephane (busulfan), canolepoplatin (carboplatin), cladribine (cladribine), camptothecin, CPT 10-Hydroxy-7-ethyl-camptothecin (SN3) 8)], floxaridine, fludarabine, hydrourea, hydroxyurea, ifosfamide, idarubicin, mesna, irinotecan (mitoxantrone), topotecan (topotecan), leuprolide (leuprol ide), megestol d-nore (megestrol), menolephalan (melpharan), menole; epupurin (mercaptopurine), plicamycin (plicamycin), mitotane ), Sword snofuga 1 i pegaspargase ヽ ヽ ス タ ス タ pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent pent ), Thiotepa, ゥ uracil mustard, vinoreno Vinorelbine, chlorambucil, prednisolone, vindesine, nimstine, semsten semustinli, capecitabine, FT, atomizexin (oxaloplatin), gefitinib (Iressa), imatinib (STJ571) [imatinib (STI571)], amsacrine, 11-trans retinoic acid, salidomide thalidomi de), bexarotene (targretin), dexamethasone, dexamethasone, anastrozole (Alimidex), leuplin or a combination thereof. Preferably, pinklistin, cyclophosphamide, etoposide, methotrexate or a combination thereof is used.
抗体としては、 上述した抗体があげられる。 Examples of the antibody include the above-mentioned antibodies.
本発明における BRMとしては、 BCG、嫌気性コリネバクテリァ、 ムラミルジぺプチド、 トレハ ロースジミコール酸等の細菌製剤、 ピラン共重合体、 MVE、 ポリ I :C、 ピリミジン、 チモシン、 チムリン、 チモポェシン、 ピシバニール、 フコィダン、 クレスチン等があげられる。 BRMs in the present invention include BCG, anaerobic corynebacterium, bacterial preparations such as muramyl dipeptide, trehalose dimycolic acid, pyran copolymer, MVE, poly I: C, pyrimidine, thymosin, thymulin, thymopoesin, picibanil, fucoidan. , Krestin and the like.
本発明の医薬の効果は、例えば il imの細胞障害活性測定系によって調べることができる。 ii i^の糸田胞障害活性測定系の例としては、 ADCC活性の測定系があげられる。 ADCC活性は、 抗体の存在下で、 抗原を発現する標的細胞と、 ヒトあるいはその他の動物より採取した末梢血 単核球、 単球、 マクロファージ、 顆粒球等のエフェクター細胞を接触させ、 障害された標的細 胞の度合いを検出し、 これを定量することにより測定することができる。 障害された標的細胞 の度合いは、 51Cr遊離法、 標的細胞の酵素活性を検出する方法、 フローサイトメーターによる 検出法など【こよって検出することができる。 ADCC活性測定系における本発明の免疫担当細胞を
活性ィ匕させる物質または抗腫瘍活性を有する物質の効果は、 ADCC活性測定系中にこれらの物質 を添加するか、 あるいは標的細胞、 またはエフェクター細胞、 またはその両者にあらかじめこ れらの物質を一定期間曝露して ADCC活性に与える影響を観察することにより、測定することが できる。 The effect of the medicament of the present invention can be examined, for example, by using an ilim cytotoxicity assay system. As an example of the system for measuring the activity of the itoda cyst of ii i ^, there is a system for measuring ADCC activity. ADCC activity was impaired by contacting antigen-expressing target cells with effector cells such as peripheral blood mononuclear cells, monocytes, macrophages, and granulocytes from humans or other animals in the presence of antibodies. It can be measured by detecting the degree of the target cell and quantifying it. The degree of impaired target cells, 51 Cr release assay, a method of detecting the enzymatic activity of the target cells can be detected Te detection methods such as [Koyo' by flow cytometer. The immunocompetent cells of the present invention in the ADCC activity measurement system The effect of the substance to be activated or the substance having antitumor activity can be determined by adding these substances to the ADCC activity measurement system or by preliminarily preserving these substances in target cells, effector cells, or both. It can be measured by observing the effect of a period of exposure on ADCC activity.
また本発明の医薬の効果は、 動物モデルを用いた iiLJd^抗腫瘍活性を測定することによつ ても調べることができる。 The effect of the medicament of the present invention can also be examined by measuring iiLJd ^ antitumor activity using an animal model.
動物モデルとしては、 ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移 植した異種移植モデル、 培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した 同系移植モデルなどがあげられる。 As animal models, xenograft models in which cultured cell lines derived from human cancer tissues are transplanted into immunodeficient mice such as nude mice, and syngeneic transplant models in which cultured mouse cancer cell lines are transplanted into wild-type mice having a normal immune system And so on.
異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、 皮内、 腹腔内、 静脈内等様々な 部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。 Xenograft models can be prepared by implanting human cancer cell lines into various sites such as subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, and intravenous sites of immunodeficient mice such as nude mice.
上記動物モデルを用いて抗体の単独投与、 免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活 性を有する物質の単独投与の効果と、 本発明の医薬の効果とを比較することにより、 本発明の 医薬の抗腫瘍効果を評価することができる。 By comparing the effects of the single administration of an antibody, the single administration of a substance that activates immunocompetent cells or a substance having antitumor activity with the above-described animal model, and the effects of the medicament of the present invention, The antitumor effect of the drug can be evaluated.
本発明の医薬は、 単独で投与することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つ あるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法 により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 Although the medicament of the present invention can be administered alone, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and any of the well-known drugs well known in the technical field of pharmaceutics is used. It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by the method.
与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与、 または口 腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、 蛋白 質製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることができる。 It is desirable to use the most effective route for treatment, including oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous administration. In the case of a protein preparation, intravenous administration can be preferably used.
投与形態としては、噴霧剤、 カプセル剤、錠剤、顆粒剤、 シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。 , Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like. ,
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等が あげられる。 Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大 豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 スト口ベリ一フレーバー、 ぺ パーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。 Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p-hydroxybenzoic acid. It can be produced by using preservatives such as acid esters, flavors such as stomach berry, and flavors such as permint as additives.
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、 プドウ糖、 ショ糖、マン-トール等の賦形剤、 デンプン、アルギン酸ナトリゥム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステ ル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。 Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, pudose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl It can be produced using a binder such as alcohol, hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。 Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
注射剤は、 塩溶液、 プドウ糖溶液、 あるいは两者の混合物からなる担体等を用いて調製され る。 The injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a pudose solution, or a mixture of the above.
座剤は力力ォ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 Suppositories are prepared using carriers such as lactic acid, hydrogenated fats or carboxylic acids.
また、 噴霧剤は該医薬そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつ該 医薬を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用レ、て調製される。 Sprays are also prepared using the drug itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and disperses the drug as fine particles to facilitate absorption.
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該医薬および用いる担体の性質に
より、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤において も経口剤で添カロ剤として例示した成分を添加することもできる。 Specific examples of the carrier include lactose and glycerin. Depending on the nature of the drug and the carrier used Thus, preparations such as aerosols and dry powders are possible. In addition, in these parenteral preparations, the components exemplified as carotenoids in oral preparations can also be added.
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により 異なる力 通 成人 1回当たり抗体量として 0. 1〜20mg/kgである。抗体と併用する薬剤は、単 独で臨床に用レヽられる場合の投与量と同用量またはそれより少ない用量である。 図面の簡単な説明 Dose or frequency of administration is 0. 1~20m g / k g the desired therapeutic effect, administration method, treating period, age, as different forces through adult dose of antibody per amount by weight, or the like. The dose of the drug used in combination with the antibody is the same or lower than that used alone for clinical use. Brief Description of Drawings
第 1図は、 KM2760-1と KM3060の ADCC活性に対する各種サイトカインの増強効果を示す。 縦 軸は細胞障害活性 (%) を表す。 髓はサイトカイン非添加、 口は IL-2添加、斜線は IL-15添加 時の細胞障害活性をそれぞれ表す。 FIG. 1 shows the enhancing effect of various cytokines on ADCC activity of KM2760-1 and KM3060. The vertical axis represents cytotoxic activity (%). The medulla shows no cytotoxicity, the mouth shows the addition of IL-2, and the hatched lines show the cytotoxic activity when IL-15 is added.
第 2図は、 KM3065と Rituxanの ADCC活性に対する各種サイトカインの増強効果を示す。 縦 軸は細胞障害活性 (%) を表す。 図において園はサイトカイン非添加、 口は IL- 2添加、斜線は IL-15添加時の糸田胞障害活性をそれぞれ表す。 Figure 2 illustrates the enhancement effects of various cytokines on the ADCC activity of KM 3 0 65 and Rituxan. The vertical axis represents cytotoxic activity (%). In the figure, the garden shows no cytokine addition, the mouth shows IL-2 addition, and the shaded lines show the Itoda cyst damage activity when IL-15 is added.
第 3図は、 KM3065と Rituxanの ADCC活性に対する各種サイトカインの増強効果を示す。 縦 軸は細胞障害活性 (%) を表す。 図において國はサイトカイン非添加、 口は IFN-ひ添力 [1、 斜線 は IFN- 7添加時の細胞障害活性をそれぞれ表す。 Figure 3 shows the enhancing effect of various cytokines on the ADCC activity of KM 3 0 65 and Rituxan. The vertical axis represents cytotoxic activity (%). In the figure, the country indicates the absence of cytokines, the mouth indicates IFN-addition force [1, and the hatched lines indicate the cytotoxic activity when IFN-7 was added.
以下、 本発 S月を詳細に説明する。 本願は、 2003年 12月 4 日に出願された日本国特許出願 2003-406589 号の優先権を主張するものであり、 当該特許出願の明細書及び/または図面に記 載される内容を包含する。 The following is a detailed description of the S month. This application claims the priority of Japanese Patent Application No. 2003-406589 filed on December 4, 2003, which includes the content of the description and / or drawings of the patent application. .
発明を実施するための最良の形熊 Best shape bear for carrying out the invention
実施例 1 in vitro細胞障害活性における抗 CCR4抗体とサイトカインの併用効果 Example 1 Combined effect of anti-CCR4 antibody and cytokine on in vitro cytotoxicity
in vitro 糸田胞障害活性における杭 CCR4 ヒ ト型キメラ抗体 KM2760-1 および KM3060 ( 002/31140) とサイトカインの併用効果を以下の方法により測定した。 The effect of the combination of cytokines with the CCR4 human chimeric antibodies KM2760-1 and KM3060 (002/31140) on the in vitro activity against intestinal cysts was measured by the following method.
KM2760-1はラットミエローマ細胞株 YB2/0細胞に抗 CCR4キメラ抗体発現株を導入して得ら れた細胞株 KM2760 - 1#58-35 - 16より生産された抗 CCR4キメラ抗体である。 KM2760- 1#58 - 35-16 株はレクチン耐性能を有し、 KM2760- 1の全糖鎖中のフコースが結合しない糖鎖含量は 87%であ る。一方 KM306Oは CH0/DG44細胞株に抗 CCR4キメラ抗体発現株を導入して得られた細胞株 5-03 より生産され fこ抗 CCR4キメラ抗体である。 ΚΙΟΟδΟはレクチン耐性能を有さず、 ΚΜ3060の全糖 鎖中のフコースが結合しない糖鎖含量は 8%である。 KM2760-1と ΚΜ3060は同じアミノ酸配列を 有し、 抗原結合活性も同等である。 KM2760-1 is an anti-CCR4 chimeric antibody produced from the cell line KM2760-1 # 58-35-16 obtained by introducing an anti-CCR4 chimeric antibody-expressing strain into the rat myeloma cell line YB2 / 0 cells. The KM2760-1 # 58-35-16 strain has lectin resistance, and the content of sugar chains to which fucose does not bind in the total sugar chains of KM2760-1 is 87%. On the other hand, KM306O is an anti-CCR4 chimeric antibody produced from cell line 5-03 obtained by introducing an anti-CCR4 chimeric antibody-expressing strain into the CH0 / DG44 cell line. {Δ} has no lectin resistance, and the content of sugar chains to which fucose is not bound in the total sugar chains of {3060} is 8%. KM2760-1 and ΚΜ3060 have the same amino acid sequence, and have the same antigen binding activity.
(a) エフヱクタ一細胞溶液の調製 (a) Preparation of effector-cell solution
健常人静脈虹 50mLを採取し、 へパリンナトリウム (清水製薬社製) 0. 5mLを加え穏やかに混 ぜた。 これを MONO- P0LY分離溶液 (大日本製薬株式会社製) を用いて使用説明書に従い、 遠心 分離 (400g、 20分間) して単核球層を分離した。 RPMI1640-FCS (5) 培地で 3回遠心分離して洗 浄後、 同培地を用いて 3 X 106細胞/ mLの濃度で再懸濁し、 エフェクター細胞溶液とした。 A healthy person's venous rainbow (50 mL) was collected, and heparin sodium (Shimizu Pharmaceutical Co., Ltd.) (0.5 mL) was added and mixed gently. This was centrifuged (400 g, 20 minutes) using a MONO-POLY separation solution (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) according to the instruction manual to separate a mononuclear cell layer. After washing by centrifugation three times with RPMI1640-FCS (5) medium, the cells were resuspended in the same medium at a concentration of 3 × 10 6 cells / mL to obtain an effector cell solution.
(b) エフェクター細胞のサイト力インによる刺激 (b) Stimulation by effector cells
上記(a)で得られたェフエクタ一細胞溶液を 50 /i Lずつ、 96穴 U底プレート(Falcon社製)に 分注した。 さらに RPMIIMO - FCS (5)で希釈した以下の溶液を 50 / Lずつ添加し、 5%C02ィンキ ュベータ 内 ίこて 3日間静置した。
( 1 ) 1¾¾11640—?じ5 (5)のみ (サイト力イン非添加コントロール) The fefecta single cell solution obtained in the above (a) was dispensed at 50 / i L into a 96-well U-bottom plate (Falcon). Further RPMIIMO - FCS diluted following solutions (5) was added in 50 / L, and allowed to stand 5% C0 in 2 Inki Yubeta ί trowel 3 days. (1) 1¾¾11640—Fuji 5 (5) only (control with no added site force)
( 2 ) IL-2 (ぺプロテック社製) 2ng/mL (2) IL-2 (protech) 2ng / mL
( 3 ) IL-15 (ぺプロテック社製) 2ng/mL (3) IL-15 (protech) 2ng / mL
(c) 標的細胞溶液の調製 (c) Preparation of target cell solution
G418 (ナカライテスク社製) を 0. 5mg/mLで含む RPMIIMO- FCS (10) 培地 (FCS を 10%含む RPMI1640培地(GIBCO BRL社製))で培養した CCR4/EL4細胞 (CCR4遺伝子を導入したマウス胸腺 腫細胞、 W001/64754) を遠心分離操作及び懸濁により RPMIIMO-FCS (5)培地 (FCS を 5%含む RPMI1640培地(GIBCO BRL社製)) で洗浄した後、 RPMI1640- FCS (5) 培地によって、 2 X 105細胞 AnLに調製し、 標的細胞溶液とした。 G418 (manufactured by Nacalai Tesque) containing at 0. 5 mg / mL RPMIIMO- FCS ( 10) medium (manufactured by RPMI1640 medium (GIBCO BRL, Inc. containing 10% FCS)) and CCR4 / EL4 cells (CCR4 gene cultured in the introduction Mouse thymoma cells, W001 / 64754) were washed with RPMIIMO-FCS (5) medium (RPI1640 medium containing 5% FCS (GIBCO BRL)) by centrifugation and suspension, and then RPMI1640-FCS (5 ) 2 x 10 5 cells AnL was prepared with the medium and used as the target cell solution.
(d) 細胞障害活性の測定 (d) Measurement of cytotoxic activity
(b)で調製した 96ゥエル U字底プレートの各ゥエルに (c) で調製した標的細胞溶液の 50 /x L (1 X 104細胞/ウエノレ) を分注した。 このときエフェクター細胞と標的細胞の比は 15 : 1となる。 更に、 KM2760- 1、 あるいは KM3060を各最終濃度 1 ng/mLあるいは lOOng/mLとなるように加え て全量を 200 /z Lとし、 37°Cで 4時間反応させた。反応後、 プレートを遠心分離し、上清中の乳 酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を、 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Pr omega 社製) を用いて、 添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。 標的細 胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、 また、 エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、 標的細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地 のみを用いて、 上記と同様の操作を行うことで取得した。 標的細胞全遊離の吸光度データは、 抗体溶液、 エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、 反応終了 45分前に の 9% Triton X- 100溶液を添加し、 上記と同様の操作を行い、 上清の LDH活性を測定することにより 求めた。 ADCC活性は次式により求めた。 . (数 1 ) To each well of the 96-well U-bottom plate prepared in (b), 50 / x L (1 × 10 4 cells / well) of the target cell solution prepared in (c) was dispensed. At this time, the ratio of effector cells to target cells is 15: 1. Further, KM2760-1 or KM3060 was added to a final concentration of 1 ng / mL or 100 ng / mL to make the total volume 200 / zL, and the reaction was carried out at 37 ° C for 4 hours. After the reaction, the plate is centrifuged, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant is measured using the CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) according to the attached instructions. Was measured. Absorbance data for spontaneous release of target cells uses only medium instead of effector cell solution and antibody solution, and absorbance data for spontaneous release of effector cells uses only medium instead of target cell solution and antibody solution Were obtained by performing the same operation as above. For the absorbance data of total release of target cells, use the medium instead of the antibody solution and effector cell solution, add 9% Triton X-100 solution 45 minutes before the completion of the reaction, and perform the same operation as above. It was determined by measuring the LDH activity. ADCC activity was determined by the following equation. (Number 1)
細胞障害活性 (%) = [ (検体の吸光度) 一 (エフェクター細胞自然遊離の吸光度) 一 (標的 ,钿胞自然遊離の吸光度) ] / [ (標的細胞全遊離の吸光度) 一 (標的細胞自然遊離の吸光度) ] X 100 Cytotoxic activity (%) = [(Absorbance of specimen) spontaneous release of effector cells 1 (Absorbance of spontaneous release of target cells and cells)] / [(Absorbance of total release of target cells) 1 (Spontaneous release of target cells) Absorbance)] X 100
第 1図に結果を図示した。 サイトカイン非添加時の KM2760-1の ADCC活性は KM3060の ADCC 活性よりも高いが、 サイトカインの添加によりさらに増強された。 この結果は、 抗体組成物中 に含まれる F c領域に結合する全 N—ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N— ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50%以上である抗体組成物 の高い ADCC活性は、 サイトカインによってさらに上昇することを示す。 Figure 1 shows the results. ADCC activity of KM2760-1 without cytokine was higher than that of KM3060, but was further enhanced by cytokine addition. This result indicates that, among all N-daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, of the sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain. The high ADCC activity of the antibody composition with a proportion of 50% or more indicates that the cytokine further increases.
実施例 2 iiL^iii ^細胞障害活性における抗 CD20抗体とサイトカインの併用効果 Example 2 Combined effect of anti-CD20 antibody and cytokine on iiL ^ iii ^ cytotoxicity
in vitro細胞障害活性における杭 CD20ヒト型キメラ杭体 KM3065 (W003/55993) およぴ巿販 の抗 CD20 ヒト型キメラ抗体 Rituxan (Genentech社製) とサイトカインの併用効果を実施例 1 に言己載の方法により測定した。 . The effect of the combination of the cytokine CD20 human chimeric pile KM3065 (W003 / 55993) and the commercially available anti-CD20 human chimeric antibody Rituxan (Genentech) and cytokine on in vitro cytotoxic activity was described in Example 1. Was measured according to the method described above. .
サイトカインは IL- 2、 IL-15 (いずれも Peprotech社製、終濃度 Ing/mL)、 IFN- α (Peprotech 社製、 終濃度 lOOng/mL) 、 IFN- γ (R&D Systems社製、 終濃度 lOOng/mL) を用いた。 KM3065 はラットミエローマ細胞株 YB2/0細胞に抗 CD20キメラ抗体発現株を導入して得られた細胞株 KM3065より生産された抗 CD20キメラ抗体である。 KM3065株はレクチン耐性能を有し、 KM3065
の全糖鎖中のフコースが結合しない糖鎖含量は 96%である。一方 Rituxanの全糖鎖中のフコー スが結合しない糖鎖含量は 6%である。 KM3065と Rituxanは同じアミノ酸配列を有し、 抗原結 合活性も同等である。 Cytokines are IL-2, IL-15 (all manufactured by Peprotech, final concentration Ing / mL), IFN-α (Peprotech, final concentration lOOng / mL), IFN-γ (R & D Systems, final concentration lOOng) / mL) was used. KM 3 0 65 is an anti-CD20 chimeric antibody produced from the cell line KM3065 obtained by introducing the anti-CD20 chimeric antibody expression strain rat myeloma cell line YB2 / 0 cells. KM3065 strain has lectin resistance, KM3065 The content of sugar chains to which fucose is not bound in the total sugar chains is 96%. On the other hand, the content of sugar chains that do not bind to fucose in all sugar chains of Rituxan is 6%. KM3065 and Rituxan have the same amino acid sequence, and have the same antigen binding activity.
第 2図および第 3図に結果を図示した。サイトカイン非添加時の KM3065の ADCC活性は Ritu xanの ADCC活性よりも高いが、 サイトカインの添カ卩によりさらに増強された。 この結果は、 抗 体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 N—グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元 末端の N—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50%以上である 抗体組成物の高い ADCC活性は、 サイトカインによってさらに上昇することを示す。 Figures 2 and 3 show the results. The ADCC activity of KM3065 without cytokine was higher than that of Rituxan, but was further enhanced by the addition of cytokine. This result indicates that, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, sugar chains in which fucose is not linked to N-acetyldarcosamine at the sugar chain reducing end The high ADCC activity of the antibody composition having a ratio of 50% or more indicates that the cytokine further increases.
産業上の利用可能性 Industrial applicability
抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 N—ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖 還元末端の N—ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 50%以上で ある抗体組成物と少なくとも 1種類の薬剤とを用いる医薬は、 高い治療効果を有することが期 待される。
Of all N-daricoside-linked complex type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, the ratio of sugar chains in which fucose is not linked to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain is 50%. A medicament using the antibody composition and at least one drug is expected to have a high therapeutic effect.